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Dokumentenidentifikation DE68928899T4 25.11.1999
EP-Veröffentlichungsnummer 0423224
Titel LEADERSEQUENZ ZUR INDUZIERUNG EINER POSTTRANSLATIONALEN MODIFIKATION VON POLYPEPTIDEN IN BAKTERIEN, SOWIE DAFÜR KODIERENDES GEN
Anmelder University of Maryland, College Park, Md., US
Erfinder HANSEN, Norman, J., Silver Spring, MD 20903, US
Vertreter WINTER, BRANDL, FÜRNISS, HÜBNER, RÖSS, KAISER, POLTE, Partnerschaft, 85354 Freising
DE-Aktenzeichen 68928899
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 30.06.1989
EP-Aktenzeichen 899085583
WO-Anmeldetag 30.06.1989
PCT-Aktenzeichen US8902820
WO-Veröffentlichungsnummer 9000558
WO-Veröffentlichungsdatum 25.01.1990
EP-Offenlegungsdatum 24.04.1991
EP date of grant 07.01.1999
Veröffentlichungstag im Patentblatt 25.11.1999
IPC-Hauptklasse C07H 21/04
IPC-Nebenklasse C07K 14/00   C12P 21/00   

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft die Expression von Proteinen, welche eine posttranslationale Modifikation ihrer Aminosäuresequenz erfordern, bevor eine reife Form erreicht wird. Derartige Proteine zeigen andere Aminosäuren als die 20 bekannten Aminosäuren, die durch die konventionellen Nukleinsäuren codiert werden. Insbesondere wird eine Leader-Peptidsequenz identifiziert, welche eine posttranslationale Modifikation von spezifischen Aminosäuren induzieren kann, wenn sie in Verbindung mit dem Vorläuferpolypeptid des antibiotischen Nisins exprimiert wird. Verfahren zum Bilden verbesserter Zusammensetzung unter Verwendung dieser Leadersequenz werden ebenfalls angesprochen.

Hintergrund des Standes der Technik

Polypeptide, einschließlich solche, welche natürliche antibiotische Wirkungen aufweisen, wurden identifiziert, welche andere als die 20 bekannten Aminosäuren umfassen, die durch den genetischen Code identifiziert werden, als die Expressionsprodukte von Bakterien und anderen Organismen. Die Struktur der beiden wichtigeren, Nisin und Subtilin, sind in Fig. 1 der vorliegenden Anmeldung dargestellt.

Das Vorliegen in diesen Polypeptiden und anderen der ungewöhnlichen Aminosäuren Lanthionin, β-Methyllanthionin, D-Alanin, Dehydroalanin und Dehydrobutyrin schlägt klar vor, daß etwas anderes als eine gewöhnliche Proteinbiosynthese, welche durch den genetischen Code gelenkt wird, involviert ist in die Expression der reifen Formen dieser natürlich vorkommenden Polypeptide. Nichtsdestoweniger hat die Forschung gezeigt, daß das Erscheinen dieser Polypeptide durch Proteinbiosyntheseinhibitoren blockiert werden kann. Hurst et al., Canadian Journal of Microbioiogy, 17, 1379-1384 (1971). Es ist ebenfalls bekannt, daß Vorläuferpeptide der reifen Formen bestimmt werden können mit Antikörpern gegen das reife Peptid. Nishio et al., Biochemistry Biophysics Research Community, 116, 751-751 (1983). Diese Beobachtungen mit anderen Beobachtungen betreffend Nisin, Subtilin und verwandte Proteine schlagen einen Mechanismus vor, der die primäre Biosynthese eines Vorläufers über einen ribosomalen Mechanismus involviert, gefolgt von posttranslationalen Modifikationen.

Insbesondere beschreibt der oben erwähnte Artikel von Hurst et al. das Vorliegen eines Nisinvorläuferpolypeptids in Bakterien. Jedoch isoliert diese Offenbarung den Vorläufer nicht mit irgendeinem Reinheitsgrad, so daß er analysiert oder verwendet werden könnte.

Die Wirkung dieser Proteine und potentieller Mutantenversionen davon sind von hinreichendem kommerziellen Interesse, um wesentliche Aktivität in dem Gebiet der abgeleiteten Mikroorganismen zu erzeugen, welche Fremd- DNA-Fragmente enthalten und für die Herstellung des Proteins codieren. Das U.S.-Patent 4, 716, 115 von Gonzales et al. ist gerade auf einen solchen abgeleiteten Mikroorganismus gerichtet. Jedoch hat die Unmöglichkeit, eine genetische Sequenz zu erhalten, die direkt für das reife Protein codiert und der Mangel an Information bezüglich dar Natur der posttranslationalen Modifikation, die erforderlich ist um zu dem reifen Protein zu gelangen, das Klonieren von Mikroorganismen, die das spezifische Gen enthalten, welches für diese Proteine codiert, verboten, und vielleicht wichtiger, hat Versuche abgehalten zufällige Varianten und stellenspezifisch mutierte Proteine herzustellen, welche sehr wahrscheinlich zu höheren Wirkungsgraden oder anderen verstärkten Eigenschaften führen könnten.

Deshalb blieb es ein Gegenstand des biotechnologischen Gebietes, ein umfassendes Verständnis des Mechanismus zu erreichen, mittels welchem die reifen Formen dieser ungewöhnlichen Aminosäure-haltigen Polypeptide gemacht werden und ein Expressionsvehikel zu entwickeln, zum Inkorporieren eines Genes, welches spezifisch für die Produktion dieser Peptide codiert und welches geeignet ist für die Transformation von allgemein verfügbaren Bakterien.

Offenbarung der Erfindung

Die Anmelder haben eine Gen-Leader-Sequenz identifiziert, welche wenn sie mit dem Gen, welches für das Vorläuferpolypeptid des antibiotischen Nisins codiert, gekoppelt ist, die posttranslationale Modifikation des Vorläufers induziert oder daran partizipiert, um die reife Form zu erhalten. Die Struktur des vollständigen Genes, einschließlich wahrscheinlicher ribosomaler Bindungsstellen, bestätigt das posttranslationale Modifikationsmodell für die Herstellung dieses Peptids.

Zum Zweck der Vollständigkeit und Klarheit der Beschreibung der vorliegenden Erfindung wird im folgenden Text und in den Figuren auf die Vorläufer, die Leadersequenzen und Gene, welche für diese Leadersequenzen von Subtilin und Nisin codieren, Bezug genommen; es wird jedoch verstanden, daß der hierin beanspruchte Umfang der Erfindung lediglich die Nisinvorläufer, die Nisin-Leader-Sequenz und das Gen, welches für diese Leadersequenz codiert betrifft.

Das Gen zur Expression des Vorläufers und letztlich des reifen Proteins des Subtilins erscheint in Fig. 2. Die Leadersequenz, welche verwendet werden kann um die posttranslationale Modifikation von anderen Proteinen, welche ungewöhnliche Aminosäuren enthalten, wie beispielsweise Nisin und dergleichen, zu promovieren, ist spezifisch in Fig. 3 dargestellt. Eine separate Leadersequenz, welche eine signifikante Homologie mit derjenigen für Subtilin aufweist, wird ebenfalls identifiziert und die Gesamtgensequenz ist in Fig. 3 angegeben.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist die Konformationsstruktur für die kleinen antibiotischen Proteine Nisin und Subtilin, wie von Gross et al. bestimmt, Protein Cross-linking, pages 131-153 (1977).

Fig. 2 ist die genetische Basenpaarsequenz für das gesamte verdaute Fragment, welches das Gen enthält, welches für das Subtilinvorläuferpeptid codiert, einschließlich des Leader-Fragmentes, welches für die Induktion der posttranslationalen Modifikation verantwortlich ist. Eine vermeintliche ribosomale Bindungsstelle ist mit R. B. S. markiert, das Leader-Fragment hat Sterne darüber und solche Aminosäuren des Vorläufers, welche einer Modifikation unterliegen, sind fett wiedergegeben.

Fig. 3 ist eine Illustration, welche die Sequenz für das Gen, welches für Nisin codiert, wiedergibt und das Vorläuferpolypeptid, welches dem entspricht, denselben Typ an Markierungen trägt und dieselben Bedeutungen hat wie in Fig. 2.

Bester Modus zum Ausführen der Erfindung

Um zu dem Gen für den Polypeptidvorläufer für Proteine von Interesse zu gelangen und deshalb für die letztliche Expression der reifen Form des Proteins, ist es notwendig, eine Gensonde zu entwickeln, basierend auf der vermeintlichen Aminosäurevorläufersequenz des fraglichen Proteins. Zur Erleichterung der Diskussion wird die Beschreibung hierin zunächst im Zusammenhang mit dem Gen und Vorläufer für Subtilin gegeben, obwohl dieselbe Verfahrensweise angewendet wird, um das vollständige Gen des Vorläufers für Nisin zu bestimmen, wie nachfolgend diskutiert, und anwendbar ist auf zusätzliche Gene, die für Proteine codieren, die ebenfalls in ähnlicher Weise ungewöhnliche Aminosäuren in der reifen Form enthalten.

Subtilin

Organismen und Kulturbedingungen. Bacillus subtilis ATCC 6633, ein Subtilin-produzierender Stamm, wurde erhalten von der American Type Cuture Collection, Rockville, MD. Er wurde kultiviert in dem hoch-Sucrose Medium A von Nishio et al., (1983), ursprünglich beschrieben bei Feeney et al. (1948). Es enhält (pro Liter) 100 g Sucrose, 11,7 g Citronensäure, 4 g NH&sub4;SO&sub4;, 4,2g (NH&sub4;)&sub2;HPO&sub4;, 5 g Hefeextrakt (Difco), 100 ml einer Salzmischung (7,61 g KCl, 4.18 g MgCl&sub2;-6H&sub2;O, 0,543 g MnCl&sub2;-4H&sub2;O), 0,49 g FeCl&sub3;-6H&sub2;O und 0,208 g ZnCl&sub2; in 1000 ml H&sub2;O) und hinreichend NH&sub4;OH, um den pH auf 6,8 bis 6,9 zu bringen. Stammlösungen wurden aufbewahrt auf LB-Platten (auf 10 g Tryptone, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl pro Liter) enthaltend 1,5% Agar.

Klonisolierung und Hybridisierungsverfahren.

Eine Subtilingensonde wurde entworfen, basierend auf der vermeintlichen Aminosäurevorläufersequenz des Subtilins. Das reife Subtilinmolekül enthält nur 32 Aminosäuren und enthält keine Regionen mit niedriger Codondegenerativität. Deshalb wurde anstelle des Herstellens einer Sondenmischung, welche sämtliche möglichen Sequenzen enthält, die für ein kurzes Stück von Aminosäuren in dem Subtilinvorläufer codieren, eine lange Sonde synthetisiert, gemäß der Strategie von Lathe, Journal of Molecular Biology, 183, Seiten 1-12 (1985). Zweideutige Positionen innerhalb von Codons wurden ausgewählt durch sinnvolle Abschätzung (educated guess) gemäß einer Codonfrequenzbenutzungstabelle, hergestellt aus dem bekannten B.subtilis-Gen, welches für die alpha-Amylase, Yang et al., Nucleic Acids Research, 11, Seiten 237-249 (1983), codiert. Da man die Sequenzhomologie zwischen der Sonden- und der Zielgensequenz nicht vorhersagen kann, müssen die Hybridisierungs- und Waschbedingungen empirisch optimiert werden. Das 96-mer "guessmer" wurde endmarkiert unter Verwendung von Polynukleotidkinase, auf Disulfid-quervernetzten BAC-Gelen wie von Hansen et al. (1982) beschrieben, gereinigt und gegen EcoR 1-Verdaus von gesamter ATTC 6633 genomischer DNA bei 7ºC-Temperaturintervallen im Bereich von 37-60ºC hybridisiert, unter Verwendung einer 6-fachen Standardsalzcitrat (SSC) Salzstärke. Getrennte Streifen wurden dann gewaschen unter Verwendung von Temperaturingrementen von 4ºC in 2-fach SSC. Die Hybridisierungs- und Waschbedingungen, welche die beste Kombination aus Signalstärke und Spezifität ergaben, wurden ausgewählt für das nachfolgende Screening einer partiellen Mbo1-Bibliothek von ATCC 6633 DNA, konstruiert in Lambda J1. Hybridisierungen, bei welchen Sonden und Ziel hoch homolog waren, wurden in demselben Hybridisierungspuffer wie oben durchgeführt, jedoch betrug die Hybridisierungstemperatur 70ºC, Waschungen wurden durchgeführt bei 0,1-fach SSC bei 52ºC. DNA Sequenzanalyse wurde durchgeführt unter Verwendung des modifizierten T7-Polymerase "Sequenase" Systems, von der United States Biochemical Corp.

RNA-Isolierung und S1-Kartierung.

Gesamt-RNA wurde isoliert unter Verwendung der Verfahren von Ulmanen et al. (1985). S1-Kartierung wurde durchgeführt nach dem Verfahren von Davis et al. (1986), in welchem ein synthetisches Oligonukleotid verwendet wird, um die Synthese des zweiten Stranges zu starten, unter Verwendung von Einzelstrang-M13-DNA, welche das klonierte Gen als Matrize enthält. Eine Markierung wurde als ³²P aus [alpha-³²P-dATP] inkorporiert. Nach einer kurzen Markierungszeit wurde ein Überschuß an dATP hinzugefügt, und die Synthese des zweiten Stranges wurde bis zur Komplettierung fortgeführt. Ein geeignetes Restriktionsenzym wurde verwendet, um das doppelsträngige Produkt zu schneiden. Der markierte Strang wurde erhalten durch Elektrophorese auf einem denaturierenden Agarosegel, gefolgt von Autoradiographie, um das Fragment zu lokalisieren, Ausschnitt aus dem Gel und Elektroelution der DNA. Nach der Elektroelution wurde die DNA mit 1 : 1 Chloroform: Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Das markierte Fragment wurde gegen Gesamt-mRNA bei verschiedenen unterschiedlichen Temperaturen hybridisiert und nichthybridisierte Einzelstrangnukleinsäure wurde abgebaut unter Verwendung von Nuklease-S1. Das Produkt wurde elektrophoretisiert auf einem denaturierenden Sequenzgel zusammen mit einem Satz von Dideoxysequenzierungsreaktionen, erzeugt unter Verwendung desselben Oligonukleotids als Primer. Die Lokalisierung des geschützten markierten DNA-Fragmentes bezüglich der Sequenzierungsspuren identifizierte das Ende der mRNA.

RNA- und Proteinanalyse.

Northern-Analyse wurde durchgeführt durch Elektroblotting von Acrylamidgelen von RNA-Präparationen auf Zeta-Sonden-Nylonmembranen (Bio-Rad). Proteine wurden durch Elektrophorese auf dem Polyacrylamidgelsystem von Swank und Munkres (1971) analysiert und Silbergefärbt unter Verwendung von Bio-Rad Reagenzien. Subtilin-Aktivität wurde gemessen wie für Nisin, beschrieben bei Morris et al. (1984).

Unter Verwendung der obigen Materialien und Verfahren wurden Fragmente, welche die Sequenz, die mit dem Guessmer hybridisierte enthält, in M13 kloniert und sequenziert. Die Sequenz wurde auf Homologie zu der Subtilingensonde abgesucht und ebenfalls in alle Leserahmen computerübersetzt. Diese wurden abgesucht auf die mutmaßliche Subtilinvorläufersequenz. Eine perfekte Übereinstimmung wurde gefunden, welche die exakte Sequenz der 32 Reste enthält. Die Sequenz ist in Fig. 2 dargestellt.

Wie bemerkt, schließt diese Sequenz einen Teil ein, welcher für ein Vorläuferpolypeptid codiert, welches Serin, Threonin und Cysteine enthält, die nach der Translation einer Modifikation unterliegen, um bei dem reifen Protein anzugelangen, wobei sie die erwähnten ungewöhnlichen Aminosäuren aufweisen. Die (-10) Region entspricht stark einem prokaryotischen Konsensus-Promotor (TATAAT), wie in anderen Bakterien beobachtet, Siebenlist et al., Cell, 20, Seiten 269-281 (1980). Die vermeintliche Ribosomenbindungsstelle ist als RBS markiert und umfaßt eine 12- Basenpaarsequenz, welche typisch ist für solche die in B. subtilis beobachtet wird, wie von Band et al., DNA, 3, Seiten 17-21 (1984) berichtet. Es sollte bemerkt werden, daß sie so positioniert ist, daß die Translationsinitiation an dem unmittelbar downstream Met-Codons beginnen würde, welches die Leadersequenz des Subtilins initiiert. Es sollte bemerkt werden, daß die Subtilinvorläuferpeptid-Leader-Region, welche beim Transport des Subtilins aus der Zelle eine Rolle spielt, ungewöhnlich im Vergleich mit Sequenzen prokaryotischer exportierter Proteine ist.

NISIN

Der obige Ansatz wurde dupliziert für das antibiotische Nisin und die resultierende Gensequenz, die für den Vorläufer codiert, ist in Fig. 3, welche hieran angehängt ist, dargestellt.

Bakterienstämme, Klonierungsvektoren und Kulturbedingungen. Nisinproduzierende Streptococcus lactis ATCC 11454 wurden erhalten von der American Type Culture Collection (Rockville, MD). Die Stämme wurden gelagert bei -20ºC in ATCC Medium 17 (100 g entrahmtes Milchpulver, 100 g Tomatensaft, 5 g Hefeextrakt bei pH 7,0) enthaltend 25% Glycerin. Arbeitsstammlösungen wurden aufbewahrt auf 1,2% LB-Agarplatten (10 g Bacto-tryptone, 5 g Bacto-Hefeextrakt, 10 g NaCl pro Liter). M17-Kulturmedium, bestehend aus 5 g Bacto-peptone (Difco), 5 g Bacto-soytone (Difco), 2,5 g Hefeextrakt (Difco), 5 g Rinderextrakt (Difco), 0,5 g Ascorbinsäure, 5 g Lactose (oder Glukose), 19 g beta-Dinatriumglycerophosphat (Eastman) und 0,12g wasserfreies MgSO&sub4; pro Liter wurde verwendet, um S.lactis zur Nisinproduktion, Genombibliothekkonstruktion und Gesamt-RNA-Isolation zu kultivieren. Die Organismen wurden bei 32ºC ohne Belüftung unter Verwendung eines 2%igen Inokulums in einem geeigneten Volumen von M17- Medium gezüchtet.

Bacillus cereus -T-Sporen, verwendet in dem Assay zur Nisinproduktion, wurden präpariert und gelagert wie im Stand der Technik beschrieben. Assay's für die antibiotische Wirkung wurden durchgeführt wie zuvor beschrieben, unter Verwendung von Fraktionen des S.lactis-Kulturüberstandes.

DNA-Isolierungsverfahren. S.lactis ATCC 11454 wurde inkubiert in 500 ml M17 Medium für 30 Stunden bei 32ºC ohne Belüftung. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und in 25 ml PBS (8 g NaCl, 1,4 g Na&sub2;HPO&sub4;, 1,2 ml 1 N HCl pro Liter) gewaschen. Die Zellen wurden resuspendiert in 15 ml 50 mM Tris- HCl (pH 7,6) und nachfolgend verdaut mit 33 Mikrogramm pro Milliliter Mutanolysin (Sigma) für 15 min bei 37ºC unter sanfter Bewegung. Dann wurden Sml STEP-Lösung (0,5% SDS, 50 mM Tris-HCl in 0,4M EDTA und 1 mg pro ml Proteinase K) hinzugefügt und die Inkubation bei 37ºC für 30 min unter gelegentlichem Mischen durchgeführt. Die Mischung wurde extrahiert mit 1 Volumen an CHCl&sub3;, 1 Volumen 50 : 50 Phenol : CHCl&sub3; und schließlich mit 1 Volumen CHCl&sub3;. Ein Zehntel Volumen 3 M Natriumacetat und 2 Volumina Ethanol wurden hinzugefügt; die DNA wurde aufgewickelt und resuspendiert in 20 ml mM Tris-HCl und 4 mM EDTA, enthaltend 50 Mikrogramm pro ml pankreatischer RNase (Sigma). Diese Lösung wurde gegen einen Puffer aus 50 mM Tris-HCl und 4 mM EDTA für 16 Stunden bei 4ºC mit einem Pufferwechsel dialysiert. Die DNA wurde zweimal Ethanol-gefällt in Gegenwart von 2,5 M Ammoniumacetat und schließlich in 2 ml 10 mM Tris- HCl, pH 7,6 aufgelöst.

Sondenkonstruktion, Radiomarkierung und Hybridisierungsverfahren.

Mehrere unterschiedliche Sonden wurden verwendet, um nach dem Nisin- Gen in S.lactis ATCC 11454 DNA zu suchen. Die Hybridisierungsbedingungen wurden optimiert wie zuvor beschrieben. Zwei oligomere Sonden wurden hergestellt durch chemische Synthese unter Verwendung eines Biosearch Model 8700 DNA Synthesizers. Eine war eine 20-mer gemischte Sonde, ausgelegt gegen eine Region niedriger Codondegenerativität innerhalb der vermeintlichen Nisinvorläufersequenz. Die Zweite war eine Einzelsequenz 103- mer Oligonukleotidsonde, ausgelegt unter Verwendung der Strategie von Lathe. Eine natürliche DNA-Sonde wurde ebenfalls angewendet, welche ein 1,1 kb- Restriktionsfragment war, welches das Subtilingen, das zuvor aus Bacillus subtilis ATCC 6633 (2) kloniert worden war, enthält.

Bibliothekskonstruktion und Isolierung des Nisin-Gens.

Es wurde eine Gesamtgenombibliothek von S.lactis ATCC 11454 DNA in Lambda J1 konstruiert und gescreent wie oben beschrieben. Positive Klone wurden durch Restriktionsanalyse kartiert und subkloniert in pUC9 und pTZ19U-Plasmidvektoren für weitere Analyse und in M13mp18 zum Sequenzieren subkloniert. Die Sequenzbestimmung wurde durchgeführt durch die Dideoxyterminationsmethode unter Verwendung modifizierter T7- Polymerase und dem Protokoll in einem Sequenasekit, erhalten von der United States Biochemical Company.

RNA-Isolation und Northern Blot-Analyse.

Eine Gesamt-RNA-Isolation wurde durchgeführt gemäß dem Verfahren von Ulmanen et al. RNA-Fraktionierung wurde durchgeführt auf einem denaturierenden Acrylamidgel, elektrogeblotted auf Zeta-Sonden (Biorad) Nylonmembran und hybridisiert, wie oben beschrieben.

Proteinanalyse.

Proteine wurden analysiert durch Elektrophorese auf dem Polyacrylamidgelsystem von Swank und Munkres und Silbergefärbt unter Verwendung von Biorad-Reagenzien. Die Nisinaktivität wurde bestimmt durch das Verfahren von Morris et al.

Diskussion

Somit wurde der Modus, durch welchen Subtilin, Nisin und andere Proteine, welche ungewöhnliche Aminosäuren enthalten, die nicht durch den genetischen Code codiert werden, etabliert. Spezifische Leadersequenzen welche innerhalb des Genes für Subtilin und Nisin codiert sind, die in Fig. 2 und 3 gezeigt sind, die für eine posttranslationale Modifikation von spezifischen Aminosäuren inklusive der Vorläuferreste Ser, Thr und Cys erforderlich sind, welche umgewandelt werden zu diesen ungewöhnlichen Aminosäuren auf die oben Bezug genommen wurde, unterliegen Reaktionen, welche Dehydrierung und potentielle elektrophile Additionsreaktionen, welche eine Stereoinversion involvieren, um Thioether-Querbindungen und D-Aminosäuren zu erzeugen. Gene, welche für das Vorläuferpolypeptid codieren, einschließlich des Leaders, können durch konventionelle Technologien in ein Expressionsvehikel inseriert werden, welches zum Beispiel für Nisin Streptococcus lactis als einen natürlichen Hersteller einschließt und die Expressionsbakterien sind beispielsweise in U.S. Patent 4 716 115 aufgeführt. Ähnliche Expressionsvehikel können für andere Proteine identifiziert werden.

Im Nachgang zu der hierin angesprochenen Erfindung wurde die Gensequenz für Epidermin, einem anderen Lanthioninenthaltenen Polypeptid- Antibiotikum von Schnell et al., Nature, 333, Seiten 276-278 (1988) publiziert. Obwohl die Aminosäurereste der Leadersequenzen für die drei Antibiotika hinreichende Homologie reflektieren, um einen gemeinsamen evolutionären Ursprung zu zeigen, ist es derzeit klar, daß signifikante Unterschiede in den Aminosäuresequenzen eines jeden und ihren korrespondierenden Gensequenzen vorliegen. Wie jedoch in Tabelle 1 wiedergegeben, sind die hydropathischen Indices der drei Leader-Aminosäuresequenzen erstaunlicherweise ähnlich. Insbesondere gibt es zu den strukturellen Regionen benachbart eine Region hoher Hydrophilie, gefolgt von einer Region, entfernter von der strukturellen Region, welche im Durchschnitt neutral ist, jedoch dazu tendiert, zwischen hydrophilen und hydrophoben Resten zu alternieren. Tatsächlich liegt eine erstaunliche Korrelation bezüglich dieser Reste vor, wenn man sie auf denselben Graphen legt. Diese Korrelation setzt sich nach unten fort aufgrund des Umstandes, daß jede Leaderregion eine Unterbrechung in den hydrophilen Resten mit hydrophoben Resten reflektiert, bei exakt derselben Lokalisation in jedem Fall. Somit umfaßt die vorliegende Erfindung nicht nur die Erkenntnis, daß die Modifikation erreicht wird durch Codieren eines Leaderbereiches, welcher dazu hilft, die Modifikation in dem strukturellen Bereich zu erreichen, sondern sich auch auf die Erkenntnis erstreckt, daß der Leaderbereich im allgemeinen charakterisiert werden kann als ein solcher, der einen Teil, proximal zu der strukturellen Region aufweist, welcher von hydrophiler Natur ist, ergänzt durch einen weiter entfernten Teil, in welchem hydrophile und hydrophobe Reste alternieren, um einen insgesamt neutralen Wert zu ergeben. Empirisch betrachtet, schließen die drei hierin dargestellten Beispiele alle die Gegenwart eines einzelnen hydrophoben Restes innerhalb des hydrophilen Teils, benachbart zu der strukturellen Region ein. Bis zum Einreichungstag der vorliegenden Anmeldung ist es unbekannt, ob das Vorliegen eines solchen Restes essentiell ist zum Erreichen der erforderlichen posttranslationalen Modifikationen. Unter Beachtung des Durchschnittskönnens eines Fachmanns können Routineexperimente die Notwendigkeit eines solchen Vorliegens zusammen mit unterschiedlichen Alternativen, welche die Modifikationseffizienz verbessern können, bestimmen.

Die verfügbare Technologie erlaubt ebenfalls die Herstellung eines Genes, welches für ein reifes Protein codiert, lediglich aus dem Gen für die strukturelle Region, welche in vielen Fällen bestimmt werden kann in einer relativ geradlinigen Art, d. h. Vorhersage basierend auf der Aminosäuresequenz, gefolgt von Hybridisierung und Sequenzanalyse. Die Wirkung der Leadersequenz dieser Erfindung auf spezifische Aminosäuren stellt ebenfalls ein neues Mittel zur Verfügung zum Erhalten von stellenspezifischer Mutagenese ohne Zuflucht zur DNA-Modifikation. Daher wurde zum Beispiel berichtet, daß Deletion oder Ersatz von unterschiedlichen Resten, wie beispielsweise Cystein, die biologische Aktivität verbessern kann. Siehe z. B. U.S. Patent 4 518 584. Zusätzlich wird von neuen Mutanten von natürlich vorkommenden Peptiden möglicherweise erwartet, daß sie höhere Aktivitäten oder bessere Spezifität für gewisse biologische Funktionen zeigen. Diese können nun hergestellt werden durch Insertion des genetischen Codes für die Leadersequenz der vorliegenden Erfindung gegenüber dem Gen, welches für die Expression eines natürlich vorkommenden Polypeptids codiert, welches dann der posttranslationalen Modifikation unterliegt, gelenkt durch die Leadersequenz, welche die fraglichen Reste eliminiert oder modifiziert.

Tabelle 1

Es sollte ebenfalls bemerkt werden, daß natürlich wo es erwünscht ist, die wesentliche Expression des Vorläufers und nicht des Peptids selbst zu sichern, dies nun auch durch spezifisches Ausschneiden des Leaderfragmentes aus dem Gen, welches den Peptidvorläufer codiert, erreicht werden kann. Bei Abwesenheit der Leadersequenz der vorliegenden Erfindung wird es der Vorläufer sein, welcher exprimiert wird ohne Anweisungen sich einer posttranslationalen Modifikation zu unterziehen.

Ein anderes Merkmal der Erfindung der vorliegenden Anmeldung ist die Fähigkeit des Entwerfens von "Zielproteinen (targeted proteins)" oder Proteinen, welche aufgrund der Gegenwart der ungewöhnlichen Aminosäuren Dehydroalanin und Dehydrobutyrin kovalent an ein "Target " gebunden werden können. Somit können unter Verwendung struktureller Varianten, welche spezifische Ziele erkennen und selektieren können, die Leaderfragmente angewendet werden, um "Bindungsstellen" zu induzieren, um einen kovalenten Bindungs-"Antikörper" zu entwickeln, um spezifische Toxine zu neutralisieren, spezifische Materialien auszuwählen usw. Sämtliche dieser Modifikationen liegen im Bereich des Durchschnittsfachmanns und der ausgeweiteten Biotechnologie und stellen somit eine direkte Anwendung der Entdeckung der Leadersequenz, die hierin offenbart ist, dar.

Anwendungen der vorliegenden Erfindung sind nicht beschränkt auf die Modifikation von existierenden Proteinen. Unter den gegebenen Möglichkeiten DNA-Sequenzen zu synthetisieren, können spezifische Polypeptide durch künstliche Klone codiert werden und für spezielle Verwendungen ausgelegt werden. Als ein Beispiel, unter der gegebenen Quervernetzungsfähigkeit der ungewöhnlichen Aminosäuren, welche durch diese Erfindung hergestellt werden, kann ein Klebstoff hergestellt werden, welcher spezifisch für ein gegebenes Substrat ist, z. B. Kohlefasern, der aufgrund der Fähigkeit der ungewöhnlichen Aminosäuren, erzeugt durch Modifikation, um kovalente Bindungen zu formen, fest an das Substrat gebunden werden kann. Die Fähigkeit der Aminosäuren erlaubt dem Designer jegliche erwünschte Menge an Hydrophobie, an Hydrophilie usw. als einen Klebstoff einzufügen, um Probleme zu überwinden, welche mit derzeit verwendeten Klebstoffen, wie beispielsweise Epoxiden, verbunden sind. Natürlich werden spezifische Anwendungen Mutationen der Leadersequenz der vorliegenden Erfindung und andere spezifische Varianten erzeugen. Solange wie diese Varianten die wesentliche biologische Funktion des Induzierens oder Assistierens bei der posttranslationalen Modifikation behalten, bleiben sie innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.

Es sollte bemerkt werden, daß eine Publikation, welche die Identifikation der Leadersequenz durch den Anmelder detailliert in Verbindung mit Sharmila Banerjee in Journal of Biological Chemistry, Volume 263, vorraussichtliches Erscheinungsdatum 5. Juli 1988, erscheinen wird.

Der exakte Mechanismus, durch welchen posttranslationale Modifikation induziert wird, ist unklar. Ohne an irgendeine Theorie gebunden zu sein, wird bemerkt, daß der Subtilinvorläufer Reste in der Leadersequenz aufweist, welche anfänglich alternieren zwischen hochhydrophiler und hochhydrophober Natur, wobei sie hoch hydrophil wird in der Nähe der strukturellen Region, welche im Gegensatz hierzu streng hydrophob ist. Dies steht im Gegensatz zu gewöhnlichen Leaderregionen für exportierte Proteine von Prokaryonten, welche im allgemeinen eine mehr hydrophobe Region aufweisen und basische Reste enthalten, nicht die sauren Reste der Erfindung. Dies schlägt vor, daß die posttranslationalen Modifikationen an einer kompartimentalisierten Stelle auftreten, welche die ungewöhnliche Leadersequenz beim Zielen oder Lenken des Vorläufers dorthin assistierte. Es wird erwartet, daß andere Proteine an dem Modifikationsmechanismus partizipieren. Enzyme, die nötig sind, um die essentiellen chemischen Reaktionen sind an oder nahe der Zellmembran lokalisiert.

Die vorliegende Erfindung wurde im spezifischen Detail unter Bezugnahme auf spezifische Proteine, Materialien und Verfahren beschrieben. Mit Ausnahme dort, wo es für die Durchführung erforderlich ist, ist weder eine Beschränkung auf diese spezifischen Materialien beabsichtigt, noch sollte eine Bestimmung, außerhalb der expliziten Beschränkungen der Ansprüche, die hieran angehängt sind, erfaßt werden. Insbesondere wird ins Auge gefaßt, daß die Verwendung der Leadersequenz der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit augenscheinlich jedem prokaryontischen Expressionsvehikel, insbesondere Bakterien, erfaßt ist.


Anspruch[de]

1. Ein Gen-Leader-Fragment welches für eine Peptid-Leader-Sequenz codiert, die eine posttranslationale Modifikation von Aminosäuren induziert, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Cys, Ser, Thr, wobei das Fragment die Sequenz aufweist:

2. Ein Polypeptid, welches, wenn es als ein Leader an einen Proteinvorläufer, der einer posttranslationalen Modifikation unterliegt, angehängt ist, bei der Induzierung dieser Modifikation hilft, mit der Aminosäuresequenz:

3. Ein Vorläuferpeptid welches, wenn es in Bakterien exprimiert wir d, nach der Translation in das Protein Nisin umgewandelt wird, wobei der Vorläufer die folgende Sequenz von Resten aufweist:







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