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Dokumentenidentifikation DE69229181T2 21.10.1999
EP-Veröffentlichungsnummer 0623139
Titel IDENTIFIZIERUNGSONDEN ZUR GESCHLECHTSBESTIMMUNG BEI VÖGELN
Anmelder The Perkin-Elmer Corp., Norwalk, Conn., US
Erfinder HALVERSON, Joy, Lynn, Davis, CA 95616, US;
DVORAK, Jan, Davis, CA 95616, US
Vertreter LEINWEBER & ZIMMERMANN, 80331 München
DE-Aktenzeichen 69229181
Vertragsstaaten DE, FR, GB
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 25.09.1992
EP-Aktenzeichen 929211621
WO-Anmeldetag 25.09.1992
PCT-Aktenzeichen US9208284
WO-Veröffentlichungsnummer 9407907
WO-Veröffentlichungsdatum 14.04.1994
EP-Offenlegungsdatum 09.11.1994
EP date of grant 12.05.1999
Veröffentlichungstag im Patentblatt 21.10.1999
IPC-Hauptklasse C07H 21/04
IPC-Nebenklasse C12N 15/63   C12Q 1/68   G01N 27/26   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet von Restriktionsfragment-Längenpolymorphie-Markern, die sich zur Geschlechtsidentifikation von Vogelarten eignen, und Verfahren zur Verwendung solcher Marker.

Hintergrund der Erfindung

Die RFLP-(Restriktionsfragment-Längenpolymorphie-)Analyse erwies sich bei der Kartierung und Entdeckung neuer Gene in eukaryotischen Organismen als sehr erfolgreich. RFLP-Markersonden bestehen aus Polynukleotidsequenzen, die spezifisch an einen Bereich des Chromosoms hybridisieren. Diese chromosomalen Hybridisierungsbereiche erweisen sich zwischen Individuen der gleichen Art als polymorph, wenn die chromosomale DNA durch Restriktions-Endonukleasen gespalten und durch Hybridisierungsanalyse analysiert wird. Unterschiedliche RFLP-Allele werden voneinander auf der Grundlage der Hybridisierungsbandenmuster unterschieden, die nach der Größentrennung auftreten. Genetische Verbindungsanalysen zwischen RFLP-Markern und uncharakterisierten Genen stellten sich als nützliches Verfahren zum Isolieren und Kartieren uncharakterisierter Gene von Interesse heraus. Obwohl der RFLP-Marker am meisten zum Identifizieren von für genetische Krankheiten verantwortlichen chromosomalen Störungen verwendet wurde, ist es auch von Interesse, RFLP-Marker zur Lösung anderer komplexer Fragen betreffend die genetische Regulation einzusetzen, wie z. B. bei der geschlechtlichen Entwicklung von Tieren.

Während die Genetik und Biochemie der Geschlechtsbestimmung von Säugetieren Gegenstand umfangreicher wissenschaftlicher Untersuchungen ist, wurden ähnliche Studien bislang nicht mit Vögeln durchgeführt. Dies ist angesichts der wirtschaftlichen Bedeutung zahlreicher Vogelarten, wie z. B. Hühner und Truthähne, überraschend. Es ist von Interesse, Forschungsverfahren zu entwickeln, mit denen man den komplexen Prozeß der genetischen Geschlechtsbestimmung von Vögeln entschlüsseln kann. Ge schlechtsspezifische genetischer Marker sind von besonderem Interesse. Solche Marker können dazu dienen, unreife Vögel vor der Entwicklung geschlechtsspezifischer morphologischer Unterschiede geschlechtlich zu identifizieren. Die frühe geschlechtliche Identifikation ist ein wichtiger Faktor beim Züchten jener Vögel, die vor der Entwicklung äußerer Geschlechtsmerkmale geschlechtsreif werden. Dementsprechend besteht ein Interesse daran, Verfahren zur Verhinderung unerwünschter Paarungen bereitzustellen, indem Geschlechtsidentifikation (und -trennung) vor der Erlangung der Geschlechtsreife ermöglicht wird.

Genetische geschlechtliche Identifikation eignet sich auch bei der Zucht seltener Vogelarten mit nicht identifizierten sekundären Geschlechtsmerkmalen; Zuchtprogramme für Vögel in Gefangenschaft können auf diese Weise effizient gestaltet werden.

Geschlechtschromosome unterscheiden sich voneinander im Gegensatz zu autosomalen Chromosomen hinsichtlich ihrer Größe und genetischen Zusammensetzung. Einige Bereiche eines Geschlechtschromosoms enthalten somit Gene, die kein entsprechendes Allel auf dem anderen Geschlechtschromosom besitzen.

Einer der Hauptunterschiede zwischen den Geschlechtschromosomen von Vögeln und jenen des Menschen und anderer Säugetiere liegt darin, daß der weibliche Vogel das "heterogametische" Geschlecht mit Z- und W-Geschlechtschromosomen ist. Bei Säugetieren ist das männliche Geschlecht das "heterogametische" Geschlecht mit X- und Y- Chromosomen, während das weibliche Geschlecht das "homogametische" Geschlecht mit zwei X-Chromosomen ist.

Es ist von Interesse, genetische RFLP-Marker bereitzustellen, die sich zur Identifizierung von DNA-Bereichen eignen und die das Geschlecht des Vogels diagnositizieren können, worin die DNA-Bereiche in Z- und W-Chromosomen vorkommen können, sodaß RFLPs, die für jedes Geschlechtschromosom typisch sind, detektierbar sind; oder es kommt der DNA-Bereich nur in einem der Geschlechtschromosome vor, sodaß das Aus maß oder Gegenwart der RFLP das Geschlecht des Vogels bestimmt. Solche genetischen Marker ermöglichen die Identifizierung des chromosomal spezifizierten Geschlechts eines einzelnen Vogels auf der Grundlage einer Analyse eines DNA-Präparats des Vogels.

Einschlägige Literatur

Halverson, J., Dvorak, J., Flammer, K. 1985. "A new method of avian sex determination - Identifikation of the W body by C-banding of erythrocytes". Proceedings of the Annual Meeting of the Association of Avian Veterinarians. 1985. Boulder, Colorado, USA.

Halverson, J., Rauen, K., 1998. "The molecular approach to poultry breeding". Proceedings of the Thirty-seventh Western Poultry Disease Conference and Molecular Biology Workshop. 1988. Davis, Kalifornien, USA.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es werden Vögel-Nukleotidsequenzen zur Verwendung als Quelle für Hybridisierungssonden bereitgestellt. Sonden aus diesen Sequenzen, Tsex (auch als pMg1 bezeichnet) und verwandten Sequenzen, werden in der Hybridisierung zur Geschlechtsidentifizierung zahlreicher Vögelarten verwendet. Verfahren zur Verwendung der Sonden werden bereitgestellt, um einzelne Vögel geschlechtlich zu identifizieren. Für eine bestimmte Vogelart können die Sonden sowohl an Z- als auch an W-Chromosome hybridisieren, wodurch Differenzierung zwischen den zwei Chromosomen auf der Grundlage von Restriktionsfragment-Länenpolymorphien ermöglicht wird. Alternativ dazu können die Sonden nur an eines der zwei Geschlechtschromosome in einigen Spezies hybridisieren, wodurch Geschlechtidentifizierung auf der Grundlage geschlechtsspezifischer Hybridisierungsintensität ermöglicht wird. Die Sonden bieten ein Mittel zur Identifizierung des Geschlechts eines Vogels ohne Zugrundelegung morphologischer Charakteristika, die Sonden eignen sich auch zur Gewinnung und Identifizierung von Nukleotidsequen zen, die zu Tsex- und geschlechtsspezifischen Nukleotidsequenzen homolog sind, die genetisch mit genomischen Tsex- oder Tsex-homologen Sequenzen verbunden sind.

BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Es werden neuartige Nukleinsäuresequenzen und Verfahren zur Verwendung der Sequenzen bereitgestellt, um das chromosomal festgelegte Geschlecht einzelner Vögel zu bestimmen. Das Verfahren basiert auf der Fähigkeit von Hybridisierungssonden aus den Nukleinsäuresequenzen, mit Sequenzen der Geschlechtschromosomen von Vögeln zu hybridisieren, die zwecks Geschlechtsidentifizierung analysiert werden. Die bereitgestellten Nukleinsäuresequenzen, d. h. Tsex, Derivate davon und äquivalente Sequenzen, sind zu Nukleinsäuresequenzen homolog, die auf beiden oder einem der Z- und W- Chromosome der meisten untersuchten Vögel vorhanden sind. Es gibt jedoch Vogelarten, in denen Tsex-homologe Sequenzen nur auf einem der zwei Geschlechtschromosome vorhanden sind. Betreffend Vögel-DNA umfaßt der Ausdruck "homolog" in Zusammenhang mit Nukleinsäuresequenzen jene Nukleinsäuresequenzen, die zu gegenseitiger Hybridisierung bei rauhen Bedingungen von zumindest etwa 25ºC unterhalb der Tm fähig sind (Tm ist die Temperatur, bei der etwa die Hälfte der Nukleinsäurestränge denaturiert ist). Vom Ausdruck "Tsex-homologe Sequenzen" ist die Tsex-Sequenz selbst umfaßt. Ganz allgemein verwendet können Hybridisierungs-Arbeitvorschriften mit aus Tsex stammenden Sonden verwendet werden. Siehe "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Ausgabe (1989), Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, N. Y., USA, wo Beispiele für solche Arbeitsvorschriften angeführt sind.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Identifizierung des chromosomal spezifizierten Geschlechts eines bestimmten Vogels auf der Grundlage einer Hybridisierungsanalyse genomischer DNA, die aus dem der Geschlechtsuntersuchung zu unterziehenden Vogel extrahiert wurde. Geeignete Vögel für Chromosomen-Identifizierung durch Tsex- Hybridisierung besitzen Tsex-homologe Sequenzen, die auf einem oder beiden Geschlechtschromosom(en) vorhanden sind.

Die Erfindung bietet ein Mittel zur Identifizierung des Geschlechts von Vogelarten ohne Zugrundelegung morphologischer Geschlechtseigenschaften. Somit kann die Erfindung dazu verwendet werden, das Geschlecht von Vögeln zu identifizieren, wenn sekundäre (oder äußere) Geschlechtsmerkmale fehlen oder unbekannt sind. Die Identifizierung des Geschlechts beim Fehlen sekundärer Geschlechtsmerkmale ist vorteilhaft, da es beim kommerziellen Züchten günstig ist, geschlechtsreife Vögel voneinander zu trennen, um unerwünschte Paarungen zu verhindern. Diese Trennung kann schwierig zu erzielen sein, da einige Vogelarten vor der Entwicklung offenkundiger äußerer Geschlechtsmerkmale geschlechtsreif werden. Durch Vorsehen eines einfachen und zuverlässigen Mittels der Geschlechtsidentifizierung vor der Entwicklung äußerer Geschlechtsmerkmale bei Vögeln kann die vorliegende Erfindung somit in der kommerziellen Vogenzucht eingesetzt werden. Mit Hilfe der Erfindung kann man das Geschlecht seltener Vogelarten bestimmen, deren geschlechtsspezifische äußere Merkmale unbekannt sind. Durch Ermöglichen von Zuchtpaaren bietet die Erfindung eine geeignete Möglichkeit zur Züchtung seltener Vögel.

Hybridisierungssonden aus Tsex finden neben ihrer Verwendung zur Geschlechtsidentifizierung zahlreiche andere Anwendungen. Aus Tsex stammende Hybridisierungssonden können dazu dienen, Tsex-homologe Sequenzen zu isolieren. Eine derartige Isolierung kann durch Screenen von DNA-Rekombinations-Sammlungen aus Vogel-DNA (oder cDNA) anderer Arten als vom Truthahn erzielt werden (die Tsex-Sequenz ist aus einer Truthahn-cDNA abgeleitet). Darüber hinaus können diese Tsex-Sonden dazu verwendet werden, cDNAs voller Länge für Tsex- und die Tsex-Genomsequenzen zu isolieren. Aus Tsex abgeleitete Hybridisierungssonden können auch für Chromosomen-"Walking and jumping"-Verfahren eingesetzt werden, um kodierende und nichtkodierende Sequenzen zu isolieren, die chromosomal proximal - jedoch nicht unbedingt direkt benachbart - zu Tsex-homologe Sequenzen liegen. Aus Tsex-Sequenz stammende Sonden können in Chromosomen-Walking and jumping-Verfahren eingesetzt werden, wie dies in einigen öffentlich zugänglichen Publikationen beschrieben ist, z. B. Sambrook et al., s. o.

Zusätzliche Verwendungszwecke der Erfindung sind die Isolierung von Geschlechtsbestimmungs-Mutationen bei Vogelarten. Geschlechtsbestimmung betreffende Mutationen werden beim Manipulieren des Nachkommenschafts-Phenotyps beim kontrollierten Züchten zahlreicher Tiere eingesetzt (z. B. verknüpfte X-Chromosomen, autosomale Geschlechtschromosom-Translokationen). Die Erfindung erleichtert die Entdeckung von Geschlechtsbestimmungs-Mutanten, indem Forscher den geschlechtsmäßig spezifizierten Genotyp von Vogelmutanten mit fragwürdiger Geschlechtsmorphologie analysieren können.

Die Tsex-Sequenz wurde aus einer cDNA-Bibliothek aus einer Truthahn-Embryonen- Poly(A)-mRNA erhalten. Die Tsex-Sequenz weist eine Länge von 959 Basen paaren auf. Die Sequenz von Tsex ist in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

1 5'AACAGCATCT GATGCTGCAC CCCTTCAGTA TCTGGCTCCC TACTCAGGCT 51 GCTCCATGGG GGAATACTTC AGAGACAATG GGAAACATGC ATTGATCATC 101 TACGATGACT TGTCCAAACA GGCTGTTGCC TACCGTCAGA TGTCTCTGCT 151 GCTGCGTCGT CCGCCTGGCC GTGAAGCTTA CCCAGGTGAT GTGTTCTACC 201 TGCACTCTCG CCTGCTGGAG AGAGCAGCTA AAATGAATGA TTCCTTTGGA 251 GGAGGCTCTC TGACTGCTTT GCCCGTCATT GAAACTGAGG CTGGTGATGT 301 GTCTGCTTAC ATTCCAACCA ATGTCATCTC CATCACTGAT GGACAGATCT 351 TCTTGGAAAC TGAACTGTTC TACAAAGGTA TCCGTCCAGC CATCAACGTT 401 GGTCTGTCTG TGTCCCGTGT GGGTTCTGCT GCTCAGACCA GGGCAATGAA 451 ACAGGTGGCT GGTACCATGA AGCTGGAGCT GGCTCAGTAC CGTGAAGTGG 501 CTGCCTTTGC TCAGTTTGGG TCTGATTTGG ATGCTGCCAC ACAACAGCTG 551 CTGAATCGTG GTGTGCGTCT GACAGAGCTC CTGARACAAG GACAGTATGT 601 TCCCATGGCT ATTGAGGAAC AGGTTGCAGT CATCTATCGT GGTGTAAGAG 651 GTCACTTGGA CAAGCTGGAG CCCAGCAAAA TCACTAAATT TGAGAGTGCT 701 TTCCTGGCTC ATGTACTGAG CCAGGACCAG GCCCTCCCTC TCCACCATCA 751 GGACTGAAGG GAAGATCTCT GACCAGACGG AAGCTAAGCT GAAGGAAATA 801 GTCACAAATT TCCTATCTAC TTTTGAGGCA TAAACTCATT ATCTGTTCAA 851 ACAGACCAGG CTGTTTTTGT TGTTACGTGC TTTGCCTCCA TCAAAGACCT 901 AAACGTATCG AGTGCTTGAA TGTACAGATC TCACTGAGAA TAAAAGTTTC CATGTAAAA3'

Sequenz von Position 1 bis zum Ende (Position 959)

Die Tsex-Sequenz kann zur Herstellung einer Vielzahl an Nukleinsäure-Hybridisierungssonden verwendet werden, die auch als Tsex-Sonden bezeichnet werden.

Hybridisierungssonden auf der Grundlage der Tsex-Sequenz können vielen Verwendungszwecken zugeführt werden, z. B. zur Geschlechtsidentifizierung von Vögeln und Isolierung Tsex-homologer Sequenzen aus einer genetischen Sammlung. Sonden können entweder einstrangige oder doppelstrangige RNA oder DNA sein. Sonden können durch in vitro- oder in vivo-Synthese produziert werden. Sonden können auch durch eine Kombination von in vitro- und in vivo-Synthese produziert werden. Verfahren der in vitro-Sondensynthese umfassen organisch-chemische Syntheseverfahren oder enzymatisch vermittelte Synthese, z. B. mittels SP6-RNA-Polymerase und eines Plasmids, das die Tsex-Sequenz unter der Transkriptionskontrolle eines 5%-spezifischen Promotors enthält. Üblicherweise besitzen Sonden eine spezifische Komplementärsequenz von zumindest 12 Nukleotiden, noch üblicher zumindest 14 Nukleotiden und vorzugsweise mehr als 50 Nukleotiden, noch bevorzugter die gesamte Tsex-Sequenz.

Sonden können entweder vollständige oder teilweise Homologie zu Tsex aufweisen. Sonden mit Teilhomologie zu Tsex besitzen üblicherweise weniger als 20% Fehlübereinstimmung mit Tsex, vorzugsweise weniger als 10% Fehlübereinstimmung mit Tsex.

Bei der Durchführung von Geschlechtsbestimmungs-Analyse unter Verwendung von aus Tsex-Sequenz stammenden Sonden, welche die vollständige 959 bp-Tsex-Sequenz nicht enthalten, werden die Sonden vorzugsweise gegen DNA-Präparate aus Vögeln bekannten Geschlechts hybridisiert, um zu verifizieren, daß die Sonden das gewünschte geschlechtsspezifische Hybridisierungsmuster produzieren. Bei der Geschlechtsbestimmung zuvor nicht untersuchter Vogelarten mit aus Tsex-Sequenz stammenden Sonden wird die geschlechtsspezifische Art der mit Tsex-Sequenz-Sonden produzierten Hybridisierungsmuster vorzugsweise durch Hybridisierung gegen Vögel mit bekanntem Geschlecht verifiziert.

Sonden können durch Bindung an eine Vielzahl an Markierungen modifiziert werden, die für Detektion von Duplexbildung zwischen der Sonde und ihrem komplementären Ziel sorgen. Zu Markierungen zählen radioaktive Isotope, Liganden wie etwa Biotin, Enzyme, Fluoreszenzmittel und dergleichen. Eine Vielzahl von Arbeitsvorschriften zur Markierung von Sonden und Detektieren von Duplices zwischen Sonden und ihren Ziel-Hybridisierungssequenzen wurde in der Literatur beschrieben. Siehe z. B. Berger und Kimmel (Hrsg.), "Guide to Molecular Cloning Techniques" (1987), Academic Press Inc., San Diego, CA, USA.

Sondensequenzen können mit einer Vielzahl anderer Nukleinsäuresequenzen verknüpft sein. Zu diesen anderen Nukleinsäuresequenzen zählen Vektoren, wie z. B. Plasmide, Cosmide, Phagen und dergleichen. Durch Verbinden der Sondensequenz mit einer Vektorsequenz können Sonden problemlos hergestellt, erweitert, gelagert und modifiziert werden.

Nukleinsäurepräparate, die sich zur Hybridisierungsanalyse mit Tsex-Sonden eignen, können aus jedem Abschnitt eines Vogelkörpers isoliert werden, der im wesentlichen intakte Nukleinsäuren enthält. Vorzugsweise können Nukleinsäurepräparat-Quellen ohne Töten oder Verletzen des Vogels erhalten und leicht aus dem Versuchsvogel entfernt werden. Bevorzugte Quellen von Ausgangsmaterial sind Federbrei, Blut oder dergleichen.

Aus Tsex stammende Hybridisierungssonden können zur Bestimmung des Geschlechts eines einzelnen Vogels auf der Grundlage vn Nukleinsäure-Hybridisierungsanalyse verwendet werden. Wie zuvor besprochen, zeigt die Hybridisierungsanalyse, daß Tsex-homologe Sequenzen auf zumindest einem und üblicherweise beiden Geschlechtschromosomen zahlreicher Vogelspezies vorhanden sind. Für jene Spezies, bei denen Tsex- homologe Sequenzen auf sowohl Z- als auch W-Geschlechtschromosomen vorhanden sind (nachstehend als Tsex-Doppelspezies bezeichnet), können Tsex-Sequenz-Hybridi sierungssonden dazu dienen, männliche von weiblichen DNA-Präparaten auf der Grundlage der Gegenwart zumindest einer zusätzlichen Hybridisierungsbande zu unterscheiden, die in den weiblichen chromosomalen Präparaten vorhanden ist. Für Vogelarten mit Tsex-homologen Sequenzen, die nur auf einem Geschlechtschromosom vorhanden sind (nachstehend als Tsex-Einzelspezies bezeichnet), kann das genetisch spezifizierte Geschlecht des Vogels, aus dem die DNA stammte, durch Verwendung einer Tsex-spezifischen Sonde und halbquantitatives Vergleichen des Hybridisierungsgrads der Sonde an eine Probe mit dem Hybridisierungsgrad der gleichen Sonde an einen Standard mit bekanntem Geschlecht bestimmt werden.

Tsex-Doppelspezies sind u. a.: Truthähne, Hühner, Kanadagänse, Fasane, Zebrafinken, Kiebitze, Flughühner, Lummen, Pionites-Papageien (einschließlich von Rostkappenpapagei und Grünzügelpapagei), Aras (einschließlich von Arargung, Arakanga, Hyazinthara, Halsbandara, Zwergara, Grünflügelara, Soldatenara), Rotbauch-Mohrenköpfe, Amazonen (einschließlich von Grünwangenamazone, Venezuelaamazone, Rotstirnamazone, Mitraamazone, Kirschkopfamazone, Gelbscheitelamazone, Rotbugamazone), Kakadus (einschließlich von Rosakakadu, Goffinkakadu, Weißhaubenkakadu, Molukkenkakadu, Gelbhaubenkakadu), Loris, Nymphensittiche, Wellensittiche, Rosellasittiche.

Tsex-Einzelvogelspezies sind u. a.: Graupapageien, Edelpapageien, Unzertrennliche und Neotropische Sittiche (Elfenbeinsittich, Felsensittich, Nandaysittich).

Einige Vogelarten eignen sich nicht zur Geschlechtsidentifizierung mit aus Tsex abgeleiteten Sonden mit den verwendeten Restriktions-Endonukleasen, sind aber möglicherweise zur Identifizierung mit einer geeigneten Endonuklease fähig. Aus Tsex abgeleitete Sonden hybridisieren an Sequenzen auf den W- und Z-Chromosomen in diesen Spezies; die produzierten Hybridisierungsmuster variieren aber nicht zwischen den Geschlechtern. Die einzigen untersuchten Arten, die derzeit für Geschlechtsidentifizierung mit aus Tsex stammenden Sonden nicht in Frage kommen, sind Weißkopf-Seeadler, Rotschwanz-Bussarde, Sträuße, Pinguine, Mönchsgeier, Sperbergeier.

Das bevorzugte Verfahren zur Geschlechtsidentifizierung durch Hybridisierungsanalyse mit Tsex-Nukleinsäure-Hybridisierungssonden erfordert die Immobilisierung von Ziel- Hybridisierungssequenzen auf einen festen Träger. Die Vogel-Geschlechtsbestimmung unter Anwendung des Verfahrens der Nukleinsäure-Hybridisierung mit Tsex-spezifischen Sonden kann teste Immobilisierungsträger verwenden, die sich zur Hybridisierungsanalyse mit den meisten allgemein anerkannten Nukleinsäure-Hybridisierungsverfahren eignen. Geeignete Trägermembranen, die zur Bindung von Nukleinsäuren fähig sind, sind Nitrocellulose, Nytran, Zetaprobe und dergleichen. Eine Vielzahl von Arbeitsvorschriften zur Immobilisierung von Nukleinsäuren an Membranen wurde in der Literatur beschrieben. Siehe beispielsweise obige Publikation von Berger und Kimmel.

Das Immobilisierungsverfahren kann durch Kapillartransfer, elektrophoretischen Transfer, Vakuumtransfer und dergleichen vermittelt werden. Die Menge an auf die feste Trägermembran übertragener Nukleinsäure liegt im allgemeinen im Bereich von 0,01 bis 20 ug, vorzugsweise im Bereich von etwa 0,05 bis 5 ug, pro Analysenprobe.

Chromosomale DNA-Präparate, die sich zur Hybridisierung mit aus Tsex abgeleiteten Sonden eignen, können vor der Übertragung der Nukleinsäuren auf einen Immobilisierungsträger und üblicherweise nach Größentrennung, wo das Geschlecht auf der Grundlage der Größendifferenz eines oder mehrerer Fragmente bestimmt wird, mit Restriktions-Endonukleasen gespalten werden. Vor der Immobilisierung müssen chromosomale DNA-Präparate aus Tsex-Doppelspezies mit zumindest einer Restriktions- Endonuklease gespalten werden, während chromosomale DNA aus Tsex-Einzelspezies vorzugsweise - obwohl dies nicht entscheidend ist - mit zumindest einer Restriktions-Endonuklease gespalten werden. Geeignete Restriktions-Endonukleasen werden hinsichtlich ihrer Fähigkeit ausgewählt, ein geschlechtsspezifisches Hybridisierungsmuster zu produzieren, wenn sie an aus Tsex stammende Sonden hybridisiert werden. Wenn Restriktionsstellen in der Tsex- oder homologen DNA vorhanden sind, können einige Fragmente erzeugt werden, die sich an die Sonde binden. Spaltung mit geeigneten Re striktions-Endonukleasen erzeugt Chromosomen-Fragmente mit Größen, die durch Elektrophorese aufgetrennt werden können.

Wenn DNA-Präparate für die Geschlechtsbestimmungs-Analyse Spaltung mit Restriktions-Endonuklease unterzogen werden, werden die DNA-Präparate durch Elektrophorese größengetrennt und in situ vom Gelelektrophorese-Trennmedium auf einen Nukleinsäure-Bindeträger übertragen. Die elektrophoretische Trennung sollte bis zu einem Punkt fortschreiten, an dem der durch Elektrophorese erzielte Trenngrad der Fragmente aus der Chromosomen-Spaltung ausreicht, um Tsex-homologe Chromosomen-Fragmente in einem durch Hybridisierungsanalyse nachweisbaren Ausmaß voneinander zu trennen. Geeignete Gelelektrophorese-Trennmedien sind Agarose, Polyacrylamid, Gemische davon und dergleichen in einer Konzentration, die für die Trennung von Nukleinsäurefragmenten in einem Ausmaß zweckmäßig ist, das ausreicht, um Größenunterschiede zwischen Tsex-homologen DNA-Fragmenten zu zeigen. Die in situ-Ubertragung von Nukleinsäuren auf Bindemembran kann durch jedes herkömmliche Verfahren zur Hybridisierungsanalyse durchgeführt werden. Nichteinschränkende Beispiele für solche Verfahren sind Southern-Blotting und Elektroblotting.

Nach Immobilisierung auf einen festen Träger werden die Proben an Tsex-Hybridisierungssonden hybridisiert. Duplices, die sich zwischen der markierten Sonde und den Tsex-homologen Sequenzen in den zu analysierende Porben bilden, und allenfalls vorhandene Hybridisierungsstandards werden anschließend durch zur Sondenmarkierung geeignete Verfahren visualisiert.

Bei der Durchführung chromosomaler Geschlechtsanalyse auf Tsex-Doppelspezies sind gegebenenfalls, d. h. vorzugsweise, männliche und weibliche chromosomale DNA-Hybridisierungs-Geschlechtsstandards vorhanden. Unter Hybridisierungsstandards ist chromosomale DNA aus einem Individuum bekannten Geschlechts der gleichen Art wie das Individuum, das Gegenstand der geschlechtsbestimmenden Analyse ist, zu verstehen;

der Standard ist auch in einer Menge vorhanden, die im wesentlichen die gleiche ist wie die zur Analyse dienende DNA-Probe.

Männliche und weibliche DNA-Proben aus Tsex-Doppelspezies können durch die Gegenwart zumindest einer Hybridisierungsbande im chromosomalen Präparat eines Geschlechts, das in Präparaten des anderen Geschlechts nicht vorhanden ist, voneinander unterschieden werden. Da man häufig eine Vielzahl an Banden unterschiedlicher Größe erhält, die sich an die Sonde binden, ist alles, was zur Unterscheidung des Geschlechts des betreffenden Vogels erforderlich ist, eine Bande eines Größenmerkmals eines bestimmten Geschlechts, wobei das Fehlen der Bande für das andere Geschlecht charakteristisch ist. Außerdem besitzen die Hybridisierungsbanden, die männlichen und weiblichen chromosomalen DNA-Präparaten gemeinsam sind, aufgrund der doppelten Dosis von Ziel-DNA aus den zwei Z-Chromosomen größere (üblicherweise etwa doppelt so hohe) Hybridisierungsintensität bei Proben von Männchen. Durch Vergleichen von der Analyse dienenden DNA-Proben untereinander oder durch Vergleichen der Proben mit bekannten männlichen und weiblichen Standards der gleichen Art kann das Geschlecht des einzelnen Tiers bestimmt werden, das die DNA für die Analyse liefert.

Geschlechtsidentifizierung in Tsex-Einzelspezies wird im wesentlichen gleich wie in Tsex-Doppelspezies durchgeführt; die Schritte der Spaltung mit Restriktions-Endonuklease und der elektrophoretischen Trennung sind jedoch optional (werden aber vorzugsweise durchgeführt) und nicht - wie bei der Analyse von Tsex-Doppelspezies - obligatorisch. Bei der Analyse von Tsex-Einzelspezies sind alle DNA-Analysenproben und Hybridisierungsstandards notwendigerweise in etwa der gleichen Menge vorhanden, sodaß die Intensität der erzielten Hybridisierung unter den Proben und Hybridisierungsstandards genau verglichen werden kann.

In Tsex-Einzelspezies, wo Tsex-homologe Sequenzen nur auf dem Z-Chromosom vorhanden sind, zeigt Sondenhybridisierung mit chromosomalen Präparaten aus Männchen größere (etwa doppelt so hohe) Hybridisierungsintensität als Sondenhybridisierung mit gleichen Mengen von DNA aus weiblichen Vertretern der gleichen Spezies.

Aus Tsex stammende Sonden können auch zum Isolieren anderer geschlechtsspezifischer Sequenzen verwendet werden. Wie bereits besprochen, eignen sich Tsex-Sonden zur Geschlechtsidentifizierung, da Hybridisierung mit diesen Sonden geschlechtsspezifische Hybridisierungsmuster ergibt. Da die Tsex-Sonden, die an die W- und Z-Chromosome hybridisieren, die gleiche Sequenz besitzen, ist es offenkundig, daß die geschlechtsspezifische Art der Hybridisierung auf andere chromosomale Sequenzen als Tsex selbst zurückzuführen sein muß (oder Tsex-homologe Sequenzen in anderen Spezies als Truthan). Auf dem Chromosom liegen Tsex-homologe Sequenzen nahe an Nukleinsäuresequenzen, die sich in einer geschlechtsspezifischen Weise voneinander unterscheiden. Diese noch nicht identifizierten geschlechtsspezifischen Sequenzen können durch Anwendung herkömmlicher Sammlungs-Screeningverfahren detektiert werden, z. B. Chromosomen-Walking (Bender et al..). Mol. Biol. 168, 17 (1983)) und Chromosomen-Jumping (Poustka et al., Nature 325, 323 (1987)), um Sequenzen proximal zu Tsex-homologen Sequenzen zu erhalten, worin zumindest die erste Runde von Sammlungsscreening eine von der Tsex-Sequenz abgeleitete Sonde verwendet. Diese Sammlungs-Screeningverfahren werden ausführlich von Berger und Kimmer, s. o., und Sambrook et al., s. o., beschrieben.

Genetische Sammlungen zum Screenen von aus Tsex stammenden Sonden können in Plasmid-, Cosmid- oder YAC- (künstliche Hefechromosom-) Vektoren oder dergleichen erzeugt werden. Abschnitte von Nukleotidsequenzen, die in einer ersten Screeningrunde isoliert werden und nicht Tsex-homolog sind, können markiert und als Sonden für eine zweite Runde des Sammlungsscreening verwendet werden. Das Verfahren des wiederholten Screenings einer Sammlung mit neu isolierten Sequenzen kann wunschgemäß wiederholt werden, um entlang des Chromosoms zu "gehen" oder zu "springen" ("walk" oder "jump"). Die Bewegung entlang des Chromosoms vom Tsex-homologen Bereich aus kann in beide Richtungen erfolgen. Der Bereich des Chromosoms, der durch "Wal king"-Verfahren und dergleichen analysiert wird, kann sich über eine Entfernung von mehr als 5000 kb zu jeder Seite des Tsex-Bereichs (oder Tsex-homologen Bereichs) erstrecken, obwohl bevorzugte Walking-Entfernungen im Bereich von etwa 100 bis 1000 kb liegen. Chromosomale Bereiche von Interesse sind auch Introns innerhalb der Tsex- homologen Genom-Sequenz. Nukleotidsequenzen, die zu Tsex nicht homolog sind und während des Walkings isoliert werden, können hinsichtlich ihrer Fähigkeit gescreent werden, geschlechtsspezifische Hybridisierungsmuster zu erzeugen, wenn sie als Hybridisierungssonden verwendet werden. Es ist ferner von Interesse, chromosomales Walking zur Isolierung geschlechtsspezfiischer Nukleotidsequenzen bei jenen Vogelarten durchzuführen, die nicht-polymorphe Tsex-homologe Sequenzen sowohl auf den W- als auch Z-Chromosomen aufweisen, z. B. Pinguine.

Als Beispiel für die Verwendung von Tsex zum Isolieren zusätzlicher geschlechtsspezifischer Nukleotidsequenzen sei der Fall des Screenens einer genomischen Truthahn- Sammlung mit einer markierten Tsex-DNA-Sequenz als Sonde genannt. Plasmide aus einzelnen Klonen, die beim Screenen erhalten werden, können dann restriktionskartiert und Bereiche der gewonnenen Plasmide, die zu Tsex nicht homolog sind, isoliert werden. Die isolierten Bereiche können dann zur Verwendung als Sonden in einer zweiten Runde des Sammlungs-Screenens markiert werden. Aus Sammlungs-Screening gewonnene Sequenzen können auch zur Verwendung als geschlechtsspezifische Sonden untersucht werden, indem die neu isolierten Sequenzen markiert und die markierten Sequenzen gegen Southern-Blots hybridisiert werden, die restriktionsgespaltene genomische DNA von männlichen und weiblichen Vögeln (der gleichen Art) enthalten. Sequenzen, die geschlechtsspezifische Hybridisierungsmuster-Polymorphien zeigen, können in ähnlichen Geschlechtsidentifizierungs-Arbeitsvorschriften zur Anwendung kommen wie jene, die Tsex-Sonden verwenden.

Neben der Verwendung der Nukleinsäure als Identifikator des Geschlechts kann auch das Expressionsprodukt zur Identizierung des Geschlechts verwendet werden. Sofern die Expressionsprodukte der zwei Sequenzen hinsichtlich Epitopen unterschiedlich sind, können Antiseren oder monoklonale Antikörper erzeugt werden, die zwischen den zwei Allelen unterscheiden, wenn das Tsex oder ein verwandtes Gen auf beiden Chromosomen vorhanden ist. Wenn sich das Gen nur auf einem Chromosom befindet, zeigt die Menge oder Gegenwart des Proteins das Geschlecht des Vogels an. Verschiedene Immungssays können dazu dienen, die Proteine unter Verwendung von Radioisotopen, Enzymen, Chromophoren, Fluorophoren, Chemolumineszenzmitteln oder dergleichen als nachweisbare Markierungen zu detektieren.

Sets können mit Sonden und Standards zur Bestimmung des Geschlechts von Vögeln bereitgestellt werden. Durch Durchführung des Assays mit der Probe und Vorsehen genomischer DNA, die in gleicher Weise verarbeitet werden kann, können die Ergebnisse direkt verglichen werden. Das Set würde demnach eine oder mehrere Sonden, üblicherweise eine Sonde (im allgemeinen markiert), und genomische DNA für ein oder beide Geschlechter des Vogels von Interesse umfassen, um die Verarbeitung im Assay durchzuführen und Vergleiche mit der Probe-DNA anzustellen.

Nach dieser allgemeinen Beschreibung der Erfindung folgen nun Beispiele, welche die Erfindung lediglich veranschaulichen und sie - sofern nicht anders angeführt - nicht einschränken sollen.

BEISPIELE RNA-Isolierung

Eine cDNA-Sammlung wurde aus PolyA-mRNA hergestellt, die aus Truthahnembryos isoliert worden war. Alle RNA-Isolierungsverfahren und Manipulationen wurden in RNAse-freier Laborausrüstung durchgeführt. Um RNAse-Kontaminierung zu entfernen, wurden Glasgeräte über Nacht auf 180ºC bis 190ºC erhitzt und Kunststoffgeräte mit einer 0,2%-igen Diethylpyrocarbonat-(DEPC-)Lösung behandelt.

8,3 g 3, 4 und 5 Tage alter Truthahnembryos wurden gepoolt und in Lysepuffer eingelegt (7 ml Puffer/1 g Gewebe). Der Lysepuffer bestand aus:

4 M Guanidiniumisothiocyanat

0,2 M Tris pH 7,5

0,01 M EDTA

5% β-Mercaptoethanol (w/v)

Das Gewebe wurde 1 min lang bei der Einstellung "5" in einem PolytronTM-Homogenisator homogenisiert. Das Homogenisat wurde durch Mull und einen Myragewebefilter (eine Doppelschicht, in der das Homogenisat zunächst durch den Mull gelangt) durchgeseiht. Das Filtrat wurde dann 10 min lang bei 25ºC und 10.000 · g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und N-Laurylsarcosin bis zur Erreichung einer Endkonzentration von 0,5% zugesetzt. 7 Volumina 4 M LiCl wurden dann zugegeben. Der Überstand wurde dann 15-20 Stunden lang bei 4ºC stehen gelassen. Die Lösung wurde dann 90 min lang bei 4% und 10.000 · g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet in 100 ml 3 M LiCl resuspendiert. Die das resuspendierte Pellet enthaltende Lösung wurde dann 60 min lang bei 4ºC und 10.000 · g zentrifugiert und der Überstand entfernt. Das Pellet wurde anschließend in Solubilisierungspuffer durch Wirbeln gelöst. RNA-Solubilisierungspuffer: 0,1% SDS, 0,01 M pH 7,5 Tris, EDTA pH 8 0,5 mM (etwa 50 ml Puffer/10 g Probe). Die RNA wurde dann mit einem gleichen Volumen an Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol-(25 : 25 : 1-)Lösung extrahiert. Die wäßrige Phase der Extraktion wurde gewonnen und eine 3 M Kaliumacetat-Lösung zugegeben, um eine Lösung mit einer Endkonzentration von 0,2 Mol-% Kaliumacetat zu bilden. 2, 2 Volumina 95% Ethanol wurden anschließend zugegeben. Die Lösung wurde in 30 ml CorexTM- Gläser abgefüllt. Die CorexTM-Gläser wurden über Nacht bei -20ºC gelagert. Die Gläser wurden dann 30 min lang bei 4ºC und 10.000 · g zentrifugiert. Der Überstand wurde enfernt und das Pellet mit einer 70% Ethanollösung gewaschen. Das Reagenzglas wurde entleert und dann 20-60 min lang in einem Vakuumofen getrocknet. Das Pellet wurde in sterilem entionisiertem Wasser erneut suspendiert.

Isolierung von PolyA-mRNA

PolyA-mRNA, durch Oligo(dT)-Cellulose aus dem gesamten Truthahnembryonen-RNA- Präparat isoliert, wurde mit etwa 2 ml Ladepuffer äquilibriert (Lade-Puffer; 20 mM Tris pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 0,5 M LiCl, 0,1% SDS). Die Oligo(dT)-Cellulose-Aufschlämmung wurde in eine mit silikonisierter Glaswolle ausgestopfte 1,0 ml-Pasteurpipette 1,0 ml gegossen. Die Säule wurde mit jeweils 3 Volumina an (1) sterilem entionisiertem Wasser, (2) 0,1 M NaOH, 5 mM EDTA, (3) sterilem entionisiertem Wasser gewaschen. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen, bis der Säulenausfluß einen pH-Wert von 8,0 aufwies. Die Säule wurde dann mit 5 Volumina Ladepuffer gewaschen. Eine wäßrige Lösung, umfassend die gesamte aus Truthahnembryos isolierte RNA, wurde 5 min lang auf 65ºC erhitzt. Gleiche Volumina von 2 · Ladepuffer wurden der RNA-Lösung zugegeben und die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Lösung wurde dann auf den Kopf der Oligo(dT)-Cellulose-Säule aufgebracht. Der Säulenausfluß wurde gesammelt, erneut auf 65ºC erhitzt und wieder auf den Säulenkopf aufgebracht. Die Säule wurde dann mit 5 ml Ladepuffer gewaschen. 1 ml-Aliquote des Säulenausflusses wurden abgenommen. 5 Volumina an 0,1 M LiCl-Puffer (20 mM Tris pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,1 M LiCl, 0,1% SDS) wurden anschließend der Säule zugegeben. Die mRNA-Fraktion wurde dann mit 5 Volumina Elutionspuffer eluiert (1 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,05% SDS), 1,0 ml-Allquote des Säulenausflusses wurden abgenommen. Die Säule wurde danach mit dem entionisiertem Wasser gespült, bis die RNA-Konzentration im Ausfluß etwa 0 betrug. Die A&sub2;&sub6;&sub0; jeder Säulenfraktion wurde bestimmt, um die RNA-Konzentration zu messen. Die Fraktionen wurden dann bei -70ºC in 70% Ethanol und 0,2 M Kaliumacetat gelagert.

cDNA-Klonieren

Die Truthahnembyronen-cDNA-Sammlung wurde mittels der Verfahren und Vektoren von Alexander et al., "Dimer - Primer cDNA Cloning", Methods in Enzymology 154, Academic Press (1987), erzeugt. Die cDNA wurde in die Sstl-Stelle von pARC 7 klo niert. Plasmid pARC 7 wurde mit Sstl gespalten und unter Verwendung terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase mit Poly(dT) versehen. Isolierte Truthahnembryonen-mRNA wurde an die Poly-dT-Schwänze über die Poly-A-Schwänze der mRNAs anneliert. Nach dem Annelieren an die Poly-dT-Schwanzprimer wurde der erste Strang der cDNA-Synthese unter Verwendung von reverser Transkriptase von Mäuse-Moloney-Leukämievirus kataylsiert. Der erste DNA-Strang wurde dann mittels terminaler Desoxynukleotidyl- Transferase mit Poly-dG-Schwanz versehen. Der modifizierte Vektor, der auf beiden Termini cDNA-Stränge trägt, wurde danach mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten. Ein BamHI-Linker mit einem Poly-dC-Schwanz wurde bei 42ºC an den Poly-dG- Schwanz anneliert. Das Gemisch wurde dann gekühlt, wodurch die Konstrukte durch Annelieren der kohäsiven BamHI-Enden ringschließen können. Der Ringschluß wurde durch Einsatz von T4 DNA-Ligase abgeschlossen. Der noch in der Konstruktion verbleibende RNA-Strang wurde durch Vermischen des RNA-DNA-Duplex mit RNaseH und Ersetzen der RNA durch DNA unter Verwendung von DNA-Polymerase I entfernt. Der verbleibende Nick wurde mit T4 DNA-Ligase gefüllt, und die Konstrukte wurden in E. coli-Stamm DHSα transformiert.

Isolierung von pTsex

Klone aus der Truthahnembryonen-cDNA-Sammlung wurden willkürlich ausgewählt und die Plasmide darin durch ein Plasmid-Miniprep-Verfahren präpariert (Birnboim und Doly, Nukleic Acids Research 7, 1513 (1979)). Die Truthahnembryonen-cDNA-Sammlungsplasmide wurden anschließend durch Spaltung entweder mit PstI oder XbaI gescreent, was zur Freisetzung des Insertabschnitts des Plasmids und zur anschließenden Trennung des Vektors vom Insert mittels Agarosegel-Elektrophorese führt. Klone mit Inserts von mehr als etwa 400 Basen paaren wurden weiterem Screenen unterzogen.

Weiteres Screening erfolgte durch radioaktives Markieren des cDNA-Abschnitts der isolierten Klone und Verwendung der resultierenden radioaktiven Sonde, um Southern- Blots zu screenen, die restriktionsgespaltene chromosomale DNA ausgewachsener Trut hähne und Truthennen enthalten. Vor dem radioaktiven Markieren wurden die Inserts aus den Klonen zur weiteren Analyse Spaltung entweder mit PstI oder XbaI unterzogen, gefolgt von Trennung der Spaltfragmente voneinander mittels Agarosegel-Elektrophorese. Das Plasmidinsert wurde durch Elektroelution vom Gel getrennt. Das Insert wurde dann durch Nicktranslation radioaktiv markiert. Die Nicktranslation wurde durchgeführt, indem das folgende Gemisch in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen eingefüllt wurde: 0,5 ug der DNA von Interesse, 2,5 ul 10 · Nicktranslationspuffer (500 mM Tris pH 7,8, 50 mM MgCl, 100 mM β-Mercaptoethanol, 100 ug/ml BSA), 2,5 ul 2 mM dGTP, 2,5 ul 2 mM dTTP, 2,5 mM 2,0 mM dCTP, 5 ul dATP 3000 Curie/mM ³²P, 2 ul DNAse I (1 U/100 ul), 1 U DNA-Polymerase I, H&sub2;O bis zu einem Gesamtvolumen von 25 ul. Das Gemisch wurde bei 15ºC 75 min lang inkubiert. 8 ul 0,25 M EDTA wurden zugegeben und das Gemisch 10 min lang bei 65ºC inkubiert, um die Reaktion abzubrechen. 1 ul 10 mg/ml ultraschallbehandelte Lachssperma-DNA wurde dann zugegeben, um die Wiederfindung der Sonde zu erhöhen. Die nicht eingearbeiteten Nukleotide wurden mittels Gelfiltration über eine G-75-Sephadexsäule entfernt.

Die ³²P-markierten Inserts wurden dann als Sonden verwendet, um mit einem Southern- Blot zu hybridisieren (umfassend restriktionsgespaltene chromosomale DNA aus Truthahnblut). Southern-Blots zum Screenen der Truthahnembryonen-cDNA-Sammlung enthielten chromosomale DNA von 8 Truthähnen, 4 Weibchen und 4 Männchen. 5 ug-Proben chromosomaler DNA, die aus dem Blut von 3 Männchen und 3 Weibchen isoliert worden war, wurden getrennt mit BamHI und EcoRI gespalten. Ein einzelnes Paar chromosomaler DNA-Präparate aus Truthähnen und Truthennen wurde mit HindIII gespalten. Die chromosomalen Spaltfragmente wurden durch Agarosegel-Elektrophorese getrennt und durch Southern-Blotting auf eine Zetaprobe- (BioRad) Filtermembran übertragen. Alle potentiellen Geschlechtsidentifizierungsmarker wurden gegen Southern-Blots getestet, die diese Kombination restriktionsgespaltener chromosomaler Truthahn-DNA enthielten.

Die Vorhybridsierungslösung (siehe Abschnitt über Hybridisierungsbedingungen für die Zusammensetzung dieser Lösung) wurde in einen Polyethylenbeutel gefüllt, der den Southern-Blot enthielt, und über Nacht bei 65ºC inkubiert. Die Vorhybridisierungslösung wurde entfernt und Hybridisierungslösung zugegeben. Die Hybridisierungslösung war im wesentlichen die gleiche wie die Vorhybridisierungslösung, mit der Ausnahme, daß die Hybridisierungslösung die gesamte in der Nicktranslationsreaktion markierte Sonde enthielt (10 min lang bei 95% denaturiert). Die Hybridisierung wurde 36 Stunden lang bei 65ºC fortgesetzt.

Nach der Hybridisierung wurden die Membranen nach dem folgenden Verfahren gewaschen. Die erste Waschung erfolgte in einer Lösung, die aus 1 · SSC und 1% SDS bestand, 10-15 min lang bei 45ºC. Der Blot wurde dann in einer Lösung von 0,1 · SSC, 1% SDS und 0,1% Natriumpyrophosphat 40 min lang bei 65ºC gewaschen. Nach dem Waschen wurde der Blot auf WhatmanTM 3 mm-Papier trockengetupft, in Saran-Wickel eingewickelt und 3 Tage lang KodakTM XAR-Röntgenfilm ausgesetzt. Der Röntgenfilm wurde anschließend auf Differenzen der Bandenmuster zwischen männlichen und weiblichen chromosomalen DNA-Präparaten analysiert, die mit dem gleichen Restriktionsenzym gespalten wurden. Die gewünschten geschlechtsspezifischen Sonden sollten keine Schwankungen der Bandenmuster zwischen DNA-Proben von Vertretern des gleichen Geschlechts bewirken.

Der dritte nach dem oben beschriebenen Verfahren untersuchte TruthahnembryonencDNA-Sammlungsklon zeigte ein geschlechtsspezifisches Hybridisierungsmuster. Hybridiserung mit dieser Sonde (Tsex-Sequenz) mit allen 3 männlichen, chromosomalen, mit BamHI gespaltenen Truthhahn-DNA-Präparaten zeigte identische Hybridisierungsbanden von 19,5 kb und 11,5 kb, während Hybridisierung von pTsex mit allen 3 mit BamHI gespaltenen chromosomalen DNA-Präparaten aus Truthennen zur Bildung von Hybridisierungsbanden mit Größen von 19,5, kb, 13,5 kb, 11,5 kb, 7,3 kb, 6,4 kb und 5,5 führte.

Mit EcoRI gespaltene, männliche, mit Tsex- sondierte, chromosomale DNA führte zum Erhalt von Hybridisierungsbanden mit Größen von etwa 13,5 kb, 3,9 kb und 3,4 kb, während Hybridisierung mit EcoRI-gespaltenen Truthennen-DNA zur Bildung von Hybridisierungsbanden mit Gewichten von etwa 13,5 kb, 9,1 kb, 3,9 kb, 3,4 kb und 2,3 kb führte. Es gab keine Schwankungen in den Hybridisierungsmustern, die von den weiblichen DNA-Proben sowie von den weiblichen DNA-Proben erzeugt wurden.

Mit HindIII gespaltene, männliche, chromosomale DNA erzeugte Hybridisierungsbanden mit Gewichten von etwa 6,5 kb und 2,5 kb, während Hybridisierung chromosomaler DNA die Bildung von Hybridisierungsbanden mit Gewichten von etwa 6,5 kb, 5,7 kb, 5,3 kb, 4,4 kb und 2,5 kb bewirkte.

Blutabnahme

Venöses Blut wird abgenommen, indem ein Zehennagel ausreichend kurz geschnitten wird, daß das Blutgefäß im Zehennagel (endet üblicherweise im distalen Viertel des Nagels) geöffnet wird. Nachdem das Blut begonnen hat, rasch auszutreten, wird eine 20 ul UnopetteTM-Pipette an den Nagel gehalten, damit das Blut durch Kapillarwirkung rasch in die Pipette fließen kann. Das andere Ende der UnopetteTM paßt auf die Düse eines Spritzfläschchens, das 70% Ethanol enthält. Das Ethanol wird durch die Pipette gespritzt, wodurch das abgenommene Blut in ein 2 ml-Polypropylen-Schraubverschluß-Reagenzglas gespült wird, das dann verschlossen wird. Es sollte zwischen der Blutabnahme und dem Vermischen des Bluts mit 70% Ethanol nicht mehr als 30 Sekunden Zeitverzögerung liegen. Das Blut wird nun aufbewahrt und ist mehrere Wochen lang durch Lagern bei Raumtemperatur zur DNA-Isolierung verwendbar.

Blut kann auf Wunsch auch durch Venenpunktion abgenommen werden. Die Flügelvene (Armvene) und Jugularvene werden bevorzugt. Die UnopetteTM-Pipette kann dazu dienen, 20 ul Blut zwecks Aufbewahrung in Ethanol wie oben in das 2 ml-Reagenzglas zu übertragen. Wenn Blut vor der Aufbewahrung über einen beliebigen Zeitraum gelagert werden muß, sollte es sofort in einem Eiswasserbad gekühlt und dann auf Eis gehalten werden.

Federbrei

Der proximale Schaft von teilweise gewachsenen Primärfedern enthält einen schleimigen, DNA-reichen Brei. Federn werden am besten durch eine feste, kontinuierliche Zugbewegung entfernt, die sicherstellt, daß die Feder in intaktem Zustand entfernt wird, ohne einen Stummel zurückzulassen. Die proximalen 2 Zoll der Feder werden abgeschnitten und in 5 ml einer vorgekühlten Lösung von DNA-Isolierpuffer eingelegt (DIB - 0,1 M NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM Tris pH 7,0). Die Probe im Puffer sollte auf Eis gehalten werden, bis sie zur DNA-Präparierung verwendet werden kann.

GENOM-DNA-ISOLIERUNG Blut

Das aufbewahrte Blut, das in Form von sehr feinen, rötlich-braunen Teilchen auftritt, wird in einem Mikrofugerohr pelletiert. Der Ethanol wird dekantiert und das Pellet in 1 ml kaltem DIB durch Aufwirbeln erneut suspendiert. Die Blutteilchen werden wieder pelletiert, die Flüssigkeit dekantiert und das Pellet in 1 ml kaltem DIB erneut suspendiert. Nach dem Aufwirbeln wird die Lösung in ein 15 ml Polypropylen-Reaenzglas mit Schraubverschluß gegossen. Das Mikrofugen rohr wird dann mit 1 ml kaltem DIB ausgespült und die Waschlösung mit dem vorherigen Extrakt gepoolt. 2,5 ml kalter DIB mit 0,4 mg/ml Proteinase K werden dann dem 15 ml-Reagenzglas zugegeben und dieses 1-5 min lang in ein 60ºC Wasserbad gestellt. Nach Erwärmen der Reagenzgläser werden 0,5 m 5% SDS (Natriumlaurylsulfat) zugegeben und die Reagenzgläser verschlossen und unter vorsichtigem Schwenken vermischt. Die Proteinase K-Spaltung wird 2-4 Stunden lang bei 60ºC fortgesetzt. Das mit Proteinase K behandelte Präparat wird dann - wie unten beschrieben - mit Phenol extrahiert.

Federbrei

Der Federbrei wird aus dem Federschaft entfernt, indem der Schaft mit einer feinen Schere längsgeschnitten, geöffnet und der Brei herausgedrückt wird. Der Brei wird in einen gekühlten Mörser mit etwa 1/2 ml Quarzsand eingebracht und mit flüssigem Stickstoff bedeckt. Nach dem Frieren des Breis und Abdampfen des flüssigen Stickstoffs wird das Material mit einem Stößel zu einem Pulver zerstampft. Das Pulver wird mit 2 ml DIB vermischt und in ein 15 ml Polypropylen-Reagenzglas gefüllt. Der Mörser wird mit weiteren 2 ml DIB gespült, der anschließend mit dem ersten Extrakt kombiniert wird. 0,5 ml Proteinase K (2 mg/ml) werden zugegeben und das Reagenzglas 1-5 min lang bei 60ºC gehalten. Nach dem Erwärmen werden 0,5 ml 5% SDS zugegeben, die Reagenzgläser verschlossen und dann unter leichtem Schwenken vermischt. Die Proteinase K- Spaltung wird 2-4 Stunden lang bei 60ºC fortgesetzt. Das mit Proteinase K behandelte Präparat wird dann wie unten angeführt mit Phenol extrahiert.

Phenolextraktion

Nach Proteinase K-Spaltung werden 5 ml Tris-äquilibriertes Phenol (pH 8,0) der Probe zugegeben. (Phenol wird gemäß dem folgenden Verfahren mit Tris äquilibriert: gleiche Volumina reines Phenol und 1 M Tris-HCl, pH 8,0 werden gründlich vermischt und getrennt. Die Tris-Schicht wird entfernt und durch 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0 ersetzt und das Verfahren wiederholt, bis der pH-Wert der Tris-Schicht 8,0 beträgt. Üblicherweise sind 2 oder 3 Austauschmengen an 0,1 M Tris erforderlich. Die Zugabe von 2 ml 5 M Kaliumhydroxid zum reinen Phenol verringert die Anzahl erforderlicher Extraktionen.) Nach der Zugabe von Phenol werden die Proben verkappt, in Aluminiumfolie eingewickelt, um Abbau des Phenols durch Belichtung zu verhindern, und 2-3 Stunden auf einer Rüttelvorrichtung gründlich durchmischt.

Nach dem Rütteln werden die Proben 30 min lang bei 60ºC inkubiert, um die Absetzung der wäßrigen Schicht zu verstärken, die Phenol und denaturiertes Protein enthält.

Diese Schichten können nach mehreren Verfahren getrennt werden: Pipettieren der wäßrigen Schicht in ein frisches Reagenzglas, Vakuumabsaugung der Phenolschicht usw. Ein geeignetes Verfahren zur Handhabung einer großen Anzahl an Proben sieht die Verwendung von siliziumimprägniertem Filterpapier vor. Ein Kegel wird aus dem Papier gebildet und in einem Trichter positioniert. Die gesamte Probe (nun bei 60ºC) wird in den Kegel gegossen. Das Papier hält die wäßrige Schicht zurück, die Phenolschicht kann jedoch hindurchgelangen. Der Inhalt des Kegels wird wieder zurück in das Reagenzglas gegossen. Chloroform wird dann zur Probe zugegeben, um restliches Phenol zu entfernen. Die Probe wird wieder vorsichtig vermischt und dann zumindest 2 Stunden lang bei 4ºC gehalten. Die Probe wird dann in einen weiteren trennenden Filterkegel gegossen, der die wäßrige Schicht zurückhält, durch die jedoch das Chloroform hindurchtreten kann. Der Kegelinhalt wird wieder zurück in das Reagenzglas gegossen.

Die Probe wird durch Zugabe 1/10 Volumens 3 M Natriumacetat auf 0,3 M Natriumacetat (NaAc) eingestellt. Zwei Volumina 95% Ethanol werden zugegeben und vorsichtig mit der Probe vermischt. Dieses Verfahren führt zur Extraktion von Wasser aus der DNA, wodurch die DNA in eine weiße, strangige Substanz ausfällt, die mit einem Glashaken aufgehoben werden kann. Das Ethanol wird abgegossen und die DNA auf dem Haken in etwa 2 ml frischem 70% Ethanol gespült. Der Haken wird dann umgedreht, sodaß das Ende mit der DNA aus dem Rohr ragt. Die DNA-Probe wird dann mehrere Stunden lang an der Luft getrocknet. Die DNA wird anschließend in 400 ul sterilem TE (10 mM Tris HCl, 2 mM EDTA pH 8,0) in 2 ml Polypropylen-Reagenzgläsern mit Schraubverschlüssen erneut suspendiert. Die Proben werden auf einen rüttelnden Plattform-Rüttler gelegt und gelöst. Der Auflösungsprozeß erfordert üblicherweise mehrere Tage bei Raumtemperatur oder 24 Stunden bei 60ºC.

Im allgemeinen liefern 20 ul Blut 80-120 ug DNA, was zu Konzentrationen von 0,2-0,3 ug/ul führt. Quantifizierung ist bei Federbreiproben infolge der Probenschwankung und RNA-Kontaminierung (Ribonukleinsäure) erforderlich. Quantifizierung ist auch notwendig, wenn DNA aus größeren Blutvolumina für Forschungszwecke isoliert wird.

Hybridisierungsbedingungen

2 · Vorhybridisierungs- und 2 · Hybridisierungslösungen:

Konzentrationen Volumen für 100 ml

20 · SSC (3 M NaCl 0,3 Trinatriumcitrat) 50

100 · Denhardts* 20

1 M Natriumphosphat pH 6,5 10

10 mg/ml Fischsperma-DNA** 20

* jeweils 2% an Ficoll, Rinderserumalbumin, Poly(vinylpyrrolidon)

** behandelt, um Fragmentgröße auf durchschnittlich 1000 Basenpaare zu verkleinern.

Diese Lösung wird durch Papier filtriert, um kleine Klumpen zu entfernen. Das Volumen wird gemessen und das gleiche Volumen an entionisiertem Formamid zugegeben. Laurylsulfat (SOS) wird dann zugegeben, um eine 1%-ige Lösung zu bilden.

Endkonzentrationen

SSC 5 X

Denhardts 10 X

Natriumphosphat pH 6,5 0,05 M

Fischsperma-DNA 1 mg/ml

Formamid 50%

SDS 1%

Diese Lösung wird auf 95ºC erhitzt und bei 95ºC gehalten, um die Fischsperma-DNA zu denaturieren. Die Lösung wird dann rasch in einem Eiswasserbad auf 72ºC gekühlt, in einen geeigneten Behälter eingebracht, und dann werden die Blots zugegeben. Der Behälter wird in einen 42ºC warmen Rüttelinkubator eingelegt und zumindest 8 Stunden lang vorsichtig vermischt.

Die Hybridisierungslösung ist mit der Vorhybridisierungslösung mit Ausname der Zugabe der Sonde identisch. ³²P markierte Tsex-Sequenz bei einer Konzentration von 0,05 ug/ml wird als Sonde verwendet. Die Hybridisierungslösung wird auf 95ºC erhitzt und 5-10 min lang bei 95ºC erhitzt, um sowohl die Fischsperma-DNA als auch die Sonden- DNA zu denaturieren. Die Hybridisierungslösung wird dann rasch auf 42ºC gekühlt, in einen Behälter eingebracht, und dann werden vorhybridisierte Southern-Blots zugegeben. Der Behälter wird bei 42ºC unter leichtem Rühren 36 Stunden lang inkubiert. Blots erfordern 1 ml Hybridisierungslösung pro 10 cm² Oberfläche. Üblicherweise werden nicht mehr als 3-4 Blots im gleichen Behälter untergebracht. Da die Hybridisierungslösung die Sonde verdünnt, muß zusätzliche markierte Sonde hergestellt werden, wenn mehr als 3 Blots (13 · 15 cm) hybridisiert werden sollen.

Die Blots werden dann dreimal 10 min lang jeweils in 2 · SSC, 0,5% SDS bei Raumtemperatur gewaschen, dann viermal 30 min lang jeweils in 2 · SSC gewaschen und trocken getupft. Die feuchten Blots werden in Saranwickel eingewickelt und auf Röntgenfilm zwischen zwei Verstärkerschirme gelegt. 2-4 Tage Belichtung sind erforderlich, um Hybridisierungsbanden aus Einzelkopiegenen, wie z. B. Tsex, zu visualisieren. Nach der Belichtung wird der Röntgenfilm nach dem Standardverfahren entwickelt.

Zusammenfassung der Hybridisierungsergebnisse

Die Tsex-Sequenz wurde unter Anwendung der oben beschriebenen Arbeitsvorschriften markiert und als Hybridisierungssonde verwendet, um Hybridisierung gegen chromosomale DNA-Präparate von zahlreichen Vogelarten durchzuführen. Tabelle 2 bietet eine Zusammenfassung der Hybridisierungsmuster für DNA-Proben von Männchen und Weibchen der untersuchten Spezies. Hybridisierungsbanden sind entweder dem W- Chromosom, dem Z-Chromosom oder beiden Geschlechtschromosom zugeschrieben. Leerräume in Tabelle 2 zeigen die Unmöglichkeit auf, die angeführte Restriktions- Endonuklease zu testen.

TABELLE 2 Hybridisierungmuster
(Banden in kb) Vogelchromosom
Tabelle 2 (Fortsetzung)

Es ist aus obigen Ergebnissen offenkundig, daß ein einfaches, präzises und wirksames Verfahren zur Bestimmung des Geschlechts von Vögeln in einem Stadium zur Verfügung gestellt wird, in dem visuelle Manifestationen von Geschlechtsmerkmalen nicht gegeben sind. Auf diese Weise können Paarungen und andere Ereignisse in Zusammenhang mit dem Geschlecht des Vogels entsprechend genau vorgenommen werden.

Alle in dieser Beschreibung erwähnten Publikationen und Patentanmeldungen legen Zeugnis über den Wissensstand von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ab. Alle Publikationen und Patentanmeldungen sind hierin so aufgenommen, als ob jede einzelne Publikation oder Patentanmeldung spezifisch und individuell durch Verweis aufgenommen wäre.


Anspruch[de]

1. Nukleinsäure, bestehend aus der Sequenz:

oder der komplementären Sequenz davon oder einem Fragment aus zumindest 50 Nukleotiden davon, die für eine unterscheidende mit dem Geschlecht eines Vogels verbundene RFLP sorgt.

2. Hybridisierungssonde, umfassend ein Fragment aus zumindest 50 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der Sequenz aus Anspruch 1 oder das mit einer Markierung verbundene Fragment.

3. Hybridisierungssonde nach Anspruch 2, worin die Sonde mit Biotin, einem Enzym, einem Fluoreszenzmittel oder einem Chemolumineszenzmittel verbunden ist.

4. Hybridisierungssonde mit einer Länge von zumindest 50 Nukleotiden, die zur Hybridisierung mit der Tsex-Sequenz aus Anspruch 1 unter rauhen Hybridisierungs- Bedingungen fähig ist, wobei die Sonde weniger als 20% Fehlübereinstimmung mit der Tsex-Sequenz aufweist.

5. Replikationsvektor, der zumindest 50 aufeinanderfolgende Nukleotide der Sequenz aus Anspruch 1 umfaßt.

6. Verfahren zur Bestimmung, ob eine Vogel-Chromosomen-DNA-Probe von einem genetisch männlichen oder weiblichen Vogel stammt;

worin der Vogel dadurch gekennzeichnet ist, daß er eine spezifische Sequenz auf zumindest einem der W- und Z-Geschlechts-Chromosomen aufweist, die für das Geschlechtschromosom einzigartig ist, wobei die Sequenz innerhalb der Tsex-Sequenz in Tabelle 1 liegt;

wobei das Verfahren umfaßt:

die Vorbereitung der Vogel-Chromosomen-DNA-Probe zur Hybridisierung oder, wenn die Geschlechtsunterscheidung auf einer Differenz der Restriktionsfragment-Längenpolymorphien basiert, a) das Spalten der Vogel-Chromosomen-DNA-Probe mit zumindest einer Restriktionsendonuklease; und b) die Größentrennung der mit Restriktionsendonuklease gespaltenen DNA;

das Hybridisieren der Vogel-Chromosomen-DNA-Probe mit einer Sonde, die ein Fragment aus zumindest 14 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der Sequenz aus Anspruch 1 oder das mit einer Markierung verbundene Fragment umfaßt; und

das Bestimmen der Gegenwart, der Größe und/oder der Intensität von Hybridisierungsbanden als Indikator für das Geschlecht des Vogels.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Sequenz sowohl auf den Z- als auch den W-Chromosomen vorliegt und die Bestimmung nach der Größe erfolgt.

8. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Sequenz entweder auf dem Z- oder dem W-Chromosom vorliegt und die Bestimmung durch Messung der Intensität eines markierten Fragments mit bestimmter Größe erfolgt.

9. Verfahren nach Anspruch 6, worin das Fragment mit bestimmter Größe durch Gelelektrophorese abgetrennt wird.

10. Set zum Bestimmen des Geschlechts eines Vogels, umfassend Proben-DNA von einem Vogel von Interesse mit bekanntem Geschlecht und eine Sonde nach Anspruch 2.

11. Set zum Bestimmen des Geschlechts eines Vogels, umfassend Proben-DNA von einem Vogel von Interesse mit bekanntem Geschlecht und eine Sonde, die ein Fragment aus zumindest 14 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der Sequenz aus Anspruch 1 oder das mit einer Markierung verbundene Fragment umfaßt.







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