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Dokumentenidentifikation DE69322872T2 27.05.1999
EP-Veröffentlichungsnummer 0661999
Titel VAKZINE GEGEN IMMUNODEFIZIENZ-VIRUS DER KATZE (KIV)
Anmelder Mallinckrodt Veterinary, Inc., Mundelein, Ill., US
Erfinder FRANCIS, Michael, James Pitman-Moore Ltd., Uxbridge Middlesex UB9 6LS, GB
Vertreter HOFFMANN · EITLE, 81925 München
DE-Aktenzeichen 69322872
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 20.09.1993
EP-Aktenzeichen 939209714
WO-Anmeldetag 20.09.1993
PCT-Aktenzeichen GB9301974
WO-Veröffentlichungsnummer 9406471
WO-Veröffentlichungsdatum 31.03.1994
EP-Offenlegungsdatum 12.07.1995
EP date of grant 30.12.1998
Veröffentlichungstag im Patentblatt 27.05.1999
IPC-Hauptklasse A61K 39/21
IPC-Nebenklasse C07K 7/02   G01N 33/569   C12N 15/49   

Beschreibung[de]

Diese Erfindung betrifft synthetische Peptide des Katzen-Immunodefizienz-Virus (KIV), deren Herstellung und Verwendung als Vakzine und diagnostische Reagenzien.

KIV ist ein vor kurzem entdeckter T-lymphotrophischer Lentivirus, der Katzen infiziert, um ein AIDS-ähnliches Syndrom hervorzurufen. Während KIV morphologische und pathologische Ähnlichkeit zum menschlichen Immunodefizienz-Virus (HIV) aufweist, ist jedoch gezeigt worden, daß KIV unterschiedliche antigene Eigenschaften besitzt (Pederson et al., Science 235: 790-793, 1987). Infizierte Katzen und Kätzchen zeigen eine im allgemeinen eine schwache AIDS-ähnliche Krankheit mit unterbrochenen Symptomen (z. B. Lymphadenopathie, Leukopenie und Anämie), die durch eine starke Beeinträchtigung der Immunfunktion als Folge des Verlusts von CD4&spplus; T-Zellen gekennzeichnet ist, und zur Anfälligkeit für sekundäre opportunistische Infektion und schließlich zum Tod führt.

Epidemologische Untersuchungen haben gezeigt, daß die KIV-Infektion weltweit verbreitet ist, und der Krankheit vom veterinären Standpunkt eine wichtige klinische Bedeutung verleiht. Folglich haben vor kurzem Bemühungen begonnen, die auf die Entwicklung von Vakzinen gegen KIV gerichtet sind, aber während Vorergebnisse mit Vakzinen, die auf ganzen infizierten Zellen oder ganzen Viren basieren, sich zwar als vielversprechend erwiesen haben (Yamamoto et al., AIDS research and human retroviruses 7: 911-922, 1991), ist in der Literatur über die erfolgreiche Immunisierung von Katzen gegen die KIV-Infektion unter Verwendung einer Untereinheit oder auf Peptid basierenden Vakzinen nicht berichtet worden. Bisher sind keine kommerziellen Vakzine erhältlich.

Trotz seiner Allgegenwart scheint der KIV nicht von Katzen auf Menschen übertragbar zu sein. Nichtsdestoweniger scheint KIV mit HIV und anderen Säugerlentiviren in der Genomorganisation, den biologischen Eigenschaften, der Neigung zur Dauerinfektion in dem natürlichen Wirt mit seiner begleitenden pathologischen Manifestation (z. B. Abnahme der CD&sup4;&spplus;- Lymphozyten sowohl in vivo als auch in vitro, allmählicher Verlust der Immunwirkung und opportunistische Infektion) ähnlich zu sein. Folglich kann die Entwicklung von Versuchsmodellen für nicht-menschliche Lentivirus-Infektionen, wie KIV, den Entwurf einer Vakzine und therapeutischer Strategien gegen die HIV-Infektion beim Menschen erleichtern.

Die Molekularstruktur von KIV ist bezüglich der Genomorganisation und Nucleotidsequenz untersucht worden (Talbot et al., PNAS 86: 5743- 5747, 1989; Olmstead et al., PNAS 86: 8088-8092, 1989), aber bis jetzt ist der Fortschritt hinsichtlich der Identifizierung von Bereichen mit besonderer immunogener Bedeutung langsam gewesen, und die meisten Vorschläge für Vakzine, die derzeit untersucht werden, umfassen ganzen, nicht zerstörten Virus.

Daher besteht weiterhin die Notwendigkeit, eine wirksame Versuchsvakzine gegen KIV, insbesondere einer Untereinheit oder einer auf Peptidbasierenden Vakzine, sowohl zur Bekämpfung der KIV-Infektion in Katzen und Kätzchen als auch zur Erstellung eines nützlichen Tiermodells für die HIV-Infektion beim Menschen, in dem Versuchsvakzine untersucht werden können, zu entwickeln. Diese Erfindung ist auf die Bereitstellung einer solchen Vakzine gerichtet.

Eine Reihe von Methoden zur Entwicklung von Virus-Vakzinen sind verfügbar. Eine oben erwähnte Methode ist ganzen, nicht-zerstörten Virus entweder in der inaktivierten oder lebenden attenuierten Form zu verwenden. Obgleich im allgemeinen wirksam und im Fall von KIV zunächst vielversprechend, ist eine solche Methode nicht immer problemlos, da gelegentlich der Virus nicht vollständig inaktiviert oder nicht ausreichend attenuiert sein kann und möglicherweise den immunisierten Wirt infiziert, anstelle ihn zu schützen. Im Fall einer so schwerwiegenden Infektion wie KIV ist dies ein nicht leicht zu nehmendes Risiko und eine synthetische Vakzine, die alle Aspekte der Virushandhabung bei der Herstellung und Impfung beseitigen würde, würde eine attraktivere Alternative darstellen. Mit diesem Ziel vor Augen bemühte man sich während des letzten Jahrzehnts, Vakzine zu entwickeln, die auf synthetischen Peptiden basieren, enthaltend antigene Stellen, die bei der Entwicklung von schützender Immunität wichtig sind (Francis, Sci. Progress 74: 115-130, 1990). Solche Peptide können zusammenhängende oder nicht-zusammenhängende Epitope nachahmen (ein nicht zusammenhängendes Epitop ist eines, das Aminosäurereste von verschiedenen Proteinen oder verschiedenen Bereichen desselben Proteins umfassen). Der erste Hinweis, daß Peptide protektive Immunität in vivo zusätzlich zu der neutralisierenden Aktivität in vitro herbeiführen können, wurde 1982 unter Verwendung eines Peptids des VP1-Hüllproteins von Fuß-und Maulkrankheit-Virus (FDMV) in einem Meerschweinchen- Tiermodell erhalten. Dies wurde anschließend durch das Aufzeigen der protektiven Immunität in Kühen und Schweinen gestützt. Obwohl bisher kein kommerzielles Produkt den Markt erreicht hat, sind Peptide verwendet worden, um eine Immunantwort gegen eine große Anzahl von Viren, einschließlich des Hepatitis B Virus, Grippevirus, Herpes simplex, menschlicher Rotavirus, Rinder-Rotavirus, Rinder-Enterovirus und vieler anderer hervorzurufen.

Auf der Suche nach einer auf einem Peptid basierenden Vakzine gegen KIV richteten wir unsere Bemühungen auf das KIV-Hüllprotein, von dem wir annehmen, daß es bei der Virusinfektiosität wichtig ist und ein Hauptziel sowohl für zytotoxische T-Zellen als auch neutralisierende Antikörper in der Wirt-Immunantwort auf die KIV-Infektion darstellt.

In einer anhängigen internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/EP93/01860 (WO-A-9402612), die am 15. Juli 1993 eingereicht wurde, haben wir eine KIV-Vakzine vorgeschlagen, die auf synthetischen Peptiden des Bereiches, der von den Resten 483 bis 567 des KIV Hüllproteins reicht, basiert.

WO92/09632 beschreibt Peptidfragmente des env KIV-Proteins, die im Serum von Antikörpern der KIV-infizierten Tiere erkannt werden und die, wenn sie bei der Immunisierung verwendet werden, Antikörper entwickeln, die immunogene Peptide, das KIV-Endprotein und KIV, erkennen.

Wir schlagen jetzt erfindungsgemäß eine weitere Reihe von KIV-Hüllproteinpeptiden als geeignete Kandidaten für KIV-Vakzine oder diagnostische Mittel vor.

In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird somit ein synthetisches Polypeptid bereitgestellt, das eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus:

oder ein antigenes Fragment, eine funktionell-äquivalente Variante, in der die immunogene Aktivität erhalten bleibt oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, umfaßt.

In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform werden solche synthetischen Polypeptide und Antigenfragmente, funktionell-äquivalente Varianten und deren pharmazeutisch annehmbare Salze zur Verwendung bei der Bekämpfung der KIV-Infektion in Tieren, z. B. zur Stimulierung einer Immunantwort gegen KIV, bereitgestellt.

Alternativ betrachtet wird erfindungsgemäß außerdem die Verwendung solcher erfindungsgemäßer synthetischer Polypeptide und antigener Fragmente, funktionell-äquivalenter Varianten und deren pharmazeutisch annehmbaren Salze bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Bekämpfung der KIV-Infektion in Tieren, bevorzugt zur Stimulierung einer Immunantwort gegen KIV, bereitgestellt.

Der Ausdruck "Polypeptid", wie er hier verwendet wird, definiert sowohl langkettige Polypeptide als auch kürzere Peptidsequenzen.

Wie oben erwähnt, sind erfindungsgemäß funktionell-äquivalente Varianten und Fragmente von erfindungsgemäßen synthetischen KIV-Polypeptiden umfaßt. "Funktionell-äquivalent", wie hier in Bezug auf die Polypeptid- Aminosäuresequenzen verwendet, definiert Polypeptide, die von den obigen natürlichen KIV-Hüllprotein Polypeptidsequenzen abstammen oder mit ihnen verwandt sind, worin die Aminosäuresequenz durch einzelne oder mehrere Aminosäuresubsitution, -addition oder -deletion modifiziert ist und außerdem Sequenzen, bei denen die Aminosäuren chemisch modifiziert worden sind, einschließlich durch Glykolysierung oder Deglycolisierung, aber die nichtsdestoweniger immunogene oder andere KIV-bekämpfende Aktivität beibehalten, z. B. können sie eine wirtsprotektive Immunantwort, zum Beispiel durch Entwickeln von neutralisierenden Antikörpern, und/oder funktionelle Immunität in dem Wirt liefern. Solche funktionell-äquivalenten Varianten können als natürliche biologische Varianten auftreten oder können unter Verwendung von bekannten Techniken hergestellt werden, zum Beispiel können funktionell-äquivalente rekombinante Polypeptide unter Verwendung von bekannten Techniken, wie seitengerichtete Mutagenese, zufällige Mutagenese oder enzymatischer Spaltung und/oder durch Ligasierung von Aminosäuren hergestellt werden.

Folglich wurden zum Beispiel die oben erwähnten Aminosäuresequenzen hauptsächlich aus einer Kombination von Sequenzen der KIV UK 8 und Petaluma Isolate bestimmt. Fig. 1 zeigt eine Zusammensetzung der Aminosäuresequenzen von Hüllproteinen von den KIV UK 8 und Petaluma Isolaten, von denen die erfindungsgemäßen synthetischen Peptide abstammen. Abweichungen in der Sequenz können jedoch zwischen verschiedenen Stämmen oder Serotypen, Isolaten verschiedener geographischer Herkunft oder sogar zwischen verschiedenen Isolaten desselben Wirts auftreten. Verschiedene KIV-Isolate und deren Sequenzunterschiede sind zum Beispiel von Rigby et al., in Journal of General Virology 74, 425-436, 1993 beschrieben worden. Ein Vergleich und die Anordnung der vorhergesagten Aminosäuresequenzen des Hüllproteins von verschiedenen beispielhaften KIV-Isolaten ist in Fig. 2 dargestellt. Das Sternchen (*) steht für einen konservierten Cysteinrest. NG steht für konservierte potentielle N-gebundene Glycolysierung, L> < SU für mutmaßliche Spaltung des hydrophoben Leaders, SU> < TM für eine mutmaßliche Spaltstelle zwischen dem Oberflächen-Glycoprotein und dem Transmembranprotein. Solche Varianten sind im Umfang der Erfindung eingeschlossen.

Wie oben erwähnt, kann die Modifikation der Aminosäuresequenzen zum Erhalt von funktionell-äquivalenten Sequenzvarianten durch Aminosäuresubstitution erfolgen, solange die Immunogenität des Polypeptids nicht beeinträchtigt wird. Folglich kann zum Beispiel eine Aminosäuresequenz durch eine andere, die den physiochemischen Charakter des Polypeptids oder seines Epitops/seiner Epitope bewahrt, ausgetauscht werden, zum Beispiel hinsichtlich der Ladungsdichte, Hydrophilizität, Hydrophobizität, Größe und Konfiguration, und die immunologische Struktur wird somit beibehalten. Zum Beispiel kann A durch G oder umgekehrt, V durch A, L oder G, K durch R, S durch T oder umgekehrt, E durch D oder umgekehrt und Q durch N oder umgekehrt ausgetauscht werden.

Im allgemeinen hat die substituierende Aminosäure ähnliche Eigenschaften, z. B. Hydrophobizität, Hydrophilizität, Elektronegativität, sperrige Seitenketten u. s. w. in Bezug auf die auszutauschende Aminosäure. "Additions"-Varianten umfassen Amino- und/oder Carboxyl-terminale Fusionen, zum Beispiel durch Zugabe von Aminosäuresequenzen von bis zu 300 Resten, zum Beispiel bis zu 200 oder 100, sowie Intrasequenz-Insertionen von einzelnen oder mehreren Aminosäuren. Hinzugefügte Aminosäuresequenzen können solche sein, die sich in den entsprechenden Positionen des KIV Hüllproteins befinden, oder andere Aminosäuren, zum Beispiel der gesamten oder einem Teil von anderen Polypeptiden oder Proteinen. Längere Peptide können mehrfache Kopien einer oder mehrerer Polypeptidsequenzen umfassen. Alternativ können Mehrfachkopien der Polypeptide (z. B. 5 bis 20, bevorzugt 8 bis 15) an das Aminosäuregrundgerüst, z. B. ein Polyleucingrundgerüst, zur Bildung von sogenannten mehrfachen Antigenpeptiden (MAPs) gebunden werden, wie zum Beispiel von Tam in PNAS 85: 5400- 5413, 1988, beschrieben.

Insertionale Aminosäuresequenzvarianten sind solche, in denen ein oder mehrere Aminosäurereste in eine vorbestimmte Stelle in dem Protein eingeführt werden, obgleich wahllose Insertion mit geeignetem Screenen des resultierenden Produktes außerdem möglich ist. Deletionale Varianten sind durch die Entfernung einer oder mehrere Aminosäuren von der Sequenz gekennzeichnet. Bevorzugt werden Deletionen oder Insertionen bei benachbarten Paaren, zum Beispiel eine Deletion von zwei Resten oder Insertion von zwei Molekülen, hergestellt. In allen Fällen ist die Voraussetzung, daß durch die Modifikation die Immunogenizität des Polypeptids bewahrt wird.

Beispiele von funktionell-äquivalenten Variantpolypeptiden können folglich solche umfassen, die mindestens eine Aminosäurehomologie von 50%, bevorzugt von mindestens 60 oder 70% oder am meisten bevorzugt von mehr als 80% aufweisen. Es ist dabei zu bemerken, daß die funktionelläquivalenten Varianten eine Gesamtsequenzhomologie unter den genannten Prozentangaben entfalten können, wobei solche immer noch unter den Umfang dieser Erfindung fallen, die konservierte Homologiebereiche haben.

In bestimmten Fällen, in denen sie nicht natürlich vorkommen, kann es nützlich sein, ein oder mehrere Cysteinreste am Ende des Polypeptids einzuschließen, zum Beispiel, um eine bestimmte Trägerbindung zu ermöglichen oder eine Disulfidbindung zu erlauben - dies kann wünschenswert sein, damit das Polypeptid die antigenen Schleifen, wie solche, die auf der Oberfläche von Proteinen auftreten, nachahmen und dadurch seine Immunogenität erhöht werden kann. Es ist dabei zu bemerken, daß die obengenannten Polypeptide 1 bis 6 und 8 N- und C-terminale Cysteinreste haben. Eine Fettsäure oder ein hydrophober Schwanz kann außerdem zu den Peptiden hinzugefügt werden, um die Immunogenität zu erhöhen und die Einführung eines Zufuhrvehikels, wie Liposomen, Novosomen und ISCOMS (Reid, Vaccine 10: 597-601, 1992) zu erleichtern.

Die Aminosäurereste der erfindungsgemäßen synthetischen Polypeptide können chemisch modifiziert sein, insbesondere an den Enden des Moleküls, und können zum Beispiel die Form von Aminoestern oder Amiden annehmen. Folglich können zum Beispiel N- oder C-terminale Reste, z. B. N- oder Cterminale, insbesondere C-terminale Cysteinreste chemisch blockiert oder geschützt werden, zum Beispiel durch eine Acetamido- oder andere Schutzgruppe. Ein breiter Bereich von Blockierungsgruppen sind im Stand der Technik bekannt und können verwendet werden, einschließlich zum Beispiel Sulfonat-, Carboxylmethyl-, Carboxyamidomethyl-, Aminoethyl- und ähnliche Gruppen.

Das Polypeptid kann zur Bildung eines immunogen aktivem Konjugats an einen Träger gebunden sein. Jeder geeignete physiologisch annehmbare Träger kann verwendet werden, zum Beispiel ein Protein, wie Rinderserumalbumin, Thyroglobin, Ovalbumin oder Schlüssellochlimpethemocyanin. Kürzlich wurde dem Konzept der Präsentation von Mehrfachkopien viraler Peptide auf der Oberfläche von bestimmten Strukturen auf eine Weise, die einem Virion entspricht, viel Aufmerksamkeit beigemessen. Dies kann entweder durch die Herstellung von Virus-/Peptidchimären, z. B. mit Poliovi rus, oder das Verbinden des Peptids mit Proteinen, die sich natürlich in Partikel zusammenführen lassen, wie Hepatitis B-Oberflächenantigen, das Ty-Protein von Hefe oder das Kernprotein des Hepatitisvirus (HBcAg) erreicht werden. Das Polypeptid kann außerdem an andere KIV-Proteine oder Polypeptide gebunden werden, wodurch sowohl ein Antigen als auch eine multivalente Vakzine gleichzeitig bereitgestellt werden.

Anstelle eine Trägersequenz an ein Protein auf diese Weise zu binden, kann ein Polypeptid hergestellt werden, daß selbst eine geeignete Trägersequenz einführt, d. h. als ein Fusionsprotein, umfassend das erfindungsgemäße synthetische Polypeptid/ die synthetischen Polypeptide oder eine längere Sequenz, die ein solches an eine heterologe Trägersequenz gebundenes Polypeptid einführt, wie hiernach detaillierter beschrieben wird. Solche Trägerproteine werden im allgemeinen so ausgewählt, daß das resultierende Produkt physiologisch annehmbar ist.

Andere Modifikationen können durchgeführt werden, um Immunogenizität des synthetischen Polypeptids herzustellen, wobei diese das Einführen von oder Koppeln an längere Aminosäuresequenzen, enthaltend KIV-Helfer-T-Zellepitope, umfassen. Insbesondere können hier bestimmte Trägerproteine, wie HBcAg, erwähnt werden, die Helfer-T-Zellepitope enthalten und folglich den doppelten Vorteil einer stark immunogenen Antigenpräsentationsart und der Gegenwart von Helfer-T-Zellepitopen haben. Solche Modifikationen und viele andere, die die Antigenpräsentation und/oder Zufuhr zu dem Immunsystem erhöhen, einschließlich solche, die oben beschrieben sind, sind im Stand der Technik sehr bekannt und sind von Francis in Vaccines, Hrsg. Gregoriadis et al., Plenum Press, New York, S. 13-23, 1991; Sci. Progress 74: 115-130, 1990 und Francis & Clarke in Meth. Enzymol. 178, 6559-676, 1989 diskutiert und im Überblick dargestellt.

Die erfindungsgemäßen synthetischen Polypeptide können als pharmazeutisch oder physiologisch annehmbare Salze, z. B. Säureadditionssalze, zur Verfügung gestellt werden. Dies kann sowohl organische als auch anorganische Salze umfassen, wie solche, die zum Beispiel von Säuren, wie Salzsäure, Fluorwasserstoffsäure, Weinsäure, Fumarsäure, Bromwasserstoffsäure, Glycolsäure, Zitronensäure, Maleinsäure, Phosphorsäure, Succinsäure, Essigsäure, Salpetersäure, Benzoesäure, Ascorbinsäure, p- Toluolsulfonsäure, Benzol-Sulfonsäure, Naphthalin-Sulfonsäure, Propionsäure und dergleichen hergestellt werden. Bevorzugt sind die Säureadditionssalze solche, die von Salzsäure, Essigsäure oder Succinsäure herge stellt werden. Solche Salze können durch herkömmliche Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, hergestellt werden.

Alternativ kann das Peptid in ein Carbonsäuresalz umgewandelt werden, wie ein Ammoniumsalz oder Alkalimetallsalz, z. B. ein Natrium-, Kalium- oder Lithiumsalz usw.

Wie oben erwähnt, können die erfindungsgemäßen synthetischen KIV-Polypeptide verwendet werden, um eine KIV-Infektion bei Tieren zu bekämpfen, und bevorzugt, um eine Wirt-Immunantwort gegen KIV zu stimulieren. Eine solche Immunantwort kann Elemente der humoralen und/oder Zell-vermittelten Immunität umfassen, um den Wirt gegen eine KIV-Infektion zu schützen und/oder den Virus zu töten oder zu inhibieren und kann somit zum Beispiel die Herstellung von Immuneffektor-Molekülen, Antikörper oder Zellen, die den Virus schädigen, hemmen oder töten, einschließen. Gewöhnlich kann eine solche Wirt-schützende Immunantwort durch die Herstellung von Antikörpern, die den Virus neutralisieren können, manifestieren.

Folglich ist einer der Wege, auf denen die erfindungsgemäßen synthetischen KIV-Polypeptide ihre Wirt-schützenden Wirkungen entfalten kann, das Entwickeln von neutralisierenden Antikörpern, die das Wachstum und/oder die Erhaltung des Virus inhibieren. Solche neutralisierenden Antikörper, die monoklonal oder polyklonal sein können, bilden eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform sowie Vakzinzusammensetzungen, enthaltend dieselben und ihre Verwendung bei der Herstellung von Vakzinzusammensetzungen zum passiven Immunisieren von Wirten gegen die KIV-Infektion. Techniken zum Erhalt von mono- oder polyklonalen Antikörpern sind im Stand der Technik bekannt.

Erfindungsgemäße KIV-Polypeptide können leicht durch rekombinante DNA-Technologie unter Verwendung von Standardtechniken hergestellt werden, wie solche, die zum Beispiel von Sambrook et al., 1989, (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbour Press) beschrieben werden.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform stellt folglich ein Nucleinsäuremolekül bereit, umfassend eine Nucleotidsequenz, die einen Bereich des KIV env-Gens umfaßt, der die KIV-Hüllproteinreste codiert, ausgewählt aus:

Reste

(1) 377-417 und/oder

(2) 462-490 und/oder

(3) 354-377 und/oder

(5) 417-445 und/oder

(6) 320-339 und/oder

(7) 161-190 und/oder

(8) 248-267 und/oder

(10) 716-736,

oder einen Teil davon, der ein antigenes KIV-Fragment codiert oder eine Sequenz, die degeneriert ist oder mehr als 60% Sequenzhomologie mit dieser hat oder die unter stark stringenten Bedingungen mit einer solchen vorgenannten Sequenz hybridisiert, wobei das Nucleinsäuremolekül bei der KIV-Bekämpfung verwendet wird und bevorzugt eine Vakzine gegen die KIV- Infektion in Tieren ist, d. h. eine Vakzinzusammensetzung zum Stimulieren einer Immunantwort gegen KIV.

Alternativ betrachtet wird erfindungsgemäß ein solches Nucleinsäuremolekül bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur KIV-Bekämpfung, bevorzugt einer Vakzine gegen die KIV-Infektion in Tieren, verwendet. Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform stellt ein Nucleinsäuremolekül bereit, umfassend eine erste Nucleotidsequenz, die einem Bereich des KIV env-Gens, der Reste des KIV-Hüllproteins codiert, entspricht, ausgewählt aus;

Reste

(1) 377-417 und/oder

(2) 462-490 und/oder

(3) 354-377 und/oder

(5) 417-445 und/oder

(6) 320-339 und/oder

(7) 161-190 und/oder

(8) 248-267 und/oder

(10) 716-736,

oder einen Teil davon, der ein antigenes KIV-Fragment codiert, oder eine Sequenz, die degeneriert ist oder mehr als 60% Sequenzhomologie mit dieser hat, oder die unter stark stringenten Bedingungen mit einer der vorgenannten Sequenzen hybridisiert zusammen mit mindestens einer zusätzlichen Nucleotidsequenz, die diese erste Nucleotidsequenz flankiert, wobei die zusätzlich Nucleotidsequenz nicht mehr als 900 Basen, bevorzugt nicht mehr als 600, z. B. nicht mehr als 300 Basen umfaßt.

Erfindungsgemäße Nucleinsäuremoleküle können einzel- oder doppelsträngige DNA, cDNA oder RNA sein und können leicht die Form eines rekombinanten Nucleinsäuremoleküls, bevorzugt eines rekombinanten DNA-Moleküls, einnehmen.

Die erfindungsgemäß zusätzlichen flankierenden Sequenzen in dem Nucleinsäuremolekül können von dem KIV env-Gen selbst, von anderen Bereichen der KIV-DNA oder von heterologen Quellen abstammen und können codierend oder nicht-codierend sein. In einer bevorzugten Ausführungsform können die flankierenden Sequenzen ein oder mehrere Restriktionsstellen enthalten.

Wie oben erwähnt, können Abweichungen in dem env-codierenden Bereich zwischen verschiedenen Serotypen, Isolaten oder KIV-Stämmen, z. B. Stämmen verschiedener geographischer Herkunft, oder sogar zwischen verschiedenen Isolaten von demselben Wirt auftreten, und solche Abweichungen in dem die obengenannten Reste des KIV-Hüllproteins codierenden Bereich des KIV env- Gens, der Produkte exprimiert, die den KIV bekämpfen, zum Beispiel durch Stimulieren einer Immunantwort gegen KIV, sind im Umfang dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform eingeschlossen.

"Im wesentlichen homolog", wie hier verwendet, umfaßt solche Sequenzen mit einer Sequenzhomologie von ungefähr 60% oder mehr, z. B. 70 oder 80% oder mehr, wobei die Nucleinsäure eine Sequenz ist, die ein KIV-bekämpfendes, z. B. immunogenes, Polypeptid codiert oder die mit dieser komplementär ist und außerdem funktionell-äquivalente allele Varianten und verwandte Sequenzen, die durch eine einzelne oder mehrere Basensubstitution, Addition und/oder Deletion modifiziert sind. Mit "funktionelläquivalent" sind Nucleotidsequenzen gemeint, die immunreaktive oder immunogene Polypeptide codieren, zum Beispiel Polypeptide, die die Herstellung von Antikörpern, zum Beispiel neutralisierenden Antikörpern, bewirken, oder die funktionelle Immunität im Wirt bewirken oder solche, die den KIV-Virus anderweitig bekämpfen können.

Die Verwendung von Nucleotidsequenzen, wie oben definiert, die mit den obengenannten Bereichen des KIV env-Gens hybridisieren, oder jede degenerierte, im wesentlichen homologe oder funktionell-äquivalente Sequenz, wie oben definiert, ist außerdem vom Umfang dieser Erfindung umfaßt.

"Hybridisierung", wie hier verwendet, definiert solche Sequenzen, die unter nicht-stringenten Bedingungen (z. B. 6 · SSC 50% Formamid bei Raumtemperatur) binden und die unter Bedingungen niedriger Stringenz (z. B. 2 · SSC, Raumtemperatur, bevorzugt 2 · SSC, 42ºC) oder unter Bedingungen von höherer Stringenz (z. B. 2 · SSC 65ºC) (SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,2) gewaschen werden. Im allgemeinen kann gesagt werden, daß Sequenzen, die unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisieren sowie Sequenzen, die aufgrund der Degeneration des Codes unter hoch stringenten Bedingungen hybridisieren würden, erfindungsgemäß umfaßt sind.

Verfahren zur Herstellung solcher Derivat-verwandten Sequenzen, zum Beispiel durch seitengerichtete Mutagenese, wahllose Mutagenese oder enzymatische Spaltung und/oder Ligasierung von Nucleinsäuren, sind im Stand der Technik bekannt, so sind Verfahren zur Bestimmung, ob die so modifizierte Nucleotidsequenz Homologie mit der Versuchssequenz hat, zum Beispiel durch Hybridisierung.

Die Bereitstellung einer erfindungsgemäßen Nucleotidsequenz ermöglicht folglich, daß die synthetischen KIV-Polypeptide in bedeutenden Mengen erhalten werden, wodurch die Entwicklung von Anti-KIV-Vakzinen und - Therapien erleichtert wird.

Eine erfindungsgemäße Ausführungsform stellt folglich die Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls bereit, umfassend eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, das neutralisierende Antikörper gegen KIV entwickeln kann, wobei die Sequenz ein oder mehrere antigene Determinantcodierende Bereiche von den Bereichen der KIV env-Gen codierenden Reste des KIV-Hüllproteins umfaßt, ausgewählt aus

(1) 377-417 und/oder

(2) 462-490 und/oder

(3) 354-377 und/oder

(5) 417-445 und/oder

(6) 320-339 und/oder

(7) 161-190 und/oder

(8) 248-267 und/oder

(10) 716-736,

oder eine Sequenz, die degeneriert ist und mehr als 60% Sequenzhomologie mit dieser hat oder die unter stark stringenten Bedingungen mit einer der vorgenannten Sequenzen hybridisiert zur Herstellung einer Zusammensetzung zur KIV-Bekämpfung,

Die erfindungsgemäßen oben definierten Nucleinsäuremoleküle können in geeigneten Expressionssystemen, die im Stand der Technik bekannt sind, exprimiert werden, um rekombinante synthetische KIV-Polypeptide der Erfindung zu erhalten.

Die rekombinanten synthetischen KIV-Polypeptide können folglich durch Expression in einer Wirtszelle, enthaltend ein rekombinantes DNA- Molekül, das ein oben breit definiertes Nucleinsäuremolekül umfaßt, das operativ an eine Expressionskontrollsequenz gebunden ist, oder ein rekombinantes DNA-Klonierungsvehikel oder einen Vektor, enthaltend ein solches rekombinantes DNA-Molekül, hergestellt werden. Alternativ können die Polypeptide durch direkte Injektion eines bloßen DNA-Moleküls, das eine erfindungsgemäße Nucleotidsequenz umfaßt, in eine Wirtszelle exprimiert werden. Geeignete rekombinante DNA-Technologie und Expressionstechniken sind, wie oben erwähnt, in der Literatur beschrieben, zum Beispiel von Sambrook et al., 1989, (supra).

Die so exprimierten Polypeptide können Fusionspolypeptide sein, die ein erfindungsgemäßes KIV-Polypeptid und ein zusätzliches Polypeptid, das durch die DNA des daran fusionierten rekombinanten Moleküls codiert wird, umfassen. Das kann zum Beispiel β-Galactosidase, Glutathionin-S-Transferase, der Hefe Ty-Partikel, das Hepatitis-Kern- oder Oberflächenantigen, ein transmembraner Teil von Membranproteinen oder ein anderes häufig im Stand der Technik verwendetes Polypeptide sein. Fusionen mit dem Hepatitiskernantigen sind besonders bevorzugt.

In einer alternativen Form des Fusionsproteins können durch ein oder mehrere erfindungsgemäße synthetische Polypeptide ein oder mehrere antigene Epitope eines anderen Proteins, wie das Hepatitiskernantigen, der Hefe Ty-Partikel oder das Grippevirushämagluttonin (HA), oder Teile davon ausgetauscht sein.

Andere erfindungsgemäße Ausführungsformen schließen folglich DNA enthaltende Klonierungs- und Expressionsvektoren, die erfindungsgemäße Nucleotidsequenzen umfassen, ein. Solche Expressionsvektoren umfassen geeignete Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel translationale (z. B. Start- und Stopcodone) und transkriptionale Kontrollelemente (z. B. Promotor-Operator-Bereiche, ribosomale Bindungsstellen, Terminations-Stopsequenzen) die in den passenden Leserahmen mit den Nucleinsäuremolekülen der Erfindung verbunden sind.

Diese Erfindung schließt außerdem transformierte oder transfektierte prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen oder transgene Organismen, die eine erfindungsgemäße Nucleotidsequenz, wie oben definiert, enthalten, sowie Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen synthetischen Polypeptids durch Kultivieren von Wirtszellen, die ein Nucleinsäuremolekül, wie oben beschrieben, enthalten unter Bedingungen, bei denen das besagte Polypeptid exprimiert wird und das so hergestellte Polypeptid gewonnen wird, ein.

Erfindungsgemäße Klonierungs- oder Expressionsvektoren können Plasmide, Phagen und Viren gemäß im Stand der Technik bekannten Techniken umfassen und können in einer Vielzahl von verschiedenen Expressionssystemzellen exprimiert werden, einschließlich bakteriellen (z. B. E. coli), Hefe- oder Säugerexpressionssystemen. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können folglich in gentechnisch veränderten Zell-Linien exprimiert werden, z. B. Zell-Linien (wie BHK oder Hela), die zum Beispiel mit einem Virusvektor transfiziert sind und die die erfindungsgemäßen KIV-Polypeptide exprimieren können. Daher kann als ein typischer geeigneter viraler Vektor der rekombinant Vacciniavirus erwähnt werden. Als zweckmäßige Expressionsmethode kann ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül in einen Plasmidvektor stromabwärts des Vacciniavirus-Promotors, der durch Vacciniathymidinkinase (TK)-Sequenzen flankiert ist, eingeführt werden. Der resultierende Vektor wird in mit Vacciniavirus transfektierten Zellen eingeführt. Als Folge der homologen Rekombination wird ein TK rekombinanter Virus, der das Polypeptid exprimiert, hergestellt.

Bevorzugte erfindungsgemäße Expressionssysteme umfassen insbesondere Säugerzellsysteme (z. B. BHK-Zellen), aber auch Hefe, Vaccinia, Baculovirus und Bakteriensysteme, wie E. coli oder Salmonella.

Die synthetischen Polypeptide können außerdem durch chemische Synthese hergestellt werden, zum Beispiel unter Verwendung von Festphasensynthese, wobei es von Vorteil ist, kommerziell erhältliche Polypeptidsynthesevorrichtungen zu verwenden. Bei einer solchen Synthese werden die aktiven Seitenkettengruppen (z. B. Amino- oder Carboxylgruppen) der jeweiligen Aminosäuren geschützt, und der Endschritt wird das Entfernen der Schutzgruppen und/oder das Entfernen von dem inerten Träger, an den das Polypeptid während der Synthese gebunden ist, sein. Lösung-Phasensynthesesysteme sind auch im Stand der Technik bekannt.

Beim Aufbau der Peptidketten kann man prinzipiell entweder am C-Terminus oder N-Terminus beginnen, obwohl nur das Verfahren, das am C-Terminus beginnt, allgemein verwendet wird.

Folglich kann durch Reaktion eines geeigneten Derivats von zum Beispiel Cystein mit einem geeigneten geschützten Derivat von Glutamin am C- Terminus begonnen werden. Das Cystein-Derivat wird eine freie α-Aminogruppe haben, während das andere Reagens entweder eine freie oder aktivierte Carboxylgruppe und eine geschützte Aminogruppe haben wird. Nach der Kopplung kann das Zwischenprodukt zum Beispiel durch Chromatographie gereinigt werden und dann können selektiv die N-Schutzgruppen entfernt werden, um die Zugabe eines weiteren freien N-geschützten und freien oder aktivierten Aminosäurerestes zu ermöglichen. Dieses Verfahren wird fortgesetzt, bis die erforderliche Aminosäuresequenz vollständig ist.

Carbonsäure aktivierende Substituenten, die zum Beispiel verwendet werden können, schließen symmetrische oder gemischte Anhydride, oder aktivierte Ester, wie zum Beispiel p-Nitrophenylester, 2,4,5,Trichlorphenylester, N-Hydroxybenzotriazolester (OBt), N-Hydroxysuccinimidylester (OSu) oder Pentafluorphenylester (OPFP) ein.

Die Kopplung der freien Amino- und Carboxylgruppen kann zum Beispiel unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) bewirkt werden. Ein anderes Kopplungsmittel, das zum Beispiel verwendet werden kann, ist N- Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin (EEDQ).

Im allgemeinen ist es günstig, die Kopplungsreaktionen bei niedrigen Temperaturen, zum Beispiel bei -20ºC bis zu Raumtemperatur in einem geeigneten Lösungssystem, zum Beispiel Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethylformamid, Methylenchlorid, oder einer Mischung dieser Lösungsmittel zu bewirken.

Es kann vorteilhaft sein, die Synthese auf einem Festphasenharzträger durchzuführen. Chlormethyliertes Polystyrol (mit 1% Divinylbenzol cross-vernetzt) ist ein nützlicher Trägertyp; in diesem Fall beginnt die Synthese am C-Terminus, zum Beispiel durch Kopplung von N-geschütztem Cystein an den Träger.

Eine Anzahl von geeigneten Festphasentechniken sind von Eric Atherton, Christopher J. Logan und Robert C. Sheppard, J. Chem. Soc. Perkin I, 538-46, 1981; James P. Tam, Foe S. Tjoeng und R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 102, 6117-27, 1980; Manfred Mutter und Dieter Bellof, Helvetica Chimica Acta 67, 2009-16, 1984 beschrieben.

Eine große Auswahl von Schutzgruppen für Aminosäuren sind bekannt und viele sind aufgeführt in Schröder E. und Lübke, K., The Peptides, Bd. 1 und 2, Academic Press, New York und London, 1965 und 1966; Pettit G. R., Synthetic Peptides Bd. 1-4, Van Nostrand, Reinhold, New York 1970, 1971, 1975 und 1976; Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Synthese von Peptiden, Band 15, Georg Thieme Verlag Stuttgart, NY, 1983; The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology 1-7, Hrsg. Erhard Gross, Johannes Meienhofer, Academic Press, NY, San Francisco, London; Solid phase peptide synthesis 2. Ausg., John M. Stewart, Janis D. Young, Pierce Chemical Company.

So umfassen zum Beispiel Aminschutzgruppen, die verwendet werden können, Schutzgruppen, wie Carbobenzoxy(Z-), t-Butoxycarbonyl (Boc-), 4- Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulphonyl(Mtr-) und 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc-). Man wird zu schätzen wissen, daß wenn das Peptid vom Cterminalen Ende aufgebaut wird, eine Aminschutzgruppe an der α-Aminogruppe jedes neuen hinzugefügten Restes vorhanden sein wird, die vor dem nächsten Kopplungsschritt selektiv zu entfernen ist. Eine besonders nützliche Gruppe für einen solchen temporären Aminschutz ist die Fmoc Gruppe, die durch Behandlung mit Piperidin in einem organischen Lösungsmittel selektiv entfernt werden kann.

Carboxylschutzgruppen, die beispielsweise verwendet werden können, umfassen leicht spaltbare Estergruppen, wie Benzyl-(OBZl), p-Nitrobenzyl (-ONB) oder t-Butyl (-tOBu) sowie die Kopplung auf einem festen Träger, zum Beispiel an Polystyrol gebundene Methylgruppen.

Man wird zu schätzen wissen, daß es ein breiten Bereich anderer solcher Gruppen gibt, die zum Beispiel in den oben erwähnten Literaturangaben genau geschildert sind, und die Verwendung aller dieser Gruppen in den zuvor beschriebenen Verfahren ist erfindungsgemäß umfaßt.

Viele Verfahren zum Entfernen von Amin- und Carboxylschutzgruppen sind vorhanden. Diese müssen jedoch mit der verwendeten Synthesestrategie übereinstimmen. Die Schutzgruppen der Seitenkette müssen in Bezug auf die Bedingungen, die verwendet werden, um die temporären α-Aminschutzgruppen vor dem nächsten Kopplungsschritt zu entfernen, stabil sein.

Aminschutzgruppen, wie Boc, und Carboxylschutzgruppen, wie tOBu, können durch Säurebehandlung, wie Trifluoressigsäure, gleichzeitig entfernt werden.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform stellt ein Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen synthetischen Polypeptiden bereit, bei dem die Entfernung der Schutzgruppen oder die Entfernung von einem festen Träger eines entsprechenden geschützten oder immobilisierten Polypeptids durchgeführt wird.

Die erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen und Polypeptide können verwendet werden, um Vakzinzusammensetzungen unter Verwendung von im Stand der Technik bekannter Vazinherstellungsverfahren hergestellt werden.

Traditionell können Vakzinformulierungen ein oder mehrere erfindungsgemäße Polypeptide und - wenn geeignet - zusammen mit einem oder mehreren geeigneten Adjuvantien, z. B. Aluminiumhydroxid, Muramyldipeptid, Mineral- oder Pflanzenölen, Novosomen, Liposomen, Saponinen, Quil-A, Q5- 21, Matriz oder Pluronics in Gegenwart eines oder mehrerer pharmazeutisch annehmbarer Träger oder Verdünnungsmittel umfassen. Geeignete Träger umfassen flüssige Media, wie Kochsalzlösung, die für die Verwendung als Vehikel geeignet sind, um die Polypeptide in ein Versuchsobjekt einzuführen. Zusätzliche Komponenten, wie Konservierungsmittel, können eingeschlossen sein, und die Vakzine können zur Bildung einer multivalenten Vakzine außerdem andere antigene Komponenten, wie andere KIV-Antigene, z. B. andere KIV-Proteine und/oder Polypeptide oder andere Katzenvirus- Antigene, z. B. vom Katzenleukämievirus, umfassen. Es ist kürzlich festgestellt worden, daß immunstimulierende Komplexe (ISCOMS Morein et al., Nature 308: 457-460, 1984) besonders wirksam als Adjuvantien bei der Vakzinherstellung und besonders attraktiv bei präsentierenden Antigenen, die "transmembrane" Anteile umfassen, sind.

Solche Vazinzusammensetzungen bilden eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform, und die Erfindung stellt folglich außerdem eine Zusammensetzung zur KIV-Bekämpfung bereit, bevorzugt eine Vakzinzusammensetzung, zum Stimulieren einer Immunantwort in einem Tier gegen KIV, wobei diese Zusammensetzung ein oder mehrere synthetische Polypeptide umfaßt, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus

wahlweise zusammen mit einem oder mehreren Adjuvantien und einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel.

Ein alternativer günstiger Weg zum Präsentieren der erfindungsgemäßen Vakzine ist, an ein Tier einen Expressionsvektor zu verabreichen, der das fragliche Polypeptid so exprimieren kann, daß das immunogene Peptid in dem Tier in situ exprimiert wird. Es wurde festgestellt, daß durch eine solche "in situ"-Expression der antigenen Polypeptide dem Immunsystem des Tiers das Immunogen auf eine bevorzugte Weise präsentiert wird.

Ein weitere bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform schließt folglich eine Zusammensetzung zur KIV-Bekämpfung ein, bevorzugt eine Vakzinzusammensetzung, die Immunantwort in einem Säuger gegen KIV stimuliert, wobei die besagte Zusammensetzung einen Expressionsvektor oder eine Zelle umfaßt, in die ein oben definiertes erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül eingeführt wurde, um eine Immunantwort die gegen Polypeptide, die durch die eingeführte Nucleotidsequenz codiert sind, gerichtet ist, zu stimulieren zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln. Expressionsvektoren, die für eine solche Anwendung geeignet sind, sind im Stand der Technik bekannt und umfassen insbesondere virale Vektoren, vor allem Pockenvirusvektoren. Erwähnenswerte Vektoren umfassen Vacciniavirus, Pockenvirus von Geflügel, Pockenvirus vom Kanarienvogel, Katzenrhinotracheitis, Katzencalicivirus, Katzenpanleukopenie, Adenovirus und Bakterien (z. B. Salmonellen), wie zum Beispiel von Ada et al., Vaccine 8 : 425-437, 1990 beschrieben. Es ist vorteilhaft, daß ein Fusionsprotein in einem solchen System exprimiert wird, bei dem der heterologe Proteinteil (der "Träger") das gesamte oder einen Teil eines transmembranen Proteins (z. B. Grippevirus HA) umfaßt. Wenn das Fusionsprotein in Eukaryontenzellen, die mit einem solchen rekombinanten Virus infiziert sind, exprimiert wird, ist es im allgemeinen glykolysiert und wird an die Zelloberfläche befördert, wodurch es die synthetischen Polypeptide (oder ihre Epitope) auf der Außenseite der Zelloberfläche präsentiert.

Die Verabreichung einer Zusammensetzung zum Beispiel einer erfindungsgemäßen Vakzinzusammensetzung kann auf jedem herkömmlichen Weg erfolgen, z. B. orale oder parenterale, wie subkutane, intravenöse, intramuskuläre oder intradermale Injektion, wahlweise in Abständen, zum Beispiel zwei Injektionen in einem Abstand von 7 bis 42 Tagen. Gewöhnlich wird ein Peptid in einer Menge von 1 bis 1000 ug/Dosis, besonders bevorzugt von 2 bis 100 ug/Dosis, entweder über den oralen oder parenteralen Weg verabreicht. Wenn ein rekombinanter viraler Vektor als Vakzine verabreicht wird, können die Verabreichungswege und die Dosis dieselben sein.

In den verschiedenen oben diskutierten Aspekten dieser Erfindung ist das Tier bevorzugt ein Säuger und am meisten bevorzugt eine Katze oder ein Kätzchen.

Wir haben gezeigt, daß erfindungsgemäße synthetische Polypeptide durch Katzenantisera, die positiv für den KIV sind, erkannt werden können. Folglich können solche Polypeptide zum Nachweis von Antikörpern gegen KIV verwendet werden und können somit die Basis eines diagnostischen KIV-Tests bilden, insbesondere um KIV-infizierte Katzen, die Seroumgewandelt sind, zu identifizieren.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform stellt somit ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen KIV bereit, wobei das besagte Verfahren das Kontaktieren eines oder mehrerer erfindungsgemäßer synthetischer Peptide mit einer Probe, die den besagten Antikörper enthält, und das Nachweisen der Gegenwart eines zwischen diesem Polypeptid und dem Antikörper gebildeten Komplex umfaßt.

Der Nachweis einer solchen Komplexbildung kann unter Verwendung von Standard-Immunoassays, wie zum Beispiel ELISA erhalten werden.

Die Probe kann jede klinische oder biologische Probe sein und kann zum Beispiel eine Körperflüssigkeit oder einen Feststoff umfassen (z. B. eine Blut-, Plasma-, Serum-, Urin- oder Gewebeprobe).

Im allgemeinen wird die Probe eine von Blut abstammende Probe sein.

Es ist günstig, daß die zur Durchführung des diagnostischen Tests erforderlichen Reagenzien in einer Kit-Form bereitgestellt werden, und dies stellt eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform dar.

Folglich wird erfindungsgemäß außerdem ein Testkit zur Verwendung beim Nachweis von Antikörper gegen KIV in einer Probe, die einen oder mehrere erfindungsgemäße synthetische Polypeptide und Mittel zum Nachweisen der Komplexbildung zwischen diesem Polypeptid und dem Antikörper umfaßt, bereitgestellt.

Solche Nachweismittel können bevorzugt ein oder mehrere markierte z. B. colorimetrisch markierte sekundäre Antikörper oder colorimetrisch markierte Formen der besagten synthetischen Polypeptide umfassen.

Monoklonale Antikörper gegen die obigen KIV-Polypeptide können außerdem in diagnostischen Systemen von Nutzen sein, zum Beispiel in markierter Form, und stellen ein weiteres Merkmal dieser Erfindung dar. Die Erfindung wird jetzt in den folgenden nicht einschränkenden Beispielen unter Bezugnahme auf die beiliegenden Abbildungen detaillierter dargestellt.

Fig. 3 bis 12 zeigen jeweils die Antikörper-Antwort gegen die KIV-Polypeptide 1 bis 10 in Antisera von KIV-infizierten Katzen, gemessen gemäß indirektem ELISA.

In diesen Figuren zeigt die Abscisse den reziproken Wert der Seroverdünnung und die Ordinate die Adsorption bei 492 nm;

die Symbole stellen in den Abschnitten (a) bis (d) der Figuren (außer in Abschnitt (c) der Fig. 11) jeweils dar:

(a) O Blutentnahme von der Katze A5 davor

Blutentnahme von der Katze A6 davor

Blutentnahme von der Katze A5 nach der Immunisierung

Blutentnahme von der Katze A6 nach der Immunisierung

(b) O Blutentnahme von der Katze A7 davor

Blutentnahme von der Katze A9 davor

Blutentnahme von der Katze A7 nach der Immunisierung

Blutentnahme von der Katze A9 nach der Immunisierung

(c) O Blutentnahme von der Katze A10 davor

Blutentnahme von der Katze A11 davor

Blutentnahme von der Katze A10 nach der Immunisierung

Blutentnahrne von der Katze A11 nach der Immunisierung

(d) O Blutentnahme von der Katze A12 davor

Blutentnahme von der Katze A34 davor

Blutentnahme von der Katze A12 nach der Immunisierung

Blutentnahme von der Katze A34 nach der Immunisierung

In Abschnitt (c) der Fig. 11 bedeuten die Symbole

O normales Katzenserum

Blutentnahme von der Katze A11 davor

Blutentnahme von der Katze A10 nach der Immunisierung

Blutentnahme von der Katze All nach der Immunisierung

Beispiel 1 Material und Verfahren Peptide

Peptide wurden von Dr. James Tam von der Rockefeller University, USA unter Verwendung des Festphasenchemie-Verfahrens, das von Merrifield (1963) entwickelt wurde, wie folgt synthetisiert:

Jedes Peptid wurde durch Umkehrphasen-HPLC gut gereinigt und durch Aminosäureanalyse und maßspektrometrische Analyse charakterisiert. Zusätzliche nicht-natürliche Cysteinreste wurden zu dem Carboxylterminus der Peptide 7, 9 und 10 (SEQ ID Nrn. 7, 9 und 10) hinzugefügt, um die Kopplung an einen Proteinträger zu erleichtern. Außerdem wurden die aminoterminalen Cysteine in jedem Peptid mit einer Acetamidgruppe, wie Cys(Acm), geschützt gelassen, um eine spezifische Trägerbindung zwischen den carboxlterminalen Cysteinen zu ermöglichen. Dies eröffnete auch die Möglichkeit zur Herstellung von polymeren oder zyklischen Peptiden durch Aktivierung von Cys (Acm) und folglich der Entfernung der Acm-Gruppe. Die Sequenzen basieren auf einer Kombination von den UK8- und Petaluma- Sequenzen. Peptid 1 (SEQ ID Nr. 1) enthält ein nichtnatürliches Met an der Position 411 und Peptid 9 (SEQ ID Nr. 9) enthält ein nichtnatürliches Ala an der Position 607. Die Position 421 in dem Peptid 5 (SEQ ID Nr. 5) enthält einen Rest von KIV-Dutch 19k1 und nicht von UK8 oder Petaluma.

Antisera

Die Antisera, die von 8 Katzen vor und nach der KIV-Infektion gesammelt wurden, wurden von Prof. 0. Jarrett von der Katzenvirus-Abteilung, Glasgow Universität, zur Verfügung gestellt. Die Erkennungsnummern der Katzen waren A5, A6, A7, A9, A10, A11, A12 und A34.

Antipeptidassay

Eine Modifikation der von Voller & Bidwell, Br. J. Exp. Path., 57: 243-247, 1976, beschriebenen indirekten ELISA-Technik wurde verwendet, um Antipeptid-Antikörper-Antworten zu untersuchen. Kurz gesagt wurden Mikroplatten über Nacht bei Raumtemperatur mit ungekoppeltem synthetischen Peptid bei einer Konzentration von 10 ug/ml beschichtet. Die Platten wurden gewaschen und Testserumproben in einem Bereich von verdoppelten Verdünnungen von 1 : 10 wurden zugegeben. Nach einstündiger Inkubation bei 37ºC wurden die Platten gewaschen, und Anti-Katzen IgG-Peroxidasekonjugat wurde zugegeben. Nach einer weiteren Stunde bei 37ºC wurden die Platten gewaschen, und ein Enzymsubstrat (0,04% o-Phenylendiamin + 0,004 % Wasserstoffperoxid in Phosphat/Citratpuffer) wurde zugegeben. Die resultierende Farbentwicklung wurde mit 12,5% Schwefelsäure nach 3 bis 5 Minuten gestoppt, und die Absorption bei 492 nm wurde in einem Titertek Multiskan plus (Flow Laboratories, Irvine, Ayrshire, UK) gemessen.

Die von den verdoppelten Verdünnungen der post-Inokulationsproben erhaltenen A&sub4;&sub9;&sub2;-Werte wurden gegen den reziprokalen log&sub1;&sub0; Antiserumverdünnungswert aufgetragen. Die berichteten Ergebnisse sind der Mittelwert von zwei Tests.

Ergebnisse

Graphische Abbildungen, die Reaktivität der Katzenantisera gegen jedes der 10 Peptide zeigt, sind in Fig. 3 bis 12 dargestellt. Die Ergebnisse dieser graphischen Abbildungen sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Diese Tabelle zeigt, daß alle Peptide einen niedrigen serologischen Reaktivitätswert gegenüber mindestens einem oder mehreren der KIVpositiven Antisera aufwiesen. Außerdem hatten fünf dieser 10 Peptide (KIV 2, 3, 5, 8 und 9 (SEQ ID Nrn. 2, 3, 5, 8 und 9)) starke Reaktivität gegen eines oder mehrere der Antisera. Insbesondere ist in dieser Hinsicht das Peptid 2 (SEQ ID Nr. 2), das mit jeder der acht Antisera gut reagierte und die Peptide 8 und 9 (SEQ ID Nrn. 8 und 9), die stark jeweils mit 6 der 8 und 5 der 8 Antisera reagierten, zu nennen. Die in vielen der Antisera nachgewiesenen Anti-Peptid-Gesamttiter waren sehr hoch, z. B. > 1 : 10000 gegenüber dem Peptid 2 und > 1 : 1000 gegenüber den Peptiden 8 und 9 (SEQ ID Nrn. 8 und 9). Kein Katzen-Antiserum reagierte mit allen Peptiden, obgleich A7, A10, A11, A12 und A13 mit drei oder mehr der Peptide stark reagierten.

Diese Ergebnisse zeigen, daß jedes der obigen zehn Peptide, die von dem KIV-Hüllprotein ausgewählt wurden, in gewisser Hinsicht durch mindestens ein oder mehrere der KIV-positiven Antisera erkannt werden. Diese Erkennung ist für fünf der Peptide stark signifikant und in drei der Fälle sind die Mehrzahl der untersuchten Katzensera positiv. Diese Ergebnisse zeigen daher, daß die Peptide oder Kombinationen der Peptide beim Nachweis von seropositiven Katzen, die der KIV-Infektion ausgesetzt sind, nützlich sein würden. Außerdem ist die Verwendung solcher Peptide als Basis einer Vakzine gegen KIV angedeutet.

Tabelle 1 Reaktivität der KIV-Peptide gegenüber einen Bereich von KIV-positiven Katzenantisera, gemessen durch das indirekte ELTSA

Legende

+/- Anzeigen der Aktivität von den prä-Blutwerten bei einer Verdünnung von nur 1/10

+ OD 0,1-0,3 über der Prä-Blutung

++ OD 0,4-0,6 über der Prä-Blutung

+++ OD 0,7-1,0 über der Prä-Blutung

++++ OD > 1, 1 über der Prä-Blutung

Beispiel 2 Weitere serologische Screeningassays mit Katzen-Anti- sera Einführung

Nach den anfänglichen vielversprechenden Ergebnissen, die durch Screenen von acht Antisera von Katzen, die mit dem UK (Glasgow) 8 Virus gegenüber den zehn KIV-Peptiden infiziert worden waren, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden fünf der am reaktiven Peptide zum ausführlicheren Screenen ausgewählt. Die fünf ausgewählten Peptide waren die Peptide 2, 3, 5, 8 und 9 (SEQ ID Nrn. 2, 3, 5, 8 und 9).

Die verwendeten Katzenantisera waren eine Reihe von 59 Antisera von Katzen, die mit UK-Isolaten infiziert sind (hergestellt von 6 Antisera von versuchsweise infizierten Katzen, die an der Bristol Universität gehalten werden und 53 Antisera, bestehend aus Feldisolaten und versuchsweise infizierten Katzen von der Glasgow Universität), 36 Antisera von Katzen, die mit den Dutch-Isolaten infiziert sind (Blut wurde von vier versuchsweise infizierten Katzen Nrn. 11 bis 14 serienmäßig entnommen) und drei Antisera von Katzen, die mit USA-Isolaten von KIV (5040, 5039 und 8917-6) infiziert sind.

Ergebnisse

Die erhaltenen Gesamtergebnisse vom Screenen der 59 Antisera von Katzen, die UK Isolaten von KIV ausgesetzt waren, zeigen, daß 94% eine positive Reaktion gegenüber Peptid 2 (SEQ ID Nr. 2), 69,6% gegenüber Peptid 3 (SEQ ID Nr. 3), 76,8% gegenüber Peptid 5 (SEQ ID Nr. 5), 88,4% gegenüber Peptid 8 (SEQ ID Nr. B) und 70% gegenüber Peptid 9 (SEQ ID Nr. 9) aufwiesen.

Die von mit Dutch-Isolaten infizierten Katzen gesammelten Sera zeigten eine starke Antwort in Bezug auf das Peptid 2 (SEQ ID Nr. 2) nach der Infektion (Tabelle 2). Niedrigere Reaktivitäten wurden außerdem bei 4 anderen Peptiden in den Antisera von zwei der Katzen (12 und 14) beobachtet. Drei der Antisera von Katzen, die mit US-Isolaten infiziert sind, zeigten zwei (5039 und 5040) prägnante Antworten bei der Mehrzahl der 5 Peptide, während nur eines mit den Peptiden 2 und 9 schwach reaktiv war (SEQ ID Nrn. 2 und 9)(Tabelle 2).

Schlußfolgerung

Diese Ergebnisse zeigen, daß Antisera, die von Katzen gesammelt wurden, die mit einem breiten Bereich von KIV-Isolaten sowohl europäischer als auch amerikanischer Herkunft infiziert waren, signifikante Antworten gegenüber den KIV-Peptiden 2, 3, 5, 8 und 9 (SEQ ID Nrn. 2, 3, S. 8 und 9) zeigten. Dies bestätigt und erweitert die in Beispiel 1 erhaltenen Ergebnisse und unterstützt die Nützlichkeit von Peptiden für diagnostische sowie Vakzinzwecke.

Tabelle 2: Reaktivität von Antisera, die von mit Dutch- und US- Isolaten von KIV-infizierten Katzen gesammelt wurden gegenüber KIV-Hüllpeptiden

Gesamtzahl der untersuchten Sera = 39

Legende

- keine Antwort wurde gemessen

+ OD 0,1-0,3 über normalem Katzen-Serum

++ OD 0,4-0,6 über normalem Katzen-Serum

+++ OD 0,7-1,0 über normalem Katzen-Serum

++++ OD > 1,5 über normalem Katzen-Serum

NA Serum war nicht erhältlich

Beispiel 3 Herstellung und Charakterisierung von Antikörpern gegen KIV-Peptide Einleitung

Zur Einschätzung des immunogenen Potentials der zehn KIV-Peptide wurde jedes Peptid an einen Proteinträger (Keyhole Limpet Haemocyanin- KLH) gekoppelt und 10 Gruppen von zwei Meerschweinchen und zwei Kaninchen wurden subkutan unter Verwendung einer 23 G Nadel mit 50 ug in einer Dosis von 50 ml inokuliert. Alle Tiere wurden wie oben an den Tagen 42 und 48 aufgefrischt und Antisera, die am Tag 108 gesammelt wurden, wurden auf antihomologe Peptide, anti-KLH und anti-rekombinantes KIV gp130 durch ELISA und anti-KIV gp130 auf einem Western-Blot untersucht.

Ergebnisse

Die für Meerschweinchen und Kaninchen erhaltenen Ergebnisse sind jeweils in den Tabellen 3 und 4 dargestellt.

Es ist aus Tabelle 3 ersichtlich, daß hohe Titer (≥ 1 : 10240) Antipeptid-Antisera in den Meerschweinchen gegen acht der zehn Peptide erzeugt wurden. Die Peptide 7 und 9 (SEQ ID Nrn. 7 und 9) konnten keine nachweisbaren Peptidantworten entfalten, obgleich hohe Titerantworten gegenüber KLH erzeugt wurden. Der Grund dafür ist unklar. Darüber hinaus zeigten die Peptide 2, 5 und 6 (SEQ ID Nrn. 2, 5 und 6) außerdem mit dem rekombinanten KIV gp130 in den ELISA und Western-Blots Reaktivität. Eine niedrige Aktivität gegenüber gp130 in den ELISA wurde außerdem bei dem Peptid 9 (SEQ ID Nr. 9) Antisera beobachtet, trotz der Tatsache, daß keine Antipeptid-Antikörper nachweisbar waren.

Die Tabelle 3 zeigt, daß Antipeptid-Antisera von Kaninchen mit hohem Titer (≥ 1 : 2560) gegen sechs der zehn Peptide (SEQ ID Nrn., 2, 4, 5, 6 und 9) erzeugt wurden, während niedrige Titer-Antisera (1 : 40 bis 1 : 320) gegen die restlichen vier Peptide (SEQ ID Nrn. 3, 7, 8 und 10) erzeugt wurden. Nur mit einer Ausnahme (Kaninchen 11, Titer 1 : 640) waren die Antworten gegen KLH im allgemeinen hoch (1 : 10240). Die ELISA-Reaktivität gegen KIV gp130 wurde in zwölf der Antisera nachgewiesen, die acht der zehn untersuchten Peptide umfassen. Nur die Peptide 1 und 7 (SEQ ID Nrn. 1 und 7) erzeugten keine Anti-KIV gp130 Aktivität, nachgewiesen gemäß ELISA, obwohl die Peptid 7 (SEQ ID Nr. 7) Antisera etwas Aktivität gegenüber gp130 auf dem Western-Blot zeigten. Interessanterweise reagierten einige der Antipeptid-Antisera mit nachweisbarer Aktivität gegen KIV gp130 in einem ELISA (3, 8, 9 und 10) nicht mit denaturiertem gp130 auf einem Western-Blot.

Schlußfolgerungen

Diese Ergebnisse zeigen, daß es nach der chemischen Konjugation der Peptide an einen Proteinträger möglich ist, Antipeptid-Antikörper gegen alle 10 der KIV-Peptide zu erzeugen. Außerdem zeigen ausgewählte Sera gegenüber neun der zehn Peptide etwas Anti-KIV-Hüllproteinaktivität. Obwohl die funktionelle Bedeutung dieser Ergebnisse nicht bekannt ist, deuten sie auf die Nützlichkeit dieser Peptide für die KIV-Vakzin-Entwicklung hin.

Tabelle 3 Antikörper-Antworten am Tag 108 bei Meerschweinchen, die mit KLH, das an die KIV-Peptide 1 bis 10 gekoppelt ist, immunisiert sind

NA nicht erhältlich (das Tier starb)

- keine Antwort nach dem Tag 0

++ starke 130kd Bande

+ schwache 130kd Bande

Tabelle 4 Antikörper-Antworten am Tag 109 bei Kaninchen, die mit KLH, das an die KIV-Peptide 1 bis 10 gekoppelt wurde, immunisiert sind

NA nicht erhältlich (das Tier starb)

keine Antwort nach dem Tag 0

++ starke 130kd Bande

+ schwache 130kd Bande


Anspruch[de]

1. Synthetisches Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus:

oder ein antigenes Fragment, eine funktionell-äquivalente Variante, die die immunogene Aktivität beibehält, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.

2. Synthetisches Polypeptid nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der KIV-Bekämpfung.

3. Synthetisches Polypeptid nach Ansprüchen 1 oder 2 in Form eines Fusionsproteins, umfassend ein zusätzliches Polypeptid, das an diese Aminosäuresequenz gebunden, oder das an ein Trägerprotein oder ein Polypeptid gekoppelt ist.

4. Verwendung eines synthetischen Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur KIV-Bekämpfung.

5. Nucleinsäuremolekül, umfassend eine Nucleotidsequenz, die einen Bereich der KIV env Gen codierenden Reste des KIV-Hüllproteins umfaßt, ausgewählt aus:

Reste (1) 377-417 und/oder

(2) 462-490 und/oder

(3) 354-377 und/oder

(5) 417-445 und/oder

(6) 320-339 und/oder

(7) 161-190 und/oder

(8) 248-267 und/oder

(10) 716-736,

oder einen Teil davon, der ein antigenes KIV-Fragment codiert oder eine Sequenz, die degeneriert ist oder eine Sequenzhomologie mit dieser von mehr als 60% hat oder die unter stark stringenten Bedingungen mit einer der vorgenannten Sequenz hybridisiert, zur Verwendung bei der KIV-Bekämpfung.

6. Nucleinsäuremolekül, umfassend eine erste Nucleotidsequenz, die einem Bereich der KIV env Gen codierenden Reste des KIV-Hüllproteins entsprechen, ausgewählt aus:

Reste

(1) 377-417 und/oder

(2) 462-490 und/oder

(3) 354-377 und/oder

(5) 417-445 und/oder

(6) 320-339 und/oder

(7) 161-190 und/oder

(8) 248-267 und/oder

(10) 716-736,

oder einen Teil davon, der ein antigenes KIV-Fragment codiert oder eine Sequenz, die degeneriert ist oder eine Sequenzhomologie mit dieser von mehr als 60% hat oder die unter stark stringenten Bedingungen mit jeder der vorgenannten Sequenz hybridisiert, zusammen mit mindestens einer zusätzlichen Nucleotidsequenz, die von dieser ersten Nucleotidsequenz flankiert ist, wobei die zusätzliche Nucleotidsequenz nicht mehr als 900 Basen umfaßt.

7. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 6 zur Verwendung bei der KIV- Bekämpfung.

8. Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls, nach Anspruch 5 oder 6 bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur KIV-Bekämpfung.

9. Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls, umfassend eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, das neutralisierende Antikörper gegen KIV entwickeln kann, wobei die Sequenz ein oder mehrere antigene Determinant-codierende Bereiche von den Bereichen der KIV env-Gen codierenden Reste des KIV-Hüllproteins, ausgewählt aus

Reste

(1) 377-417 und/oder

(2) 462-490 und/oder

(3) 354-377 und/oder

(5) 417-445 und/oder

(6) 320-339 und/oder

(7) 161-190 und/oder

(8) 248-267 und/oder

(10) 716-736,

enthält, oder eine Sequenz, die degeneriert ist oder die mit dieser eine Sequenzhomologie von mehr als 60% hat oder die unter stark stringenten Bedingungen mit jeder der vorgenannten Sequenzen hybridisiert für die Herstellung einer Zusammensetzung zur KIV-Bekämpfung.

10. Expressions- oder Klonierungsvektor, umfassend ein Nucleinsäuremolekül, das eine Nucleotidsequenz, wie in Anspruch 5 definiert, umfaßt.

11. Wirtszelle oder transgener Organismus, enthaltend ein Nucleinsäuremolekül, das eine Nucleotidsequenz, wie in Anspruch 5 definiert, oder einen Expressionsvektor, wie in Anspruch 10 definiert, umfaßt.

12. Verfahren zur Herstellung eines synthetischen Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend Kultivieren von Wirtszellen, wie in Anspruch 11 definiert, unter Bedingungen, bei denen dieses Polypeptid exprimiert wird und Gewinnen dieses so hergestellten Polypeptids.

13. Verfahren zur Herstellung eines synthetischen Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem ein entsprechendes geschütztes oder immobilisiertes Polypeptid der Entfernung der Schutzgruppen oder Entfernung von einem festen Träger unterworfen wird.

14. Zusammensetzung zur KIV-Bekämpfung, umfassend ein oder mehrere synthetische Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einen Expressionsvektor oder eine Wirtszelle, in die ein Nucleinsäuremolekül eingeführt ist, das eine Nucleotidsequenz nach Anspruch 5 umfaßt, zur Stimulierung einer Immunantwort, die gegen Polypeptide gerichtet ist, die durch das eingeführte Nucleinsäuremolekül codiert sind, zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutischen Trägern oder Verdünnungsmitteln.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 14, die zusätzlich ein oder mehrere andere antigene KIV-Proteine und/oder Polypeptide umfaßt.

16. Antikörper, die spezifisch an ein synthetisches Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 binden.

17. Verfahren zum Nachweisen von Antikörpern gegen KIV, wobei das Verfahren das Kontaktieren einer oder mehrere synthetischer Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit einer Probe, die diesen Antikörper umfaßt, und Nachweisen der Gegenwart eines zwischen diesem Polypeptid und dem Antikörper gebildeten Komplex, umfaßt.

18. Testkit zur Verwendung beim Nachweis von Antikörpern gegen KIV in einer Probe, umfassend ein oder mehrere synthetische Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und Mittel zum Nachweisen der Komplexbildung zwischen diesem Polypeptid und dem Antikörper.







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