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Dokumentenidentifikation DE69131226T2 23.09.1999
EP-Veröffentlichungsnummer 0527752
Titel EXPRESSION VON BORDETELLA ANTIGENEN IN PICHIA
Anmelder Medeva Pharma Ltd., Leatherhead, Surrey, GB
Erfinder CLARE, Jeffrey, John Langley Court, Kent BR3 3BS, GB;
ROMANOS, Michael, Anthony Langley Court, Kent BR3 3BS, GB
Vertreter Rechts- und Patentanwälte Lorenz Seidler Gossel, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69131226
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 28.03.1991
EP-Aktenzeichen 919065987
WO-Anmeldetag 28.03.1991
PCT-Aktenzeichen GB9100487
WO-Veröffentlichungsnummer 9115571
WO-Veröffentlichungsdatum 17.10.1991
EP-Offenlegungsdatum 24.02.1993
EP date of grant 12.05.1999
Veröffentlichungstag im Patentblatt 23.09.1999
IPC-Hauptklasse C12N 1/19
IPC-Nebenklasse C12N 15/81   C12N 15/31   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft die Expression von heterologen Proteinen in Hefe und genauer gesagt die Herstellung von Bordetella-Pertactin-Antigenen in Pichia.

Bordetella pertussis verursacht Keuchhusten, eine akute Atemwegserkrankung, die bei Menschen ernsthaft und entkräftend wirkt, wobei Kinder besonders anfällig sind. Der Organismus ist jedes Jahr für ungefähr 1 Million Todesfälle verantwortlich, obwohl dies zu einem gewissen Ausmaß in den entwickelten Ländern durch Impfprogramme im großen Maßstab bekämpft wird. Es ist festgestellt worden, daß Impfung gegen B. pertussis sehr wirksam bei der Verhinderung der Krankheit ist, und daß ein Versagen des Impfens zu einem verstärkten Auftreten der Erkrankung führt. In praktisch allen Gebieten wird die Immunisierung unter Verwendung eines Ganzzell-B. pertussis-Impfstoffs bewirkt, von dem festgestellt wurde, daß er relativ effektiv zur Verhinderung der Erkrankung und von · Kindersterblichkeit ist.

Jedoch hat die öffentliche Akzeptanz der Ganzzell-Impfstoffe aufgrund von Nebenwirkungen und der Kontroverse über seltene neurologische Komplikationen, die solchen Impfstoff- Präparationen zugeschrieben werden, abgenommen. Folglich haben Forscher nach sichereren, wirksamen azellulären Impfstoffen gesucht, welche aus gereinigten Bordetella-Antigenen bestehen.

Von dem Oberflächenantigen von B. pertussis ist bekannt, daß es eine humorale und eine zelluläre Immunantwort in Menschen hervorruft. Es ist als ACAP in der EP-A-162639 offenbart und nun als P.69 bekannt (I. G. Charles et al.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 80, 3554-3558 (1989)). Es ist wahrscheinlich eine bedeutende Komponente eins jedweden zukünftigen azellulären Impfstoffes gegen B. pertussis-Infektionen.

B. parapertussis und B. bronchiseptica sind mit dem B. pertussis-Organismus nah verwandt. B. parapertussis ist ebenfalls für Ausbrüche von Keuchhusten beim Menschen verantwortlich (Zeuler et al., J. Pediatr. 9: 493-497 (1946)); von B. bronchiseptica ist bekannt, daß es Atemwegserkrankungen bei Tieren verursacht, insbesondere atrophische Rhinitis bei Schweinen (Harris und Switzer, Am. J. Vet. Res. 29, 777-785 (1968)).

B. parapertussis und B. bronchiseptica scheinen zu dem B. pertussis-P.69 verwandte Antigene mit Molekülmassen von 70 bzw. 68 kD zu präsentieren. Diese Bordetella-Antigene, welche hier nachstehend als "Pertactin-Antigene" bezeichnet werden, binden bekanntermaßen an den BB05-Antikörper, scheinen aber unterschiedliche immunogene Eigenschaften zu haben (I. G. Charles et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 80 3554-3558 (1989)). Nur kleine Mengen an Pertactin-Antigen können aus Kulturen eines Bordetella-Organismus isoliert werden. Für die Herstellung von Antigenen in einem kommerziellen Maßstab ist es zu bevorzugen, zur Herstellung großer Quantitäten in der Lage zu sein.

E. coli ist als ein Wirtsorganismus für die Herstellung von heterologen Proteinen, wie Antigenen, in Quantität bekannt, besitzt aber bestimmte Nachteile, da es toxische pyrogene Faktoren (Lipopolysaccharide aus der Zellwand) enthält, die aus dem Endprodukt rigoros ausgeschlossen werden müssen. Die Leichtigkeit, mit der diese Faktoren ausgeschlossen werden können, hängt von dem Reinigungsverfahren ab. Es wäre jedoch vorteilhaft, die Möglichkeit einer Kontamination insgesamt zu eliminieren, indem einfach ein nicht-toxischer Organismus als der Wirt verwendet wird, wie Hefe.

Wenn Bäckerhefe, Saccharomyces cerevisiae, als der Wirtsorganismus verwendet wird, werden häufig schlechte Expressionshöhen von heterologem Protein erhalten (Kingsman et al., Biotechnology & Genet. Engin. Reviews, Bd. 3, 377-416, 1985). Die Verwendung der Hefe Pichia asn toris als ein Wirt für die Expression von heterologem Protein ist ebenfalls bekannt (EP-A-0180899 und EP-A-0263311). Allerdings ist die Expression von Membranproteinen in Hefe allgemein problematisch, da diese Proteine mit Hefezellmembranen interagieren können, was toxische Effekte auf die Hefezelle und verminderte Produktausbeuten verursacht. Beispiele solcher Schwierigkeiten sind beschrieben worden und schließen die Expression von Mittlerem T-Antigen aus Polyoma-Virus (Belsham et al., Eur. J. Biochem. 156, 413-421, 1986), die Expression des bakteriellen Membranproteins OmpA (Janowitz et al., Gene 20, 347-358, 1982) und die Expression von Influenzavirus-Hämagglutinin (Jabbar et al. 4, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 2019-2023, 1985) ein.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben einen Weg zur Herstellung guter Expressionsspiegel der Bordetella-Pertactin-Antigene durch Kultivieren von Pichia-Transformanten gefunden, die mehrere Kopien der DNA enthalten, die für ein Pertactin-Antigen oder ein antigenes Fragment davon codiert.

Folglich stellt die vorliegende Erfindung einen Pichia-Mikroorganismus bereit, der mit mehreren Kopien einer DNA transformiert ist, die für ein Pertactin-Antigen oder ein antigenes Fragment davon codiert, wobei die mehreren Kopien in die chromosomale Pichia-DNA integriert sind.

Der Pichia-Mikroorganismus kann somit mit DNA für die Expression eines Pertactin-Antigens, dessen Aminosäuresequenz zu mindestens 95% mit der in der Fig. 1A, 1B oder 1C dargestellten homolog ist, oder eines antigenen Fragmentes davon transformiert sein. Es wird bevorzugt, wenn die obenstehend beschriebene Aminosäuresequenz zu mindestens 98% mit der in der Fig. 1A, 1B oder 1C dargestellten oder einem antigenen Fragment davon homolog ist.

Ein Pertactin-Antigen aus B. pertussis schließt das Antigen ein, dessen Aminosäuresequenz zu mindestens 95% homolog ist mit der in der Fig. 1A dargestellten, jedoch vorzugsweise im wesentlichen dieselbe ist. Dieses Antigen wird als P69 bezeichnet. Ein Pertactin-Antigen aus B. bronchiseptica schließt das Antigen ein, dessen Aminosäuresequenz zu mindestens 95% homolog mit der in der Fig. 1B dargestellten ist, aber vorzugsweise im wesentlichen dieselbe ist. Dieses Antigen wird als P68 bezeichnet. Ein Pertactin-Antigen aus B. parapertussis schließt das Antigen ein, dessen Aminosäuresequenz zu mindestens 95% homolog mit der in der Fig. 1C dargestellten ist, aber vorzugsweise im wesentlichen dieselbe ist. Dieses Antigen wird als P70 bezeichnet.

Die DNA für die Expression eines Pertactin-Antigens kann einen größeren Vorläufer codieren, der ein Molekulargewicht von ungefähr 94 kD hat und der innerhalb der Zelle zu dem gewünschten Antigen prozessiert wird. Im Falle von P.69 ist der Vorläufer ungefähr 93,5 kD groß. Die dafür codierende DNA ist von Charles et 4, (PNAS, 86, S. 3554-3558, (1989)) kloniert und sequenziert worden. Der Vorläufer des P.68-Antigens von B. bronchiseptica ist ungefähr 941 kD groß, und der Vorläufer für P.70 von B. parapertussis ist ungefähr 95 kD groß.

Mit mehreren Kopien von DNA für die Expression eines antigenen Fragmentes eines Pertactin- Antigens transformierte Pichia-Mikroorganismen werden ebenfalls von der Erfindung beinhaltet. Die Fragmente enthalten bevorzugt nicht mehr als 50 Aminosäurereste. Weiter bevorzugt enthalten sie zwischen 5 und 25 Reste. Die Fragmente umfassen am stärksten bevorzugt eine definierte antigenisch wirksame Sequenz, welche im wesentlichen aus den Aminosäureresten 547 bis 552 des P.69-Proteins von B. pertussis besteht.

Diese Sequenz ist: PGPQPP

Die entsprechende Sequenz für andere Stämme von B. pertussis und für Stämme von B. parapertussis und B. bronchiseptica kann leicht durch Übereinanderstellen der Aminosäuresequenz des P.69-Antigens, des P.70-Antigens bzw. des P.68-Antigens mit der P.69-Sequenz, welche von Charles et al. (1989), hierin bereits zitiert, gezeigt worden ist, ermittelt werden.

Die obenstehend beschriebenen Fragmente schließen ebenfalls eine Sequenz ein, welche im wesentlichen aus den Aminosäureresten 544 bis 566 des P.69-Proteins von B. pertussis besteht.

Diese Sequenz ist: APQPGPQPPQPPQPQPEAPAPQP

Diese Sequenz und die entsprechende Sequenz für das P.70-Antigen von B. parapertussis und das P.68-Antigen von B. bronchiseptica können aligniert bzw. übereinandergestellt werden. Ein weiteres Fragment von Interesse ist ein 60 kD großes Fragment, das vom C-terminalen Ende der DNA für P.69 codiert wird, welches von Charles et al. (1989), hierin bereits zitiert, als für ein antigenes Fragment von P.69 codierend identifiziert worden ist.

Die Transformation des Organismus kann durch jedwedes bekannte Verfahren in der Literatur (Beggs, Nature 275, 104-109 (1978)) durchgeführt werden. Es ist zu bevorzugen, das Sphaeroblastenverfahren zu verwenden, welches von Cregg et al., Bio/Technology 5, 479-485 (1987), beschrieben worden ist. Der Pichia-Organismus wird bevorzugt mit einer Expressionscassette transformiert. Expressionscassetten schließen DNA-Sequenzen zusätzlich zu derjenigen, welche für die Sequenz von Interesse codiert, in diesem Falle der für ein Pertactin-Antigen codierenden DNA, ein, wie transkriptionale und translationale Initiations- und Terminationssequenzen. Die Cassette kann auch regulatorische (d. h. Promoter) und/oder selektierbare Marker-Sequenzen einschließen. Solche Expressionscassetten sind im Fachgebiet gut bekannt und es liegt wohl innerhalb der Fähigkeiten des Fachmanns, sie zu konstruieren. Die Expressionscassette kann einen Teil eines Vektorkonstruktes oder eines natürlich vorkommenden Plasmides bilden.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das zur Transformation von Pichia-Zellen verwendete Vektorkonstrukt den Promoter aus dem Methanol-induzierbaren AOX1-Gen, um die Expression der für ein Pertactin-Antigen codierenden DNA zu steuern. Insbesondere kann es sich bei dem Vektor um pPIC3-60.5K. handeln. Dieser Vektor, verdaut mit BglII, wird sich in den wirtschromosomalen AOX1-Locus integrieren. Die resultierenden aox1'-Transfor manten weisen den Muts-Phänotyp (langsame Methanol-Verwertung) auf und können deshalb selektiert werden.

In der Erfindung wird ein Pichia-Organismus mit mehr als einer Kopie der DNA, welche für ein Pertactin-Antigen oder ein antigenes Fragment davon codiert, transformiert. Die DNA wird in die chromosomale Pichia-DNA integriert. Es ist zu bevorzugen, daß der Organismus mehr als 5 Kopien, vorzugsweise mehr als 10 Kopien und am stärksten bevorzugt zwischen 5 und 30 Kopien der DNA enthält, welche das Pertactin-Antigen oder ein antigenes Fragment davon codiert.

Solche Transformanten können bis zu 5% des Zellproteins als das gewünschte Protein herstellen. In optimalen Fermenter-Bedingungen können Spiegel von bis zu 10% Zellprotein als das heterologe Antigen hergestellt werden. Bei solchen Spiegeln ist der Großteil des Antigens unlöslich. Dies ist vorteilhaft, da das Material leicht aus der unlöslichen Fraktion isoliert, renaturiert und gereinigt werden kann.

Der bevorzugte Pichia-Organismus, auf den obenstehend Bezug genommen wurde, ist Pichia pastoris.

Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Pertactin-Antigens oder eines antigenen Fragmentes davon zur Verfügung, wobei das Verfahren das Kultivieren eines transformierten Pichia-Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung umfaßt.

Das Kultivieren des transformierten Mikroorganismus wird durch bekannte Verfahren beispielsweise in einem Hefeextrakt-Band-Medium unter Verwendung eines Schüttelkolbens durchgeführt. Für optimale Bedingungen ist es zu bevorzugen, einen Fermenter zu verwenden, welcher für die Überwachung des pH-Wertes, des O&sub2;, der Rührgeschwindigkeit, Temperatur und/oder des Luftstroms ausgestattet ist, um die Umgebung der Zellen zu kontrollieren. Das durch solche Verfahren hergestellte Antigen kann durch Zentrifugation isoliert und durch Chromatographie gereinigt werden.

Um Organismen zu erhalten, welche mehr als eine Kopie der für ein Pertactin-Antigen codierenden DNA enthalten, ist es notwendig, eine Bibliothek von Transformanten unter Anwendung von Standardtechniken, zum Beispiel wie beschrieben von Cregg et al., Bio/Technology 5: 479-485 (1987), herzustellen. Transformanten, welche mindestens eine integrierte Kopie der DNA, welche für ein Pertactin-Antigen codiert, enthalten, bilden ungefähr 10-20% dieser Transformanten. Diejenigen, welche mehrere Kopien der DNA enthalten, werden dann durch Screening identifiziert. Individuelle Transformanten werden auf Mikrotiterplatten herangezüchtet, jede Mikrokultur wird danach auf Nitrozellulosefilter überführt und durch Southern-Hybridisierung unter Verwendung von Pertactin-spezifischer DNA sondiert, welche unter Verwendung von Zufalls-geprimter Markierung (Feinberg et al., (1989) Anal. Biochem., 132-, 6-13) zu einer hohen spezifischen Aktivität radioaktiv markiert wurde. Ein schwaches Signal zeigt an, daß die Transformanten eine einzelne Kopie der DNA enthalten, ein stärkeres Signal zeigt an, daß die Transformanten mehr als eine Kopie der DNA enthalten. Die Filter können dann mit den Mikrotiterplatten kartiert werden, um die gewünschten Mehrfach-Kopien-Mikrokultur(en) zu identifizieren.

Ein Pichia-Organismus gemäß der Erfindung kann deshalb durch ein Verfahren hergestellt werden, welches folgendes umfaßt:

i) Transformieren eines Pichia-Organismus mit einem Vektorkonstrukt, das eine DNA enthält, welche für ein Pertactin-Antigen oder ein Fragment davon und einen selektierbaren Marker codiert.

ii) Screenen von Pichia-Zellen mittels des selektierbaren Markers, um einen transformierten Organismus zu selektieren,

iii) Screenen des transformierten Organismus, um Transformanten zu identifizieren, welche die DNA oder das Fragment davon enthalten.

Ein Verfahren für die verbesserte Produktion eines Pertactin-Antigens oder eines antigenen Fragmentes davon umfaßt:

a) Transformieren eines Pichia-Organismus mit mehreren Vektorkonstrukten, enthaltend DNA, die für ein Pertactin-Antigen oder ein Fragment davon in funktionstüchtiger Verknüpfung an einen Promoter, um die Expression der DNA zu steuern, codiert; und danach

b) Kultivieren des resultierenden transformierten Organismus unter geeigneten Bedingungen, um die Herstellung des durch die DNA codierten Antigens zu erhalten.

Die vorliegende Erfindung wird nun fernerhin unter Bezugnahme auf die begleitenden Figuren beispielhaft veranschaulicht werden.

Figuren-Legenden

Fig. 1A: Die Aminosäuresequenz von P.69 und die DNA-Sequenz, welche für P.69 aus B. pertussis und dessen 93.5 kD großen Vorläufer codiert.

Fig. 1B: Die Aminosäuresequenz von P.68 und die DNA-Sequenz, welche für P.68 aus B. bronchisentica und dessen 94 kD großen Vorläufer codiert.

Fig. 1C: Die Aminosäuresequenz von P.70 und die DNA-Sequenz, welche für P.70 aus B. parapertussis und dessen 95 kD großen Vorläufer codiert.

Fig. 2A: Konstruktion des Vektors pPIC3-60.5K.

Fig. 2B: Eine Plasmidkarte des Vektors pPIC3-60.5K ist im Teil A gezeigt. Der Teil B gibt Details der DNA-Sequenz der DNA an, welche für P.69 codiert, die bei der Konstruktion von pPIC3-60.5K verwendet wurde. Das verwendete EcoRI-NheI-DNA-Fragment enthält die Region von Aval (Nt. 315) bis BglI (Nt. 1979) aus dem 93 kD-Vorläufer-Gen (Charles et al., (1989), PNAS 86 3554-3558), flankiert von Sequenzen, die aus dem Vektor pPERtac8 (Makoff et al., Bio/Technology 8, 1030 (1990)) abgeleitet sind. Dieses Fragment wurde in pPic2 unter Verwendung der gezeigten Adapter-Oligonukleotide eingefügt, welche für das 5'- Ende der für das P.69-Gen codierenden DNA codieren.

Fig. 3: DNA-Dot-Blot-Screening von GS115/pPIC3-60.5K-Muts-Transformanten. Der gezeigte Filter wies 56 Transformanten, eine Positiv-Kontrolle (Position E10: Mehrfach- Kopien-Transformante SL 22, identifiziert in einem vorhergehenden Screen) und eine Negativ- Kontrolle (E11: GS115) auf. Die meisten der Transformanten in dem Screen ergaben ein schwaches Signal von ähnlicher Intensität, ein sehr kleiner Anteil ergab ein viel stärkeres Signal, welches eine Mehrfach-Kopien-Integration anzeigte (A3, A4, B6: bezeichnet als Nr. SL3, SL4 und SL18). Vier weitere Filter wurden auf die gleiche Weise gescreent, aber es wurden keine weiteren Mehrfach-Kopien-Transformanten gefunden.

Fig. 4: Western-Blot-Analyse von P.69-Pertactin-induzierten P. pastoris-Zellextrakten. P. pastoris-Transformanten wurden zwei Tage lang wie in Beispiel 4 beschrieben induziert. Proteine wurden durch Elektrophorese in 7,5%igen SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt und in Western-Blots unter Verwendung des monklonalen Antikörpers BBOS (Bio/Technology 8, 1030 (1990)) nachgewiesen. Die Spuren enthielten: Authentisches B. pertussis-Pertactin (1); oder Zellextrakte aus induzierten Schüttel-Kolben: P. pastoris-Einfach-Kopie-Integrante SL1 (2) oder aus Mehrfach-Kopien-Integranten SL3 (3), SL4 (4), SL18 (5) und SL22 (6). Die Expressionsspiegel wurden durch Vergleich mit bekannten Mengen von Pertactin abgeschätzt.

Fig. 5: Analyse der Pertactin-Expression aus einer SL22-Fermenter-Induktion. Ein Fermenter- Protokoll für Ansatz-Wachstum in Glycerin, gefolgt von Glycerin-Hungern und danach einer gesteuerten Methanol-Zufuhr, wurde wie in Beispiel 5 angewandt. Proteinextrakte (50 ug), hergestellt aus zu verschiedenen Zeiten nach der Induktion genommenen Proben, wurden analysiert: die Spuren 2 bis 9 entsprechen -1, 0, 2, 4, 7, 23, 30 bzw. 50 Stunden. Die Spur 1 enthielt Proteinmarker (Amersham Rainbow-Marker: Myosin 200 kD, Phosphorylase b 92,5 kD, Rinderserumalbumin 69 kD, Ovalbumin 46 kD, Carboanhydrase 30 kD). Die induzierte Pertactin-Bande ist durch einen Pfeil angezeigt. Ein densitometrische Abtastung des gefärbten Gels (Joyce-Loebl, Chromoscan) zeigte, daß das Pertactin ungefähr 10% des Zellproteins nach 30 Stunden erreichte.

Fig. 6: SDS-Polyacrylamidgel-Analyse der Pertactin-Reinigung. Induzierte 5L4-Zellen wurden geerntet, in Puffer A (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M NaCl) + 1% Trition X-100 suspendiert und mit Glasperlen lysiert, wobei ein "Bead Beater" (Biospec Products, Bartesville, OK) verwendet wurde. Unlösliches Protein wurde durch Zentrifugation pelletiert, gewaschen und in 6 M GuanidiniumthiocyanatlPuffer A suspendiert. Bei Dialyse blieb Pertactin löslich, während Hefeproteine durch Zentrifugation entfernt werden konnten. Solubilisiertes Pertactin wurde auf eine chelatierende Sepharose-Säule geladen, die mit Zink befüllt und Puffer A äquilibriert worden war. Nach Waschen mit 0,5 M NaCl wurde Pertactin in 50 mM MES, pH 6,0, 0,1 M NaCl eluiert. Pertactin wurde fernerhin durch Chromatographie auf Q-Sepharose in 50 mM Tris HCl, pH 8,0, bei Elution unter Verwendung eines Gradienten von 0 bis 0,4 M NaCl eluiert. Gelspuren: [1] 30 ug Gesamt-Hefeextrakt; [2] gesamtes lösliches Protein; [3] Guanidinium-solubilisierte Fraktion; [4] Zn-Sepharose-gereinigt; [5] Q-Sepharose-gereinigt; [6] natives Pertactin; [7] Amersham Rainbow-Marker.

Beispiele Allgemeine Information in Bezug auf die Beispiele: Medien:

YPD, 1 Liter: 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, 20 g Glucose.

YNBBG, 1 Liter: 13,4 g Hefe-Stickstoff-Basis, mit/ohne Aminosäuren (Difco LABs., Detroit,

Michigan, USA), 0,4 mg Biotin, 20 ml Glycerin.

YNBBGCas: dasselbe wie obenstehend plus 10 g Cas-Aminosäuren.

YNBBD: dasselbe wie YNBBG, aber mit 20 g Glucose statt 20 ml Glycerin.

YNBBM: dasselbe wie YNBBG, aber mit 5 ml Methanol statt 20 ml Glycerin.

YNBBDCas und YNBBMCas wiesen 10 g Cas-Aminosäuren pro Liter auf.

Feste Medien: wie obenstehend plus 20 g Agar pro Liter.

Beispiel 1: Konstruktion von intrazellulären Pichia pastoris-Egpressionsvektoren für P.69

Der Vektor pPIC3-60.5K, hinterlegt bei THE NATIONAL COLLECTION OF INDUSTRIAL AND MARINE BACTERIA LTD. P. O. Box 31, 135, Abbey Road, Aberdeen AB98DG, Scotland, UK, am 30. März 1990 unter der Zugangs-Nummer 40270, abgeleitet aus pA0804 (Digan et al Dev. Ind. Microbiol., 1988, 29 59-65) wurde für die intrazelluläre Expression von P.69 in Pichia asp toris verwendet. Dieser Vektor verwendet den Promotor aus dem AOX1-Gen, um die Expression zu steuern, und kann in den wirtschromosomalen AOX1- Lokus integriert werden. Um die Einfügung des P.69-Gens zu erleichtern, wurden die in der Fig. 2A gezeigten synthetischen Oligonukleotide zwischen die Asull- und EcoRI-Stelle von pAO804 kloniert, um pPIC1 zu ergeben. Danach wurde ein Derivat dieses Plasmids, pPIC2, dem die EcoRI-Stelle fehlt, konstruiert. Dies wurde durch Verdauen mit EcoRI, gefolgt von Auffüllen der überstehenden einzelsträngigen Enden mit dem Klenow-Fragment von DNA- Polymerase I und Zusammenligieren der glatten Enden bewerkstelligt. Ein 1,8 kb großes EcoRI-NheI-Fragment (siehe Fig. 2B) aus dem Plasmid pPERtac8 (Makoff et al., Bio/Technology 8, 1030 (1990)), das den Großteil des für P.69 (ein 60,5 kD großes Polypeptid) codierenden Gens enthält, wurde in BamHI-SpeI-geschnittenen pPIC2 eingefügt, wobei die in der Fig. 2A gezeigten Adapter-Oligonukleotide verwendet wurden, um pPIC3- 60.5K zu ergeben. Diese Oligonukleotide codieren für das 5'-Ende des P.69-Gens, einschließlich des Initiator-ATG-Codons.

Beispiel 2: Transformation von Pichia pastoris

Der Pichia astoris-Stamm GS 115 (his4&supmin;) wurde mit pPIC3-60.5K unter Verwendung des Sphaeroplasten-Verfahrens transformiert, das von Cregg et al Bio/Technology 5: 479-485 (1987) beschrieben wurde. Transformanten wurden auf Minimalmedium ohne Histidin regeneriert, so daß His&spplus;-Kolonien selektiert werden. Bei der transformierenden DNA handelte es sich um 10 oder 20 ug BglII-verdauten pPIC3-60.5K. Dieser Verdau enthält zwei DNA- Fragmente, von denen eines (7,2 kb) AOX1-Sequenzen an jedem Ende besitzt, so daß es zielgelenkt ist, an dem chromosmalen AOX1-Gen zu integrieren und dieses zu ersetzen ("transplazieren").

Von den erzeugten His&spplus;-Transformanten wird hauptsächlich festgestellt, daß sie nichtdisruptiertes AOX1 enthalten, und Transplazierungen (aox1) können unter Anwendung eines weiteren Screening-Vorgehens isoliert werden. Transplazierungen können durch ihr langsanes Wachstum auf Methanol identifiziert werden (MutS- im Gegensatz zu Mut&spplus;-Phänotyp; Cregg et al., Bio/Technology 5, 479-485, 1987). Die Transformanten können direkt von den Regenerationsplatten abgepickt bzw. abgenommen werden und hinsichtlich Wachstum auf Minimal-Methanol-Platten (YNBBM-Agar) getestet werden. Alternativ dazu können die Regenerations-Top-Agars abgehoben und in Wasser homogenisiert und die Hefezellen zu etwa 300 Kolonien je Platte auf Minimal-Glucose-Platten (YNBBD-Agar) ausplattiert werden. Muts-Kolonien werden dann durch Replica-Plattieren auf Minimal-Methanol-Platten identifiziert. Im allgemeinen haben wir und andere herausgefunden, daß der Anteil von Muts 10-20% aller Transfomanten beträgt. Gelegentlich könnten Mut&spplus;-Transformanten als MutS bewertet werden, und diese können sich ebenfalls als mehrere Kopien des Vektors enthaltend erweisen.

Beispiel 3: Screening nach Mehrfach-Kopien-Transformanten

Um große Anzahlen von Transformanten rasch zu screenen, wurden sie in individuellen Vertiefungen in einer sterilen 96-Platz-Mikrotiterplatte herangezogen. 200 ul YPD in jeder Vertiefung wurden mit einer Transformante inokuliert und die Platten wurden zwei Tage lang bei 30ºC ohne Schütteln inkubiert, um Wachstum bis zur stationären Phase zu gewährleisten. Auf jeder Mikrotiterplatte eingeschlossen war eine Vertiefung mit GS 115 (Negativ-Kontrolle) und eine mit einer bekannten pPIC3-60.5K-Integrante (Positiv-Kontrolle). Unter Verwendung eines "Multi-Kanal"-Pipettierers wurden 50 ul große Proben jeder Mikrokultur auf einen Nitrozellulosefilter auf einem Schleicher & Schuell-"Minifold" unter Vakuum überführt. Die Filter wurden luftgetrocknet, zur Orientierung gekennzeichnet und dann auf die folgende Weise behandelt, um die Zellen zu lysieren: (i) 15 min bei Raumtemperaturmit 50 mM EDTA, 2,5% 2-Mercaptoethanol, pH 9,0, (ii) 4 Stunden lang bei 37ºC mit 1 mg/ml Zymolyase (100T) in Wasser, (iii) 5 min bei Raumtemperatur in 0,1 M NaOH, 1,5 M NaCl und (iv) zweimal 5 min lang bei Raumtemperatur in 2 · SSC. Jede Behandlung wurde durch Tränken von 2 Blättern 3MM-Papier mit der Lösung und Aufbringen des Nitrozellulosefilters auf der Oberseite durchgeführt. Nach diesen Behandlungen wurden die Filter 1 Stunde lang bei 80ºC gebacken.

Die Filter wurden durch Southern-Hybridisierung unter Verwendung von P.69-spezifischer DNA sondiert, die zu einer hohen spezifischen Aktivität unter Anwendung von zufallsgeprimter Markierung (Feinberg, A., und Vogelstein, B., (1989), Anal. Biochem. 132, 6-13) radioaktiv markiert worden war. Für Vorhybridisierung, Hybridisierung, Waschen und Autoradiographie wurden Standardverfahren verwendet.

Die Fig. 3 zeigt die Ergebnisse eines solchen Screens von über 200 Muts-Transformanten von pPIC3-60.5K. Alle der Transformanten reagierten mit der Sonde und die meisten ergaben ein ähnliches schwaches Signal (Einzel-Kopie-Transformanten), ein sehr kleiner Anteil jedoch ergab viel stärkere Signale. Diese Mehrfach-Kopien-Transformanten wurden weiter getestet. Die Positiv-Kontrolle in dem gezeigten Filter ist eine zuvor als Mehrfach-Kopie identifizierte Transformante.

Die Kopienanzahl des P.69-Strukturgens wurde durch quantitative Dot-Blot-Analyse der DNA (Tabelle 1) bestimmt. SL3, SL4 (Mut&spplus;), SL18 und SL22 ergaben signifikant höhere Spiegel von Produkt als Einzel-Kopie-Integranten, und zwar bis zu 5% des Zellproteins (Tabelle 1). Der Großteil (90%) des von SL4 und SL22 hergestellten Pertactins war unlöslich. SL22 wurde bei der NCIMB, Aberdeen, Schottland, unter der Zugangsnummer 40391 am 22. März 1991 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt.

Beispiel 4: Proteinanalyse

Selektierte Transformanten wurden in YNBBGCas 2 Tage lang bei 30ºC kultiviert, um die stationäre Phase zu erreichen. Diese Starter-Kulturen wurden zu einer OD&sub6;&sub0;&sub0; von 0,25 in 5 ml frischem YNBBGCas verdünnt und 6 Stunden lang herangezüchtet. Um diese Kulturen zu induzieren, wurden die Zellen durch Zentrifugation abgesammelt, einmal in sterilem Wasser gewaschen und in YNBBMCas resuspendiert. Die Induktionen wurden 2 Tage lang bei 30ºC durchgeführt.

Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit geerntet, einmal in Wasser gewaschen und in 0,5 ml eiskaltem Aufbrechpuffer (20 mM Natriumphosphat, pH 7,0, 0,1% Triton X-100, 4 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) suspendiert. Mit Säure gewaschene Glasperlen (0,45 mm) wurden zugegeben und die Zellen wurden durch heftiges Vortexen aufgebrochen. Die Proteinkonzentration der Extrakte wurde unter Verwendung des BioRad- Proteinassays (BioRad, gemäß den Anweisungen des Herstellers) bestimmt und das Material wurde bei -20ºC aufbewahrt.

Proteine wurden durch Elektrophorese in 7,5%igen SDS-Polyacrylamidgelen (Laemmli U. K., Nature 227: 680-785, 1970) getrennt. Die Proteine wurden in dem Gel durch Färben mit Coomassie Brilliant Blue R sichtbar gemacht. Alternativ dazu wurden die Proteine auf einen Nitrozellulosefilter überführt und mit dem P.69-speziflschen monoklonalen Antikörper BB05 (Montaraz et al., 1985, Infect. Immunity 47 744-751; hinterlegt beim PHLS, "Public Health Laboratory Service Centre for Applied Microbiology and Research", Porton Down, Salisbury, Wiltshire, U. K., in der Europäischen Sammlung von Tier-Zellkulturen unter der Zugangsnummer 90020103 am 1. Februar 1990 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags), dann mit Ziegen-Anti-Maus-IgG, konjugiert an Meerrettichperoxidase, reagieren gelassen und mit H&sub2;O&sub2; und 4-Chlornaphthol (BioRad) entwickelt. Auf diesem Wege konnte das exprimierte P.69 spezifisch nachgewiesen werden.

Die Fig. 4 zeigt einen Western-Blot von induzierten Extrakten von vier selektierten Mehrfach- Kopien-Transformanten (SL 3, 4, 18 und 22) und eine typische Einzel-Kopien-Transformante. Durch Vergleichen mit Standard-Konzentrationen von reinem P.69 kann abgeschätzt werden, daß Einzel-Kopien-Transplazierungen P.69 bei 0,1-0,5% der Gesamtzellproteine (bzw. "total cell proteins", t. c. p.) exprimieren, SL22 bei ungefähr 2% und SL4 bei etwa 5 %. Diese Höhen gelten für Schüttelkolben-Induktionsbedingungen.

Beispiel 5: Eipression von P.69 während Fermentation bei hoher Zelldichte

Bei optimalen Fermenterinduktionen kann eine Verbesserung in der Proteinausbeute beobachtet werden. So ist SL22 in einem gesteuerten Fermenter induziert worden (Beispiel 5) und exprimiert P.69 bei etwa 10% t. c. p. SL4, von dem anschließend bestimmt wurde, Mut&spplus; zu sein, zeigte keine Veränderung der Expressionsspiegel im Fermenter. In geringexprimierenden Transformanten ist das P.69 großteils löslich (etwa 55%), wohingegen es bei hohen Expressionsspiegeln hauptsächlich (etwa 90%) unlöslich ist. Dies ist zu bevorzugen, da das Material ohne weiteres aus der unlöslichen Fraktion isoliert, renaturiert und gereinigt werden kann.

Die Herstellung von P.69 durch Pichia pastoris-Kulturen hoher Zelldichte wurde unter Verwendung von SL22 in einem 2 l großen Braun-Fermenter durchgeführt, der mit Überwachungs- und Reguliereinrichtungen für den pH, gelöstes 02, Rührgeschwindigkeit, Temperatur und Luftfluß ausgestattet war. Eine 10 ml große YNBBG-Übernachtkultur wurde verwendet, um den Fermenter zu inokulieren, der 1 Liter 5 · Basalsalze (Phosphorsäure, 42 ml/l; Calciumsulfat 2 H&sub2;O, 1,8 g/l; Kaliumsulfat 28,6 g/l; Magnesiumsulfat 7 H&sub2;O, 23,4 g/l; Kaliumhydroxid, 6,5 g/l) mit 4 ml PTM&sub1;-Salzen (Kupfer(II)-sulfat 5 H&sub2;O, 6 g/l; Kaliumiodid, 0,08 g/l; Mangansulfat H&sub2;O, 3 g/l; Natriummolybdat, 0,2 g/l; Eisen(II)-sulfat 7 H&sub2;O, 65 g/l; Biotin, 0,2 g/l; Schwefelsäure, 5 ml/l) und 5% (v/v) Glycerin bei 30ºC enthielt. Der gelöste Sauerstoff wurde durch Einstellen der Belüftung und der Bewegung über 20% gehalten, und der pH-Wert wurde durch die Zugabe von 50% (v/v) Ammoniumhydroxid bei pH 5,0 gehalten. Das Wachstum wurde fortgesetzt, bis das Glycerin aufgebraucht war (24-30 h). Eine limitierte Glycerinzufuhr (enthaltend 50% w/v Glycerin und 12 ml/l PTM&sub1;-Salze) wurde dann bei 12 ml/h 17-21 h lang begonnen. Nach dieser Zeitdauer wurde die Kultur durch Ersetzen der Glycerinzufuhr durch eine Methanolzufuhr (100% Methanol plus 12 ml/l PTM1- Salze) bei 1 ml/h während 2 h induziert. Dann wurde die Methanolzufuhr-Geschwindigkeit schrittweise über eine Dauer von 6 h auf 6 ml/h erhöht und die Fermentation wurde unter Anwenden dieser Bedingungen weitere 40 Stunden lang fortgeführt. An diesem Punkt wurde die Methanolzufuhr-Geschwindigkeit auf 2 ml/h vermindert.

Proben wurden aus dem Fermenter zu verschiedenen Zeiten nach der Induktion entnommen und hinsichtlich der P.69-Expression wie im Beispiel 4 beschrieben analysiert. Die Ergebnisse einer Western-Blot-Analyse sind in der Fig. 5 gezeigt, wobei gezeigt wird, daß P.69-Spiegel von etwa 10% des Zellproteins erzielt wurden.

Beispiel 6: Renaturierung und Reinigung von P.69

Induzierte SL4-Zellen wurden geerntet, in Puffer A (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M NaCl) + 1% Triton X-100 suspendiert, und mit Glasperlen unter Verwendung eines "Bead Beater" (Biospec Products, Bartesville, OK) lysiert. Unlösliches Protein wurde durch Zentrifugation pelletiert, gewaschen und in 6 M Guanidiniumthiocyanat/Puffer A suspendiert. Bei Dialyse blieb Pertactin löslich, während Hefeproteine durch Zentrifugation entfernt werden konnten. Solubilisiertes Pertactin wurde auf eine chelatierende Sepharose-Säule geladen, die mit Zink befüllt und Puffer A äquilibriert worden war. Nach Waschen mit 0,5 M NaCl wurde Pertactin in 50 mM MES, pH 6,0, 0,1 M NaCl eluiert. Pertactin wurde fernerhin durch Chromatographie auf Q-Sepharose in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, bei Elution unter Verwendung eines Gradienten von 0 bis 0,4 M NaCl gereinigt. Die Gesamtausbeute von Pertactin belief sich auf 40%.

Beispiel 7: Impfschutz-Daten

Rekombinantes aus Pichia abgeleitetes P.69 wurde hinsichtlich seiner Fähigkeit, Impfschutz durch Toxoid zu stimulieren, im Kendrick-Test getestet, der der internationale Standard- Wirksamkeitsassay für Ganzzell-Keuchhustenimpfstoffe ist.

Von Impfstoffen, enthaltend 5 ug (TEST A) oder 20 ug (TEST B) Toxoid, 20 ug P.69 und 10% Alhydrogel/PBS, wurden Verdünnungsreihen in PBS angefertigt, und 0,5 ml große Dosen wurden intraperitoneal an männliche und weibliche NIH/S-Mäuse verabreicht. Kontroll- Mäuse erhielten Ganzzell-Impfstoff (Britische Ref. 66/84; Spitzendosis 8 IU/ml). Nach 14 Tagen wurden die Mäuse intrazerebral mit 20 ul B. pertussis 18-323 (etwa 50 LD50) herausgefordert.

Die Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse von zwei Experimenten, welche Toxoid mit oder ohne zugegebenem P.69 vergleichen. Toxoid allein war deutlich weniger schützend als der Ganzzell- Referenzimpfstoff und konnte durch Erhöhen der Dosis von S ug auf 20 ug nicht verbessert werden. Das Hinzufügen von nativem oder aus Hefe abgeleitetem Pertactin steigerte den Impfschutz auf die Höhe des Ganzzell-Impfstoffes. Zum Vergleich wurde auch aus E. coli hergestelltes P.69 (A. J. Makoff et al., Bio/Technology 8 1030 (1990)) in den Test eingeschlossen und ergab ähnliche Ergebnisse. Die Ergebnisse mit reinem rekombinanten P.69 aus zwei unterschiedlichen Quellen zeigen, daß der immunogene Effekt eher auf P.69 selbst denn auf kontaminierenden B. pertussis-Antigenen beruhte.

Tabelle 1. Expression von P.69-Pertactin in rekombinantem Pichia.

a Die integrierten Vektorkopienanzahlen wurden durch Dot-Blot-Analyse von gereingter DNA genau bestimmt, die mit radioaktiv markierter P.69-Struktur-DNA oder DNA aus Einzel- Kopie-P. pastoris-ARG4 (zur Verfügung gestellt von K. Shreekrishna, Phillips Petroleum Co.) sondiert wurde. Eine aus einer Southern-Analyse als Einzel-Kopie bekannte Transformante wurde als eine Kontrolle verwendet. Die hybridisierte Sonde wurde durch Szintillationszählung gemessen.

b Schüttelkolben-Induktionen.

C Spitzenhöhen bei Fermenter-Induktionen.

Tabelle 2

a 18 Tiere pro Gruppe

b 17 Tiere in dieser Gruppe


Anspruch[de]

(für die Vertragsstaaten: AT, BE, CH, DE, DK, FR, GB, GR, IT, LI, LU, NL und SE)

1. Pichia-Mikroorganismus, der mit mehreren Kopien einer DNA transformiert ist, die ein Pertactin-Antigen oder ein antigenes Fragment davon codiert, wobei die mehreren Kopien in die chromosomale Pichia-DNA integriert sind.

2. Pichia-Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, wobei die DNA ein Pertactin-Antigen, dessen Aminosäuresequenz zu mindestens 98% mit der in der Fig. 1A, 1B oder 1C dargestellten homolog ist, oder ein antigenes Fragment davon codiert.

3. Pichia-Mikroorganismus gemäß Anspruch 2, wobei die DNA ein Pertactin-Antigen, dessen Aminosäuresequenz im wesentlichen die gleiche ist, wie jene, welche in der Fig. 1A, 1B oder 1C dargestellt ist, oder ein antigenes Fragment davon codiert.

4. Pichia-Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, wobei die DNA das P69-Antigen von Bordetella pertussis codiert.

5. Pichia-Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, wobei die DNA das P68-Antigen von Bordetella bronchiseptica codiert.

6. Pichia-Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, wobei die DNA das P70-Antigen von Bordetella parapertussis codiert.

7. Pichia-Mikroorganismus gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das antigene Fragment im wesentlichen besteht aus folgender Aminosäuresequenz:

PGPQPP oder

APQPGPQPPQPPQPQPEAPAPQP.

8. Pichia-Mikroorganismus gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zwischen 5 und 30 Kopien der DNA in die chromosomale Pichia-DNA integriert sind. 9. Pichia-Mikroorganismus gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, welcher Pichia pastoris ist.

10. Verfahren zur Herstellung eines Pertactin-Antigens oder eines antigenen Fragments davon, wobei das Verfahren das Kultivieren eines transformierten Pichia-Mikroorganismus, wie er in mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche definiert ist, umfaßt.







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