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Dokumentenidentifikation DE69321885T2 12.05.1999
EP-Veröffentlichungsnummer 0578388
Titel Verfahren zur fermentativen Herstellung von 10-Hydroxy-C18-Carbonsäure und Gamma-Dodekalaktonderivaten
Anmelder International Flavors & Fragrances Inc., New York, N.Y., US
Erfinder Farbood, Mohamad I., Monmouth, New Jersey 07733, US;
Morris, James A., Monmouth, New Jersey 07728, US;
McLean, Lynda B., Monmouth, New Jersey 07747, US
Vertreter Jaeger und Kollegen, 82131 Gauting
DE-Aktenzeichen 69321885
Vertragsstaaten CH, DE, FR, GB, LI, NL
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 14.06.1993
EP-Aktenzeichen 933045999
EP-Offenlegungsdatum 12.01.1994
EP date of grant 04.11.1998
Veröffentlichungstag der Übersetzung europäischer Ansprüche 16.03.1995
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.05.1999
IPC-Hauptklasse C12P 17/04
IPC-Nebenklasse C12P 7/64   C12N 9/20   C12N 1/20   

Beschreibung[de]
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Unsere Erfindung betrifft ein Fermentationsverfahren zur Herstellung von 10-Hydroxy-C&sub1;&sub8;-carbonsäurederivat-enthaltenden Zusammensetzungen und gamma-Dodecalactonderivat-enthaltenden Zusammensetzungen, Produkte, die dabei gebildet werden, und deren organoleptische Verwendungen. Die EP-A-258993 offenbart ein Verfahren zur Erzeugung von gamma-Dodecalacton durch Inkubation einer Ricinusölsäurequelle mit Sporobolomycis odorus oder Rhodotorula glutinis. Die Reaktion zur Herstellung der 10-Hydroxy-C&sub1;&sub8;-carbonsäurederivat-enthaltenden Zusammensetzungen umfaßt die Durchführung einer Fermentation von C&sub1;&sub8;-Carbonsäurederivaten, die gemäß der Struktur:

definiert sind, mit dem Mikroorganismus Pseudomonas sp. NRRL B- 2994 oder einem 10-Hydroxy-C&sub1;&sub8;-carbonsäurederivat-produzierenden Mutanten davon während einer Zeitspanne, die ausreichend ist, um eine oder mehrere solche Hydroxycarbonsäuren zu erzeugen. Unsere Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Durchführung der Fermentation solcher 10-Hydroxy-C&sub1;&sub8;-carbonsäurederivate mit Mikroorganismen der Gattung Candida und/oder der Gattung Yarrowia oder

produzierenden Mutanten davon während einer Zeitspanne, die ausreichend ist, um ein oder mehrere gamma-Dodecalactonderivate mit der Struktur:

zu erzeugen, worin die gestrichelten Linien gleiche oder verschiedene Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen bedeuten, wobei jede der gestrichelten Linien eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Einfachbindung oder eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung bedeutet. Unsere Erfindung betrifft auch Produkte, die gemäß solchen Verfahren hergestellt werden, sowie organoleptische Verwendungen solcher Produkte.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Unsere Erfindung betrifft ein Verfahren, das Fermentationstechniken anwendet, um bestimmte natürlich-vorkommende C&sub1;&sub2;-Lactone zu erzeugen und zu gewinnen, die sich durch ihre organoleptischen Eigenschaften zur Steigerung und Verstärkung des Aromas oder Geschmacks von Verbrauchsmaterialien, wie z. B. Nahrungsmitteln, Kaugummis, Zahnpasten, medizinischen Produkten, Kautabaks, Rauchtabaks, Parfümkompositionen, Kölnischwassern und parfümierten Gegenständen, z. B. festen oder flüssigen anionischen, kationischen, nichtionischen oder zwitterionischen Waschmitteln, parfümierten Polymeren, Weichspülerzusammensetzungen, Weichspülergegenständen, Kosmetikpulvern, Haarpräparaten und dergleichen, als nützlich erwiesen haben, wobei die Lactone gemäß der allgemeinen Struktur:

definiert sind, worin die gestrichelten Linien gleiche oder verschiedene Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen bedeuten und jede der gestrichelten Linien eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Einfachbindung oder eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung bedeutet.

Die Lactonzusammensetzungen unserer Erfindung enthalten vorzugsweise eine oder mehrere der folgenden Lactonverbindungen:

und/oder

Unsere Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung von hydroxycarbonsäurehaltigen Vorläuferzusammensetzungen, die sich unter anderem zur Erzeugung der obengenannten Lactonzusammensetzungen eignen. Solche Hydroxycarbonsäurezusammensetzungen sind gemäß der allgemeinen Struktur:

definiert, worin die gestrichelten Linien gleiche oder verschiedene Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen bedeuten und jede der gestri chelten Linien eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Einfachbindung oder eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung bedeutet.

Die hydroxycarbonsäurehaltigen Zusammensetzungen unserer Erfindung werden durch Fermentation einer oder mehrerer Carbonsäuren hergestellt, die gemäß der allgemeinen Struktur:

definiert sind, worin die gestrichelten Linien gleiche oder verschiedene Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen bedeuten und jede der gestichelten Linien eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Einfachbindung oder eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung bedeutet, unter Verwendung des Mikroorganismus Pseudomofas sp. NRRL B-2994 gemäß der Reaktion:

Die Fermentationsreaktion wird bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 5,5 bis etwa 9,0 durchgeführt, wobei der bevorzugteste pH- Bereich etwa 6,5 bis etwa 8,5 beträgt. Die Reaktion wird bei einer Temperatur von etwa 20ºC bis etwa 35ºC über einen Zeitraum von etwa 48 Stunden bis etwa 150 Stunden durchgeführt. Triglyceride solcher Carbonsäurereaktanten können anstelle der freien Carbonsäuren mit gleichguten Ergebnissen verwendet werden. Somit können zum Beispiel triglyceridhaltige Öle, wie z. B. Sonnenblumenöl (welches einen hohen Prozentsatz Ölsäure enthält), zur Erzeugung von Hydroxysäuren, wie z. B. denjenigen mit den Strukturen:

und/oder

verwendet werden.

Solche Hydroxycarbonsäuren werden gemäß den Reaktionen:

und

erzeugt.

Wie oben angegeben, wird die Reaktion, nämlich:

welche "Z,Z"-Isomere und optisch aktive Verbindungen erzeugen wird, durch Verwendung des Mikroorganismus Pseudomonas sp. NRRL B- 2994 oder eines

produzierenden Mutantenstammes davon durchgeführt. Ebenso kann das Triglycerid der Säure mit der Struktur:

mit einem solchen Mikroorganismus unter den obigen Bedingungen umgesetzt werden, um die Hydroxycarbonsäuren, die gemäß der allgemeinen Struktur:

definiert sind, zu ergeben.

Die Lactonzusammensetzungen mit der allgemeinen Struktur:

werden aus den Hydroxycarbonsäurezusammensetzungen, die gemäß der allgemeinen Struktur:

definiert sind, durch Verwendung eines Mikroorganismus der Candida-Gattung oder der Yarrowia-Gattung erzeugt. Spezielle Beispiele solcher Mikroorganismen sind folgende:

Candida brumptii IFO 0731,

Candida deformans ATCC 22969,

Candida grhanothermophilum ATCC 20380,

Candida iberica ATCC 26318,

Candida kefyr ATCC 42265,

Candida olepohila ATCC 20177,

Candida rugosa ATCC 14830,

Candida sp. ATCC 20473,

Candida sp. ATCC 20504,

Candida utilis ATCC 9226,

Candida utilis ATCC 15239,

Candida utilis ATCC 20248,

Candida utilis ATCC 42181,

Candida zeylanoides ATCC 15585,

Yarrowia lipolytica ATCC 8661,

Yarrowia lipolytica ATCC 8662,

Yarrowia lipolytica ATCC 16617,

Yarrowia lipolytica ATCC 16618,

Yarrowia lipolytica ATCC 20255,

Yarrowia lipolytica ATCC 20324,

Yarrowia lipolytica ATCC 20341,

Yarrowia lipolytica ATCC 46483,

Candida petrophilum ATCC 20226 und

Yarrowia lipolytica ATCC 34088,

gemäß der Reaktion:

worin die gestrichelten Linien gleiche oder verschiedene Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen bedeuten und jede der gestrichelten Linien eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Einfachbindung oder eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung bedeutet. Die Reaktion wird bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 5 bis etwa 7,5 durchgeführt, wobei der bevorzugte pH-Bereich etwa 6,5 bis etwa 7,0 beträgt. Die Reaktion wird bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20ºC bis etwa 35ºC durchgeführt. Die Reaktion wird über einen Zeitraum von etwa 18 Stunden bis etwa 30 Stunden durchgeführt. Die Reaktion wird mit oder ohne einem "Co-Oxidans", das Olivenöl, Kokosnußöl, Palmöl oder irgendein anderes "Co-Oxidans" sein kann, welches dem Durchschnittsfachmann bekannt ist, durchgeführt. Ein bevorzugtes "Co-Oxidans" ist Olivenöl. Jedoch muß die Reaktion nicht mit einem solchen "Co-Oxidans" durchgeführt werden, obwohl die Verwendung des "Co-Oxidans" in hohem Maße vorzuziehen ist.

Beispiele für die allgemein gezeigte Reaktion:

sind folgende:

und

Die obenstehenden Reaktionen können innerhalb derselben Mischung simultan durchgeführt werden, oder sie können einzeln unter Verwendung im wesentlichen reiner Hydroxycarbonsäurereaktanten durchgeführt werden.

Zusätzlich zu den Mikroorganismen, die zur Durchführung der Reaktionen:

verwendet werden, können auch

produzierende Mutantenstämme solcher Organismen verwendet werden, wobei in vielen Fällen höhere Ausbeuten erzielt werden als mit den oben aufgeführten Mikroorganismen.

Die Fermentation wird durch Einstellen des pH-Wertes auf einen Bereich von etwa 2 bis etwa 4 unter Verwendung von Säurezusammensetzungen, wie z. B. 50%iger Schwefelsäure oder Citronensäure, beendet. Die Fermentationsnährlösung wird dann über einen Zeitraum von etwa 10 Minuten bis etwa 60 Minuten auf etwa 100ºC erhitzt. Die Nährlösung wird dann mit einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Ethylacetat, extrahiert und der Rohextrakt anschließend eingedampft und fraktioniert destilliert, um eine Stoffzusammensetzung zu ergeben, die eine wesentliche Menge von wenigstens einem der Lactone enthält, die gemäß der allgemeinen Struktur:

worin die gestrichelten Linien gleiche oder verschiedene Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen bedeuten und jede der gestrichelten Linien eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Einfachbindung oder eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung bedeutet, definiert sind.

Wenn die Lactonzusammensetzungen unserer Erfindung direkt aus den Carbonsäuren erzeugt werden, ist die Reaktionssequenz wie folgt:

wobei die folgenden Reaktionen beispielsweise entweder separat oder in Kombination durchgeführt werden können:

Bevor irgendeine der obenstehenden Rektionen stattfindet, wird eine Kultursuspension durch Beimpfen eines geeigneten Mediums mit dem erwünschten Mikroorganismus hergestellt.

Ein geeignetes Medium ist eines, das Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und Wachstumsfaktoren enthält. Unter den geeigneten Kohlenstoffquellen sind zum Beispiel Glukose, Galaktose, L-Sorbose, Maltose, Saccharose, Cellobiose, Trehalose, L-Arabinose, L-Rhamnose, Ethanol, Glycerin, L-Erythrit, D-Mannit, Lactose, Melibiose, Raffinose, Melecitose, Stärke, D- Xylose, D-Sorbit, alpha-Methyl-D-glucosid, Milchsäure, Citronen säure und Succinsäure. Unter den geeigneten Stickstoffquellen sind zum Beispiel stickstoffhaltige organische Substanzen, wie z. B. Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser und Casein, Harnstoff, Aminosäuren oder stickstoffhaltige anorganische Verbindungen, wie z. B. Nitrate, Nitrite und anorganische Ammoniumsalze. Unter den geeigneten anorganischen Salzen sind zum Beispiel Phosphate, Magnesium, Kalium, Calcium, Natrium. Die obengenannten Nährstoffe in dem Kulturmedium können zum Beispiel mit einem oder mehreren Vitaminen aus der B-Gruppe und/oder einem oder mehreren Spurenmineralien, wie z. B. Fe, Mo, Cu, Mn, B, wie beschrieben ergänzt werden. Jedoch kann das Verfahren in einem vitaminfreien Medium durchgeführt werden; wenn zum Beispiel eine kleine Menge Hefeextrakt zu dem Medium hinzugegeben wird, sind keine Vitamine oder Spurenmineralien notwendig.

Die Kultivierung des Mikroorganismus kann als eine Stationärkultur oder als eine Submerskultur (z. B. Schüttelkultur, Fermentoren) vorzugsweise unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden. Geeigneterweise kann man im pH-Bereich von etwa 3,5 bis etwa 8,0 und vorzugweise im Bereich von etwa 4,0 bis etwa 7,5 arbeiten. Der pH-Wert kann durch Zugabe von anorganischen oder organischen Basen, wie z. B. Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Calciumhydroxid, Calciumcarbonat, durch Ionenaustauscherharze oder durch die Zugabe eines Puffers, wie z. B. eines Phosphats, gesteuert werden. Die Inkubationstemperatur wird geeigneterweise zwischen etwa 15ºC und etwa 33ºC gehalten, wobei ein Bereich von etwa 20ºC bis etwa 30ºC bevorzugt ist.

Bei der Erzeugung der C&sub1;&sub8;-10-Hydroxycarbonsäuren mit der Struktur:

können anstelle der Verwendung der Carbonsäuren mit der Struktur:

als Vorläufer oder als Reaktanten Triglyceride davon verwendet werden, welche die Struktur:

haben, wobei solche Triglyceride mikrobiologisch unter Verwendung von Pseudomonas sp. NRRL B-2994 (wie oben angegeben) und auch unter Verwendung von Lipase gemäß der Reaktion:

umgesetzt werden können.

Somit können zum Beispiel die Triglyceride mit der Struktur:

der Fermentation unter Verwendung von Lipase MY und Pseudomonas sp. NRRL B-2994 (gemäß dem Verfahren des nachstehenden Beispiels IX) gemäß der Reaktion;

unterworfen werden.

Bei den obigen Reaktionen bedeuten die gestrichelten Linien gleiche oder verschiedene Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen, wobei jede der gestrichelten Linien eine Kohlenstoff-Kohlenstoff- Einfachbindung oder eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung bedeutet. Somit sind die Triglyceride, die verwendet werden können, wenn die gestrichelten Linien jeweils Kohlenstoff-Kohlenstoff-Einfachbindungen sind, z. B. Sonnenblumenöl (hoher Ölsäuregehalt). Nach Wunsch können auch andere triglyceridhaltige Öle verwendet werden.

Das/Die Lactonderivat(e) und ein oder mehrere zusätzliche Parfümbestandteile, einschließlich z. B. Kohlenwasserstoffe, Alkohole, Ketone, Aldehyde, Nitrile, Ester, die anders als die Lactonderivate unserer Erfindung sind, Ether, synthetische etherische Öle und natürliche etherische Öle, können beigemischt werden, so daß die Kombination der Gerüche der einzelnen Komponenten einen angenehmen und erwünschten Duft erzeugt, insbesondere und vorzugsweise im fruchtigen Bereich (z. B. Pfirsich- und Aprikosenaromen). Solche Parfümkompositionen enthalten üblicherweise (a) die Hauptnote oder das "Bukett" oder den Grundstein der Komposition, (b) Modifikatoren, welche die Hauptnote abrunden und begleiten, (c) Fixateure, einschließlich Riechstoffe, die dem Parfüm während aller Verdunstungsstufen eine spezielle Note verleihen, und Substanzen, welche die Verdunstung verlangsamen, und (d) Kopfnoten, die üblicherweise niedrigsiedende, frisch riechende Materialien sind.

Bei Parfümkompositionen sind es die einzelnen Zusammensetzungen, welche zu deren speziellen Geruchseigenschaften beitragen; die sensorische Gesamtwirkung der Parfümkomposition wird jedoch wenigstens die Gesamtsumme aus den Wirkungen eines jeden Bestandteils sein. Somit können eines oder mehrere der Lactonderivate unserer Erfindung verwendet werden, um die Aromaeigenschaften einer Parfümkomposition zu ändern, zu modifizieren oder zu verstärken, zum Beispiel durch Ausnutzung oder Milderung der Geruchsreaktion, welche andere Bestandteile der Kompositionen beisteuern.

Die Menge an Lactonderivat(en) unserer Erfindung, die in Parfümkompositionen sowie in parfümierten Gegenständen und Kölnischwassern wirksam sein wird, hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich der anderen Bestandteile, deren Mengen und den erwünschten Wirkungen. Es ist gefunden worden, daß Parfümkompositionen, die so wenig wie 0,005% Lactonderivat(e) oder sogar noch weniger (z. B. 0,002%) enthalten, verwendet werden können, um Seifen, Kosmetika, Waschmitteln, einschließlich festen oder flüssigen anionischen, kationischen, nichtionischen oder zwitterionischen Waschmitteln, parfümierten Polymeren und anderen Produkten süße, fruchtige (Pfirsich und Aprikose) Aromen zu verleihen. Die eingesetzte Menge kann bis zu 70% der Duftkomponenten betragen und wird von den Kostenüberlegungen, der Beschaffenheit des Endproduktes, der erwünschten Wirkung auf das fertiggestellte Produkt und dem erwünschten speziellen Duft abhängig sein.

Das/Die Lactonderivat(e) unserer Erfindung ist/sind (alleine oder zusammen mit anderen Bestandteilen in Parfümkompositionen) in Waschmitteln, Seifen, Raum-Odorierungsmitteln, Desodorantien, Parfüms, Kölnischwassern, Duftwassern, Badepräparaten, Haarpräparaten, wie z. B. Lacken, Brillantinen, Pomaden und Shampoos, Kosmetikpräparaten, wie z. B. Cremes, Desodorantien, Handlotionen und Sonnenschutzmitteln, Pulvern, wie z. B. Talken, Pudern, Gesichtspudern, und dergleichen geeignet.

So wenig wie 0,25% des/der Lactonderivate(s) werden ausreichen, um blumigen Parfümformulierungen ein intensives, süßes, fruchtiges (Pfirsich und Aprikose) Aroma zu verleihen. Im allgemeinen sind bei der Verwendung in den Parfümkompositionen nicht mehr als 5% des/der Lactonderivate(s), bezogen auf das letztliche Endprodukt, erforderlich.

Darüber hinaus werden so wenig wie 0,25% des/der Lactonderivate(s) ausreichen, um parfümierten Gegenständen per se solche Aromen zu verleihen, ganz gleich, ob in Gegenwart von anderen Parfümmaterialien oder bei alleiniger Verwendung. Somit kann der Anwendungsbereich des/der Lactonderivate(s) unserer Erfindung in parfümierten Gegenständen, z. B. parfümierten Polymeren und festen oder flüssigen anionischen, kationischen, nichtionischen oder zwitterionischen Waschmitteln, von 0,25 Gew.-% bis zu etwa 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des parfümierten Gegenstandes, variieren.

Zusätzlich kann die Parfümkomposition oder Duftkomposition unserer Erfindung ein Vehikel oder einen Träger für das/die Lactonderivat(e) enthalten. Das Vehikel kann eine Flüssigkeit sein, wie z. B. ein nichttoxischer Alkohol, z. B. Ethanol, ein nichttoxisches Glycol, z. B. Propylenglycol, oder dergleichen. Der Träger kann auch ein absorbierender Feststoff sein, wie z. B. ein Gummi (z. B. Akaziengummi oder Xanthangummi oder Guar), oder Komponenten zur Einkapselung der Komposition mittels Koazervation (wie z. B. durch Gelatine) oder durch Bildung eines Polymers um einen flüssigen Kern herum (wie durch Verwendung eines Harnstoff- Formaldehyd-Vorpolymers, um eine polymere Kapsel um einen Parfümkompositionskern herum zu bilden).

Aus der vorliegenden Offenbarung wird man erkennen, daß die Lactonderivate gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, um den Geschmack einer breiten Vielfalt von Materialien, die zu sich genommen, verzehrt oder anderweitig organoleptisch aufgenommen werden, zu ändern, variieren, steigern, modifizieren, verstärken oder anderweitig zu verbessern.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Candida brumti IFO 0731 auf 10-Hydroxystearinsäure erzeugten Reaktionsprodukts von Beispiel I(a).

Fig. 2 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Candida deformans ATCC 22969 auf 10-Hydroxystearinsäure erzeugten Reaktionsprodukts von Beispiel I(b).

Fig. 3 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Candida ethanothermophilum ATCC 20380 auf 10-Hydroxystearinsäure erzeugten Reaktionsprodukts von Beispiel I(c).

Fig. 4 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Candida iberica ATCC 26318 auf 10-Hydroxystearinsäure erzeugten Reaktionsprodukts von Beispiel I(d).

Fig. 5 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Candida kefyr ATCC 42265 auf 10-Hydroxystearinsäure erzeugten Reaktionsprodukts von Beispiel I(e).

Fig. 6 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Candida oleophila ATCC 20177 auf 10-Hydroxystearinsäure erzeugten Reaktionsprodukts von Beispiel I(f).

Fig. 7 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Candida rugosa ATCC 14830 auf 10-Hydroxystearinsäure erzeugten Reaktionsprodukts von Beispiel I(g).

Fig. 8 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Candida sp. ATCC 20473 auf 10-Hydroxystearinsäure erzeugten Reaktionsprodukts von Beispiel I(h).

Fig. 9 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Candida sp. ATCC 20504 auf 10-Hydroxystearinsäure erzeugten Reaktionsprodukts von Beispiel I(i).

Fig. 10 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Candida utilis ATCC 9226 auf 10-Hydroxystearinsäure erzeugten Reaktionsprodukts von Beispiel I(j).

Fig. 11 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Candida utilis ATCC 15239 auf 10-Hydroxystearinsäure erzeugten Reaktionsprodukts von Beispiel I(k).

Fig. 12 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Candida utilis ATCC 20248 auf 10-Hydroxystearinsäure erzeugten Reaktionsprodukts von Beispiel I(l).

Fig. 13 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Candida utilis ATCC 42181 auf 10-Hydroxystearinsäure erzeugten Reaktionsprodukts von Beispiel I(m).

Fig. 14 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Candida zeylanoides ATCC 15585 auf 10-Hydroxystearinsäure erzeugten Reaktionsprodukts von Beispiel I(n).

Fig. 15 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Yarrowia lipolytica ATCC 8661 auf 10-Hydroxystearinsäure erzeugten Reaktionsprodukts von Beispiel I(o).

Fig. 16 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Yarrowia lipolytica ATCC 8662 auf 10-Hydroxystearinsäure erzeugten Reaktionsprodukts von Beispiel I(p).

Fig. 17 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Yarrowia lipolytica ATCC 16617 auf 10-Hydroxystearinsäure erzeugten Reaktionsprodukts von Beispiel I(q).

Fig. 18 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Yarrowia lipolytica ATCC 16618 auf 10-Hydroxystearinsäure erzeugten Reaktionsprodukts von Beispiel I(r).

Fig. 19 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Yarrowia lipolytica ATCC 20255 auf 10-Hydroxystearinsäure erzeugten Reaktionsprodukts von Beispiel I(s).

Fig. 20 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Yarrowia lipolytica ATCC 20324 auf 10-Hydroxystearinsäure erzeugten Reaktionsprodukts von Beispiel I(t).

Fig. 21 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Yarrowia lipolytica ATCC 20341 auf 10-Hydroxystearinsäure erzeugten Reaktionsprodukts von Beispiel I(u).

Fig. 22 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Yarrowia lipolytica ATCC 46483 auf 10-Hydroxystearinsäure erzeugten Reaktionsprodukts von Beispiel I(v).

Fig. 23 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Yarrowia lipolytica ATCC 34088 auf 10-Hydroxystearinsäure erzeugten Reaktionsprodukts von Beispiel II, Schritt 2, welches die Verbindung mit der Struktur:

enthält (vereinte Destillationsfraktionen 3 und 4)

Fig. 24 ist das GC-Massenspektrum von gemäß dem Beispiel II, Schritt 2, erzeugtem gamma-Dodecalacton mit der Struktur:

Fig. 24A ist eine Vergrößerung des Bereichs der Peaks 127- 181 des GC-Massenspektrums von Fig. 24 für die Verbindung mit der Struktur:

Fig. 25 ist das GLC-Profil des Reaktionsprodukts von Beispiel III, Schritt 2, welches die Verbindung mit der Struktur:

enthält.

Fig. 26 ist das GLC-Profil des Reaktionsprodukts von Beispiel IV, Schritt 2, welches die Verbindung mit der Struktur:

enthält.

Fig. 27 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Candida petrophilum ATCC 20226 auf 10-Hydroxystearinsäure erzeugten Reaktionsprodukts von Beispiel V, Schritt 2, welches die Verbindung mit der Struktur:

enthält.

Fig. 28 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Yarrowia lipolytica ATCC 34088 auf 10-Hydroxyoctadec-12-ensäure erzeugten Reaktionsrohprodukts von Beispiel VI, welches die Verbindungen mit den Strukturen:

und

enthält.

Fig. 29 ist die GLC-Quarzglaskapillaruntersuchung des Reaktionsprodukts von Beispiel VI, das die Mischung aus Verbindungen mit den Strukturen:

und

enthält.

Fig. 30 ist das GLC-Profil des Reaktionsprodukts von Beispiel VIII, das Reaktionsprodukt des Rohextrakts von Schritt 2 von Beispiel II mit BF&sub3;/Methanol (wobei Methylester gebildet werden), welches unter anderem die Verbindung mit der Struktur:

enthält.

Fig. 31 ist das GLC-Profil des durch die Einwirkung von Yarrowia lipolytica ATCC 34088 auf die Mischung der Verbindungen mit den Strukturen:

und

erzeugten Reaktionsprodukts von Beispiel VII, Schritt 2, welches die Verbindungen mit den Strukturen:

und

enthält.(GLC-Säule programmiert auf 200-225ºC bei 10ºC pro Minute)

Fig. 32 ist das GC-Spektrum des Reaktionsprodukts von Beispiel VII, welches die Verbindungen mit den Strukturen:

und

enthält.

Fig. 33 ist das GC-Massenspektrum der gemäß dem Beispiel VII hergestellten Verbindung mit der Struktur:

(gamma-Dodecalacton).

Fig. 33A ist eine Vergrößerung des Bereichs von Fig. 33 mit den Peaks 123 bis 192.

Fig. 34 ist das GC-Massenspektrum der gemäß dem Beispiel VII hergestellten Verbindung mit der Struktur:

((Z)-6-Dodecen-4-olid).

Fig. 34A ist eine Vergrößerung des Teils des Massenspektrums von Fig. 34, der die Peaks 123-192 enthält.

Fig. 35 ist das GC-Massenspektrum der gemäß dem Beispiel VII hergestellten Verbindung mit der Struktur:

((Z,Z)-6,9-Dodecadien-4-olid).

Fig. 35A ist eine Vergrößerung des Teils des GC- Massenspektrums von Fig. 35 mit den Peaks 105-194.

Fig. 36 ist das GLC-Profil des Destillationsprodukts des Reaktionsprodukts von Beispiel VII, welches die Verbindungen mit den Strukturen:

und

enthält.

Fig. 37 ist das GLC-Profil der Destillationsfraktion 3 des Reaktionsprodukts von Beispiel VII.

Fig. 38 ist das GLC-Profil des Reaktionsprodukts von Beispiel VII, Schritt 2, welches die Verbindungen mit den Strukturen:

und

enthält (Bedingungen: 10' · 0,125"-Carbowax-Säule, betrieben bei 225ºC, isotherm).

Fig. 39 ist das Infrarotspektrum der Verbindung des durch die Bezugszahl 381 angezeigten Peaks von Fig. 38 für die Verbindung mit der Struktur:

Fig. 40 ist das NMR-Spektrum für den durch Bezugszahl 381 angezeigten Peak von Fig. 38 für die Verbindung mit der Struktur:

Fig. 41 ist das Infrarotspektrum für den durch Bezugszahl 382 angezeigten Peak von Fig. 38 für die Verbindung mit der Struktur:

Fig. 42 ist das NMR-Spektrum für den durch Bezugszahl 382 angezeigten Peak von Fig. 38 für die Verbindung mit der Struktur:

Fig. 43 ist das Infrarotspektrum für den durch Bezugszahl 383 angezeigten Peak von Fig. 38 für die Verbindung mit der Struktur:

Fig. 44 ist das NMR-Spektrum für den durch Bezugszahl 383 angezeigten Peak von Fig. 38 für die Verbindung mit der Struktur:

Fig. 45 ist das GLC-Profil des Reaktionsprodukts von Beispiel IX, welches die Verbindung mit der Struktur:

enthält.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist das GLC-Profil des Reaktionsprodukts von Beispiel I(a). Der durch Bezugszahl 100 angezeigte Peak ist der Peak für die Verbindung mit der Struktur:

Fig. 28 ist das GLC-Profil des Reaktionsrohprodukts von Beispiel VI. Der durch Bezugszahl 280 angezeigte Peak ist der Peak für die Verbindung mit der Struktur:

Der durch Bezugszahl 282 angezeigte Peak ist der Peak für die Verbindung mit der Struktur:

Fig. 30 ist das GLC-Profil des Reaktionsprodukts von Beispiel VIII. Die Peaks des GLC-Profils sind zu vier Gruppen zusammengefaßt, Gruppe "A", Gruppe "B", Gruppe "C" und Gruppe "D".

Die Peaks der Gruppe "A" umfassen die Verbindungen:

Methanol,

Chloroform,

Methylisobutyrat,

2-Methyl-2-propenoat,

Methylbutyrat,

Methylcrotonat,

Methylisovalerat,

Methyl-2-methylbutyrat,

Hexanol,

Methylvalerat,

Methylsenecioat,

Methyltiglat,

Methyl-4-methylvalerat,

Methylhexanoat,

Methyl-3-hexenoat,

Methyl-4-methyl-4-pentenoat,

3-Methyl-2-oxovaleriansäuremethylester,

Methyl-2-furoat,

Methyl-2,4-dimethylpentanoat,

4-Methyl-2-oxovaleriansäuremethylester,

Methylheptanoat,

Dimethylfumarat,

Dimethylsuccinat,

Methyl-4-methylenhexanoat,

Phenylacetaldehyd,

Methylcyclohexancarboxylat,

Dimethylester von Methylmaleinsäure,

Methyl-3-octenoat,

Methylbenzoat,

Nonanal,

Phenylethylalkohol,

Methyl-3-octenoat,

Methyloctanoat,

Methyl-2,2-dimethoxy-3-methylpentanoat,

Methylphenylacetat,

n-Decanal,

1,1-Dimethoxy-2-phenylethan,

Methylnonanoat,

Benzylaceton,

gamma-Octalacton und

Methyldecanoat.

Die Peakgruppe, welche die durch die Bezugszahlen 310 und 311 angezeigten Peaks, die in Gruppe "B" enthalten sind, umfaßt, umfaßt die Verbindungen:

gamma-Nonalacton,

Methyl-4-oxononanoat,

Methylundecanoat,

gamma-Decalacton,

Methyl-4-oxodecanoat,

Methyl-3-dodecenoat,

Ionol,

gamma-Undecalacton,

Methyl-3,6-dodecadienoat,

die Verbindung mit der Struktur:

Methyl-4-oxododecanoat,

gamma-Dodecalacton mit der Struktur:

(angezeigt durch den Peak mit der Bezugszahl 311) und Methylmyristat.

Die Peakgruppe, welche durch Gruppe "C" dargestellt ist und die durch die Bezugszahlen 312 und 313 angezeigten Peaks enthält, umfaßt folgende Verbindungen:

Methylpalmitat,

Methyl-9-hexadecenoat und

Methylheptadecanoat.

Die Peakgruppe, welche durch Gruppe "D" dargestellt ist und den durch Bezugszahl 314 angezeigten Peak enthält, umfaßt die folgenden Verbindungen:

Methyl-10,13-octadecadienoat,

Methyl-9-octadecenoat und

Methylstearat.

Fig. 32 ist das GC-Spektrum des Reaktionsprodukts von Beispiel VII. Der durch Bezugszahl 20 angezeigte Peak ist der Peak für die Verbindung mit der Struktur:

Der durch Bezugszahl 321 angezeigte Peak ist der Peak für die Verbindung mit der Struktur:

Der durch Bezugszahl 322 angezeigte Peak ist der Peak für die Verbindung mit der Struktur:

Fig. 36 ist das GLC-Profil des Reaktionsprodukts von Beispiel VII (Destillationsprodukt). Der durch Bezugszahl 360 angezeigte Peak ist der Peak für die Verbindung mit der Struktur:

Der durch Bezugszahl 361 angezeigte Peak ist der Peak für die Verbindung mit der Struktur:

Der durch Bezugszahl 362 angezeigte Peak ist der Peak für die Verbindung mit der Struktur:

Fig. 38 ist das GLC-Profil des Reaktionsprodukts von Beispiel VII (Bedingungen: 10' · 0,125"-Carbowax-Säule, auf 225ºC programmiert). Der durch Bezugszahl 381 angezeigte Peak ist der Peak für die Verbindung mit der Struktur:

Der durch Bezugszahl 382 angezeigte Peak ist der Peak für die Verbindung mit der Struktur:

Der durch die Bezugzahl 383 angezeigte Peak ist der Peak für die Verbindung mit der Struktur:

BEISPIEL I GAMMA-DODECALACTON-SCREENINGVERFAHREN

Das folgende Inokulummedium wurde unter den folgenden Bedingungen hergestellt:

Das folgende Screeningmedium wurde unter Verwendung folgender Bedingungen hergestellt:

Verfahren:

500-ml-Kolben, die 100 ml des wie oben hergestellten Screeningmediums enthielten, wurden bei 121ºC 20 Minuten lang sterilisiert. Jeder Kolben wurde beimpft, wobei 5% der 24 Stunden lang gewachsenen Kultur eines jeden, wie in der nachstehenden Tabelle I aufgeführten Organismus verwendet wurden. Jeder Kolben wurde in einem Schüttler (150 U/min) bei 25ºC 48 Stunden lang inkubiert.

Abbruch:

Am Ende der Fermentation wird die Fermentation durch Einstellen des pH-Werts auf 2 mit 50%iger H&sub2;SO&sub4; beendet. Die Kolben werden dann 10 Minuten lang auf 100ºC erhitzt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Nährlösung wird dreimal mit gleichem Volumen Ethylacetat extrahiert. Die vereinten Extrakte werden zweimal mit gesättigtem NaCl gewaschen. Das Lösungsmittel wird unter Vakuum eingedampft. Das Öl wird mit BF&sub3;-Methanol behandelt und durch GC analysiert.

Ergebnisse:

Die Ergebnisse dieser Screens sind in der folgenden Tabelle I zusammengefaßt:

Die GLC-Profile der dem jeweiligen Beispiel entsprechenden Reaktionsprodukte sind wie folgt:

BEISPIEL II ERZEUGUNG VON 10-HYDROXYSTEARINSÄURE UND NATÜRLICHEM GAMMA- DODECALACTON SCHRITT 1: ERZEUGUNG VON 10-HYDROXYSTEARINSÄURE AUS ÖLSÄURE
Reaktion:

Das folgende Inokulummedium wird erzeugt:

Inokulummedium:

Difco-Hefeextrakt 0,5%

KH&sub2;PO&sub4; 0,4%

MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,05%

TWEEN® 80 0,02%

pH = 7,0, eingestellt vor der Sterilisation mit 50%igem wäßrigem KOH.

Fernbach-Kolben mit 500 ml Medium werden 30 Minuten lang bei 121ºC sterilisiert. Nach der Sterilisation werden 0,5 ml sterile 50%ige Dextrose pro 100 ml Medium zugegeben. Die Kolben werden aus einem Schrägröhrchen mit Pseudomonas sp. NRRL B-2994 angeimpft und bei 25ºC, 100 U/min. 24 Stunden lang inkubiert, um eine "Inokulumkultur" zu bilden.

Produktionsmedium:

Das folgende Produktionsmedium wird hergestellt:

TASTONE® 900 (Extrakt aus primärgewachsener Hefe, hergestellt von Universal Foods Inc.,433 East Michigan Street, Milwaukee, Wisconsin 53202 (Marke von Universal Foods Inc.)) 0,5%

KH&sub2;PO&sub4; 0,4%

MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,05%

TWEEN® 80 0,02%

Ölsäure 0,1

pH = 6,5, aufrechterhalten während der Fermentation mit 25%igem NaOH.

8 Liter Medium werden in 14-Liter-Fermentoren bei 121ºC 30 Minuten lang sterilisiert. Nach der Sterilisation werden 5 ml sterile 50%ige Dextrose pro Liter Medium zugegeben.

Parameter:

Inokulum: 500 ml Inokulumkultur (werden zu jeweils 8 Liter Produktionsmediumcharge zugegeben)

Temperatur: 26ºC

Belüftung: 0,1 V/V/M

Rührgeschwindigkeit: 420 U/min

Verfahren:

Nach 24stündigem Wachstum wird die Belüftung gestoppt, die Rührgeschwindigkeit auf 900 U/min erhöht und mit dem Einspritzen der Ölsäure wie in nachstehender Tabelle II gezeigt begonnen. TABELLE 2. ERZEUGUNG VON 10-HYDROXYSTEARINSÄURE AUS ÖLSÄURE

Schritt 2: Umwandlung von 10-Hydroxystearinsäure in gamma- Dodecalacton
Reaktion:

Das folgende Inokulummedium wurde hergestellt:

Inokulummedium:

Fleischextrakt 2,0%

KH&sub2;PO&sub4; 0,01%

MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,005%

TWEEN® 80 0,02%

Olivenöl 1,0%

pH = 7

100 ml Medium wurden in 500-ml-Kolben 20 Minuten lang bei 121ºC sterilisiert. Die Kolben wurden aus einem Schräg röhrchen mit Yarrowia lipolytica ATCC 34088 angeimpft und bei 25ºC, 150 U/min. 24 Stunden lang inkubiert.

2% TASTONE® 900 wurden zu dem Fermentor von Schritt 1, der die zuvor erzeugte 10-Hydroxystearinsäure enthielt und 20 Minuten lang bei 121ºC sterilisiert worden war, zugegeben. Der Fermentor wurde anschließend auf 28ºC abgekühlt und mit 200 ml Inokulum beimpft. Nach 20stündiger Inkubation wurden 30 g Olivenöl zu dem Fermentor hinzugegeben.

Fermentorparameter:

Inokulum: 200 ml Inokulumkultur

Temperatur: 28ºC

Belüftung: 0,5 V/V/M

Rührgeschwindigkeit: 620 U/min

pH: 7, mit 25%igem NaOH aufrechterhalten

Staudruck: 7,5 psi

Antischaummittel: Mazu DF 100, automatisch nach Bedarf zugegeben.

Ergebnisse von Schritt 2:

Die Nährlösungsproben wurden wie in Schritt 1 analysiert. Die Ergebnisse von Schritt 2 sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengefaßt:

TABELLE 3. UMWANDLUNG VON 10-HYDROXYSTEARINSÄURE IN GAMMA- DODECALACTON.

Produktgewinnung:

Am Ende der Fermentation wurde der pH-Wert mit Citronensäure auf 4 eingestellt und die Nährlösung anschließend 30 Minuten lang auf 100ºC erhitzt. Die gesamte Nährlösung (6,5 Liter) wurde 3mal mit 1/3 Volumen Ethylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden vereint und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rohextrakt (110 Gramm) wurde fraktioniert destilliert, was zu 12,7 Gramm Produkt mit einer Reinheit von 90,2% führte. Die Destillationsdaten sind wie folgt:

Die Fraktionen 3 und 4 wurden für die nachfolgende Bewertung ihrer organoleptischen Qualitäten vereint.

BEISPIEL III ERZEUGUNG VON NATÜRLICHEM GAMMA-DODECALACTON
Reaktion:

Ein Versuchsverfahren, das identisch mit dem des obigen Beispiels II war, wurde durchgeführt, mit der Ausnahme, daß vor der Sterilisation in Schritt 23% Olivenöl zu dem Fermentor zugegeben wurden und kein zusätzliches Olivenöl hinzugegeben wurde.

Die Ergebnisse der Schritte 1 und 2 sind in den folgenden Tabellen 4 und 5 zusammengefaßt.

TABELLE 4. ERZEUGUNG VON 10-HYDROXYSTEARINSÄURE AUS ÖLSÄURE
TABELLE 5. UMWANDLUNG VON 10-HYDROXYSTEARINSÄURE IN GAMMA- DODECALACTON.

Produktgewinnung:

Insgesamt 5,7 Liter Nährlösung ergaben 173 Gramm rohes gamma-Dodecalacton. Die fraktionierte Destillation des Rohprodukts führte zu 29,4 Gramm Produkt mit einer Reinheit von 97,9%.


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