PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE19738292C1 12.05.1999
Titel Verfahren zur Reinigung und Konzentrierung von AAV-2 sowie antigenen Teilen davon
Anmelder Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts, 69120 Heidelberg, DE
Erfinder Kleinschmidt, Jürgen, Dipl.-Biol. Dr., 69245 Bammental, DE;
Kern, Andrea, 74930 Ittlingen, DE
Vertreter Patentanwälte Dr. Bernard Huber, Dr. Andrea Schüßler, 81825 München
DE-Anmeldedatum 02.09.1997
DE-Aktenzeichen 19738292
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 12.05.1999
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.05.1999
IPC-Hauptklasse C12N 7/02
IPC-Nebenklasse C07K 16/08   G01N 33/50   G01N 33/569   G01N 33/577   
Zusammenfassung Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung und Konzentrierung von AAV-2 sowie antigenen Teilen davon, wobei man AAV-2 oder antigene Teile davon an ein aktiviertes Chromatografiematerial bindet, das daran gekoppelte gegen AAV-2 gerichtete Antikörper umfaßt, und man anschließend mit einer nahezu neutralen Lösung enthaltend 2 bis 4,5 M MgCl2 eluiert. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit zur Durchführung des Verfahrens.

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von AAV-2 sowie antigenen Teilen davon.

Für therapeutische Ansätze müssen Viren, insbesondere rekombinante Viren, die als Vektoren verwendet werden, aufgereinigt und ankonzentriert werden. Die dafür bisher gebräuchlichen Verfahren, wie mehrfache Dichtegradientenzentrifugation oder chromatografische Methoden, z. B. mit einer sulfonierten Cellulosesäule, sind oft aufwendig und teuer und müssen mehrfach wiederholt werden, um so viele Kontaminationen wie möglich zu entfernen. Trotzdem ist damit oftmals nur eine partielle Reinigung möglich.

Desvoyes et al. (Plant Science 116 (1996), S. 239-246) beschreiben die Reinigung von "virus like particles" (VLPs) mit Hilfe einer Antikörper-Affinitätschromatografie, wobei als Säulenmaterial Glutaraldehyd-aktivierte Sepharose konjugiert mit monoklonalen Antikörpern gegen VLPs von Vicia faba eingesetzt wird. Die Elution der VLPs erfolgte mit Glycin-HCl-Puffer (0,2 M Glycin-HCl, pH 2,35, 0,5 M NaCl).

Diaco et al. (J. Gen. Virol. 67 (1986), S. 345-351) beschreiben die Reinigung von Sojabohnen-Mosaik-Virus durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern. Die Elution der gebundenen Viren von der Säule erfolgte mit DD-H2O mit pH 3,0.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb darin, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem adeno-assozierte Viren vom Typ 2 (AAV-2) aus Zellkultur-Überständen und Zellextrakten einfach und effizient aufgereinigt und ankonzentriert werden können.

Diese Aufgabe wird durch die Gegenstände der Patentansprüche gelöst.

Insbesondere wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Reinigung und Konzentrierung von AAV-2 sowie antigenen Teilen davon gelöst, das die folgenden Schritte aufweist:

  • - Kopplung eines gegen AAV-2 gerichteten Antikörpers an ein aktiviertes Chromatografiematerial,
  • - Auftragen einer wt-AAV-2 bzw. rAAV-2 enthaltenden Probe,
  • - Eluieren von wt-AAV-2 bzw. rAAV-2 mit einer Lösung, bevorzugt einem Puffer, enthaltend 2 bis 4,5 M MgCl2.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf dem Prinzip der Affinitätschromatografie. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein gegen AAV-2 gerichteter Antikörper an ein Chromatografiematerial gebunden. Die Bindung des Antikörpers an das Chromatografiematerial erfolgt gemäß bekannter Methoden, beispielsweise wie in "Harlow and Lane, Antibodies (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor, 1988" beschrieben. Als Chromatografiematerial eignen sich die dem Fachmann bekannten Chromatographiematerialien, insbesondere jene hydrophilen Materialien, die in Verbindung mit Gelfiltration bekannt sind. Dies sind beispielsweise Agarosegele (z. B. Sepharose®), Dextrangele (z. B. Sephadex®), Cellulose-Gelmatrices und Acrylamid-Gelmatrices. Für den erfindungsgemäßen Zweck ist das Chromatografiematerial vorteilhafterweise aktiviert, wodurch die Bindung und Immobilisierung von Proteinen ermöglicht wird. Diese Aktivierung kann durch Cyanbromid(CNBr)-Aktivierung oder NHS-Aktivierung stattfinden.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendbaren Antikörper erkennen AAV-2 oder antigene Teile davon. Ein solcher Antikörper kann ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper sein. Der Antikörper kann aus jeglichem Tier oder dem Menschen erhalten sein, wobei für einen polyklonalen Antikörper Kaninchen und für einen monoklonalen Antikörper Mäuse bevorzugt sind. Ferner kann der Antikörper synthetisch sein, wobei ihm ggf. Teile, die für vorstehende Erkennung nicht notwendig sind, ganz oder teilweise fehlen bzw. diese Teile durch andere ersetzt sind, die dem Antikörper weitere günstige Eigenschaften verleihen. Auch können Teile außerhalb der Bindungsregionen der Antikörper modifiziert, eliminiert oder ersetzt werden. Der Fachmann weiß, daß sich für vorstehende Maßnahmen insbesondere die DNA-Rekombinationstechnik eignet. Diese ist ihm bestens vertraut. Für das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere der bereits bekannte Antikörper geeignet, der in der WO 95/11997 bzw. EP-A-0 725 837 beschrieben ist: A20; hinterlegt bei der DSMZ unter DSM ACC2194 am 13. Oktober 1994.

Der Begriff "AAV-2 oder antigene Teile davon" bezieht sich auf AAV-2 Kapsidproteine, insbesondere VP1, VP2 und/oder VP3 sowie deren Fragmente, die eine antigene Funktion erfüllen. Der Begriff "AAV-2" schließt sowohl Wildtyp als auch rekombinant hergestelltes AAV-2 ein. Detaillierte Informationen bezüglich methodischer Aspekte von AAV-2, wie Zellkultur, Viruswachstum, Virus-Vorreinigung, Isolierung der Proteine können in der relevanten Literatur gefunden werden, z. B. in Handbuch der Parvoviren, Bd. I und II, CRC Press, Boca Raton, Florida, ED. P. Tjissen; Ruffing, M. et al. (1992), J. Virol., 66, S. 6922-6930.

Gibt man auf eine Chromatografie-Säule, an die ein gegen AAV-2 gerichteter Antikörper gekoppelt ist, eine Lösung, die AAV-2 enthält, z. B. in Form von Zellkultur-Überständen oder Zeltextrakten, findet eine Bindung an den immobilisierten Antikörper statt und AAV-2 kann davon wieder abgelöst werden, wodurch eine Reinigung und Konzentrierung stattfindet. Die Elutionsbedingungen liegen dabei im nahezu neutralen Bereich, ca. pH 6 bis 8. Die Elutionslösung enthält 2 bis 4,5 M MgCl2, bevorzugt 2-3 M MgCl2. Diese Bedingungen haben den Vorteil, daß der immobilisierte Antikörper nicht denaturiert wird und bei der Elution von AAV-2 nicht von der Säule abgelöst wird, sondern weiter an die Säule gebunden bleibt, so daß die Säule nach ihrer Regenerierung mehrmals verwendet werden kann. Außerdem bleiben durch das erfindungsgemäße Verfahren die gereinigten Viren stabil bzw. infektiös.

In einer bevorzugten Ausführungsform kann das aktivierte Chromatografiematerial auch daran gebundene Spacer enthalten. Diese Spacer sind bevorzugt aliphatische oder cyclische Kohlenwasserstoffgruppen. Die aliphatischen Kohlenwasserstoffgruppen können gerade oder verzweigte Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl-, oder Decylgruppen sein. Bei den cyclischen Kohlenwasserstoffgruppen sind Phenyl-, Benzyl-, Cyclohexylgruppen zu nennen.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird auch ein Kit bereitgestellt, der ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist. Ein solcher Kit umfaßt folgendes

  • - einen gegen AAV-2 gerichteten Antikörper, und
  • - übliche Hilfsmittel, wie Puffer, Chromatografiematrix und Kontrollen.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird durch einen einzigen Reinigungschritt eine hohe Reinigung erreicht. Es ist dabei eine vollständige Entfernung von Helferviren (Adenoviren) möglich. Vorteilhaft ist auch die Konzentrierung aus großen Volumina, wobei eine Ausbeute von nahezu 100% erreicht werden kann. Für große Produktionsmengen ist ein Scale-up des erfindungsgemäßen Verfahrens auf einfache Weise möglich.

Die Erfindung wird weiter anhand der Figuren beschrieben, welche zeigen:

Fig. 1: Prinzip der erfindungsgemäßen Verfahrens

Fig. 2: Dot Blot

Fig. 3: Grafische Darstellung der Elution (hellgraue Säulen: Wildtyp AAV-2; dunkelgraue Säulen: rAAV-2)

Die Erfindung wird weiter anhand der folgenden Beispiele beschrieben:

BEISPIEL 1

Das Verfahrensprinzip ist in Fig. 1 gezeigt.

Aus 500 ml A20-Hybridomüberstand wurde ca. 8 mg A20-Antikörper über eine anti-Maus IgG-Säule (alternativ kann auch eine "Quick Antibody Matrix der Fa. Dianova verwendet werden) affinitätsgereinigt. 8 mg A20-Antikörper wurden an HiTrap NSH-aktivierte Sepharose (Fa. Pharmacia) nach den Vorschriften des Herstellers gekoppelt. Ein geklärtes Frier-Tau-Lysat von Zellen, in denen Wildtyp- AAV-2 oder rAAV-2 produziert wurde, wurde langsam über die Säule gepumpt (4°C über Nacht), mit 10 Säulenvolumen PBS gewaschen und in 2-4 ml PBS mit 2,5 M MgCl2 eluiert. Das MgCl2 kann durch Dialyse oder Pelletierung der Viruspartikel und Resuspension in einem gewünschten Puffer (z. B. Tris oder 10/1 TE) entfernt werden.

BEISPIEL 2

Der A20-monoklonale Antikörper wurde aus dem Hybridoma-Überstand unter Verwendung der "Quick Antibody Purification Column" der Fa. Dianova, Hamburg gereinigt und ankonzentiert. Der gereinigte Antikörper wurde an Hitrap-NHS aktivierte Sepharose gemäß den Herstellerangaben (Fa. Pharmacia) gekoppelt. Eine ungereinigte AAV-2 Virusaufbereitung wurde 1 : 10 mit sterilem PBS verdünnt und langsam auf die A20-Hitrap-Säule appliziert. Nach Sammeln des Durchlaufs wurde die Säule mit PBS gewaschen und die AAV-2-Kapside wurden mit 2,5 M MgCl2 in PBS ergänzt mit 50 mM Tris, pH 7 eluiert. Die A20-Hitrap- Säule wurde mit PBS regeneriert und unter PBS/0,01% Natriumazid aufbewahrt.

Die AAV-2 Viren wurden durch Dot Blot-Hybridisierung und Immunfluoreszenz titriert. Dafür wurden HeLa-Zellen in 96-er Mikrotiterplatten in einer Konzentration von ca. 1 × 104-Zellen/Vertiefung eingefüllt, mit AAV-2 aus verschiedenen Fraktionen des obigen Affinitätsexperiments (aufgetragenes Material, Durchfluß, Waschlösung, Elutionsfraktion) in seriellen Verdünnungen infiziert und mit Adenovirus Typ 5 (MOI = 5) überinfiziert. Nach drei Tagen wurden die Zellen für die Immunfluoreszenz fixiert oder für die Dot Blot-Hybridisierung gefroren/aufgetaut (3×). Die Infektion mit AAV-2 wurde durch Immunfluoreszenz mit dem monoklonalen Antikörper 76/3 (Fa. Progen, Heidelberg) zum Nachweis der AAV- 2 rep Gen-Expression verfolgt. Replizierende AAV-2 wurden mit einem markierten DNA-Fragment des AAV-2 Rep-Gens detektiert (Dots in Fig. 2; hellgraue Säulen in Fig. 3).

Rekombinantes AAV-2 wurde auch gemäß dem vorstehenden Verfahren für Wildtyp-AAV-2 gereinigt. Für die Titration von rAAV-2 wurde die Expression des LacZ-Gens durch in-situ X-Gal Färbung der infizierten HeLa-Zellen nach seriellen Verdünnungen gemessen (dunkelgraue Säulen in Fig. 3).


Anspruch[de]
  1. 1. Verfahren zur Reinigung und Konzentrierung von AAV-2 sowie antigenen Teilen davon, dadurch gekennzeichnet, daß man AAV-2 oder antigene Teile davon an ein aktiviertes Chromatografiematerial bindet, das daran gekoppelte gegen AAV-2 gerichtete Antikörper umfaßt, und man anschließend mit einer nahezu neutralen Lösung enthaltend 2 bis 4,5 M MgCl2 eluiert.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei AAV-2 entweder Wildtyp-AAV-2 oder rekombinant hergestelltes AAV-2 ist.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Chromatografiematerial ausgewählt ist aus Agarosegelen, Dextrangelen, Cellulose-Gelmatrices und Acrylamid-Gelmatrices.
  4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Chromatografiematerial einen zur Bindung von Proteinen, insbesondere von Antikörpern geeigneten Liganden trägt.
  5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Chromatografiematerial CNBr-aktivierte Sepharose® oder NHS-aktivierte Sepharose® ist.
  6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Elutionslösung 2 bis 3 M MgCl2 enthält.
  7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei es sich bei der AAV- 2 bzw. rAAV-2 enthaltenden Probe um einen Zellkultur-Überstand oder Zellextrakte handelt.
  8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der gegen AAV-2 gerichtete Antikörper A20 (DSM ACC2194) ist.
  9. 9. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 umfassend
    1. 1. einen gegen AAV-2 gerichteten Antikörper, und
    2. 2. übliche Hilfsmittel, insbesondere Puffer, Chromatografiematerial und Kontrollen.






IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

  Patente PDF

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com