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Dokumentenidentifikation DE69033006T2 23.09.1999
EP-Veröffentlichungsnummer 0485611
Titel HERSTELLUNGSVERFAHREN FÜR EIN PLASMID MIT FÄHIGKEITEN ZU EXPRESSION UND PROZESSIERUNG NACH TRANSLATION EINES RETROVIRALEN GENS, SO ERHALTENES PLASMID UND DESSEN EXPRESSIONSPRODUKT
Anmelder The Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University, Suita, Osaka, JP
Erfinder SAITO, Atsushi, Kanonji Inst. Research Foundation, 2-9-41Yahata-cho, Kanonji-shi Kagawa 768, JP;
TANAKA, Naoto, Kanonji Inst. Research Foundation, Yahata-cho, Kanonji-shi, Kagawa 768, JP;
SHINAGAWA, Hideo, D-17-204, 1-24, Satakedai, Osaka 565, JP;
NAKATA, Atsuo, 1-201, 6-24, Higashitoyonaka-cho, Osaka 560, JP
Vertreter Abitz & Partner, 81679 München
DE-Aktenzeichen 69033006
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 30.11.1990
EP-Aktenzeichen 909176901
WO-Anmeldetag 30.11.1990
PCT-Aktenzeichen JP9001561
WO-Veröffentlichungsnummer 9118990
WO-Veröffentlichungsdatum 12.12.1991
EP-Offenlegungsdatum 20.05.1992
EP date of grant 17.03.1999
Veröffentlichungstag im Patentblatt 23.09.1999
IPC-Hauptklasse C12N 15/48
IPC-Nebenklasse C12N 15/49   C12N 1/21   C12R 1/19   

Beschreibung[de]
GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Plasmid mit hoher Expressionsfähigkeit für das nef- Gen und das Nef-Proteinmolekül, das ein Expressionsprodukt davon ist.

STAND DER TECHNIK (Definition des Retrovirus)

Retrovirus ist der allgemeine Name von Viren, die als zur Retrovirenfamilie zugehörig klassifiziert werden und durch allgemeine Merkmale gekennzeichnet sind, wie eine Virusmembran, ein einzelsträngiges RNA-Genom und eine Reverse Transkriptase. Dieses Virus hat eine kugelige Gestalt mit einem Durchmesser von 80 bis 100 nm, und sein Genom besteht aus zwei Molekülen linearer (+)-Strang-RNA mit einem Molekulargewicht von etwa 3 · 10&sup6;, wobei diese zwei Moleküle ein invertiertes Dimer bilden.

Genauer ist die Retrovirenfamilie weiter in die drei folgenden Subfamilien eingeteilt: Onkovirus, Lentivirus und Spumavirus (R. E. F. Matthews, Herausg., "Classification and Nomenclature of Viruses-Fourth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses", S. 124-128, S. Karger [Schweiz] 1982). Bekannte als Onkoviren eingeteilte Viren, die auch als RNA-Tumorviren bezeichnet werden, sind u. a. menschliches T-Zell-Leukämievirus, Katzenleukämievirus, Maussarkomvirus, Moloney-Mausleukämievirus, Rinderleukämievirus, Schweineleukämievirus, Vogelleukämievirus, Vogelsarkomvirus, Vogelmyeloblastosevirus und Rous-assoziiertes Virus. Bekannte als Lentiviren eingeteilte Viren, die gewöhnlich als Viren bekannt sind, die eine langsame Virusinfektion hervorrufen, sind u. a. die menschlichen Immunschwächeviren Typ 1 und 2 (nachstehend als "HIV-1" bzw. "HIV-2" bezeichnet), Affenimmunschwächevirus, Visnavirus, das die Schafsenzephalomyelitis hervorruft, Maedivirus, das die Jaagsiekte hervorruft, Ziegenarthritis-Enzephalitisvirus, das Infektiöse-Pferdeanämie-Virus und Rinderlymphadenitisvirus ("Current Topics in AIDS", Bd. 1, S. 95-117, John Wiley & Sons, 1987; Advances in Virus Research, Bd. 34, S. 189- 215, 1988). Die als Spumaviren klassifizierten, auch als Foamy-Viren bezeichneten Viren infizieren Säuger, wie Menschen, Affen, Rinder und Katzen. Das aus diesen Wirten isolierte Foamy-Virus und Syncytienvirus sind wohlbekannt. Der Ausdruck Retrovirus, wie er hier verwendet wird, kann so verstanden werden, daß er alle Viren, sowohl bekannte als auch unbekannte, beinhaltet, die wie oben beschrieben als Retroviren klassifiziert sind.

(Gegenwärtiger Stand der Grundlagenforschung im Hinblick auf Retrovirengene)

Retroviren sind nicht nur unter dem Gesichtspunkt der schwerwiegenden und oft tödlichen infektiösen Erkrankungen wichtig, die sie in Menschen und anderen Tieren hervorrufen, sondern sie sind auch nützlich für das Verständnis von Erkrankungen, wie Sarkom, und zur Herstellung von Material für die Verwendung in Forschung und Gentechnologie. Folglich wurde in der Literatur viel über diese Viren veröffentlicht. Wie wohlbekannt ist, wurden vor 1980 Retroviren als Modell für den onkogenen Mechanismus untersucht und wurden bei einer neuen und merkwürdigen langsamen Virusinfektionserkrankung impliziert, die zu unheilbaren Sekundärerkrankungen führte. Seit der Identifizierung dieser Erkrankung als AIDS 1981 in den Vereinigten Staaten wurden vergleichende Studien an verschiedenen Retroviren intensiv durchgeführt, wobei das gesamte Spektrum an Techniken der Epidemiologie, Immunologie, Virologie und Molekularbiologie im Hinblick auf die Etablierung von Verfahren zur Behandlung und Vorbeugung von AIDS verwendet wurde. Eine große Menge an nützlichen Berichten bezüglich AIDS wurde bereits zusammengetragen (Advances in Virus Research, Bd. 34, S. 189-215, 1988; Annual Review of Immunology, Bd. 6, S. 139-159, 1988; Microbial Pathogenesis, Bd. 5, S. 149-157, 1988; "HIV and other Highly Pathogenic Viruses", S. 33-41, Academic Press, Inc., 1988; "The control of Human Retrovirus Gene Expression", S. 79-89, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Cytological Engineering, Bd. 7 (Suppl. 1), S. S5-S15, 1988).

Im Lentivirus bildet das Virusgenom einen Komplex mit der Reversen Transkriptase, dem Strukturprotein und einer Primer-tRNA im Nukleocapsid des Viruspartikels. Das Virusgenöm umfaßt etwa zehn verschiedene Gene, einschließlich der grundlegenden drei Hauptgene, die die für die Virusvermehrung wesentlichen Viruspartikelkomponenten codieren, d. h. das gag- (gruppenspezifisches Antigen-) Gen, das den Vorläufer des Nukleocapsidproteins (Kernproteins) codiert, das pol- (Polymerase-) Gen, das einen Vorläufer von drei verschiedenen Enzymen codiert, und das env- (Virusmembran-) Gen, das den Vorläufer des Virusmembranglykoproteins codiert; diese Gene sind vom 5'- zum 3'-Ende in der Reihenfolge gag, pol und env angeordnet. Lentiviren, wie HIV, enthalten das ungewöhnliche Gen vif, und die Gene sind in der spezifischen Reihenfolge gag, pol, vif und env angeordnet. Ein Teil des Bereichs am 5'-Ende des pol-Gens überlappt etwa 240 Basen mit dem Bereich am 3'-Ende des gag-Gens und hat einen unterschiedlichen Leserahmen; man nimmt an, daß die Verschiebung des Leserahmens während der Translation dieses überlappenden Abschnitts auftritt. Nach der Translation des Vorläuferproteins mit einem Molekulargewicht von 55 kd von der gesamten gag-Region mit einer Gesamtlänge von etwa 1,5 kb einschließlich des überlappenden Anteils tritt ein Schnitt auf, d. h. eine Prozessierung durch eine Protease, und es entstehen wahrscheinlich drei Proteinarten, die als Matrixprotein, Capsid bzw. Nukleocapsid dienen, d. h. in der Reihenfolge der oben angegebenen Aufzählung p17, p24 und p15. Die Expression der gesamten pol-Genregion mit einer Gesamtlänge von etwa 3 kb erzeugt den oben erwähnten Enzymvorläufer (Molekulargewicht: 100 kd) in Form eines Fusionsproteins, das sich als NH&sub2;- Protease--Integrase--COOH darstellen läßt, und dann wird dieses Fusionsprotein selbst unter der Wirkung der vom Virus hergestellten vorhandenen Protease oder durch die Proteaseaktivität innerhalb desselben Moleküls geschnitten oder gespalten, und dieser als Prozessierung bekannte Vorgang wandelt es wahrscheinlich in einzelne reife Proteine (aktive Proteine) um, d. h. einzelne Enzyme, einschließlich der Protease (p12), Reversen Transkriptase (p66 und p51) und der Integrase (p32) (Journal of Virology, Bd. 62, Nr. 5, S. 1808-1809, 1988).

Alle vorstehend erwähnten Enzyme spielen wichtige Rollen beim Vorgang der Virusvermehrung und bei der produktiven Infektion, und die folgenden Funktionen wurden bestätigt oder angenommen: Die Protease ist an der posttranslationalen Prozessierung, Nukleocapsidbildung und der Reifung des Viruspartikels beteiligt und ist hochspezifisch für die Viren, aus denen sie stammt. Es ist bekannt, daß die Reverse Transkriptase drei verschiedene enzymatische Aktivitäten besitzt. So wirkt sie als RNA-abhängige DNA-Polymerase, die den Vorgang der reversen Transkription der genomischen RNA in DNA katalysiert, der der grundlegende Schritt des Virusvermehrungsvorgangs ist. Gleichzeitig spaltet die Ribonuklease-II-Aktivität des Enzyms spezifisch den RNA-Strang des gebildeten RNA-DNA-Heteroduplexes, und die DNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivität erzeugt doppelsträngige DNA. Die Reverse Transkriptase wird allgemein als Werkzeug zur genetischen Rekombination verwendet. Die Integrase ist eine Endonuklease, die auf die DNA-Kette wirkt und das Ausschneiden des Teils der linearen oder zirkulären doppelsträngigen Virus-DNA erkennt und katalysiert, der von der genomischen Virus-RNA transkribiert worden ist und in die chromosomale Wirts-DNA integriert werden soll, und nimmt somit wahrscheinlich am Vorgang der Provirus-Bildung teil ("HIV and other Highly Pathogenic Viruses", S. 33-41, Academic Press, Inc., 1988; "The Control of Human Retrovirus Gene Expression", S. 79-89, Cold Spring Harbour Laboratory, 1988; Cell Technology (in Japanisch), Bd. 7 (Suppl. 1), S. S5-S15, 1988; AIDS Journal (in Japanisch), Bd. 1, Nr. 3, S. 291-300, 1988; Aids, Bd. 2 (Suppl. 1), S. S29-40, 1988; KAGAKU-TO-SEIBUTSU (in Japanisch), Bd. 27, Nr. 4, S. 218-227, 1989).

Der Bereich des nef-Gens mit einer Gesamtlänge von etwa 0,4 kb codiert einen negativen Regulationsfaktor mit einem Molekulargewicht von etwa 27 kd, und dieser Regulationsfaktor beendet wahrscheinlich die Vermehrung von HIV, indem er hemmend auf die Expression des HIV- Genoms wirkt, und geht so wahrscheinlich mit der latenten Infektion einher ("Virology", herausgegeben von B. N. Fields et al., Bd. 2, S. 1534-1535, veröffentlicht von Raven Press [U. S.] 1990).

[Gegenwärtiger Stand und gegenwärtige Probleme der Massenproduktion retroviraler Genprodukte durch Gentechnologie]

Die Massenproduktion von Genprodukten (nachstehend als "Antigene" bezeichnet) wird weitverbreitet an vielen Orten der Welt zum Zweck der Entwicklung von Impfstoffen für Menschen und Tiere und von diagnostischen Arzneimitteln durchgeführt. Als typisches Beispiel ist nachstehend die Massenproduktion von AsS-Virus-Antigenen erläutert. Die hauptsächlichen für die Massenproduktion untersuchten Antigene sind u. a. das Vorläufer-Glykoprotein gp160 des env-Gens und die prozessierten Produkte davon, gp 120 und gp 41 ("Forefront of Countermeasures Against AIDS", herausgegeben und verfaßt von Toshiaki Komatsu, Bd. 2, S. 477-495, veröffentlicht von CMC, 1989). Zur Herstellung von gp160 wird beispielsweise die Verwendung eines Vaculovirus-Vektors und von Insektenzellen (Proceedings of the National Academy of Sciences "USA", Bd. 84, S. 6924- 6928, 1987), eines rekombinanten Vacciniavirus und von BSC-40- oder HeLa-Zellen (Nature, Bd. 320, S. 537-540, 1986; Nature, Bd. 330, S. 259-262, 1987) und eines Adenovirus-Vektors und von A549-Zellen ("Vaccine 89", S. 207-217, Cold Spring Harbour Laboratory, 1989) berichtet. Auch die Expression des gp120-Genbereichs mittels eines in diesen Bereich inserierten und mit ihm verbundenen Plasmids und einer CHO-Zellinie (Science, Bd. 233, S. 209-212, 1986) und die Herstellung von gp120 mit Escherichia coli (Science, Bd. 234, S. 1392-1395, 1986) wurden beschrieben. Außerdem sind diesbezügliche bekannte Techniken eingeteilt und unten kurz aufgeführt worden (nachstehend werden Europäische Patente mit vorläufiger Veröffentlichungs-Nr. abgekürzt als [EP], Westdeutsche Patente mit vorläufiger Veröffentlichungs-Nr. als [DE], U. S. -Patent-Anmelde-Nr. als [US], PCT-Internationale Veröffentlichungs-Nr. als [WO] bzw. Französische Patente mit vorläufiger Veröffentlichungs-Nr. als [FR]):

(1) Auf die Massenproduktion von Genen, wie gag, Pol und env, abzielende Techniken (nachstehend für jeden verwendeten Wirt beschrieben):

Escherichia coli (EP 331961, EP 322394, DE 37 27 137, DE 37 24 016, EP 293792, US 88- 168486, US 88-218304, US 87-110348, EP 255190, WO 87/07296, DE 37 11 016, EP 227169, EP 199301. EP 219106);

Hefe (DE 38 04 891, EP 322394, US 88-168486);

(2) Techniken zur Herstellung von rekombinantem Vacciniavirus, in das Gene, wie gag, pol und env, inseriert sind:

Japanische Vorläufige Patentveröffentlichung Nr. 1-148183, FR 2620030, FR 2607518, FR 2600079, FR 2587720, FR 2596711, EP 256677, WO 87/06260, WO 87/06262;

(3) Techniken zur Expression des env-Gens durch Virusvektoren: Verwendung des Polyomavirus (Japanische Vorläufige Patentveröffentlichung Nr. 1-39991) und des Vaculovirus (EP 272858, EP 265785); und

(4) Techniken zur Expression von AIDS-Virus-Antigen als Fusionsprotein mit Hepatitis-B-Virus-Antigen (EP 278940).

Abgesehen von der Herstellungstechnik für rekombinantes Virus, das als wirksame Komponente eines Lebendimpfstoffes anwendbar ist; sind beispielsweise drei Elemente, einschließlich Massenexpression, Sekretion von Genprodukten außerhalb des Wirtes und die Prozessierung nach der Translation sehr wichtig im Hinblick darauf, daß niedrige Produktionskosten und eine hohe Qualität bei der industriellen Herstellung geeigneter Proteine mittels eines Expressionsvektors gewährleistet sind, und es ist notwendig, diese drei Elemente bei der Konstruktion eines Expressionsvektors zu berücksichtigen. Aus der obigen Beschreibung des Standes der Technik wird deutlich, daß die Massenexpression von verschiedenen Forschern untersucht worden ist, und die Entwicklung eines sekretorischen Produktionssystems (Nippon Nogeikagaku Kaishi (in Japanisch), Bd. 60, Nr. 5, S. 1035-1063, 1990) schreitet weitverbreitet und aktiv voran. Im Gegensatz dazu wird jedoch der Ausarbeitung der Prozessierung nach der Translation trotz ihrer Wichtigkeit für die Arbeitsersparnis beim Verfahren zur Reinigung der Genprodukte und Verbesserung der Reinheit dieser Produkte wenig Aufmerksamkeit geschenkt. Daher ist es offensichtlich, daß die Entwicklung eines Expressionssystems, das die Prozessierung nach der Translation ermöglicht, eine wichtige Bedeutung hat. Da sich das Nef-Protein für das Gebiet der AIDS-Diagnose und zur Aufklärung des Krisenmechanismus und, im Hinblick auf seine Antigenizität und Funktionen, zur Therapie eignet, wird die Entwicklung einer Massenproduktionstechnik erwartet.

ZIEL DER ERFINDUNG

Die Erfinder haben ausgiebige Untersuchungen durchgeführt und als Ergebnis erfolgreich die Massenexpression von sechs von den gag- und pol-Genen des Retrovirus codierten Proteinarten und deren Prozessierung herbeigeführt. Es wurden Plasmide hergestellt, die die Massenproduktion von drei Arten von viralen Nukleocapsidproteinen, gag-Genprodukten des Retrovirus, einschließlich p17, p24 und p15, und drei Enzymarten, die pol-Genprodukte sind, einschließlich der Protease, Reversen Transkriptase und Integrase einzeln und unabhängig in Form von reifen oder aktiven Proteinmolekülen mit hoher und stabiler Produktionsausbeute und niedrigen Kosten ermöglichen. Diese Errungenschaft war möglich, indem durch volle Ausnutzung der DNA-Rekombinationstechnologie ein mit cDNA-Fragmenten von Genen des Virus verbundenes Plasmid so hergestellt wurde, daß es das Proteasegen des Retrovirus durch In-Übereinstimmung-bringen des Translationsrahmens innerhalb des induzierbaren Massenexpressionsgens oder innerhalb des direkten Genexpressionsvektors als wesentliche Komponente enthielt, wodurch das Plasmid die oben genannten Genprodukte in hoher Ausbeute exprimierte, und durch Identifizieren der Prozessierung des Genprodukts selbst durch die exprimierte Protease. Direkte Expression bedeutet, daß das Retrovirusgen nicht indirekt in Form eines Fusionsproteins mit einem anderen Protein exprimiert wird, das von der vorherigen Kombination des Gens im Vektor herrührt. Es war ferner möglich, eine Transformante zu erhalten, indem das durch Insertion und Bindung der oben genannten Gen-cDNA konstruierte Plasmid in eine Wirtszelle eingebracht wurde und gleichzeitig die oben genannten von der cDNA codierten Nukleocapsidproteine und Enzyme nicht als Fusionsproteine, sonderen als jeweilige reife Proteine mit einer spezifischen Aktivität durch Anwendung des später beschriebenen Zwei-Stufen-Kulturverfahrens für die Kultur der Transformante im Kulturprodukt in sehr großer Menge stabil hergestellt wurden. Außerdem wurde gefunden, daß die Prozessierung unter der Wirkung der spezifischen Aktivität der Protease erfolgte, die einen Teil des Fusionsproteins bildete, das ein Expressionsprodukt des oben erwähnten Gens war, d. h. die Prozessierung war ein intrinsisches Phänomen des Proteasegens des Retrovirus. Es wurde ferner gefunden, daß die oben genannten so prozessierten Proteine leicht in Massen hergestellt und mit ausgezeichneter hoher Reinheit und Gleichmäßigkeit und insbesondere sowohl mit hoher Enzymaktivität als auch Antigenizität gereinigt werden konnten, die durch eine für das Virus einzigartige sehr hohe Substratspezifität gekennzeichnet waren.

Die Erfinder erreichten auch die Massenproduktion des Nef-Proteins mit einer sehr spezifischen Antigenizität. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage dieser Befunde vollendet.

Erfindungsgemäß werden ein Verfahren zur Herstellung eines Expressionsvektors, der die Massenexpression oder Massenproduktion ermöglicht, und die Prozessierung von Protein, das von dem mit dem Virus einhergehenden nef-Gen codiert wird, sowie das erhaltene Plasmid und dessen Expressionsprodukte bereitgestellt. Insbesondere stellt die Erfindung einen Expressionsvektor bereit, der eine dem nef-Gen oder einem Teil davon entsprechende cDNA-Sequenz und eine Plasmid-DNA umfaßt, die aus der pUR290-Plasmidreihe und dem Plasmid pT7-7 ausgewählt ist. Dieses Plasmid und das Nef-Protein, das das Expressionsprodukt des Plasmids darstellt, eignen sich als Materialien zur Forschung an der Vorbeugung und Therapie von Retrovirus-Infektionserkrankungen, als Reagenzien auf Gebieten, wie Gentechnologie, Proteintechnologie, Molekularbiologie und Entwicklung pharmakotherapeutischer Arzneimittel und von Antivirusmitteln gegen Retrovirus-Infektionserkrankungen sowie als Antigene zur Herstellung von Impfstoffen, diagnostischen Arzneimitteln und Antikörpern.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, die die Titer der Reversen Transkriptase-Aktivität von Rohextrakten von Escherichia coli, die mit dem das HIV-pol-Gen tragenden Plasmid pPG280 transformiert wurden, und von E.coli, die mit dem Vektor pUR290, der kein kein HIV-pol-Gen enthält, transformiert wurden, veranschaulicht; Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, die das Ergebnis der Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines aus HIV-Trägern erhaltenen menschlichen Serums von Rohextrakten von E. coli, die mit dem HIV-pol-Gen tragenden Plasmid pPG280 transformiert wurden, und von E. coli, die mit dem Vektor pUR290, der kein HIV-pol-Gen enthält, transformiert wurden, veranschaulicht; Fig. 3 ist eine graphische Darstellung, die das von E. coli-Rohextrakten auf einer Anionenaustauschsäule stammende Reverse-Transkriptase-Elutionsprofil veranschaulicht. Fig. 4 ist eine graphische Darstellung, die die Reinigung von Reverser Transkriptase mittels Affi-Gel- Heparin-Chromatographie veranschaulicht.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die folgenden Konstruktionen eignen sich zur Expression retroviraler Gene:

(I) Auswahl der retroviralen Gene und Herstellung von cDNA-Fragmenten: Bezüglich der retroviralen Gene können Gene, wie gag und pol von Retrotransposons, verwendet werden. Genauer, werden im Fall von HIV beispielsweise Gene innerhalb der gag-Region, die Nukleocapsidproteine, p17, p24 und p15, und Gene innerhalb der pol-Region, die die Protease, Reverse Transkriptase und Integrase codieren, verwendet. Die Expression dieser Gene erfordert die Verwendung des Proteasegens, und cDNA-Fragmente retroviraler Gene, die so hergestellt sind, daß sie mindestens unter den vorstehend als Beispiele aufgelisteten retroviralen Genen die Proteasegenregion enthalten, werden durch Bindung im passenden Leserahmen an ein Gen, daß stark exprimiert werden kann, verwendet. Bei der Genexpression durch DNA-Rekombinationstechnik, wobei das retrovirale Genom eine RNA ist, werden diese Gene verwendet, nachdem sie in komplementäre DNA umgewandelt worden sind. Diese cDNA kann durch Klonieren entweder eines Provirusgenoms oder der genomischen DNA eines integrierten Virus hergestellt werden. Alternativ kann die erforderliche cDNA auch aus cDNA- Banken erhalten werden, die direkt von der Virusgenom-RNA unter Verwendung herkömmlicher Techniken hergestellt worden sind. Mit jeder Herstellungstechnik, die auf der direkten Verwendung eines Retrovirus beruht, geht jedoch ein Infektionsrisiko einher. Um die mit der direkten Arbeit mit dem Virus verbundenen Gefahren zu vermeiden und bei den oben genannten Herstellungsverfahren Arbeit zu sparen, wird daher die Verwendung einer bekannten und öffentlich zugänglichen, klonierten retroviralen genomischen cDNA empfohlen. Wie zuvor beschrieben, wurden insbesondere die Klonierung verschiedener Retrovirusgenome, ihre Sequenzierung, die Herstellung von Restriktionsenzymkarten bereits von Forschern auf der ganzen Welt beschrieben, und die Verwendung ihrer Errungenschaftenkann aufgrund von Faktoren der Sicherheit und Bequemlichkeit wünschenswert sein. Die verfügbaren Klone sind u. a. beispielsweise ein Plasmid pSRA2 (Journal of Virology, Bd. 36, S. 50-61, 1980), das das Genom des Vogelsarkomvirus trägt, HIV-1-Provirusgenomklone, d. h. die Plasmide pNL3-1, pNL3-2 und pNL4-3 (Journal of Virology, Bd. 59, S. 284-291, 1986), HIV-1- pol-Gen-Klone, d. h. das Plasmid pNLH402 der E. coli-Stämme UT481/pNLH402 (hinterlegt beim Fermentation Research Institute, Japan, unter der Zugangsnummer FERM BP-2417), E. coli JM109/pCV91 (hinterlegt beim Fermentation Research Institute, Japan, unter der Zugangsnummer FERM BP-3195) sowie E. coli JM109/pNLH122 (hinterlegt beim Fermentation Research Institute, Japan, unter der Zugangsnummer FERM BP-3196). cDNA-Fragmente können aus diesen Plasmiden durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden; beispielsweise durch Spalten der DNA aus der erforderlichen Region der oben genannten Plasmidklone mittels eines Restriktionsenzyms und Reinigen des erhalten Produktes durch Phenolextraktion, Chloroformbehandlung oder Ethanolfällung. Das zum Ausschneiden von DNA-Fragmenten verwendete Restriktionsenzym kann durch Bezugnahme auf die Restriktionsenzymkarte des genomischen DNA-Klons geeignet ausgewählt werden. So kann zum Beispiel zum Ausschneiden von DNA-Fragmenten aus der gesamten pol-Genregion des oben erwähnten pNLH402 das Restriktionsenzym indlil verwendet werden (Journal of Virology, Bd. 59, S. 284-291, 1986).

(II) Konstruktion eines Retrovirusgen-Expressionsplasmids und Herstellung einer Transformante mit Einführung des so konstruierten Plasmids: Ein Retrovirusgen-Expressionsplasmid wird konstruiert, indem wie oben beschrieben hergestellte cDNA-Fragmente des Retrovirusgenoms in ein Massenexpressionsgen oder einen direkten Genexpressionsvektor mittels herkömmlicher Verfahren eingebracht werden. Der hier bezüglich der vorliegenden Erfindung verwendete, vorstehend erwähnte Begriff "Plasmid" wird zur leichteren Bezeichnung verwendet und soll im weitesten Sinne des Wortes ein Replikon bedeuten, das ein retrovirales Gen exprimiert. Daher kann jeder der folgenden bekannten oder kommerziell erhältlichen Expressionsvektoren zur Konstruktion dieses Plasmids verwendet werden: Plasmidvektoren der pSN508-Reihe der Darmbakterienfamilie (U. S. -Patent Nr. 4703005), der Plasmidvektor pJM105 (Japanisches Patent mit der vorläufigen Veröffentlichungsnr. 62-286930) und die Vektoren der pBH103-Reihe (Japanisches Patent mit der vorläufigen Veröffentlichungsnr. 62-22098) der Hefe, Vektor aus abgeschwächtem Varicellavirus (Japanisches Patent mit der vorläufigen Veröffentlichungsnr. 53-41202), Vektor aus abgeschwächtem Virus der Marek-Erkrankung (Europäisches Patent mit der vorläufigen Veröffentlichungsnr. 334530), die Escherichiacoli-Plasmidvektoren der pUR290-Reihe (EMBO-Journal, Bd. 2, S. 1791-1794, 1983), pSN5182 (Journal of Bacteriology, Bd. 157, S. 909-917, 1984) sowie pl7-7 (Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), Bd. 82, S. 1074-1078, 1985). Wichtig bei der Konstruktion des Expressionsvektors ist, die oben erwähnten Gene mit einem Gen zu verbinden, das stark exprimiert werden kann. Wenn zum Beispiel eines der vorstehend genannten Plasmide der pUR290-Reihe verwendet wird, sollten somit die Gene vorzugsweise stromabwärts des lacZ-Gens des Plasmids oder im Fall des Plasmids pSN5182 stromabwärts des pstS-Gens des Plasmids oder im Fall von pT7-7 stromabwärts des Oligopeptidgens, das von T7-7 unter der Kontrolle des T7-Promotors gebildet wird, eingesetzt werden. Es ist wesentlich, daß die Protease zusammen mit dem Zielprodukt, durch oder nicht durch Verschieben des Leserahmens, exprimiert wird. Beispielsweise sollte im Falle von HIV-1; HIV-2, Affenimmunschwächevirus oder Moloney-Mausleukämievirus, bei denen die Protease in der pol-Genregion codiert ist, die dem pol-Gen entsprechende cDNA so verbunden werden, daß sie mit dem im Plasmid enthaltenen Gen übereinstimmt, das eine hohe Expressionsfähigkeit besitzt. Dagegen ist die Protease des Vogelsarkomvirus in der gag-Genregion codiert, die einen anderen Leserahmen als das pol-Gen besitzt, und entsprechend hat das Proteasegen des menschlichen T-Zelleukämievirus oder des Rinderleukämievirus noch einen anderen Leserahmen, der sich sowohl vom pol- als auch vom gag-Gen unterscheidet. In diesen Fällen ist Sorgfalt nötig, damit eine signifikante Expression der retroviralen Gene gewährleistet ist. Geeignete Wirtszellen, die zur Herstellung von Transformanten durch Einbringen des so konstruierten Expressionsvektors verwendet werden können, sind u. a. alle Zellen, die die Vermehrung und Expression des Expressionsvektors ermöglichen, und gleichzeitig sollten unter diesen Wirtszellen diejenigen, die ein leichtes Einbringen des konstruierten Expressionsvektors und seinen sicheren Nachweis ermöglichen, strikt für die Verwendung ausgewählt werden. Bei der Verwendung der oben erwähnten Plasmide der pSN-Reihe als Expressionsvektor ist es zum Beispiel wünschenswert, E.-coli-C75-Stämme (Microbiology Research Inst. Registrierungsnr. 10191) als Wirtszellen zu verwenden, die die Selektion der Transformante durch Einbringen dieses Vektors unter Verwendung von Arzneimittelresistenz als Marker ermöglichen. Bei Verwendung der pUR290-Reihe oder von pT7-7 ist es wünschenswert, E.-coli-UT481 (Journal of Bacteriology, Bd. 163, S. 376-384, 1985) oder E.-coli-BL21 (DE3) (Journal of Molecular Biolgogy, Bd. 189, Nr. 1, S. 113-130, 1986) einzusetzen, die die Selektion der Transformanten durch Einbringen dieser Vektoren unter Verwendung von Ampicillinresistenz als Marker ermöglichen. Das Einbringen des Expressionsvektors in eine solche Wirtszelle kann durch herkömmliche. Verfahren, wie das Calciumchloridverfahren (Journal of Molecular Biology, Bd. 53, S. 154-162, 1977) durchgeführt werden. Eine Transformante, die durch Einbringen des oben erwähnten gag- oder pol-Genexpressionsplasmids erhalten wird, wird aus positiven Kolonien durch Verwendung von Markern ausgewählt. Wenn eine Transformantenkolonie identifiziert ist, wird die Expressionsvektor-DNA isoliert und mit einem Restriktionsenzym gespalten, und die erhaltenen DNA- Fragmente werden einer Agarosegelelektrophorese unterworfen. Die Größe des eingebrachten DNA- Fragmentes kann dann gemessen und das Vorliegen eines DNA-Fragmentes, das dem (den) retroviralen Gen(en) entspricht, bestätigt werden. Wenn beispielsweise ein DNA-Fragment, das die gesamte pol-Genregion des Plasmids pNLH402 umfaßt, in den Expressionsvektor pUR290 eingebracht wird, kann in Restriktionsspaltungen der DNA, die aus mit dem Vektor transformierten Zellen erhalten wird, ein EcoRI-Fragment von etwa 4 kb DNA nachgewiesen werden.

(III) Bestätigung der Retrovirusgenexpression durch Klone der transformierten Zellen und Massenproduktion verschiedener Proteine durch Kultur der Transformanten: Die Bestätigung der Expression von Retrovirusgenen durch Klone der transformierten Zellen kann beispielsweise durchgeführt werden, indem Rohextrakte der Zellen durch die Western-Blot-Technik analysiert werden. Die Rohextrakte können beispielsweise durch Züchten und Induzieren der Transformante in einem herkömmlichen Kulturmedium, Sammeln der Zellen durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, Behandeln der gesammelten Zellen mit Natriumdodecylsulfat und 2-Mercaptoethanol, Unterwerfen der Zellen einer Zentrifugation bei hoher Geschwindigkeit und Sammeln der Überstandsflüssigkeit durchgeführt werden. Die Western-Blot-Technik kann gemäß dem herkömmlichen Verfahren unter Verwendung verschiedener kommerziell erhältlicher Materialien in den folgenden Schritten durchgeführt werden: Unterwerfen des oben erwähnten Rohextraktes einer Polyacrylamidgelelektrophorese, Übertragen des getrennten Proteins auf eine Nitrocellulosemembran unter Verwendung eines Transblot-Gerätes, Eintauchen der Membran in eine Gelatinelösung zur Blockierung und Nachweis des exprimierten Proteins beispielsweise mittels seiner immunologischen Reaktion. Wenn die Probe auf der Membran beispielsweise ein HIV-pol-Genprodukt ist, kann es somit durch Inkubieren der Membran mit einem Primärserum nachgewiesen werden, das von einem menschlichen HIV-Träger erhalten wurde, gefolgt von Waschen und Inkubieren mit einem Sekundärantikörper, der einen Peroxidase-konjugierten Anti-Mensch-IgG-Markerantikörper umfaßt; das Vorliegen des pol-Genproduktes wird durch Entwickeln einer gefärbten Bande bei Zugabe von Wasserstoffperoxidlösung und einem chromogenen Mittel nachgewiesen. Wenn das exprimierte Gen von einem anderen Retrovirus als HIV stammt, wird anstelle des Serums des menschlichen HIV-Trägers als Primärserum ein geeignetes retrovirales Antiserum eingesetzt, und ein Antikörper gegen Mensch- oder Tier-IgG wird als Sekundärantikörper verwendet.

Wenn die Expression des gag- oder pol-Gens bestätigt wurde, wird die Massenproduktion von verschiedenen Nukleocapsidproteinen und Enzymen, wie Protease, Reverse Transkriptase und Integrase, durch Kultur der Transformante wie folgt erzielt: Zum Zweck der Herstellung von Impfguten für Kulturen im großen Maßstab dieser Transformante wird beispielsweise, wenn die Transformante E.-coli ist, die Transformante in LB-Medium bei einer Temperatur von 30 bis 40ºC 12 bis 35 Stunden gezüchtet, bis eine Bakterienkonzentration von 2 · 10&sup9; bis 8 · 10&sup9; Zellen/ml erreicht ist; dann werden diese Impfgute in frisch hergestelltes Medium überimpft, und ein Hauptzuchtschritt wird durchgeführt, der in zwei Schritten erfolgt, einer Vorkultur und einer Nachkultur. Die Vorkultur wird zum Zweck der Vermehrung der Zellen und der Vermehrung des Expressionsvektors durchgeführt und erfolgt am besten bei einer Temperatur von 10 bis 40ºC für 1 bis 24 Stunden oder stärker bevorzugt bei einer Temperatur von 15 bis 37ºC für 2 bis 12 Stunden. Die Vorkultur wird beendet, wenn eine bestimmte Zellkonzentration erreicht ist, im Fall von E. coli beispielsweise, wenn die Kulturflüssigkeit eine OD600nm von 0,1 bis 2,0 erreicht. Nach Beendigung dieses Vorkulturschrittes wird anschließend das Kultursystem in den zweiten oder Nachkulturschritt überführt. Die Bedingungen für den Nachkulturschritt müssen sorgfältig ausgewählt werden, um zu gewährleisten, daß die korrekte Transkription und Translation der Gene und die korrekte posttranslationale Modifikation und Prozessierung des Genproduktes erfolgen kann, damit einzelne reife aktive Proteine hergestellt werden und auch, um den Abbau und die Inaktivierung der gewünschten Genprodukte durch Einwirkung proteolytischer Enzyme des Wirts zu vermeiden. Der Nachkulturschritt sollte vorzugsweise bei einer niedrigeren Temperatur als der des Vorkulturschrittes durchgeführt werden, d. h. bei einer Temperatur von 10 bis 40ºC für 1 bis 40 Stunden oder stärker bevorzugt bei einer Temperatur von 15 bis 37ºC für 3 bis 35 Stunden. Je nach dem besonderen verwendeten Expressionsvektor kann die Expression beschleunigt oder induziert werden, indem beispielsweise eine Verarmung an Phosphationen im Medium beim Start des Nachkulturschrittes verursacht oder ein Induktor in das Medium gegeben wird. Die Anwendung der oben erwähnten Zwei-Stufen-Kultur ermöglicht die Herstellung retroviraler Nukleocapsidproteine und solcher Enzyme, wie Protease, Reverser Transkriptase und Integrase, nicht in der Form von Fusionsproteinen, sondern als unabhängige aktive Proteine, d. h. als einzelne reife Proteine, gewöhnlich in einer hohen Ausbeute von 1 bis 30 mg pro Liter Medium.

(IV) Reinigung von Nukleocapsidproteinen und Enzymen, wie Protease, Reverse Transkriptase und Integrase: Dieses Verfahren kann durch eine Kombination herkömmlicher Verfahren bewerkstelligt werden. Geeignete Techniken sind beispielsweise u. a.: Isolation des synthetisierten Proteins durch Verwendung von Fällmitteln, Zentrifugation oder Filtration; Herstellung von Rohextrakten unter Verwendung von Ultraschallbehandlung, Hochdruckbehandlung oder eines Homogenisators zum Aufbrechen der Zellen; Reinigung durch Adsorption-Elution an Silica oder Aktivkohle, Aussalzen oder Fällung in organischen Lösungsmitteln sowie hochgradige Reinigung unter Verwendung von Ultrazentrifugation, Säulenchromatographie oder Elektrophorese. Das synthetisierte Protein kann zum Beispiel mittels Fraktionierung durch Dichtegradientenzentrifugation nach Adsorption- Elution mit Silica und Aktivkohle gereinigt werden (Vorläufige Japanische Patentveröffentlichung Nr. 63-297).

Der durch das erfindungsgemäße Verfahren verfügbare Expressionsvektor kann in einer in eine Ampulle, ein Gefäß oder einen anderen kleinen Behälter eingeschlossenen oder in einer in einen Wirt eingebrachten Form bereitgestellt werden. Die Nukleocapsidproteine und Enzyme, wie Protease, Reverse Transkriptase und Integrase, die durch den Expressionsvektor in Massen produziert werden, können in Form einer Flüssigkeit, eines getrockneten Pulvers oder adsorbiert an Filterpapier oder eine Membran sowie eingeschlossen in eine Ampulle, ein Gefäß oder einen anderen kleinen Behälter bereitgestellt werden. Wenn es in Pulverform bereitgestellt wird, kann das Protein in den erforderlichen Mengen vor Gebrauch durch geeignetes Lösen in destilliertem Wasser rekonstituiert werden. Wenn es adsorbiert an Filterpapier oder eine Membran zur Verfügung gestellt wird, sollte es nach dem Benetzen mit einer Lösung, wie in der Gebrauchsanweisung vorgeschrieben, verwendet werden.

Eingehende Beschreibung der Erfindung

Konstruktion des nef-Genexpressionsplasmids; Massenproduktion, Nachweis, Reinigung und Verwendung des Nef-Proteins: Dies kann durch Verfahren, ähnlich den in (I) bis (IV) oben aufgezählten, erzielt werden. Da sich das nef-Gen im HIV-Genom an einer anderen Stelle als gag und Pol befindet und die Produktion des Nef-Proteins keine Prozessierung nach der Translation erfordert, ist es jedoch vernünftiger und hat arbeitssparende Wirkung, dieses Protein als einzelnes Protein herzustellen. Daher ist es möglich, die Massenexpression des nef-Gens als einzelnes Protein ohne Berücksichtigung der Prozessierung bei der Massenproduktion des Nef-Proteins zu bewirken. Das nef- Genexpressionsplasmid wird durch Insertion in und Bindung von nef-Gen-cDNA-Fragmenten an ein Massenexpressionsgen oder einen direkten Genexpressionsvektor hergestellt. Das nef-Gen-cDNA- Fragment kann aus dem Plasmid pNL4-3 (Journal of Virology, Bd. 59, S. 284-291, 1986) oder dem Plasmid pNLH152 (hinterlegt beim Fermentation Research Institute, Japan, unter der Zugangsnummer FERM BP-3179) hergestellt werden, die eine nef-Genregion im HIV-Genom oder eine nef-GencDNA tragen.

Die folgenden Vorteile können unter Verwendung der beschriebenen Verfahren erzielt werden:

(1) Es ist gleichzeitig möglich, eine Massenexpression und Prozessierung retroviraler Gene durchzuführen, und bei der Massenproduktion eines retroviralen Antigens oder Enzyms unter Verwendung des Expressionsvektors, wobei die Verwendung des sehr gefährlichen Retrovirus selbst vermieden wird, ist die Produktion im Hinblick auf die biologische Gefährdung sicher, und die Durchführung ist einfach.

(2) Eine sehr hohe Produktionsausbeute der HIV-Proteine kann erzielt werden, beispielsweise von 1 bis 30 mg Protein pro Liter Bakterienkultur einschließlich verschiedener Nukleocapsidproteine, Enzyme und des Nef-Proteins.

(3) Das Verfahren, durch das zwar verschiedene Nukleocapsidproteine, Protease, Reverse Transkriptase und Integrase des Retrovirus als Fusionsproteine mit Massenexpressionsgenprodukten exprimiert werden, diese aber nicht im Zustand von Fusionsproteinen, sondern als prozessierte einzelne reife Proteine hergestellt werden, ist effizienter und praktischer als die Einzelexpression der oben erwähnten Gene. Berücksichtigt man außerdem die in (1) und (2) oben erwähnten Wirkungen, ist ein solches Verfahren auch ökonomischer und erfordert geringere Produktionskosten.

(4) Da das Verfahren bei niedrigen Kosten und in großer Menge Enzyme, die eine sehr hohe Spezifität für Retrovirussubstrate besitzen, sowie hochreine Antigene des Virus zur Verfügung stellt, kann erwartet werden, daß ein großer Fortschritt nicht nur in der Gentechnologie, sondern auch in der Grundlagenforschung an Retrovirusinfektionskrankheiten, wie AIDS, T-Zelleukämie bei Erwachsenen, Vogelsarkom oder -leukämie und Katzenleukämie, der Entwicklung spezifischer und selektiver therapeutischer und vorbeugender Arzneimittel und der Diagnose dafür stimuliert und außerdem die Menschengesundheits-, Hygiene- und Viehindustrie gefördert wird.

(5) Das Verfahren zur Herstellung eines Plasmids, das die Massenexpression und die nachtranslationale Prozessierung verschiedener Retrovirusgene und verschiedener Transposongene ermöglicht, kann zur Entwicklung effizienterer und vernünftigerer Massenproduktionstechniken für diese Genprodukte verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird jetzt anhand der folgenden nicht einschränkenden Beispiele eingehender beschrieben.

In den nachstehenden Beispielen wird die Reverse-Transkriptase-Aktivität wie folgt bestimmt: Ein Reaktionsgemisch wird hergestellt, das 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,3), 50 mM Kaliumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 3 mM Dithiothreitol, 0,1% (Gew./Vol.) NONIDET P-40 (hergestellt von Shell Oil [U. S. A.]), 20 ug/ml (rA)n(dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; (Pharmacia [Schweden]), 0,5 mM dTTP (Desoxythymidintriphosphat) und 1 Ci [³H]-dTTP (Desoxythymidintriphosphat) umfaßt. 5 ul Probe werden zu einem Gesamtvolumen von 50 ul Reaktionsgemisch gegeben und zehn Minuten bei 37ºC inkubiert. Das Gemisch wird dann sofort auf Eis abgekühlt und durch ein DE81-Filterpapier (hergestellt von Whatman [England]) filtriert. Das Filter wird gut mit 5%iger Natriumphosphatlösung gewaschen, mit Wasser und dann mit Ethanol gespült und getrocknet.

Die Radioaktivität wird mittels eines Flüssigszintillationszählers gemessen.

VERGLEICHSBEISPIEL 1 Konstruktion eines das pol-Gen eines Lentivirus tragenden Expressionsvektors

5 ug DNA des Plasmids pNL4-3 (Journal of Virology, 59(2): 284-291, 1986), das die HIV- Provirusgenom-DNA trägt, wurden zu 5 ul HindIII, 20 ul 5 x RM (50 mM Tris-HCl [pH-Wert 7,5], 35 mM MgCl&sub2;, 300 mM NaCl), die mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ul verdünnt wurden, gegeben und eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Lösung wurde dann mit Phenol, das mit TE (10 mM Tris-HCl [pH-Wert 7,5], 1 mM EDTA) gesättigt war, extrahiert. Die Wasserschicht wurde vor der Ethanolfällung mit Chloroform behandelt. Der Niederschlag wurde in 10 ul TE gelöst, und 1 ul dieser Lösung wurde zu 0,1 ug (1 ul) DNA des Plamides pHSG398 gegeben, die mit HindIII gespalten und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war. 2 ul 10 · Ligationspuffer (660 mM Tris-HCl [pH-Wert 7,6], 66 mM MgCl&sub2;, 100 mM DTT und 1 mM ATP) und 1 ul T4-DNA-Ligase wurden ferner zugegeben, und das Gesamtvolumen wurde mit destilliertem Wasser auf 20 ul gebracht. Das Gemisch wurde 12 Stunden bei 15ºC inkubiert. Der E.-coli-Stamm JM103 wurde gemäß dem Calciumchloridverfahren (Journal of Molecular Biology, 53: 154, 1970) mit dieser Reaktionsflüssigkeit transformiert, und eine Chloramphenicol-resistente Kolonie wurde auf einer LB-Medium-Platte (1% Gew./Vol. Bacto-Trypton, 0,5% Gew./Vol. Bacto-Hefeextrakt, 1% Gew./ Vol. NaCl und 1,5% Gew./Vol. Agar), die 20 ug/ml Chloramphenicol enthielt, selektiert. Plasmid- DNA wurde aus dem Chloramphenicol-resistenten Klon durch ein herkömmliches Verfahren isoliert, und ein Klon pNLH402 wurde durch Selektion eines Klons erhalten, der durch Ausschneiden mit HindIII etwa 4,0 kb große Fragmente enthielt, die von der DNA des Plasmids pNL4-3 stammten.

HindIII in einer Menge von 5 ul und 5 x RM in einer Menge von 10 ul wurden zu 5 ul (5 ug) DNA des Plasmids pNLH402 gegeben, und das Gemisch wurde mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 50 ul verdünnt. Das Gemisch wurde eine Stunde bei 37ºC inkubiert, und nach Phenolextraktion und Chloroformbehandlung wurde das Gemisch einer Ethanolfällung unterworfen. Der erhaltene Niederschlag wurde zu 10 ul 5 x RM und 5 ul BglII gegeben und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 50 ul verdünnt, wodurch er vollständig gelöst wurde. Das Gemisch wurde erneut eine Stunde bei 37ºC inkubiert, und nach Phenolextraktion und Chloroformbehandlung wurde das erhaltene Produkt einer Ethanolfällung unterworfen. Die so erhaltene DNA wurde in 10 ul TE gelöst.

Gleichzeitig wurden 5 ul HindIII und 10 ul 5 · RM zu 5 ug DNA des Expressionsvektors pUR290 (The EMBO Journal, 2(2), 1791-1794, 1983) gegeben. Das mit destilliertem Wasser auf 50 ul verdünnte Gemisch wurde eine Stunde bei 37ºC inkubiert, und nach Phenolextraktion, Chloroformbehandlung und Ethanolfällung wurden 10 ul 5 · RM (NaCl-Konzentration: 500 mM) und 5 ul BamHI dazugegeben. 35 ul destilliertes Wasser wurden ferner dazugegeben, um den Niederschlag vollständig zu lösen; und die Lösung wurde dann eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Nach Phenolextraktion und Chloroformbehandlung wurde die mit Ethanol gefällte DNA in 10 ul TE gelöst.

Mit HindIII und BamHI gespaltene pUR290-DNA (1 ul) wurde mit pNLH402-DNA (1 ul), die mit HindIII und BglII gespalten worden war, gemischt, und 2 ul 10 · Ligationspuffer und 1 ul T4-DNA-Ligase wurden zugegeben. Das Volumen wurde mit destilliertem Wasser auf insgesamt 20 ul gebracht, und der Ansatz wurde 12 Stunden bei 15ºC umgesetzt. Der E.-coli-Stamm UT481 (Journal of Bacteriology, 163: 376-387, 1985) wurde gemäß dem oben erwähnten Calciumchloridverfahren mit der Reaktionsflüssigkeit transformiert. Ampicillin-resistente Kolonien wurden auf einer LB-Medium-Platte, die 20 ug/ml Ampicillin enthielt, selektiert, und ein Klon, der Fragmente von etwa 3,8 kb enthielt, die von pNL4-3 stammten, wurde selektiert, indem die Größe des inserier ten Fragmentes mittels EcoRI-Spaltung gemessen wurde. Der Klon UT481/pPG280 wurde so erhalten. Genauer, ist wahrscheinlich in diesem Klon die etwa 3,8 kb große HIV-pol-Genregion an das 3'-Ende des lacZ-Gens des Plasmids pUR290 ligiert, und das lacZ- und das pol-Genprodukt werden anfänglich als Fusionsprotein (etwa 230 kd) exprimiert, wobei die verschiedenen getrennten Enzyme nach der Prozessierung hergestellt werden.

VERGLEICHSBEISPIEL 2 Produktion der Protease- Reverse-Transkriptase- und Integraseenzyme des Lentivirus durch Kultur von transformierten Zellen

Der Transformantenklon UT481/pPG280 wurde 18 Stunden bei 37ºC in LB-Medium gezüchtet, das 20 ug/ml Ampicillin enthielt, (1% Gew./Vol. Bacto-Trypton, 0,5% Gew./Vol. Bacto- Hefeextrakt und 1% Gew./Vol. NaCl), die erhaltenen Zellen wurden in einer 1 : 100-Verdünnung zu frischem LB-Medium gegeben, das 20 ug/ml Ampicillin enthielt, und die Vorkultur wurde durchgeführt. Als die OD&sub6;&sub0;&sub0;nm des Mediums 0,5 erreichte, wurde 1 mM IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid von Sigma [U. S. A.]) zugegeben, und die Kultur wurde 18 Stunden bei 25ºC fortgesetzt. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation (5000 U/min für 5 Minuten) gesammelt und in 1/25 Volumen 40 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0) (0,1 mM EDTA, 5 mM MgCl&sub2;, 0,1% Gew./Vol. Triton X-100 und 10 mM 2-Mercaptoethanol) suspendiert. Nach Ultraschallbehandlung (fünf 30-Sekunden-Impulse, 19,5 kHz, 300 W) wurde die Überstandsflüssigkeit mittels Zentrifugation (19000 U/min. 60 Minuten) abgetrennt. Zur Bestätigung des Vorliegens des HIV-pol-Genproduktes in dieser rohen Extraktionsflüssigkeit wurde die Reverse-Transkriptase-Aktivität in der rohen Extraktionsflüssigkeit gemessen. Das Ergebnis ist in der Fig. 1 dargestellt. Wie erwartet, wurde eine signifikante Reverse- Transkriptase-Aktivität beobachtet. Die Analyse mittels der Western-Blot-Technik wurde ebenfalls durchgeführt: 4% Gew./Vol. Natriumdodecylsulfat (SDS) und 1% Gew./Vol. 2-Mercaptoethanol wurden zu den gesammelten Wirtsbakterienzellen gegeben. Nach Sminütigem Kochen und Zentrifugation (10000 U/min für fünf Minuten) wurde die Überstandsflüssigkeit auf einem 0,1% Gew./Vol. SDS - 10% Gew./Vol. Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt. Nach dem Übertragen auf eine Nitrocellulosemembran (hergestellt von S&S [Westdeutschland]) mittels eines Transblot-Gerätes (hergestellt von BioRad [U. S. A.]) wurde die Membran in eine 3% Gew./Vol. Gelatinelösung gemäß dem herkömmlichen Blockierungsverfahren eingetaucht. Dann wurde als Primärreaktion die Membran mit einem menschlichen Serum inkubiert, das von einem HIV-Träger erhalten worden war, und wurde nach dem Waschen als Sekundärreaktion mit einem Peroxidasemarker konjugierten Anti-Mensch-IgG-Serum (hergestellt von BioRad) inkubiert. Schließlich wurde die Membran nach dem Waschen in einer chromogenen Flüssigkeit eingetaucht, die hergestellt wurde, indem 0,4 ml DAB (3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid) und 15 ul 30% Gew./Vol. Wasserstoffperoxidlösung auf 50 ml TBS (20 mM Tris-HCl [pH-Wert 7,4]; 500 mM NaCl) gegeben wurden, um die Farbentstehung 15 Minuten bei Raumtemperatur hervorzurufen, und wurde dann mit destilliertem Wasser gewaschen. Das Ergebnis ist in der Fig. 2 gezeigt. Während in der rohen Extraktionsflüssigkeit von Zellen, die mit einem Vektor transformiert worden waren, der kein HIV-pol-Gen trug (E.-coli- Stamm UT481/pUR290 auf der Basis des Vektors pUR290) keine spezifische, mit dem Serum des menschlichen HIV-Trägers reagierende Bande beobachtet wurde, wurden Banden der Reversen Transkriptase mit Molekulargewichten von 66 kd und 51 kd, der Intergrase von 32 kd und der Protease von 12 kd, d. h. der HIV-pol-Genprodukte, in der Extraktionsflüssigkeit transformierter Zellen des Stammes UT481/pPG280 beobachtet. Die Säulenchromatographie mit dem Anionenaustauscher MonoQ (hergestellt von Pharmacia [Schweden]) zeigt, daß die Reverse Transkriptase, wie in der Fig. 3 gezeigt, von der β-Galactosidase getrennt, d. h. gespalten, worden ist, da die Reverse-Transkriptase-Aktivität in einer vollständig von der β-Galactosidaseaktivität getrennten Fraktion gefunden werden kann. Dies zeigt, daß die HIV-pol-Genprodukte zwar als Fusionsproteine mit β-Galactosidase hergestellt werden, aber die Protease-, Reverse Transkriptase- und Integrase-Bereiche dieses Fusionsproteins durch die Wirkung der Protease, die selbst ein pol-Genprodukt ist, spezifisch getrennt werden und sich in der Zelle anhäufen.

VERGLEICHSBEISPIEL 3 Konstruktion eines Vektors zur Ermöglichung der Produktion großer Mengen an Lentivirus-Protease

1 ul HindIII und 10 ul 5 x RM wurden zu 5 ug DNA des in Beispiel 1 hergestellten pol- Genexpressionsplamids pPG280 gegeben, und das Gemisch wurde mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ul verdünnt. Das Gemisch wurde eine Stunde bei 37ºC inkubiert, und nach Phenolextraktion und Chloroformbehandlung wurde das Gemisch einer Ethanolfällung unterworfen. Der erhaltene Niederschlag wurde zu 5 ul 5 · RM (- NaCl) und 5 ul BalI gegeben und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 50 ul verdünnt, wodurch der Niederschlag gelöst wurde. Das Gemisch wurde wiederum eine Stunde bei 37ºC inkubiert, und nach Phenolextraktion und Chloroformbehandlung wurde das erhaltene Produkt einer Ethanolfällung unterworfen. Der erhaltene Niederschlag wurde zu 5 ul 10 · Polymerasepuffer (670 mM Tris-HCl [pH-Wert 8,8], 67 mM MgCl&sub2;, 166 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 100 mM 2-Mercaptoethanol und 67 uM EDTA), 5 ul 10 · dNTP-Lösung (jeweils 3,3 mM dATP, dGTP, dTTP und dCTP) und 1 ul T4-DNA-Polymerase gegeben und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 50 ul verdünnt, wodurch er gelöst wurde. Das Gemisch wurde 15 Minuten bei 37ºC inkubiert, und nach Phenolextraktion und Chloroformbehandlung wurde das erhaltene Produkt einer Ethanolfällung unterworfen. Zu dem Gemisch aus 1 ul der Lösung, die durch Lösen des erhaltenen Niederschlags in 10 ul TE und 2 ul 10 · Ligationspuffer erhalten wurde, wurde ferner 1 ul T4-DNA-Ligase gegeben, und das Gesamtvolumen wurde mit destilliertem Wasser auf 20 ul gebracht. Das Gemisch wurde 12 Stunden bei 15ºC weiterinkubiert. Der E.-coli-Stamm UT481 wurde mit dieser Reaktionsflüssigkeit gemäß dem oben erwähnten Calciumchloridverfahren transformiert. Eine Ampicillin-resistente Kolonie wurde auf einer LB-Medium-Platte, die 20 ug/ml Ampicillin enthielt, selektiert, und ein Klon, der von pNL4-3 stammende 0,55 kb große Fragmente enthielt, wurde selektiert, indem die Größe des inserierten Fragmentes unter Verwendung einer EcoRI-Spaltung gemessen wurde. So wurde der Klon UT481/pLB550-3 erhalten.

Konstruktion eines Vektors zur Massenproduktion der Protease von HIV-1 (Lentivirus): pNLH402 (Beispiel 1) wurde mit BglII und KpnI gespalten, und das erhaltene etwa 1,7 kb große DNA-Fragment wurde weiter mit NlaIV gespalten. Das so hergestellte etwa 1,2 kb große DNA- Fragment wurde in den HincII-Anteil des Klonierungsvektors pUC 19 inseriert, um pUN40 zu erhalten. Der so erhaltene pUN40 wurde mit BamHI und PstI gespalten, und das erhaltene 1,2 kb große DNA-Fragment wurde in den Expressionsvektor pUR291 (The EMBO Journal, 2(2): 1791-1794, 1983) und pT7-7 (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82: 1074-1078, 1985) inseriert, die mit BamHI und PstI gespalten waren, um pPG401 bzw. pTP440 zu konstruieren. Dann wurde pPG401 mit BalI und PstI gespalten und nach T4-DNA-Polymerase-Behandlung mit sich selbst verbunden, um pPG421 zu erhalten. Andererseits wurde pTG440 mit BalI und PstI gespalten und nach T4-DNA-Polyrnerase- Behandlung mit sich selbst verbunden, um pTP442 zu erhalten. Diese Vektoren pPG401, pPG421, pTP440 und pTP442 exprimieren die Protease von HIV-1. Für pPG401 und pPG421 wurden die Stämme UT481 und JM103 als Wirte für die Expression verwendet. Für pTP440 und pTP442 wurde der Stamm BL21 (DE3) als Wirt für die Expression eingesetzt.

VERGLEICHSBEISPIEL 4 Massenproduktion der Lentivirus-Protease durch transformierte Zellen

Der Transformantenklon UT481/pLB550-3 wurde 18 Stunden bei 37ºC in LB-Medium (das 20 ug/ml Ampicillin enthielt) gezüchtet, die erhaltenen Zellen wurden in einer 1 : 100-Verdünnung zu frischem LB-Medium (das 20 ug/ml Ampicillin enthielt) gegeben, und die Vorkultur wurde bei 37ºC durchgeführt. Als die OD600nm des Mediums 0,5 erreichte, wurde 1 mM IPTG (Isopropyl-β-Dthiogalactopyranosid, Sigma [U. S. A.]) zugegeben, und die Kultur wurde 6 Stunden bei 37ºC fortgesetzt. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation (5000 U/min für 5 Minuten) gesammelt, und 4% Gew./Vol. Natriumdodecylsulfat (SDS) und 1% Gew./Vol. 2-Mercaptoethanol wurden zugegeben. Nach Sminütigem Kochen und Zentrifugation (10000 U/min für fünf Minuten) wurde die Überstandsflüssigkeit auf einem 0,1% Gew./Vol. SDS - 15% Gew./Vol. Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt. Anschließend wurden die gesammelten Bakterien mittels der im Beispiel 2 be schriebenen Western-Blot-Technik analysiert. Während in den Rohextrakten von UT481/pUR290 keine spezifische, mit dem Serum des menschlichen HIV-Trägers reagierende Bande beobachtet wurde, wurden Banden einer 12 kd großen Protease in der Extraktionsflüssigkeit von UT481/pLB550-3 beobachtet. Insbesondere produzierte pLB550-3 eine mehrfach größere Proteasemenge als pPG280. In diesem Klon ist wahrscheinlich das 0,55 kb große HIV-pol-Gen an das 3'- Ende des lacZ-Gens des Plasmids pUR290 ligiert, und das lacZ-pol-Genprodukt wird wahrscheinlich als Fusionsprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 140 kd hergestellt, wobei die Protease mit etwa 12 kd nach der Prozessierung hergestellt wird.

VERGLEICHSBEISPIEL 5 Konstruktion eines die Protease und das pol-Gen eines Onkovirus ragenden Expressionsvektors

5 ug DNA des Plasmids pSRA2, das die Rous-Sarkomvirus-cDNA trägt (Journal of Virology, 36, S. 50-61, 1980) wurde zu 5 ul BamHI und 20 ul 5 · RM gegeben und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ul verdünnt, und dies wurde eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Nach dieser Reaktion wurde das Gemisch auf einem 1% Gew./Vol. Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt elektrophoretisch aufgetrennt, und der Gelanteil, der ein 1,8 kb großes DNA-Fragment enthielt, wurde gespalten. Dann wurde nach Phenolextraktion und Chloroformbehandlung das erhaltene Produkt einer Ethanolfällung unterworfen. Der Niederschlag wurde in 10 ul TE gelöst, und 1 ul dieser Lösung wurde zu 0,1 ug (1 ul) des Plasmids pUR291 gegeben, das mit BamHI gespalten und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war. 2 ul 10 · Ligationspuffer und 1 ul T4-DNA- Ligase wurden ferner zugegeben, und das Gesamtvolumen wurde mit destilliertem Wasser auf 20 ul gebracht. Das Reaktionsgemisch wurde dann 12 Stunden bei 15ºC inkubiert. Anschließend wurde der Escherichia-coli-UT481-Stamm mit diesem Reaktionsgemisch gemäß dem Calciumchloridverfahren transformiert, und eine Ampicillin-resistente Kolonie wurde auf einer LB-Medium-Platte, die 20 ug/ml Ampicillin enthielt, selektiert. Die Plasmid-DNA wurde aus dem Ampicillin-resistenten Klon unter Verwendung eines herkömmlichen Verfahrens isoliert, und ein Klon pSR281 wurde durch Selektion eines Klons erhalten, der ein 1,8 kb großes Fragment enthielt, das vom Plasmid pSRA2 stammte, und ein lacZ-gag-Fusionsprotein produzierte.

5 ug DNA des Plasmids pSRA2 wurden zu 5 ul PstI und 20 ul 5 · RM (750 mM NaCl) gegeben und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ul verdünnt und dann eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Nach dieser Reaktion wurde das Gemisch auf einem 1% Gew./Vol. Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt elektrophoretisch aufgetrennt und ein 1,8 kb großes DNA- Fragment wurde herausgespalten. Dann wurde nach Phenolextraktion und Chloroformbehandlung das erhaltene Produkt einer Ethanolfällung unterworfen und in 10 ul TE gelöst. Entsprechend wurde die doppelsträngige M13mp18-Phagen-DNA durch PstI gespalten und mit alkalischer Phosphatase behandelt. 1 ul (0,1 ug) dieser DNA wurde zu 1 ul des oben erwähnten 3,1 kb großen DNA-Fragmentes, 2 ul 10 · Ligationspuffer und 1 ul T4-DNA-Ligase gegeben und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ul verdünnt und dann 12 Stunden bei 15ºC inkubiert. Anschließend wurde die rekombinante Phagen-DNA zur Transfektion des E.-coli-Stammes TG1 gemäß dem Calciumchloridverfahren verwendet, und ein Plaque bildete sich auf einer 2YT-Medium-Platte (1,6% Gew./Vol. Bacto-Trypton, 1% GewJVol. Bacto-Hefeextrakt, 0,5% Gew./Vol. NaCl und 1,5% Gew./Vol. Bacto-Agar), die X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid, Sigma [U. S. A.]) enthielt.

Der transfizierte TG1-Stamm wurde in 2YT-Medium (1,6% Gew./Vol. Bacto-Trypton, 1% Gew./Vol. Bacto-Hefeextrakt und 0,5% Gew./Vol. NaCl) vermehrt, bis die OD600nm des Mediums 0,3 erreichte, und ein wenig des farblosen Klons des erhaltenen Plaques wurde überimpft. Die Inkubation wurde mehrere Stunden fortgesetzt, und dann wurde einzel- und doppelsträngige DNA gemäß herkömmlicher Verfahren präpariert. Ein Klon M13sr31, der ein 3,1 kb großes Fragment enthält, das von pSRA2 stammt, wurde durch Spalten der erhaltenen doppelsträngigen DNA mit PstI und BamHI erhalten. Das von pSRA2 stammende 3,1 kb große Fragment codiert das 3'-Ende des gag- Gens, das Terminationscodon TAG und das pol-Gen. Die Insertion einer Base vor dem Terminationscodon führt zur Expression eines gag-pol-Fusionsgens mit übereinstimmenden Translationsrahmen. So wurde durch Verwendung eines in-vitro-Mutagenese-Kits (hergestellt von Amersham [England]) ein Klon M13sr32 erhalten, der die Sequenz ATAG enthielt, indem eine Base vor dem Terminationscodon TAG in M13sr31 eingesetzt wurde.

5 ug der doppelsträngigen DNA von M13sr32 wurden zu 5 ul PstI und 20 ul 5 · RM gegeben und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ul verdünnt und dann eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Nach dieser Reaktion wurde das Gemisch auf einem 1% Gew./Vol. Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt elektrophoretisch aufgetrennt, und ein Gel, das ein 3,1 kb großes DNA-Fragment enthielt, wurde herausgespalten. Nach Phenolextraktion und Chloroformbehandlung wurde das erhaltene Produkt einer Ethanolfällung unterworfen. Der Niederschlag wurde in 10 ul TE gelöst, und 1 ul dieser Lösung wurde zu 1 ul (0,1 ug) DNA des Plasmids pSR281 (siehe vorstehend) gegeben, die durch PstI gespalten und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war. 2 ul 10 · Ligationspuffer und 1 ul T4-DNA-Ligase wurden ferner zugegeben, und das Gesamtvolumen wurde mit destilliertem Wasser auf 20 ul gebracht. Dann wurde das Gemisch 12 Stunden bei 15ºC inkubiert. Anschließend wurde der Escherichia-coli-Stamm UT481 mit diesem Reaktionsgemisch gemäß dem Calciumchloridverfahren transformiert, und eine Ampicillin-resistente Kolonie wurde auf einer LB-Medium-Platte selektiert, die 20 ug/ml Ampicillin enthielt. Die Plasmid-DNA wurde aus dem Ampicillin-resistenten Klon mittels eines herkömmlichen Verfahrensisoliert, und das Vorliegen und die Richtung des von M13sr32 stammenden 3,1 kb großen Fragmentes wurden durch Spalten des Plasmids mit PstI und BamHI bestätigt, und dann wurde ein Klon UT481/pSR271, der wahrscheinlich die Protease und die pol-Genprodukte exprimierte, erhalten.

In der von pSRA2 stammenden 1,8 kb großen und im Plasmid pSR281 enthaltenen Region wurde eine 1,3 kb große Region entfernt, wenn pSR281 mit PstI gespalten wurde, die mit dem von M13sr32 stammenden 3,1 kb großen Fragment überlappte.

VERGLEICHSBEISPIEL 6 Herstellung der Protease, Reversen Transkrintase und Integrase eines Onkovirus

Der Transformantenklon UT481/pSR271 wurde 18 Stunden bei 37ºC in LB-Medium (das 20 ug/ml Ampicillin enthielt) gezüchtet, die erhaltenen Zellen wurden in einer 1 : 100-Verdünnung zu frischem LB-Medium (das 20 ug/ml Ampicillin enthielt) gegeben, und die Vorkultur wurde durchgeführt. Wenn die OD600nm des Mediums 0,5 erreichte, wurde 1 mM IPTG zugegeben, und die Kultur wurde 18 Stunden bei 25ºC fortgesetzt. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation (5000 U/min für fünf Minuten) gesammelt und in 1/25 Volumen 40 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0) (0,1 mM EDTA, 5 mM MgCl&sub2;, 0,1% Gew./Vol. Triton X-100 und 10 mM 2-Mercaptoethanol) suspendiert. Nach Ultraschallbehandlung (fünf 30-Sekunden-Impulse, 19,5 kHz, 300 W) wurde der Überstand durch Zentrifugation (19000 U/min. 60 Minuten) abgetrennt. Zur Bestätigung des Vorliegens des RSV- Genproduktes in dieser rohen Extraktionsflüssigkeit wurde die Reverse-Transkriptase-Aktivität in der rohen Extraktionsflüssigkeit gemessen. Wie erwartet, wurde eine signifikante Reverse-Transkriptase-Aktivität beobachtet. Die Analyse mittels der Western-Blot-Technik wurde ebenfalls durchgeführt: 4% Gew./Vol. Natriumdodecylsulfat (SDS) und 1% Gew./Vol. 2-Mercaptoethano1 wurden zu den gesammelten Bakterien gegeben. Nach fünfminütigem Kochen und Zentrifugation (10000 U/min für fünf Minuten) wurde der Überstand auf einem 0,1% Gew./Vol. SDS - 15% Gew./Vol. Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt. Nach dem Übertragen auf eine Nitrocellulosemembran (hergestellt von S&S [Westdeutschland]) unter Verwendung eines Transblot-Gerätes (hergestellt von BioRad [U. S. A.]) wurde die Membran in eine 3% Gew./Vol. Gelatinelösung gemäß dem herkömmlichen Blotverfahren eingetaucht. Dann wurde die Membran als Primärreaktion mit Anti-RSV-Kaninchenserum inkubiert und nach dem Waschen als Sekundärreaktion mit einem mit Peroxidasemarker konjugierten Anti-Kaninchen-IgG-Serum (hergestellt von BioRad) inkubiert. Schließlich wurde die Membran nach dem Waschen 15 Minuten bei Raumtemperatur in eine chromogene Flüssigkeit eingetaucht, die durch Zugabe von 0,4 ml DAB (3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid) und 15 ul 30% Gew./Vol. Wasserstoffperoxidlösung zu 50 ml TBS (20 mM Tris-HCl [pH-Wert 7,4], 500 mM NaCl) hergestellt worden war, um die Farbbildung hervorzurufen und wurde dann mit destilliertem Wasser gewaschen. Während keine spezifische mit dem Anti- RSV-Kaninchenserum reagierende Bande in der rohen Extraktionsflüssigkeit der transformierten UT481/pUR290-Zellen (auf der Basis des Vektors pUR290, der kein RSV-Genom besaß) beobachtet wurde, wurden Banden der Reversen Transkriptase des RSV in der Extraktionsflüssigkeit von UT481/pSR271 beobachtet. Obwohl die RSV-Protease und das pol-Genprodukt als Fusionsproteine mit β-Galactosidase hergestellt werden, sind die Protease und die Reverse Transkriptase durch die Wirkung der Protease, die selbst ein gag-Genprodukt ist, spezifisch getrennt worden und häufen sich wahrscheinlich in der Zelle an. In dem Klon UT481/pSR271 ist wahrscheinlich die 3,6 kb große gag- und pol-Genregion des Rous-Sarkomvirus an das 3'-Ende des acZ-Gens des Plasmids pUR291 ligiert, und es wird angenommen, daß die lacZ-, gag- und pol-Genprodukte als ein Fusionsprotein (etwa 230 kd) exprimiert werden, das dann zur Freisetzung der Enzyme, z. B. der Protease (P15), Reversen Transkriptase (P92, P65) und der Integrase (P32), prozessiert wird.

VERGLEICHSBEISPIEL 7 Isolation der Reversen Transkriptase

Wie vorstehend in Beispiel 2 erwähnt, wurde der transformierte E.-coli-Klon UT481/pPG280 in 91 LB-Medium (das 20 ug/ml Ampicillin enthielt) bei 25ºC gezüchtet, und als die Kultur eine OD600nm von 0,5 erreicht hatte, wurde 1 mM IPTG zugegeben. Die Kultur wurde ferner weitere 24 Stunden fortgesetzt, und nach dem Sammeln wurden die Zellen in 120 ml 40 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,0) (der 0,1 mM EDTA, 5 mM MgCl&sub2;, 0,1% Gew./Vol. Triton X-100 und 10 mM 2-Mercaptoethanol enthielt) suspendiert. Die Bakterienzellen wurden durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen und einer Zentrifugation (19000 U/min für 60 Minuten) unterworfen, und der Überstand wurde als rohe Extraktionsflüssigkeit abgetrennt.

VERGLEICHSBEISPIEL 8 Reinigung der Reversen Transkriptase

Polymin P (hergestellt von BRL [U. S. A. J) wurde in einer Menge von 0,1% Gew./Vol. zur rohen Extraktionsflüssigkeit gegeben, die dann 30 Minuten bei 4ºC gerührt und zentrifugiert wurde (16000 U/min für 20 Minuten):

Ammoniumsulfat wurde zum Überstand gegeben. Der von dieser zu 40% gesättigten Lösung hergestellte Niederschlag wurde durch Zentrifugation (16000 U/min für 20 Minuten) entfernt, und 137 ml Überstandsflüssigkeit wurden erhalten. Ammoniumsulfat wurde erneut bis zu einer 80%igen Sättigung zugegeben, und der so erzeugte Niederschlag wurde in 50 ml des oben genannten 40 mM Tris-HCl-Puffers gelöst und dann gegen den gleichen Puffer, der 50 mM NaCl enthielt, dialysiert.

VERGLEICHSBEISPIEL 9 Hochgradige Reinigung der Reversen Transkriptase

Die hochgradige Reinigung wurde unter Verwendung von DEAE-Bio-Gel-A- (BioRad [U. S. A.]) und Afft-Gel-Heparin-Säulenchromatographie (BioRad) durchgeführt. Die dialysierte Probe von Beispiel 8 wurde auf eine 30-ml-DEAE-Bio-Gel-A-Säule aufgetragen, die mit 40 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0) (das 0,1 mM EDTA, 5 mM MgCl&sub2;, 0,1% Gew./Vol. Triton X-100, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 50 mM NaCl enthielt) äquilibriert worden war. Die eluierte Probe wurde dann auf eine 30-ml-Affi-Gel-Heparin-Säule aufgetragen, die mit dem oben genannten Puffer äquilibriert worden war, und mit 150 ml eines Puffers eluiert, der einen Natriumchloridgradienten von 50 mM bis 400 mM umfaßte. Das Ergebnis ist in der Fig. 4 gezeigt. Die Fraktionen 29 bis 38, die die Reverse-Transkriptase-Aktivität enthielten, wurden vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden gegen 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 6,8) (der 0,1 mM EDTA, 5 mM MgCl&sub2;, 0,1% Gew./Vol. Triton X-100 und 10 mM 2-Mercaptoethanol enthielt) dialysiert und wurden weiter durch HPLC auf einer Hydroxylapatitsäule (KB-Säule, Koken [Japan]) gereinigt. Insbesondere wurde die Elution nach der Adsorption der Probe an die Säule mit einem linearen Natriumphosphatgradienten von 20 bis 400 mM durchgeführt, und Fraktionen, die Reverse-Transkriptase-Aktivität enthielten, wurden vereinigt. So wurde die gereinigte Reverse Transkriptase erhalten. Von der so erhaltenen Reversen Transkriptase wurde unter Verwendung von SDS-PAGE bestätigt, daß sie mehr als 95% rein war. Die Ausbeute betrug 31%, bezogen auf die rohe Extraktionsflüssigkeit. Die gereinigte Reverse Transkriptase bestand aus p64 und p51 im wesentlichen im gleichen Molverhältnis, und die Bestimmung der N-terminalen-Aminosäuresequenz beider Untereinheiten zeigte:

Pro - Ile - Ser - Pro - Ile - Glu - Thr - Val - Pro - Val - Lys - Leu - Lys - Pro - Gly ......, und stimmt somit mit der von der Nukleotidsequenz vorhergesagten Aminosäuresequenz überein.

VERGLEICHSBEISPIEL 10 Konstruktions eines die Nukleocapsidproteine des AIDS-Virus stark exnrimierenden Vektors

DNA des Plasmids pNL4-3 (Journal of Virology, 59 (2): 284-291, 1986), der die HIV-1- Provirusgenom-DNA trägt, wurde mit PvuII gespalten, und das erhaltene etwa 2,1 kb große DNA- Fragment wurde gesammelt. Dieses Fragment wurde in den HincII-Abschnitt des Plasmids pUC9 inseriert. Das so eingebrachte Fragment, dessen 5'-Ende mit der Seite des BamHI-Abschnitts verbunden war, wurde als pCV91 bezeichnet.

Nach Spalten von pCV91 mit BamHI und BalI wurde das erhaltene etwa 1,5 kb große DNA- Fragment gesammelt und in einen pUR292-Expressionsvektor (The EMBO Journal, 2 (2): 1791- 1794, 1983) inseriert, der nacheinander zur Herstellung von pPG912 mit SalI, T4-DNA-Polymerase und BamHI behandelt wurde. pPG912 wurde ferner mit BglII gespalten, und nach T4-DNA-Polymerasebehandlung mit sich selbst verbunden, um pPG912 in pPG922 umzuwandeln, bei dem in den III-Abschnitt vier Basen eingebracht wurden.

In pPG912 und pPG922 war ein DNA-Fragment, das den gesamten Bereich von der p24- Region der HIV-1-gag-Genregion bis zur Proteaseregion des pol-Gens vollständig enthielt, im gleichen Leserahmen mit dem 3'-Ende des lacZ-Gens verbunden. Das HIV-1-Genprodukt wurde als Fusionsprotein mit β-Galactosidase exprimiert und dann einem Prozeß unterworfen, der auf der mittels Verschiebung des Leserahmens von gag nach pol für pPG912 oder ohne Verschiebung für pPG922 exprimierten Protease beruhte, wobei das Nukleocapsidprotein p24 hergestellt wurde. In pPG912 wurde auch p15 hergestellt.

Nach dem Spalten der oben erwähnten Expressionsplasmide pPG912 und pPG922 mit BamHI und ClaI wurden die erhaltenen etwa 1,5 kb großen DNA-Fragmente gesammelt und in einen pT7-7-Expressionsvektor (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82: 1074-1078, 1985) eingebracht, der mit BamHI und ClaI gespalten worden war, um pTG11 und pTG12 herzustellen. Dann wurden pTG11 und pTG12 mit BamHI gespalten, mit T4-DNA-Polymerase behandelt und mit sich selbst verbunden, um pTG110 und pTG120 herzustellen. Diese exprimieren die mit der Quelle pPG912 und pPG922 identische HIV-Proteinregion als Fusionsproteine mit einem aus pT7-7 stammenden Oligopeptid unter der Kontrolle des T7-Promotors. Die Fusionsproteine wurden einem Prozeß unter Verwendung von Protease unterworfen, der zur Herstellung von p24 und p15 führte.

Als Wirt zur Konstruktion des Plasmids wurde der E.-coli-Stamm JM103 (Nucleic Acids Research, 9 (2): 309-321, 1981) verwendet; der E.-coli-Stamm UT481 (Journal of Bacteriology, 163: 376-384, 1985) wurde als Wirt zur Proteinexpression für pPG912 und pPG922 verwendet; und der E.-coli-Stamm BL21 (DE3) (Journal of Molecular Biology, 189(1): 113-130, 1986) wurde als Wirt zur Proteinexpression für pTG110 und pTG120 verwendet. Die jeweiligen Ausbeuten von gereinigtem p24 und p15 pro Liter E.-coli-Kultur sind in der Tabelle 1 gezeigt.

VERGLEICHSBEISPIEL 11 Konstruktion eines das Nukleocansidprotein des AIDS-Virus stark exprimierenden Vektors

Das Plasmid pPG912, das das gag-pol-Gen exprimierte, wie im Beispiel 10 hergestellt, wurde mit indlil gespalten, um das erhaltene etwa 0,9 kb große Fragment zu gewinnen. Dann wurde das Plasmid pPG930 hergestellt, indem dieses Fragment in einer gewünschten Richtung in den HindIII-Abschnitt des Expressionsvektors pUR290 (The EMBO Journal, 2 (2): 1791-1794, 1983) eingebracht wurde. In pPG930 war das DNA-Fragment, das den gesamten Bereich von der p15-Region der HIV-1-gag-Region bis zur Proteaseregion des pol-Gens enthielt, im gleichen Le serahmen mit dem 3'-Ende des lacZ-Gens auf pUR290 verbunden. Das HIV-Genprodukt wurde als Fusionsprotein mit β-Galactosidase exprimiert. Dieses Fusionsprotein wurde einem Prozeß unterworfen, der auf der mittels Verschiebung des Leserahmens exprimierten Protease beruhte, was zur Herstellung des p15-Nukleocapsidproteins führte.

Ein weiteres Plasmid pTG21 wurde hergestellt, indem das oben genannte 0,9 kb große HindIII-Fragment in einer gewünschten Richtung in den HindIII-Abschnitt des Expressionsvektors pT7-7 eingebracht wurde. Ferner wurde pTG21 mit SalI gespalten und nach T4-DNA-Polymerasebehandlung mit sich selbst verbunden, um pTG210 zu erhalten, der die gleiche HIV-Proteinregion, wie pPG930, als Fusionsprotein mit dem aus pT7-7 stammenden Oligopeptid unter der Kontrolle des T7-Promotors exprimert. Dieses Fusionsprotein wurde einem Prozeß unterworfen, der auf der durch Verschiebung des Leserahmens exprimierten Protease beruhte, wodurch p15 hergestellt wurde.

Als Wirt zur Konstruktion des Plasmids wurde der Stamm JM103 verwendet; der Stamm UT481 wurde als Wirt zur Proteinexpression für pPG930 verwendet; und der Stamm BL21 (DE3) wurde als Wirt zur Proteinexpression für pTG210 verwendet. Die jeweiligen Ausbeuten an gereinigtem p15 pro Liter E.-coli-Kultur sind, wie in der Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1 Ausbeute an gereinigtem Protein pro Liter Kultur

Die Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenzen für das gereinigte p24 und p15 ergab: Pro - Ile - Val - Gln - Asn - Leu - Gln - Gly - Gln - Met - Val-His - Gln - Ala - Ile- .... für p24 und Ile - Gln - Lys-Gly - Asn - Phe-Arg - Asn - Gln - Arg - Lys - Thr - Val ... für p15, die somit mit den von den entsprechenden Nukleotidsequenzen vorhergesagten Aminosäuresequenzen übereinstimmen.

VERGLEICHSBEISPIEL 12 Isolation des Nukleocapsidproteins p24 des AIDS-Virus durch Kultur der Transformante

Der Transformentenklon UT481/pPG922 wurde 18 Stunden bei einer Temperatur von 37ºC in LB-Medium (1% Gew./Vol. Bacto-Trypton, 0,5% Gew./Vol. Bacto-Hefeextrakt und 1% Gew./ Vol. NaCl), das 20 ug/ml Ampicillin enthielt, gezüchtet, dann wurde 1/100 Volumen zu frischem LB-Medium gegeben (das 20 ug/ml Ampicillin enthielt) und wurde bei einer Temperatur von 37ºC vorgezüchtet. Als die OD600nm des Mediums 0,5 erreichte, wurde 1 mM IPTG (Isopropylthiogalactosid; hergestellt von Sigma [US]) zugegeben, und die Kultur wurde acht Stunden bei einer Temperatur von 37ºC fortgesetzt. Die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation (5000 U/min für 10 Minuten) gesammelt, in 50 mM Natriumphosphat [pH-Wert 7,0] suspendiert, und nach Ultraschallbehandlung (fünf 3-Minuten-Impulse, 19,5 kHz, 300 W) wurde die Überstandsflüssigkeit durch Zentrifugation (19000 U/min für 60 Minuten) abgetrennt.

Grobreinigung von p24: Ammoniumsulfat wurde zur rohen Extraktionsflüssigkeit gegeben, so daß 35%ige Sättigung erreicht wurde, dann wurde nach Rühren der durch Zentrifugation (16000 U/min für 20 Minuten) erhaltene Niederschlag in 30 ml 20 mM Natriummalonat [pH-Wert 5,3] gelöst und in der erhaltenen Flüssigkeit dialysiert.

Reinigung von p24: Die dialysierte Probe wurde durch eine MonoS-Säule (hergestellt von Pharmacia [Schweden]), die mit 20 mM Natriummalonat [pH-Wert 5,3] äquilibriert worden war, geleitet und mit einem Natriumchloridgradienten (von 0 bis 1 M) eluiert. Die Fraktionen, die p24 enthielten, wurden vereinigt und gegen 20 mM Tris-HCl-Puffer [pH-Wert 8,4] dialysiert. Nach der Dialyse wurde die Flüssigkeit auf eine MonoQ-Säule (hergestellt von Pharmacia [Schweden]), die mit dem oben genannten Puffer äquilibriert worden war, aufgetragen und mit einem Natriumchloridgradienten (von 0 bis 1 M) eluiert, um gereinigtes p24 zu erhalten.

VERGLEICHSBEISPIEL 13 Isolation von p15

Der Transformantenklon BL21 (DE3)/pTG210 wurde 18 Stunden bei 37ºC in LB-Medium gezüchtet, das 20 ug/ml Ampicillin enthielt, dann wurde 1/100 Volumen zu frischem LB-Medium gegeben (das 20 ug/ml Ampicillin enthielt) und bei 37ºC gezüchtet. Als die OD600nm des Medium 0,5 erreichte, wurde 1 mM IPTG zugegeben, und die Kultur wurde fünf Stunden bei 37ºC fortgesetzt. Die Bakterienzellen wurden gesammelt und in 1/50 Volumen 20 mM Natriumphosphat [pH- Wert 7,0] suspendiert, und nach einer Ultraschallbehandlung (sechs 30-Sekunden-Impulse, 19,5 kHz, 300 W) wurde der Überstand durch Zentrifugation (19000 U/min. 60 Minuten) als rohe Extraktionsflüssigkeit abgetrennt.

Grobreinigung von p15: Ammoniumsulfat wurde zu der rohen Extraktionsflüssigkeit gegeben, so daß 60%ige Sättigung erhalten wurde, und nach Rühren wurde das Gemisch einer Zentrifugation (16000 U/min. 20 Minuten) unterworfen. Der erhaltene Niederschlag wurde in 20 mM Natriumphosphatpuffer [pH-Wert 7,0] gelöst und dann gegen den gleichen Puffer dialysiert.

Reinigung von p 15: Die dialysierte Probe wurde auf eine Phosphocellulosesäule (hergestellt von Whatman [GB]), die mit 20 mM Natriumphosphat [pH-Wert 7,8] äquilibiriert worden war, aufgetragen. Die Probe wurde dann mit einem Natriumchloridgradienten von 0 bis 1 M eluiert. Fraktionen, die p15 enthielten, wurden vereinigt und gegen 20 mM Natriumphosphatpuffer [pH-Wert 7,0] dialysiert. Die dialysierte Probe wurde auf eine Hydroxylapatitsäule (KB-Säule, hergestellt von Koken, Ltd.) aufgetragen und mit einem Natriumphosphatgradienten von 20 bis 700 mM eluiert. Die Fraktionen, die p15 enthielten, wurden vereinigt und gegen 20 mM Natriumphosphatpuffer [pH- Wert 7,0] dialysiert. Diese Probe wurde dann auf eine MonoS-Säule aufgetragen und mit einem Natriumchloridgradienten von 0 bis 1 M eluiert. Die p15 enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, um gereinigtes p15 zu erhalten.

VERGLEICHSBEISPIEL 14 Konstruktion eines die gag-pol-Gene des AIDS-Virus enthaltenden Exnressionsplasmids

Der HIV-1-Provirus-DNA-Klon pNL4-3 wurde mit indlil gespalten, und das erhaltene etwa 1, 2 kb große DNA-Fragment wurde in den HindIII-Abschnitt des Klonierungsvektors pHSG398 (hergestellt von Takara Shuzo [Japan]) inseriert, um pNLH122 herzustellen. Dieser pNLH122 wurde mit BglII und HindIII gespalten, und das erhaltene etwa 1,03 kb große DNA- Fragment wurde in M13mp19 (hergestellt von Takara Shuzo), das mit BamHI und HindIII gespalten war, inseriert, um Gag19.(Bg-H) zu erhalten. Die Sequenz GAG unmittelbar vor dem Startcodon (ATG) des gag-Gens auf Gag19.(Bg-H) wurde mittels dem Oligonukleotid-gerichteten in-vitro-Mutagenese-System Version 2 (hergestellt von Amersham [GB]) in CAT umgewandelt und erzeugte Gag19.(Nde), in das die NdeI-Stelle neu eingeführt worden war. Gag19.(Nde) wurde mit NdeI und PstI gespalten, und das erhaltene 0,63 kb große DNA-Fragment wurde in mit NdeI und PstI gespaltenes PT7-7 inseriert, um pTG541 herzustellen. Außerdem wurden die im Beispiel 10 hergestellten pPG912 und pPG922 mit PstI gespalten, und die erhaltenen etwa 1,2 kb großen DNA-Fragmente wurden jeweils in den PstI-Abschnitt von pTG541 inseriert und mit diesem in der gewünschten Richtung verbunden, und die so konstruierten Plasmide wurden als pTG591 bzw. pTG592 bezeichnet. In pTG591 und pTG592 sind die DNA-Fragmente verbunden, die den gesamten Bereich von Startcodon des gag-Gens unter der Kontrolle des T7-Promotors bis zur Proteaseregion des pol-Gens enthalten. In pTG591 wird das exprimierte HIV-Protein einem Prozeß unterworfen, der auf der durch Verschiebung des Leserahmens exprimerten Protease beruht, so daß p17, p24 und p15 in großen Mengen hergestellt werden. In pTG592 wird das exprimierte HIV-Protein einem Prozeß unterworfen, der auf der ohne Verschiebung des Leserahmens coexprimierten Protease beruht, so daß p17 und p24 in großen Mengen hergestellt werden.

Der Stamm JM103 wurde als Wirt zur Konstruktion der Plasmide und der Stamm BL21 (DE3) als Wirt zur Expression der Proteine verwendet.

VERGLEICHSBEISPIEL 15 Konstruktion eines das Matrixprotein des AIDS-Virus stark exprimierenden Vektors

Zuerst wurde der im Beispiel 14 hergestellte pTG591 mit NsiI und ApaI gespalten, und nach Behandlung mit S1-Nuklease mit sich selbst verbunden. Wenn die N-terminale Seite vom Nsi-Abschnitt des gag-Gens und die C-terminale Seite vom Apa-Abschnitt im gleichen Leserahmen verbunden sind, werden ein Gag-Protein und ein Gag-Pol-Protein exprimiert, denen der Abschnitt von der Mitte von p24 bis zur Mitte von p15 fehlt, und sie werden wahrscheinlich einem Prozeß unterworfen, der auf der im Gag-Pol-Protein enthaltenen Protease beruht, so daß p17 erzeugt wird. Unter den im obigen Arbeitsschritt erhaltenen Klonen wurde ein Klon ausgewählt, der die Aktivität zur Prozessierung des p55-Gag-Proteins exprimierte und p17 in einer großen Menge erzeugte, und als pTG691 bezeichnet.

Nach der Spaltung mit BglII wurde pTG591 mit T4-DNA-Polymerase behandelt und dann weiter mit PstI gespalten. Das erhaltene etwa 0,52 kb große DNA-Fragment wurde gesammelt. Andererseits wurde pTG591 nacheinander mit sil, S1-Nuklease und PstI behandelt, und das erhaltene etwa 2,9 kb große DNA-Fragment wurde gesammelt. Unter vielen Klonen, die durch Verbinden dieser zwei Arten von DNA-Fragmenten erhalten wurden, wurde der Klon ausgewählt, der die Aktivität zur Prozessierung des p55-Gag-Proteins exprimierte und p17 in einer großen Menge erzeugte, und als pTG681 bezeichnet.

pTG591 wurde mit SphI und ApaI gespalten und nach Behandlung mit T4-DNA-Polymerase mit sich selbst verbunden, um pTG171 herzustellen.

pTG592 wurde mit SphI und ApaI gespalten und nach Behandlung mit T4-DNA-Polymerase mit sich selbst verbunden, um pTG172 herzustellen.

Der im Beispiel 14 hergestellte Gag19.(Nde) wurde mit EcoRI und PstI gespalten, und das erhaltene 0,76 kb große DNA-Fragment wurde in M13mp18, das mit EcoRI und PstI gespalten worden war, inseriert, um Gag18.(Bg-P) zu erhalten. Das 133. Codon, CCT, des gag-Gens auf Gag18.(Bg-P) wurde mittels in-vitro-Mutagenese in TAA umgewandelt, um Gag18.TAA herzustellen, bei dem das Terminationscodon unmittelbar nach der für p17 codierenden Region inseriert war.

Gag18.TAA wurde mit NdeI und PstI gespalten, und das erhaltene 0,63 kb große DNA-Fragment wurde in mit NdeI und PstI gespaltenes pT7-7 inseriert, um pTG52 herzustellen.

Das defekte Gag-Protein und Gag-Pol-Protein wurden einer Prozessierung unterworfen, wodurch p17 mittels Verschiebung des Leserahmens in pTG691 und pTG171 und mittels Proteaseexpression ohne Verschiebung des Leserahmens in pTG681 und pTG172 in einer großen Menge hergestellt wurde. Außerdem produziert pTG52 direkt in einer großen Menge p17, ohne daß eine Prozessierung nach der Translation erforderlich ist.

Der Stamm JM103 wurde als Wirt zur Plasmidkonstruktion und der Stamm BL21 (DE3) als Wirt zur Proteinexpression verwendet.

VERGLEICHSBEISPIEL 16 Isolation von p17

Der Transformantenklon BL21 (DE3)/pTG171 wurde 18 Stunden bei 37ºC in LB-Medium gezüchtet, das 20 ug/ml Ampicillin enthielt, dann wurde 1/100 Volumen zu frischem LB-Medium gegeben (das 20 ug/ml Ampicillin enthielt) und bei 37ºC gezüchtet. Als die OD600nm des Mediums 0,5 erreichte, wurde 1 mM IPTG zugegeben, und die Kultur wurde fünf Stunden bei 37ºC fortgesetzt. Die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation (5000 U/min. 10 Minuten) gesammelt, in 1/50 Volumen 15 mM Natriumphosphat [pH-Wert 6,7] suspendiert, und nach einer Ultraschallbehandlung (sechs 30-Sekunden-Impulse, 19,5 kHz, 300 W) wurde die durch Zentrifugation (19000 U/min. 60 Minuten) erhaltene Überstandsflüssigkeit als rohe Extraktionsflüssigkeit abgetrennt.

Grobreinigung von p17: Ammoniumsulfat wurde zu der rohen Extraktionsflüssigkeit gegeben, so daß 40%ige Sättigung erhalten wurde, und nach Rühren wurde das Gemisch einer Zentrifugation (16000 U/min. 20 Minuten) unterworfen. Ammoniumsulfat wurde zur Überstandsflüssigkeit gegeben, so daß 80%ige Sättigung erhalten wurde, und nach Rühren wurde das Gemisch einer Zentrifugation (16000 U/min. 20 Minuten) unterworfen. Der erhaltene Niederschlag wurde in 15 mM Natriumphosphatpuffer [pH-Wert 6,7] gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert.

Reinigung von p17: Die dialysierte Probe wurde auf S-Sepharose (hergestellt von Pharmacia [Schweden]), die mit 15 mM Natriumphosphat [pH-Wert 6,7] äquilibriert worden war, aufgetragen. Die Probe wurde dann mit einem Natriumchloridgradienten von 0 bis 1 M eluiert. Fraktionen, die p17 enthielten, wurden vereinigt und auf das Zweifache mit 15 mM Natriumphosphat verdünnt. Diese Fraktion wurde auf eine MonoS-Säule (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war. Die Probe wurde dann mit einem Natriumchloridgradienten von 0 bis 1 M eluiert, Fraktionen, die p17 enthielten, wurden vereinigt und auf das Fünffache mit 20 mM Natriumphosphat [pH-Wert 7,0] und 10 mM 2-Mercaptoethanol verdünnt. Die erhaltene verdünnte Probe wurde auf eine Hydroxyapatitsäule (KB-Säule, hergestellt von Koken, Ltd. [Japan]) aufgetragen und mit einem Natriumphosphatgradienten von 15 bis 700 mM eluiert. Die Ausbeute an gereinigtem p17 pro Liter Transformantenkulturflüssigkeit betrug etwa 4 mg. Gereinigtes p17, von dem der Methioninrest am N-Terminus entfernt war, wurde keiner Myristylierung unterworfen und hatte eine N-terminale Aminosäuresequenz aus: Gly - Ala - Arg - Ala - Ser - Val - Leu - Ser - Gly - Gly - Glu - Leu - Asp - Lys - Trp ......, die somit mit der von der Nukleotidsequenz vorhergesagten Aminosäuresequenz übereinstimmte.

BEISPIEL 1 Konstruktion eines das nef-Gen von HIV-1 tragenden Expressionsvektors

Der HIV-1-Provirus-DNA-Klon pNL4-3 wurde mit indill gespalten, und das erhaltene etwa 1,5 kb große DNA-Fragment wurde in den HindIII-Abschnitt des Klonierungsvektors pHSG398 inseriert, um pNLH152 herzustellen. Dieser pNLH152 wurde mit HindIII und XhoI gespalten. Das erhaltene etwa 0,72 kb große XhoI-HindIII-Fragment wurde in den Expressionsvektor pUR292 (The EMBO Journal, 2 (2): 1791-1794, 1983), der mit SaII und HindIII gespalten war, inseriert, um pNF 102 herzustellen. Dieser pNF 102 wurde mit BamHI und HindIII gespalten, und das erhaltene etwa 0,72 kb große BamHI-HindIII-Fragment wurde in den mit BamHI und HindIII gespaltenen Expressionsvektor pT7-7 inseriert, um pTF103 herzustellen. Dieser pTF103 wurde dann mit BamHI gespalten und nach Behandlung mit T4-DNA-Polymerase mit sich selbst verbunden, um pTN104 herzustellen. Der oben genannte pNF102 exprimierte ein Chimerenprotein stark, das β-Galactosidase und eine Region von der 35. bis zur 206. (C-terminalen) Aminosäure des HIV-1-Nef- Proteins umfaßte. Der oben genannte pTN104 exprimierte ein Chimerenprotein stark, bei dem das aus 11 Aminosäuren bestehende Peptid aus der Mehrfachklonierungsstelle von pT7-7 an den N-Terminus der Region gebunden war, die von der 35. bis zur 206. Aminosäure des Nef-Proteins reichte. Diese Chimerenproteine reagierten spezifisch mit dem Serum eines HIV-1-Trägers im Western-Blot. Der Stamm JM103 und der Stamm UT481 wurden bei pNF102 und der Stamm BL21 (DE3) bei pTF104 als die Wirte für die Expression verwendet.

BEISPIEL 2 Konstruktion eines das HIV-1-Nef-Protein stark exprimierenden Vektors

Zuerst wurde pNLH152 mit HindIII und HincII gespalten, und das erhaltene etwa 0,96 kb große HincII-HindIII-Fragment wurde in mit HincII und HindIII gespaltenes M13mp19 inseriert, um Nef19.(Hc-H) herzustellen. Die Sequenz AAG unmittelbar vor dem Initiationscodon (ATG) des nef-Gens auf Nef19.(Hc-H) wurde mittels in-vitro-Mutagenese in CAT umgewandelt, um Nef19.(Nde) herzustellen, in das die Nde-Stelle neu eingeführt worden war. Nef19.(Nde) wurde mit NdeI und HindIII gespalten, und das erhaltene etwa 0,82 kb große NdeI-HindIII-Fragment wurde in den Expressionsvektor pT7-7 inseriert, der mit l~eI und Hir dIII gespalten worden war, um pT7-Nef herzustellen. Durch Einbringen von pT7-Nefin den Stamm BL21 (DE3) wurde das Nef-Protein, das mehr als 10% des gesamten Bakterienproteins ausmachte, exprimiert und angehäuft.

BEISPIEL 3 Isolation und Reinigung des Nef-Proteins

Der Transformantenklon BL21 (DE3)/pT7-Nefwurde 18 Stunden bei 37ºC in LB-Medium gezüchtet, das 20 ug/ml Ampicillin enthielt, dann wurde 1/100 Volumen zu frischem LB-Medium gegeben (das 20 ug/ml Ampicillin enthielt), und das Gemisch wurde bei 37ºC gezüchtet. Als die OD600nm des Mediums 1,0 erreichte, wurde 1 mM IPTG zugegeben, und die Kultur wurde weitere fünf Stunden fortgesetzt. Die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation (5000 U/min. 10 Minuten) gesammelt und in 1/50 Volumen 20 mM Natriumphosphat suspendiert, und nach einer Ultraschallbehandlung (sechs 30-Sekunden-Impulse, 19,5 kHz, 300 W) wurde die durch Zentrifugation (19000 U/min. 60 Minuten) erhaltene Überstandsflüssigkeit als rohe Extraktionsflüssigkeit abgetrennt.

Grobreinigung von Nef-Protein: Ammoniumsulfat wurde zu der rohen Extraktionsflüssigkeit gegeben, so daß 35%ige Sättigung erhalten wurde, und nach Rühren wurde das Gemisch einer Zentrifugation (16000 U/min. 20 Minuten) unterworfen. Der erhaltene Niederschlag wurde in 20 mM Natriumphosphatpuffer gelöst und dann gegen den gleichen Puffer dialysiert.

Reinigung von Nef-Protein: Die dialysierte Probe wurde auf S-Sepharose (hergestellt von Pharmacia [Schweden]), die mit 20 mM Natriumphosphat [pH-Wert 7,0] äquilibriert worden war, aufgetragen. Die Probe wurde dann mit einem Natriumchloridgradienten von 0 bis 1 M eluiert, Fraktionen, die das Nef-Protein enthielten, wurden vereinigt und dann gegen 20 mM Natriumphosphat [pH-Wert 7,0] dialysiert. Die Probe wurde dann auf eine Hydroxyapatitsäule (KB-Säule, hergestellt von Koken, Ltd.) aufgetragen und mit einem Natriumphosphatgradienten von 20 bis 700 mM eluiert. Die Fraktionen, die das Nef-Protein enthielten, wurden vereinigt und gegen 20 mM Tris-HCl [pH-Wert 8,3] und 5 mM 2-Mercaptoethanol dialysiert. Diese Probe wurde auf eine MonoQ-Säule aufgetragen und mit einem Natriumchloridgradienten von 0 bis 1 M eluiert. Die das Nef- Protein enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, wodurch gereinigtes Nef-Protein erhalten wurde. Die Ausbeute an gereinigtem Nef-Protein pro Liter Transformantenkulturflüssigkeit war etwa 7 mg.

Das mit E. coli massenproduzierte und gereinigte Nef-Protein, von dem der N-terminale Methioninrest entfernt worden war, wurde keiner Myristylierung unterworfen und zeigte die N-terminale Aminosäuresequenz: Gly - Gly - Lys - Trp - Ser - Lys - Ser - Ser - Val - Ile - Gly - Trp - Pro - Ala - Val ...., die somit mit der von der Nukleotidsequenz vorhergesagten Aminosäuresequenz übereinstimmte.

BEISPIEL 4 Diagnose einer HIV-1-Infektion unter Verwendung von eg reinigtem Nef-Protein

Das im Beispiel 3 hergestellte gereinigte Nef-Protein wurde gemäß den im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren auf einem Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt und auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Die Membran wurde dann zum Blockieren in eine 3% Gew./Vol. Gelatinelösung eingetaucht. Anschließend wurde das Vorliegen eines Antikörpers gegen das HIV-1- Nef-Protein in den Seren menschlicher HIV-1-Träger (7 Individuen) unter Verwendung einer Western-Blot-Technik untersucht. Gesunde Erwachsene (9 Individuen) wurden auf ähnliche Weise untersucht. Das Ergebnis ist in der Tabelle 2 gezeigt.

Die Seren von 6 unter 7 HIV-1-Trägern reagierten positiv mit dem Nef-Protein. Das deutet darauf hin, daß es möglich ist, einen spezifischen Nachweis und eine spezifische Diagnose des Vorliegens einer HIV-1-Infektion unter Verwendung von gereinigtem HIV-1-Nef-Protein durchzuführen, das erfindungsgemäß aus Escherichia coli hergestellt wurde.

Tabelle 2 Diagnose einer HIV-1-Infektion durch Western-Blot unter Verwendung von gereinigtem Nef-Protein

* Spezifische immunologische Reaktion gegen gereinigtes Nef-Protein.

** Die Reaktivität wurde durch die Western-Blot-Technik gemessen. Gezeigt sind positive (+) und negative (-) Reaktionen.

INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT

Die vorliegende Erfindung ist auf das Gebiet der Herstellung auf Gentechnologie beruhender medizinischer Versorgungsgüter und diagnostischer Mittel und als Reagenz für die Forschung auf Gebiete anwendbar, wie Molekularbiologie, Virologie, medizinische Wissenschaft, Pharmakologie, Tiermedizinwissenschaft und Immunologie.


Anspruch[de]

1. Expressionsvektor, umfassend eine cDNA-Sequenz, die dem nef-Gen oder einem Teil davon entspricht, und eine Plasmid-DNA, ausgewählt aus der pUR290-Plasmid-Reihe und dem Plasmid pT7-7.

2. Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei der nef-Gen-Bereich aus HIV stammt.

3. Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der Teil der nef-Gen-cDNA- Sequenz die Aminosäuren 35-206 des HIV-nef-Proteins codiert.

4. Verfahren zur Herstellung eines Plasmid-Expressionsvektors, der ein retrovirales nef-Gen exprimieren kann, umfassend das Einbringen einer cDNA-Sequenz, die dem gesamten nef-Gen oder einem Teil davon entspricht, in funktionsfähiger Verbindung mit einem Promotor in einen Vektor, ausgewählt aus der pUR290-Plasmid-Reihe und dem Plasmid pT7-7.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das nef-Gen aus HIV stammt.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, wobei der Teil der nef-Gen-cDNA-Sequenz die Aminosäuren 35-206 des HIV-nef-Proteins codiert.

7. Verfahren zur Herstellung eines retroviralen nef-Gen-Produktes, umfassend die Schritte Konstruieren eines Expressionsvektors wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, der eine dem nef-Gen entsprechende cDNA-Sequenz umfaßt, Transformieren einer bakteriellen Wirtszelle, die vektorcodierte Gene exprimieren kann, mit dem Expressionsvektor, und Züchten der transformierten Zelle, wodurch das nef-Gen-Produkt erzeugt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die bakterielle Wirtszelle E.coli UT481 ist, wenn das Plasmid eines der pUR290-Reihe ist, oder E. coli BL21 (DE3) ist, wenn das Plasmid pT7-7 ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das nef-Gen-Produkt das vollständige nef-Polypeptid oder ein Polypeptid ist, das die Aminosäuren 35-206 des nef-Polypeptides umfaßt.

10. Bakterieller Wirt, der mit dem Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3 transformiert worden ist.

11. Bakterieller Wirt nach Anspruch 10, wobei die bakterielle Wirtszelle E. coli UT481 ist, wenn das Plasmid eines aus der pUR290-Reihe ist, oder E. coli BL21 (DE3) ist, wenn das Plasmid pT7-7 ist.







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