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Dokumentenidentifikation DE68929033T2 30.12.1999
EP-Veröffentlichungsnummer 0626169
Titel Dosierungsform die ein Antigen und eine Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterols enthält
Anmelder The Liposome Co.,Inc., Princeton, N.J., US
Erfinder Popescu, Mircea C., Plainsboro, New Jersey 08536, US;
Recine, Marie S., Hamilton Twp., New Jersey 08690, US;
Alving, Carl L., Bethesday, Maryland 20817, US;
Estis, Leonard F., Upton, Massachusetts 01568, US;
Keyes, Lynn D., Upton, Massachusetts 01568, US;
Janoff, Andrew S., Yardley, Pennsylvania 19067, US
Vertreter Türk, Gille, Hrabal, Struck, 40593 Düsseldorf
DE-Aktenzeichen 68929033
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 25.08.1989
EP-Aktenzeichen 942018441
EP-Offenlegungsdatum 30.11.1994
EP date of grant 14.07.1999
Veröffentlichungstag im Patentblatt 30.12.1999
IPC-Hauptklasse A61K 39/145
IPC-Nebenklasse A61K 9/127   A61K 39/39   

Beschreibung[de]
Anwendungsgebiet der Erfindung

Diese Erfindung auf dem Gebiet der Impfstoffe befaßt sich mit einer Dosierungsform zur Immunisierung gegen Influenza, die umfaßt ein Liposom und ein Influenza-Antigen, insbesondere das Hämagglutinin- oder Bromelain-Fragment, wobei das Liposom und das Antigen in einer immunisierenden Dosis vorliegen. Außerdem befaßt sich die Erfindung mit einer Dosierungsform einschließlich einer solchen Form, die insbesondere geeignet ist für die Erzeugung einer Immunantwort, die umfaßt eine Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterols (Sterins) und eines Antigens, worin das organische Säurederivat eines Sterols und das Antigen in einer Immunisierungsdosis vorhanden sind und ein Verfahren zur Anwendung. Darüber hinaus eine Dosierungsform, einschließlich einer solchen Form, die insbesondere geeignet ist für die Erzeugung einer Immunantwort, die umfaßt Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC)/Cholesterin-Liposome, die gegebenenfalls in einem Aluminiumhydroxid-Gel vorliegen, und ein Antigen, wobei das DMPC/Cholesterin und das Antigen in einer immunisierenden Dosis vorliegen, sowie ein Anwendungsverfahren.

Hintergrund der Erfindung

Auf dem Gebiet der Impfstoffe werden Antigene in der Weise in einen Organismus eingeführt, daß sie eine Immunantwort in dem Wirtsorganismus stimulierert. Die Induktion einer Immunantwort hängt von vielen Faktoren ab, zu denen gehören, wie angenommen wird, die chemische Zusammensetzung und die Konfiguration des Antigens, die immunogene Konstitution des immungetesteten Organismus und die Art und Dauer der Verabreichung des Antigens. Eine Im munantwort weist viele Facetten auf, von denen einige die Zellen des Immunsystems sind (z. B. B-Lymphozyten, T-Lymphozyten, Makrophagen und Plasmazellen). Die Zellen des Immunsystems können an der Immunantwort teilnehmen durch Wechselwirkung mit dem Antigen, durch Wechselwirkung mit anderen Zellen des Immunsystems, durch die Freisetzung von Cytokinen und durch die Reaktionsfähigkeit dieser Cytokine. Die Immunantwort wird üblicherweise (jedoch willkürlich) in zwei Hauptkategorien unterteilt - in eine humorale und in eine durch Zellen vermittelte Immunantwort. Die humorale Komponente der Immunantwort umfaßt die Bildung von für das Antigen spezifischen Immunglobulinen. Die durch Zellen vermittelte Komponente umfaßt die Erzeugung einer Hypersensibilität vom verzögerten Typ und die Bildung von für das Antigen cytotoxischen Effektor-Zellen.

In einigen Fällen ist die Immunantwort das Ergebnis einer Anfangs- oder Primär-Dosis eines Antigens, auf die eine oder mehr Booster-Verabreichungen gegenüber dem Antigen folgen. Die Primär-Behandlung mit verhältnismäßig starken Immunogenen und Liposomen wird diskutiert in "Liposomal Enhancement of the Immunogenicity of Adenovirus Type 5 Hexon and Fiber Vaccines" von W.J. Kramp et al. in "Infection and Immunity", 25: 771-773 (1979), und in "Liposomes as Adjuvants with Immunopurified Tetanus Toxoid: the Immune Response" von D. Davis et al. in "Immunology Letters", 14: 341-348 (1986/1987).

Im Idealfall weist ein Antigen zwei Eigenschaften auf, die Fähigkeit, die Bildung der entsprechenden Antikörper zu stimulieren, und die Neigung, mit diesen Antikörpern spezifisch zu reagieren. Immunogene tragen ein oder mehr Epitope, die den kleinsten Teil eines Antigens darstellen, der von der Kombinierungs(Bindungs)stelle eines Antikörpers oder Immunglobulins erkannt werden kann.

Bei speziellen Antigenen oder Fraktionen von Antigenen oder bei speziellen Präsentationsbedingungen ist die durch das gewünschte Antigen ausgelöste Immunantwort unzureichend oder nicht vorhanden und es wird eine unzurei chende Immunität erzeugt. Dies ist insbesondere der Fall, wenn Peptid oder andere kleine Moleküle als Immunogene verwendet werden.

In diesen Fällen ist es auf dem Impfsektor bekannt, Substanzen, als Adjuvantien bezeichnet, zu verwenden zur Potenzierung einer Immunantwort, wenn diese in Verbindung mit einem Antigen verwendet werden. Adjuvantien werden außerdem verwendet zur früheren Auslösung einer Immunantwort oder einer stärkeren Immunantwort oder mit weniger Antigen oder zur Steigerung der Bildung von bestimmten Antikörper- Unterklassen, die einen immunologischen Schutz ergeben, oder zur Verstärkung der Komponenten der Immunantwort (z. B. humoral, zellulär).

Bekannte Adjuvantien sind die Freund-Adjuvantien (und andere Ölemulsionen), Bortedella pertussis, Aluminiumsalze (und andere Metallsalze), mycobakterielle Produkte (einschließlich Muramyldipeptide) und Liposome. Der hier verwendete Ausdruck "Adjuvans" ist so zu verstehen, daß er für eine Substanz oder ein Material steht, die (das) zusammen mit oder in Verbindung mit einem Antigen verabreicht wird, das die Immunantwort gegenüber diesem Antigen verstärkt. Adjuvantien können in einer Reihe von Formen vorliegen, beispielsweise als Emulsion (z. B. das Freund- Adjuvans), als Gele (Aluminiumhydroxid-Gel) und als Teilchen (Liposome) oder als festes Material. Liposomen-Impfstoffe und der Adjuvans-Effekt sind in der WO 90 O1 947 weiter diskutiert, auf deren Lehre hier Bezug genommen wird.

Es wird angenommen, daß die Adjuvans-Aktivität durch eine Reihe von Faktoren bewirkt werden kann. Zu diesen Faktoren gehören (a) ein Träger-Effekt, (b) eine Depot- Bildung, (c) eine geänderte Lymphozyten-Rezirkulation, (d) eine Stimulierung von T-Lymphozyten, (e) eine direkte Stimulierung von B-Lymphozyten und (f) die Stimulierung von Makrophagen.

Bei vielen Adjuvantien treten nachteilige Reaktionen auf. In einigen Fällen umfassen die nachteiligen Reaktionen eine Granulom-Bildung an der Injektionsstelle, eine starke Entzündung an der Injektionsstelle, eine Pyrogenizität, eine durch das Adjuvans induzierte Arthritits oder eine andere Autoimmun-Antwort oder eine onkogene Antwort. Diese Reaktionen haben die Verwendung von Adjuvantien, beispielsweise des Freund-Adjuvans, bisher verhindert.

Bei speziellen Ausführungsformen bestehen Adjuvantien aus Liposomen. In dem US-Patent Nr. 4 05 3 585 (Allison et al., erteilt am 17.10.77) ist angegeben, daß Liposome mit einer speziellen Ladung Adjuvantien sind. Davis et al. beschreiben in "Liposomes as Adjuvants with Immunopurified Tetanus Toxoid: Influence of Liposomal Characteristics" in "Immunology" 61: 229-234 (1987), und G. Gregoriadis et al. beschrieben in "Liposomes as Immunological Adjuvants: Antigen Incorporation Studies" in "Vaccine", 5 : 145-151 (1987), DMPC/Cholesterin-Liposome (1 : 1) und Antigen, die eine minimal verbesserte (gegenüber freiem Antigen) Immunantwort ergeben, in kleinen unilamellaren Vesikeln eines unterschiedlichen Dehydratisierungs-/Rehydratisierungs-Typs mit Tetanustoxoid aus dem Antigen, einem starken Immunogen. In den Artikeln von Davis und Gregoriadis war die liposomale immunogene Antwort nur minimal unterscheidbar von der Antwort auf das freie Antigen. Um die liposomale von der freien Antigen-Antwort zu unterscheiden, war es für die Autoren erforderlich, das Tetanus-Toxoid auf minimale Ansprech-Mengen zu verdünnen. Erfindungsgemäß werden Bedingungen von DMPC/Cholesterin-Liposomen angewendet, die eine therapeutisch wirksame immunologische Antwort (Ansprechempfindlichkeit) ergeben.

Es können auch andere Substanzen, z. B. Immunmodulatoren (wie Cytokine, beispielsweise die Interleukine) in Adjuvantien/Impfstoffen kombiniert werden.

Die humorale Immunantwort kann nach vielen bekannten Methoden bestimmt werden. Der einzelne radiale Immundiffusions-Assay (SRID), der Enzym-Immunoassay (EIA) und der Hämagglutinations-Inhibierungs-Assay (HAI) sind nur einige wenige der üblicherweise angewendeten Assays zur Bestimmung der humoralen Immunantwort.

In SRID wird eine Schicht aus einem Gel, z. B. aus Agarose, verwendet, die das zu testende Immunogen enthält. In dem Gel wird eine Vertiefung erzeugt und das zu testende Serum wird in die Vertiefung eingebracht. Die Diffusion des Antikörpers aus dieser heraus in das Gel führt zur Bildung eines Präzipitationsringes, dessen Fläche proportional zur Konzentration des Antikörpers in dem zu untersuchenden Serum ist.

Der EIA, auch bekannt als ELISA (Enzym-gebundener Immunoassay) wird angewendet zur Bestimmung der gesamten Antikörper in einer Probe. Das Antigen wird an der Oberfläche einer Mikrotiter -Platte adsorbiert. Das Testserum wird der Platte ausgesetzt, woran sich ein Enzym-gebundenes Immunglobulin wie IgG anschließt. Die an der Platte haftende Enzymaktivität wird quantitativ bestimmt auf irgendeine geeignete Weise, beispielsweise durch Spektrophotometrie, und sie ist proportional zur Konzentration des Antikörpers, der gegen das in der Testprobe vorhandene Antigen gerichtet ist.

Bei dem HAI wird die Fähigkeit eines Antigens, beispielsweise von Virus-Proteinen, rote Blutkörperchen von Hühnern oder dgl. zu agglutinieren, ausgenutzt. Der Assay weist neutralisierende Antikörper, d. h. solche Antikörper nach, die in der Lage sind, die Hämagglutination zu inhibieren. Verdünnungen des Testserums werden mit einer Standardkonzentration des Antigens inkubiert, danach werden rote Blutkörperchen zugegeben. Die Anwesenheit von neutralisierenden Antikörpern inhibiert die Agglutination der roten Blutkörperchen durch das Antigen. Die Tests zur Bestimmung der allergischen und zellulären Immunantwort umfassen die Bestimmung einer Hypersensibilität vom verzögerten Typ oder die Bestimmung der Proliferations-Antwort von Lymphozyten auf ein Ziel-Antigen.

Liposome sind vollständig geschlossene Doppelschicht- Lipidmembranen, die ein eingeschlossenes wäßriges Volumen enthalten. Liposome können sein unilamellare Vesikula (Bläschen) (die eine einzige Doppelschicht-Membran aufweisen) oder multilamellare Vesikula (die zwiebelartige Strukturen aufweisen, die charakterisiert sind durch Mehrfachmembran-Doppelschichten, die jeweils durch eine wäßrige Schicht von der nächsten getrennt sind) Die Doppelschicht besteht aus zwei Lipid-Monoschichten mit einem hydrophoben "Schwanz"-Bereich und einem hydrophilen "Kopf"- Bereich. Die Struktur der Membran-Doppelschicht ist so, daß die hydrophoben (nicht-polaren) "Schwänze" der Lipid- Monoschichten auf das Zentrum der Doppelschicht ausgerichtet sind, während der hydrophile "Kopf" auf die wäßrige Phase ausgerichtet ist.

Die ursprüngliche Liposom-Herstellung nach Bangham et al in "J. Mol. Biol.", 1965, 13: 238-252, umfaßt das Suspendieren von Phospholipiden in einem organischen Lösungsmittel, das dann zur Trockne eingedampft wird, wobei ein Phospholipid-Film auf dem Reaktionsbehälter zurückbleibt. Danach wird eine geeignete Menge einer wäßrigen Phase zugegeben und die Mischung wird "aufquellen" gelassen und die resultierenden Liposome, die aus multilamellaren Vesikula (MLVs) bestehen, werden auf mechanische Weise dispergiert. Dieses Verfahren stellt die Basis dar für die Entwicklung von kleinen, mit Ultraschall behandelten unilamellaren Vesikula, wie sie von Papahadjopoulos et al. in "Biochim. Biophys. Acta", 1968, 135: 624-638, beschrieben sind, und von großen unilamellaren Vesikula. Kleine unilamellare Vesikula haben einen Durchmesser von etwa 100 nm oder weniger.

Unilamellare Vesikula können hergestellt werden unter Verwendung einer Extrusions-Apparatur nach einem Verfahren, wie es von Cullis et al. in der PCT-Anmeldung Nr. WO 87/00238, publiziert am 16. Januar 1986 unter dem Titel "Extrusion Technique for Producing Unilamellar Vesicles", beschrieben ist, auf die hier Bezug genommen wird. Die nach diesem Verfahren hergestellten Vesikula, als LUVETs bezeichnet, werden unter Druck einmal oder mehrfach durch einen Membranfilter extrudiert. Es ist klar, daß LUVETs in dem Ausdruck "unilamellares Vesikulum" enthalten sind.

Eine andere Klasse von multilamellaren Liposomen sind diejenigen, die als solche charakterisiert sind, die eine im wesentlichen gleichmäßige lamellare Verteilung des gelösten Stoffes aufweisen. Diese Klasse von Liposomen wird bezeichnet als stabile plurilamellare Vesikula (SPLV) gemäß der Definition in dem US-Patent Nr. 4 522 803 (Lenk et al.), als einphasige Vesikula, wie in dem US-Patent Nr. 4 588 578 (Fountain et al.) beschrieben, und als eingefrorene und aufgetaute multilamellare Vesikula (FATMLV), wobei die Vesikula mindestens einem Einfrier- und Auftau- Cyclus ausgesetzt werden; dieses Verfahren wird von Bally et al. in der PCT-Publikation Nr. 87/00043, 15. Januar 1987, unter dem Titel "Multilamellar Liposomes Having Improved Trapping Efficiencies" beschrieben. In dem US-Patent Nr. 4 721 612 (Janoff et al.) sind steroidale Liposome für die verschiedensten Verwendungszwecke beschrieben. Auf die Lehren dieser Druckschriften bezüglich der Präzipitation und Verwendung der Liposome wird hier Bezug genommen.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß einem Aspekt betrifft diese Erfindung eine Influenza-Immunisierungs-Dosierungsform, die umfaßt ein Liposom und ein Influenza-Antigen, wobei das genannte Liposom und das genannte Antigen in einer Immunisierungsdosis vorliegen. Bei einer speziellen Ausführungsform umfaßt das Antigen das Hämagglutinin-Fragment oder das Bromelain-Fragment. Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfaßt das Liposom eine Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterols (Sterins). Bei einer bestimmten Dosierungsform ist das Antigen in das Liposom, vorzugsweise ein multilamellares Vesikulum und weiter bevorzugt von mindestens etwa I Mikron Durchmesser, eingeschlossen. Ein besonders vorteilhaftes Liposom umfaßt die Form eines Tris(hydroxymethyl)aminomethansalzes eines organischen Säurederivats eines Sterols. Ein weiteres, besonders vorteilhaftes (nützliches) Liposom enthält DMPC/Cholesterin, wobei besonders bevorzugt ist ein Molverhältnis DMPC:Cholesterin von etwa 80 bis etwa 20 DMPC zu etwa 20 bis etwa 80 Cholesterin und insbesondere ein solches, in dem das genannte Verhältnis etwa 40 : 60 bis etwa 60 : 40 beträgt, und wobei außerdem das genannte Liposom ein multilamellares Vesikulum ist, beispielsweise ein solches mit einer im wesentlichen gleichen lamellaren Verteilung des gelösten Stoffes (SPLV).

Die vorliegende Erfindung umfaßt eine Dosierungsform, umfassend eine Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterols und ein Antigen, worin das organische Säurederivat eines Sterols und ein Antigen in einer Immunisierungsdosis vorliegen. Gemäß einer Ausführungsform ist die Dosierungsform ein Liposom, wie ein multilamellares Vesikulum, insbesondere solche multilamellare Vesikula von mindestens etwa 1 Mikron Durchmesser. Bei einigen Ausführungsformen ist das Antigen in das Liposom eingeschlossen.

In speziellen Ausführungsformen der Dosierungsform ist die Salzform des organischen Säurederivats eines Sterols ein Tris(hydroxymethyl)aminomethan. Gemäß anderen Ausführungsformen ist die Salzform ein Carbonsäurederivat eines Sterols (wie einer aliphatischen Carbonsäure, insbesondere solche mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen), eine Salzform eines Dicarbonsäurederivats eines Sterols (wie einer aliphatischen Dicarbonsäuren, insbesondere solche mit bis zu 7 Kohlenstoffatomen), ein Hydroxysäurederivat eines Sterols (wie Zitronensäure), ein Aminosäurederivat eines Sterols oder eine Salzform eines Polyaminosäurederivats eines Sterols, oder eine Salzform eines Polycarbonsäurederivats eines Sterols.

Gemäß einer Ausführungsform der Dosierungsform ist die aliphatische Dicarbonsäure Bernsteinsäure bzw. ein Succinat.

In speziellen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Dosierungsform ist das Immunogen ausgewählt aus der Gruppe von Proteinen, Peptiden, Polysacchariden, Nukleinsäuren, Lipiden, Glykolipiden, Lipoproteinen, Lipopolysacchariden, synthetischen Peptiden oder Bakterienfraktionen, Virusfraktionen, Protozoenfraktionen, Gewebefraktionen oder Zellfraktionen. Spezifische Antigene sind Influenzafraktionen, wie Hämagglutinin, Parainfluenza 3 (Fusion und Hämagglutinin-Neuraminidase), Malariasporozoiten-Fraktionen, Hepatitis (A, B und nicht-A/nicht-B)-Fraktionen, Meningococcus-Fraktionen, HIV-Fraktionen (alle Stämme) und Melanomfraktionen.

Die erfindungsgemäße Dosierungsform kann darüber hinaus einen Immunmodulator enthalten, wie ein Cytokin (z. B. Interferone, Faktoren, die von Thrombocyten stammen, Monokine und Lymphokine, wie IL2).

Ein weiteres Merkmal der Erfindung ist eine Zusammensetzung zur Potenzierung einer Immunantwort in einem Tier, einschließlich Mensch, umfassend eine Immunisierungsdosis einer Zusammensetzung, umfassend ein organisches Säurederivat eines Sterols und ein Antigen. Eine Ausführungsform der Zusammensetzung zur Potenzierung der Immunantwort umfaßt ein Liposom, wie ein multilamellares Vesikulum, insbesondere solche multilamellare Vesikula von mindestens etwa 1 Mikron Durchmesser. In einigen Ausführungsformen ist das Antigen in das Liposom eingeschlossen.

In speziellen Ausführungsformen dieser Zusammensetzung zur Potenzierung von Immunantworten umfaßt die Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterols Tris(hydroxymethyl)aminomethan. In anderen Ausführungsformen ist die Salzform ein Carbonsäurederivat eines Sterols (wie einer aliphatischen Carbonsäure, insbesondere solche mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen), eine Salzform eines Dicarbonsäurederivats eines Sterols (wie einer aliphatischen Dicarbonsäure, insbesondere solche mit bis zu 7 Kohlenstoffatomen), ein Hydroxysäurederivat eines Sterols (wie Zitronensäure), ein Aminsäurederivat eines Sterols oder eine Salzform eines Polyaminosäurederivats eines Sterols, oder eine Salzform eines Polycarbonsäurederivats eines Sterols.

In einer Ausführungsform der Zusammensetzung zur Potenzierung einer Immunantwort ist die aliphatische Dicarbonsäure Bernsteinsäure bzw. ein Succinat.

In speziellen Ausführungsformen der Zusammensetzung zur Potenzierung einer Immunantwort gemäß der Erfindung wird das Antigen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Proteine, Peptide, Polysaccharide, Nukleinsäuren, Lipide, Glykolipide, Lipoproteine, Lipopolysaccharide, synthetische Peptide oder Bakterienfraktionen, Virusfraktionen, Protozoenfraktionen, Gewebefraktionen oder Zellfraktionen.

Die Zusammensetzung zur Potenzierung einer Immunantwort gemäß der Erfindung kann auch einen Immunmodulator, wie ein Cytokin, umfassen.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfaßt eine Zusammensetzung zur Potenzierung einer Immunantwort in einem Tier, einschließlich Mensch, umfassend die Anwendung eines Adjuvans, worin das Adjuvans eine Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterols umfaßt.

In speziellen Ausführungsformen dieser Zusammensetzung zur Potenzierung der Immunantwort unter Verwendung eines Adjuvans wird die Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterols, bei dem es sich um ein Tris(hydroxymethyl)aminomethan- oder Natrium-Salz handelt, umfaßt. Andere Ausführungsform der Salzform sind ein Carbonsäurederivat eines Sterols (wie einer aliphatischen Carbonsäure, insbesondere solche mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen), eine Salzform eines Dicarbonsäurederivats eines Sterols (wie einer aliphatischen Dicarbonsäure, insbesondere solche mit bis zu 7 Kohlenstoffatomen), ein Hydroxysäurederivat eines Sterols (wie Zitronensäure), ein Aminosäurederivat eines Sterols oder eine Salzform eines Polyaminosäurederivats eines Sterols oder eine Salzform eines Polycarbonsäurederivats eines Sterols.

In einer Ausführungsform der Zusammensetzung zur Potenzierung einer Immunantwort ist die aliphatische Dicarbonsäure Bernsteinsäure bzw. ein Succinat.

Die Erfindung betrifft außerdem eine Zusammensetzung zur Primärbehandlung (Auslösung) einer Immunantwort in einem Tier, einschließlich Mensch, umfassend eine Primär- bzw. eine Auslösungs-Immunisierungsdosis einer Zusammensetzung, umfassend ein Liposomadjuvans - jegliche Art von Liposom - und insbesondere ein Liposom, das ein organisches Säurederivat eines Sterols ist und ein Adjuvans-obligatorisches Immunogen, derart, daß die Verabreichung einer Verstärkerdosis von Adjuvans ohne Adjuvans- obligatorisches Immunogen die Immunantwort weiter potentiert. Die Zusammensetzung zur Auslösung einer Immunantwort bei einem Tier umfaßt gemäß einer speziellen Ausführungsform eine Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterols, worin die Salzform eine Tris(hydroxymethyl)aminomethan- oder Natrium-Salzform ist, von einem organischen Säurederivat eines Sterols. Die Auslösung unter Verwendung eines Immunogens, das in Abwesenheit eines Adjuvans keine Immunantwort ergeben würde, wird durch diese Ausführungsform insbesondere einbezogen.

Gemäß weiteren Ausführungsformen der Zusammensetzung zur Auslösung einer Immunantwort bei Tieren ist die Salzform ein Carbonsäurederivat eines Sterols (wie einer aliphatischen Carbonsäure, insbesondere solche mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen), eine Salzform eines Dicarbonsäurederivats eines Sterols (wie einer aliphatischen Dicarbonsäure, insbesondere solche mit bis zu 7 Kohlenstoffatomen), ein Hydroxysäurederivat eines Sterols (wie Zitronensäure), ein Aminosäurederivat eines Sterols oder eine Salzform eines Polyaminosäurederivats eines Sterols, oder eine Salzform eines Polycarbonsäurederivats eines Sterols. Zusätzlich werden SPLV-Liposome oder multilamellare Liposome, insbesondere solche von etwa 1 Mikron verwendet, sowie Liposome, die Phosphatidylcholin, Cholesterin, Phosphatidylserin oder Phosphatidylethanolamin umfassen. Eine bevorzugte Ausführungsform der Verfahrensweise zur Auslösung umfaßt weiter die Immunisierung eines ausgelösten bzw. primierten Tieres durch die Stufe der Verabreichung an dieses Tier von mindestens einer Verstärkerdosis eines Adjuvans ohne Adjuvans-obligatorisches Immunogen.

Eine weitere Methode zur Immunisierung eines Tieres, einschließlich Mensch, umfaßt die Stufe der Verabreichung an ein derartiges Tier von einem therapeutisch wirksamen Immunisierungsablauf von dem mindestens ein Element in der Verabreichung einer Immunisierungsdosis einer Zusammensetzung besteht, die ein Antigen und ein organisches Säurederivat eines Sterols umfaßt. Gemäß einer Ausführungsform umfaßt die Zusammensetzung auch ein Liposom (einschließlich multilamellarer Vesikula) und vorzugsweise worin das Antigen in das Liposom eingeschlossen ist, sowie Liposome von mindestens etwa 1 Mikron Durchmesser. Bei der Anwendung dieser Methode kann die Zusammensetzung darüber hinaus eine Tris(hydroxymethyl)aminomethansalz-Form eines organischen Säurederivats eines Sterols oder eine Salzform eines Carbonsäurederivats eines Sterols, wie einer aliphatischen Carbonsäure (gegebenenfalls bis zu 5 Kohlenstoffatome), eine Salzform von einem Dicarbonsäurederivat eines Sterols, wie einer aliphatischen Dicarbonsäure, gegebenenfalls mit bis zu 7 Kohlenstoffatomen (z. B. Succinat), oder eine Salzform eines Polycarbonsäurederivats eines Sterols, umfassen. In speziellen Ausführungsformen der Methode umfaßt die Zusammensetzung darüber hinaus eine Salzform eines Hydroxysäurederivats eines Sterols, wie Zitronensäure.

Darüber hinaus umfaßt die vorliegende Erfindung eine Dosierungsform, die ein Immunogen und ein multilamellares Liposom umfaßt, das DMPC/Cholesterin in einer Immunisierungsdosis enthält, wobei eine Ausführungsform außerdem Aluminium- Adjuvantien, beispielsweise ein Aluminiumhydroxid-Gel, enthält. Bei einer Ausführungsform enthält das Liposom der Dosierungsform ein Molverhältnis von etwa 80 bis etwa 20 DMPC zu etwa 20 bis etwa 80 Cholesterin, speziell in einem Verhältnis von etwa 30 : 70 bis etwa 70 : 30 und vorzugsweise von 70 : 30. Bei spezifischen Ausführungsformen ist die multilamellare Liposom-Dosierungsform eine solche mit einer gleichmäßigen Verteilung des gelösten Stoffes (SPLV) und/ oder mit einem Durchmesser von mindestens 1 um und insbesondere ein SPLV mit einem Molverhältnis DMPC/Cholesterin von 70 : 30.

Bei speziellen Ausführungsformen wird das Antigen ausgewählt aus der Gruppe, die umfaßt Proteine, Peptide, Polysaccharide, Baktieren-Fraktionen, Virus-Fraktionen, Protozoen-Fraktionen, synthetische Peptide oder Lipopolysaccharide. Außerdem kann bei Anwendung der Methode die Dosierungsform einen Immunmodulator einschließlich eines Cytokins enthalten. Die Dosierungsform kann zusätzlich enthalten einen geeigneten pharmazeutischen Träger.

Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung zur Potenzierung einer Immunantwort bei einem Tier einschließlich des Menschen, die umfaßt eine Immunisierungsdosis einer Zusammensetzung, die enthält ein Antigen und ein multilamellares Liposom, das DMPC/Cholesterin enthält, und die gegebenenfalls außerdem enthält Aluminium-Adjuvantien, wie ein Aluminiumhydroxid- Gel. Bei einer Ausführungsform enthalten die Liposome DMPC und Cholesterin in einem Molverhältnis von etwa 80 bis etwa 20 zu etwa 20 bis etwa 80 und das Verhältnis beträgt vorzugsweise etwa 30 : 70 bis etwa 70 : 30. Bei spezifischen Ausführungsformen des Verfahrens ist das multilamellare Liposom ein solches mit einer gleichmäßigen Verteilung des gelösten Stoffes (z. B. SPLV) und/oder mit einem Durchmesser von mindestens etwa 1 um, und speziell ein 70 : 30-Molverhältnis DMPC/Cholesterin SPLV.

Bei speziellen Ausführungsformen wird das Antigen ausgewählt aus der Gruppe, die umfaßt Proteine, Peptide, Polysaccharide, Bakterienfraktionen, Virusfraktionen, Protozoenfraktionen, synthetische Peptide oder Lipopolysaccharide. Außerdem kann bei Anwendung des Verfahrens die Dosierungsform enthalten einen Immunmodulator einschließlich eines Cytokins. Außerdem kann die Dosierungsform einen geeigneten pharmazeutischen Träger enthalten.

Zusätzlich umfaßt die Erfindung eine Zusammensetzung zur Potenzierung einer Immunantwort in einem Tier, einschließlich Mensch, umfassend die Verwendung eines Adjuvans, worin das Adjuvans ein Liposom, umfassend DMPC/Cholesterin, umfaßt, und gemäß einer Ausführungsform weiter Aluminium-Adjuvantien, wie Aluminiumhydroxidgel, umfaßt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfassen die Liposome ein Molverhältnis von etwa 80 bis etwa 20 DMPC zu etwa 20 bis etwa 80 Cholesterin und insbesondere worin das Verhältnis etwa 30 : 70 bis etwa 70 : 30 beträgt. Gemäß speziellen Ausführungsformen ist das multilamellare Liposom ein SPLV und/oder hat einen Durchmesser von mindestens etwa 1 Mikron und insbesondere ein 70 : 30 DMPC/Cholesterin SPLV.

Bei speziellen Ausführungsformen wird das Antigen ausgewählt aus der Gruppe, die umfaßt Proteine, Peptide, Polysaccharide, Bakterienfraktionen, Virusfraktionen, Protozoenfraktionen, synthetische Peptide oder Lipopolysaccharide. Außerdem kann bei Anwendung des Verfahrens die Dosierungsform umfassen einen Immunmodulator einschließlich eines Cytokins. Außerdem kann die Dosierungsform einen geeigneten pharmazeutischen Träger enthalten.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist eine Zusammensetzung für die Auslösung (Primärbehandlung) einer Immunantwort bei einem Tier einschließlich eines Menschen, die umfaßt eine Primär-Immunisierungsdosis einer Zusammensetzung, die enthält ein Adjuvans, bei dem es sich um ein multilamellares Liposom handelt, das DMPC/Cholesterin und ein Adjuvans-obligatorisches Immunogen (und gegebenenfalls Aluminium-Adjuvantien, z. B. ein Aluminiumhydroxid-Gel) enthält, so daß die Verabreichung einer Booster-Dosis des Adjuvans-obligatorischen Immunogens ohne Adjuvans die Immunantwort weiter verstärkt (potenziert). Die Zusammensetzung für die Primärbehandlung umfaßt in spezifischen Fällen ein Liposom, bei dem es sich um ein multilamellares SPLV-Vesikulum handelt, und/oder ein Liposom, das einen Durchmesser von mindastens etwa 1 um hat und vorzugsweise ein Molverhältnis DMPC/Cholesterin von etwa 70 : 30 aufweist. Spezifische Immunogene der Dosierungsform und des Verfahrens sind Influenza-Fraktionen, wie Hämagglutinin, Parainfluenza 3 (Fusions- und Hämagglutinin-Neuramini dase), Malaria-Sporozoit-Fraktionen, Hepatitis(A, B und Nicht-A/Nicht-B)-Fraktionen, Meningococcus-Fraktionen, HIV-Fraktionen (alle Stämme) und Melanom-Fraktionen. Ein Verfahren, um einem Tier einschließlich des Menschen Immunität zu verleihen, umfaßt die Stufe der Verabreichung an ein solches Tier einer therapeutisch wirksamen Immunisierungssubstanz, von der mindestens ein Element in einer Immunisierungsdosis einer Zusammensetzung verabreicht wird, die umfaßt ein Antigen und/oder ein multilamellares Liposom, das DMPC/Cholesterin enthält. Gemäß einem Aspekt des Verfahrens umfaßt die Zusammensetzung außerdem ein Aluminium-Adjuvans, beispielsweise ein Aluminiumhydroxid-Gel. Bei diesem Verfahren enthält ein spezielles Liposom DMPC und Cholesterin in einem Molverhältnis von etwa 80 bis etwa 20 zu etwa 20 bis etwa 80, vorzugsweise von etwa 70 : 30 bis etwa 30 : 70, und besonders bevorzugt von etwa 70 : 30, wobei das Liposom ein solches mit einer gleichmäßigen Verteilung des gelösten Stoffes ist (z. B. SPLV) und es umfaßt das Liposom, das einen Durchmesser von mindestens etwa 1 um hat.

In der Zusammensetzung, um einem Tier Immunität zu verleihen, kann das Antigen ausgewählt werden aus der Gruppe, die umfaßt Proteine, Peptide, Polysaccharide, Bakterienfraktionen, Virusfraktionen, Protozoenfraktionen, synthetische Peptide oder Lipopolysaccharide. Die Zusammensetzung kann ferner enthalten einen Immunmodulator, beispielsweise ein Cytokin. Die Zusammensetzung kann außerdem einen geeigneten pharmazeutischen Träger enthalten.

Gemäß einem weiteren Merkmal umfaßt die Erfindung eine Dosierungsform, umfassend ein Antigen und ein Liposom, umfassend DMPC/Cholesterin 70 : 30 +/- 5 (Mol) in einer Immunisierungsdosis. Die Dosisform kann darüber hinaus Aluminium-Adjuvans, wie ein Aluminiumhydroxidgel umfassen. In einigen Ausführungsformen ist das Liposom multilamellar, wie ein SPLV, vorzugsweise von mindestens etwa 1 Mikron Durchmesser oder ein unilamellares Liposom, vorzugsweise von mindestens etwa 1 Mikron Durchmesser. In Ausführungsformen dieser Dosierungsform, die unilamellare Liposome und darüber hinaus einen Immunmodulator, wie Cytokin und einen geeigneten pharmazeutischen Träger einschließt, wird das Immunogen ausgewählt aus der Gruppe von Proteinen, Peptiden, Polysacchariden, Baktieren-Fraktionen, Viren-Fraktionen, Protozoen-Fraktionen, synthetischen Peptiden oder Lipopolysacchariden.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Zusammensetzung für die Potenzierung einer Immunantwort bei einem Tier einschließlich des Menschen, die umfaßt eine Immunisierungsdosis einer Zusammensetzung, die enthält ein Immunogen und ein Liposom, das DMPC/Cholesterin im Molverhältnis 70 : 30 ± 5 enthält. Die Zusammensetzung kann ferner ein Aluminium-Adjuvans, beispielsweise ein Aluminiumhydroxid- Gel, enthalten. Die Liposome der Zusammensetzung umfassen multilamellare Liposome, z. B. SPLVs und unilamellare Lipo some und vorzugsweise solche, in denen die Liposome einen Durchmesser von mindestens etwa 1 um haben. Bei Ausführungsformen dieser Zusammensetzung, die unilamellare Liposome umfaßt, wird das Antigen ausgewählt aus der Gruppe, die umfaßt Proteine, Peptide, Polysaccharide, Bakterienfraktionen, Virusfraktionen, Protozoenfraktionen, synthetische Peptide oder Lipopolysaccharide und sie enthalten ferner einen Immunmodulator, beispielsweise ein Cytokin, und einen geeigneten pharmazeutischen Träger.

Gemäß einem weiteren Merkmal umfaßt die Erfindung eine Zusammensetzung zur Potenzierung einer Immunantwort in einem Tier, einschließlich Mensch, umfassend die Verwendung eines Adjuvans, worin das Adjuvans ein Liposom, umfassend DMPC/Cholesterin 70 : 30 +/- 5 (Mol) umfaßt. Die Zusammensetzung kann darüber hinaus Aluminium-Adjuvans enthalten, wie Aluminiumhydroxidgel. Die Liposome des zweiten Verfahrens umfassend multilamellare Liposome, wie SPLVs und unilamellare Liposome und wobei vorzugsweise die Liposome einen Durchmesser von mindestens etwa 1 Mikron haben.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem eine Zusammensetzung für die Auslösung (Primärbehandlung) einer Immunantwort bei einem Tier einschließlich des Menschen, die umfaßt eine Primärbehandlungs-Immunisierungsdosis einer Zusammensetzung, die enthält ein Adjuvans, bei dem es sich um ein Liposom handelt, das DMPC/Cholesterin im Molverhältnis 70 : 30 ± 5 enthält, und ein Adjuvans-obligatorisches Immunogen, so daß die Verabreichung einer Booster- Dosis des Adjuvans-obligatorischen Immunogens in Abwesenheit des Adjuvans die Immunantwort verstärkt (potenziert). Die Zusammensetzung kann ferner ein Aluminium-Adjuvans, beispielsweise ein Aluminiumhydroxid-Gel, enthalten. Die Liposome der Zusammensetzung umfassen multilamellare Liposome, z. B. SPLVs und unilamellare Liposome, und vorzugsweise solche Liposome, deren Durchmesser mindestens etwa 1 um beträgt.

Ein Verfahren, um einem Tier einschließlich des Menschen Immunität zu verleihen, umfaßt die Stufe der Verabreichung an ein solches Tier einer therapeutisch wirksamen Immunisierungssubstanz, von der mindestens ein Element in einer Immunisierungsdosis einer Zusammensetzung verab reicht wird, die umfaßt ein Antigen und ein Liposom, das DMPC/Cholesterin im Molverhältnis 70 : 30 ± 5 enthält. Die Zusammensetzung des Verfahrens kann ferner ein Aluminium- Adjuvans, beispielsweise ein Aluminiumhydroxid-Gel, enthalten. Die Liposome der Zusammensetzung umfassen multilamellare Liposome, z. B. SPLVs und unilamellare Liposome und vorzugsweise solche Liposome, die einen Durchmesser von mindestens etwa 1 um haben. Ausführungsformen dieser Zusammensetzung umfassen unilamellare Liposome, in denen das Antigen ausgewählt wird aus der Gruppe, die umfaßt Proteine, Peptide, Polysaccharide, Bakterienfraktionen, Virusfraktionen, Protozoenfraktionen, synthetische Peptide oder Lipopolysaccharide und außerdem einen Immunmodulator, wie ein Cytokin, und einen geeigneten pharmazeutischen Träger.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Es wurde nun gefunden, daß diese erfindungsgemäßen Adjuvantien umfassen eine Influenza-Immunisierungsdosierungsform, die ein Liposom und ein Influenza-Antigen enthält, wobei das Liposom und das Antigen in einer Immunisierungsdosis vorliegen. Diese Influenza-Antigene sind das Hämagglutinin-Fragment oder das Bromelain-Fragment.

Außerdem wurde nun gefunden, daß (i) Salzformen von organischen Säurederivaten von Sterolen besonders geeignete pharmazeutische Adjuvantien (und insbesondere in der Form von Liposomen) sind und daß (ii) DMPC/Cholesterin-Liposome (insbesondere multilamellare Liposome) besonders vorteilhafte (nützliche) pharmazeutische Adjuvantien sind (diese Adjuvantien werden zweckmäßig in Aluminiumhydroxid-Gelen verwendet). Weiter bevorzugt sind DMPC/Cholesterin-Liposome, sowohl multilamellare als auch unilamellare, in denen das DMPC/Cholesterin-Molverhältnis 70 : 30 ± 5 beträgt.

Die zur Definition der Prinzipien in der Immunologie verwendeten verschiedenen Ausdrücke sind häufig unklar definiert oder sie werden anderweitig mißbräuchlich verwendet. Zur Klärung werden bei der Diskussion der Erfindung die folgenden Definitionen verwendet:

Unter einem "Antigen" ist eine Substanz oder ein Material zu verstehen, die (das) von einem Antikörper spezifisch erkannt wird und/oder sich mit einem Antikörper vereinigt (kombiniert).

Unter einem "Adjuvans" ist eine Substanz oder ein Material zu verstehen, die (das) eine Immunantwort potenziert, wenn sie(es) in Konjunktion mit einem Antigen verwendet wird. Adjuvantien werden außerdem verwendet, um eine Immunantwort früher auszulösen oder eine Immunantwort zu verstärken oder mit weniger Antigen. Unter einem "Immunogen-obligatorischen Adjuvans" ist ein Antigen zu verstehen, das allein nicht immunogen ist, zusammen mit einem Adjuvans jedoch immunogen wird.

Unter einem "Immunogen" ist eine Substanz oder ein Material (einschließlich der Antigene) zu verstehen, die (das) in der Lage ist, allein oder in Konjunktion mit einem Adjuvans eine Immunantwort zu induzieren. Sowohl natürliche als auch synthetische Substanzen können Immunogene sein. Ein Immunogen ist allgemein ein Protein, ein Peptid, ein Polysaccharid, ein Nucleoprotein, ein Lipoprotein, ein synthetisches Polypeptid oder ein Hapten, das gebunden ist an ein Protein, ein Peptid, ein Polysaccharid, ein Nucleoprotein, ein Lipoprotein oder ein synthetisches Polypeptid oder andere Bakterien-, Viren- oder Protozoen-Fraktionen. Es ist selbstverständlich, daß der Ausdruck "immunogen" Substanzen umfaßt, die keine Immunantwort auslösen (oder nur eine therapeutisch unwirksame Immunantwort erzeugen), wenn sie nicht mit einem Adjuvans (beispielsweise kleinen Peptiden) assoziiert sind, die hier als "Adjuvans-obligatorische" Immunogene bezeichnet werden.

Unter einer "Immunantwort" ist eine spezifische Antwort des Immunsystems eines Tieres auf ein Antigen oder ein Immunogen zu verstehen. Die Immunantwort kann auch die Bildung von Antikörpern umfassen.

Unter den "Immunisierungsbedingungen" sind Faktoren zu verstehen, die eine Immunantwort beeinflussen, wie z. B. die Menge und Art des Immunogens oder des Adjuvans, das einem Tier einschließlich eines Menschen verabreicht wird, die Art der Verabreichung, die Anzahl der Inokulationen, das Intervall zwischen den Inokulationen, die Art des Tieres und sein Zustand.

Unter einem "Impfstoff" ist hier eine pharmazeutische Formulierung zu verstehen, die Immunität induzieren kann.

Unter "Immunität" ist hier ein Zustand der Resistenz eines Tieres einschließlich einer Menschen gegenüber einem Infektions-Organismus oder einer Infektions-Substanz zu verstehen. Es ist klar, daß ein Infektions-Organismus oder eine Infektions-Substanz breit definiert ist und umfaßt Parasiten, toxische Substanzen, Krebse und Zellen sowie Bakterien und Viren. Eine therapeutisch wirksame Immunisierungs-Behandlung erzeugt eine Immunantwort, beispielsweise durch Bildung von spezifischen Antikörpern und/oder einer spezifischen Reaktionsfähigkeit von Immunzellen gegenüber dem Antigen.

Unter einer "Immunisierungsdosis" ist die Menge an Antigen oder Immunogen zu verstehen, die benötigt wird, um eine Immunantwort auszulösen (zu präzipitieren). Diese Menge variiert mit der Anwesenheit und Wirksamkeit verschiedener Adjuvantien. Diese Menge variiert je nach Tier und Immunogen oder Antigen oder Adjuvans, sie liegt jedoch im allgemeinen zwischen etwa 0,1 ug/ml oder weniger als etwa 500 ug pro Inokulation. Die Immunisierungsdosis kann leicht bestimmt werden nach dem Fachmann an sich bekannten Verfahren, beispielsweise durch Durchführung statistisch signifikanter Wirtstier-Immunisierungen und Immuntest-Studien (vgl. z. B. "Manual of Clinical Immunology", H.R. Rose und H. Friedman, American Society for Microbiology, Washinton, D.C. (1980)). In einigen Fällen werden mehrere Immunisierungsdosen einschließlich Booster-Dosen verabreicht, um eine Immunität zu erzeugen, die kollektiv als "therapeutisch wirksame Immunisierungs-Behandlung" bezeichnet werden.

Unter einer "Primärbehandlung" ist die Stimulierung einer Primärantwort (im Gegensatz zu einer sekundären oder späteren Antwort) durch ein Tier auf ein Antigen zu verstehen. Die Primärantwort ist charakterisiert durch die Bildung eines Antikörpers in dem Tier gegenüber dem Antigen und im Idealfalle durch die Bildung einer Population von B-Lymphozyten und T-Lymphozyten, die auf eine sekundäre oder spätere Immunogen-Verabreichung antworten - selbst in Abwesenheit eines Adjuvans - mit einer schnellen und beträchtlichen Bildung von Antikörpern. Auf der Basis dieser Antwort erzeugen 1, 2, 3 oder mehr Booster-Dosen des Immunogens, auch in Abwesenheit eines Adjuvans, eine therapeutisch wirksame Immun-Antwort gegenüber dem Antigen.

Bei speziellen Ausführungsformen der Erfindung weisen die Liposome eine Gesamtladung auf oder sind neutral. Geladene und insbesondere negativ geladene Liposome können eine verbesserte Adjuvans-Wirkung gegenüber neutralen Liposomen aufweisen.

Eine bevorzugte Klasse von Lipiden für die Bildung von Liposomen sind solche aus Cholesterin-Hemisuccinat ("CHS"), beispielsweise solche mit Natrium ("CHSNatrium") oder Tris(hydroxymethyl)aminomethan ("CHSTris") als Gegenion, die im allgemeinen negativ geladen sind.

Bei der praktischen Durchführung der Erfindung können Salzformen eines organischen Säurederivats eines Sterins verwendet werden. Im allgemeinen kann bei der praktischen Durchführung der Erfindung irgendein Sterin, das durch die Bindung einer organischen Säure modifiziert werden kann, verwendet werden. Zu Beispielen für solche Sterine gehören, ohne daß die Erfindung darauf beschränkt ist, Cholesterin, Vitamin D, Phytosterine (einschließlich, jedoch nicht nur, Sitosterin, Campesterin, Stigmasterin und dgl.), Steroid-Hormone und dgl.

Zu Beispielen für organische Säuren, die zur Derivatisierung der Sterine (Sterole) verwendet werden können, gehören, ohne daß die Erfindung darauf beschränkt ist, Carbonsäuren, Dicarbonsäuren, Polycarbonsäuren, Hydroxysäuren, Aminosäuren und Polyaminosäuren. Da die Salzformen die Wasserlöslichkeit der organischen Säuren erhöhen, kann irgendeine beliebige organische Säure zur Deri vatisierung der Sterine (Sterole) verwendet werden; ein Vorteil kann jedoch erzielt werden, wenn der organische Säurerest selbst wasserlöslich ist. Zu solchen wasserlöslichen organischen Säureresten gehören, ohne daß die Erfindung darauf beschränkt ist, wasserlösliche aliphatische Carbonsäuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Valeriansäure und dgl. (Carbonsäuren mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen sind mit Wasser mischbar; die freie Säure mit 5 Kohlenstoffatomen ist teilweise löslich und die längerkettigen freien Säuren sind praktisch unlöslich); wasserlösliche aliphatische Dicarbonsäuren, wie Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Pimelinsäure, Maleinsäure und dgl. (die Säuren mit den kürzeren Ketten sind deutlich besser löslich in Wasser; die Grenzlöslichkeit in Wasser liegt bei C&sub6; bis C&sub7;); und wasserunlösliche aromatische Dicarbonsäuren, wie Hemimellithsäure, Trimesinsäure, Succinimid und dgl.; Polycarbonsäuren; wasserlösliche Hydroxysäuren, wie Glycolsäure, Milchsäure, Mandelsäure, Glycerinsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure und dgl. (die α-Hydroxysäuren, die eine an das α- Kohlenstoffatom der Carbonylgruppe gebundene verzweigte Kette enthalten, unterliegen weniger der Hydrolyse und sind deshalb für die praktisch Durchführung der Erfindung von Vorteil); und Aminosäuren und Polyaminosäuren. Die organische Säure kann über eine Ester- oder Ätherbindung unter Anwendung konventioneller Verfahren an eine Hydroxylgruppe des Sterins (Sterols) gebunden sein (vgl. z. B. US- Patente Nr. 3 859 047; 4 040 784; 4 042 330; 4 183 847 und 4 189 400). Die Salzformen der derivatisierten Sterine können hergestellt werden durch Auflösen sowohl des organischen Säurederivats des Sterins als auch des Gegenions des Salzes (beispielsweise der freien Base des Salzes) in einem geeigneten flüchtigen Lösungsmittel und Entfernen des Lösungsmittels durch Verdampfen oder ein ähnliches Verfahren, wobei ein Rückstand zurückbleibt, der aus der Salzform des organische Säurederivats des Sterins (Sterols) besteht.

Zu Beispielen für Gegenionen, die verwendet werden können, gehören, ohne daß die Erfindung darauf beschränkt ist, Tris, 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol, 2-Aminoethanol, Bis-tris-propan, Triethanolamin und dgl. für die Bildung des entsprechenden Salzes. Es kann nämlich auch die freie Base eines ionisierbaren bioaktiven Agens, wie z. B. die freie Miconazol-Base und dgl., als Gegenion verwendet werden. CHS bildet Liposome, wenn es einem wäßrigen Material zugesetzt wird. Dies kann zweckmäßig bei 20 bis 25ºC (Raumtemperatur) und Atmosphärendurck durchgeführt werden. Rühren beschleunigt das Verfahren der Liposom-Bildung und es wird durchgeführt unter Anwendung von Verfahren, wie Verwirbelung, Ultraschallbehandlung oder anderen Verfahren, wie sie an sich bekannt sind. Gewünschtenfalls können die resultierenden Liposome gefiltert oder klassiert werden, beispielsweise durch Hindurchleiten durch einen Filterstapel, beispielsweise einen 0,4 um oder 0,2 um-Filter (Nuclepore, Pleasanton CA). In der Regel ist eine bessere Adjuvans-Antwort zu beobachten bei größeren Lipid-Mengen. Immunogene, die sich in den Liposom-Lamellen verteilen, wie z. B. das Melanom-Antigen in CHS-Liposomen, können zu ungenügenden Immunogen-Antworten führen ohne wiederholte Inokulationen und einen zusätzlichen Immunstimulator. Ohne an irgendeine spezielle Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß diese Verteilung zur Beschränkung der äußeren Einwirkung der Epitope auf die Adjuvans- Liposome führt. Immunogene können durch Anwendung einer Reihe von an sich bekannten Verfahren modifiziert werden, beispielsweise durch Aminosäure-Addition oder -Subtraktion oder durch Konjugation mit anderen Resten.

Eine bevorzugte Klasse von Lipiden für die Bildung von Liposomen sind diejenigen von Dimyristoylphosphatidylcholin und Cholesterin (DMPC/Cholesterin").

DMPC/Cholesterin bildet über einen breiten Molmengenbereich von etwa 100 : 1 bis etwa 20 : 80 die erforderlichen multilamellaren Liposome. Besonders bevorzugt ist ein Bereich von etwa 70 : 30 bis etwa 30 : 70 und ganz be sonders bevorzugt ist ein Bereich von etwa 70 : 30. Außerdem können andere (weitere) Lipide dem DMPC/Cholesterin zugemischt werden, beispielsweise Dimyristoylphosphatidylglycerin, Dicetylphosphat, Phosphatidinsäure, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin und Cholesterinhemisuccinat ("CHS") z. B. diejenigen mit Natrium ("CHSNatrium") oder Tris(hydroxymethyl)aminomethan ("CHSTris") als Gegenion.

Aluminiumverbindungen sind allgemein bekannte Adjuvantien und dazu gehören beispielsweise Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Aluminiumoxid oder Aluminiumsulfat, und sie werden kollektiv hier als Aluminium-Adjuvantien bezeichnet. So wird beispielsweise Aluminiumhydroxid in großem Umfange in Diphtherie- und Tetanus-Toxoid-Impfstoffen sowie für Veterinär-Anwendungszwecke verwendet. Aluminiumhydroxid-Pulver bildet bei der Hydratation spontan ein Gel. Zur Herstellung eines Impfstoffes, der Aluminiumhydroxid enthält, wird üblicherweise ein Immunogen in einem wäßrigen Puffer dem vorgebildeten Gel zugesetzt. Solche Impfstoffe werden hier als Aluminium-adsorbierte Impfstoffe bezeichnet.

Multilamellare DMPC/Cholesterin-Liposome des SPLV- Verfahrens sind bevorzugt, es kann aber auch jeder andere Typ von Liposomen verwendet werden. Das SPLV-Verfahren umfaßt im allgemeinen die Rotationsverdampfung von Lipiden in Lösungsmitteln in einem Rundkolben unter Bildung eines dünnen Films. Der Lipidfilm wird dann in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, beispielsweise einem Äther oder Methylenchlorid, dispergiert, dem die wäßrige Lösung (die das Immunogen enthält) dann zugesetzt wird. Die Mischung wird dann mit Ultraschall behandelt, während sie mittels eines Stickstoffgasstromes getrocknet wird, der das organische Lösungsmittel abtreibt. Die resultierende Liposom-Paste wird in einem wäßrigen Puffer wieder suspendiert. In dem US-Patent Nr. 4 522 803 (Lenk et al.) ist dieses Verfahren näher beschrieben, auf das hier Bezug genommen wird. Gewünschtenfalls können die resultierenden Liposome gefiltert oder klassiert werden, beispielsweise durch Hindurchführen durch einen Filterstapel, beispielsweise einen 0,4 um oder 0,2 um-Filter (Nuclepore, Pleasanton, CA).

Die resultierenden Liposome werden zweckmäßig in einem wäßrigen Material verabreicht. Das Volumen des wäßrigen Materials variiert in Abhängigkeit von dem jeweils zu verabreichenden Liposom und ist nicht kritisch. Im allgemeinen sind etwa 0,5 ml ein geeignetes Liposom- Dosierungsvolumen. In der Regel ist eine bessere Adjuvans- Antwort zu beobachten bei höheren Lipidmengen.

Ein geeignetes wäßriges Material für Sterin- oder DMPS/Cholesterin-Liposome ist eine Salzlösung, ein Phosphatpuffer oder ein anderes der bekannten wäßrigen pharmazeutischen Verdünnungsmittel.

Diese Liposome sind zweckmäßig mit einer immunogenen Menge des Antigens oder Immunogens assoziiert. Diese Assoziation wird erreicht durch Mischen, Adsorption, Einkapselung, gleichzeitige Bildung oder andere Verfahren, wie sie an sich bekannt sind.

Der erfindungsgemäße Adjuvans-Effekt ist aus den Ergebnissen in den Tabellen 1, 2 und 3 in bezug auf Sterin-Liposome und aus den Tabellen 4, 5 und 6 in bezug auf DMPC/Cholesterin-Liposome und aus der Tabelle 7 sowohl in bezug auf Sterin-Liposome als auch in bezug auf DMPC/- Cholesterin-Liposome ersichtlich. In der Tabelle 1A ist zum Vergleich die Antikörper-Antwort bei Meerschweinchen angegeben, die mit Influenza B/Ann Arbor-Hämagglutinin (HA) allein oder mit Formulierungen mit CHSTris-Liposomen immunisiert worden sind. HA ruft einen speziellen Wert, der Antikörper-Antwort ohne Adjuvans hervor, diese Antwort wird jedoch durch das Adjuvans verbessert. CHSTris-Liposome potenzieren diese Antikörper-Bildung, wie aus den Ergebnissen zu ersehen ist. Insbesondere neutralisierende Antikörper-Antworten, wie durch HAI nachgewiesen, auf 5 ug oder 0,5 ug HA werden bis auf etwa das 50-fache bzw. 70- fache verstärkt, wenn HA zusammen mit dem steroidalen Adjuvans verabreicht wird.

In der Tabelle 1B ist die Antikörper-Antwort bei Meerschweinchen angegeben, die mit dem Bromelain-Fragment von HA (HAB) in verschiedenen Formulierungen immunisiert worden sind. HAB ist im allgemeinen nicht immunogen, wenn es allein verabreicht wird, und es ist beispielsweise ein Adjuvans-obligatorisches Immunogen. Die Verwendung eines steroidalen Adjuvans bei der Bildung von CHS verbessert die Immunantwort auf den gleichen Wert oder einen besseren Wert als mit einem vollständigen Freund-Adjuvans, insbesondere die Bildung von schützenden neutralisierenden Antikörpern, wie durch HAI nachgewiesen. Diese Steigerung kann etwa 1400-fach sein. Außerdem wird durch Erhöhung der Menge an Adjuvans die Immun-Antwort verbessert.

Die Tabelle 2 zeigt die Bedeutung der Primärbehandlung bei der Erzeugung der Immun-Antwort. HAB erzeugt, wie zu sehen ist, eine schwache Immun-Antwort, die bei einer Sekundär-Behandlung nicht stark potenziert wird, selbst mit dem erfindungsgemäßen Adjuvans. Wenn jedoch HAB in Assoziation mit dem erfindungsgemäßen Adjuvans verabreicht wird, hier in Form eines CHSTris-Liposoms, wird bei Anwendung einer zweiten Inokulation von HAB, hier in Lösung, eine beträchtliche Immunantwort erzeugt. Ein wichtiger Aspekt dieser Erfindung besteht darin, daß die Primärbehandlung des Tieres mit einer immunogenen Dosis des Adjuvans-obligatorischen Immunogens und eines Adjuvans spätere Booster-Dosen erlaubt, die hochwirksam sind, wobei diese Booster-Dosen kein Adjuvans enthielten, sondern lediglich ein Adjuvans-obligatorisches Immunogen in Lösung waren. Die Primärauslösung der Immunantwort mit dem erfindungsgemäßen Adjuvans erlaubt Booster-Verabreichungen eines Adjuvans-obligatorischen Immunogens ohne Adjuvans, selbst wenn dieses Immunogen ursprünglich keine Immunantwort hervorrief ohne gleichzeitige Verabreichung eines Adjuvans. Bei dieser Ausführungsform der Erfindung ist es wichtig, daß jedes beliebige Liposom als Primär-Adjuvans verwendet wer den kann, nicht jedoch gerade steroidale Liposome, für die Verwendung zusammen mit Adjuvans-obligatorischen Immunogenen.

Die Tabelle 3 zeigt, daß bessere Ergebnisse erhalten werden, wenn das Antigen in einem erfindungsgemäßen Adjuvans-Liposom eingeschlossen und nicht lediglich mit dem Adjuvans-Liposom gemischt ist. Dies gilt insbesondere, wenn die Primär-Antwort betrachtet wird. Die Tabelle 3 zeigt in Verbindung mit den Daten der Tabelle 2, daß das Einfangen ein Potentiator für die Primär-Antwort ist, noch mehr als ein Potentiator für die Sekundär-Antwort. Die Tabelle 3 zeigt außerdem, daß ein Übergang der Salzzusammensetzung von Tris zu Natrium den Adjuvans-Effekt, der durch CHS-Liposome hervorgerufen wird, nicht verändert.

In der Tabelle 4 ist die Antikörper-Antwort bei Meerschweinchen, die mit dem Bromelain-Fragment von Influenza B/Ann Arbor-Hämagglutinin (HAB) in verschiedenen Formen immunisiert worden sind, vergleichend dargestellt. HAB ist ein Adjuvans-obligatorisches Immunogen, weil es schwach immunogen ist, wenn es allein verabreicht wird oder wenn es zusammen mit Aluminiumhydroxid-Gel verabreicht wird. Die Immunogenizität wird stark erhöht, wenn HAB in verschiedenen Molverhältnissen und Lipid-Konzentrationen innerhalb von DMPC/Cholesterin-SPLVs eingeschlossen ist. Die Gesamtheit der Anti-HA-IgG-Antworten, nachgewiesen durch EIA, werden bis auf das 5000-fache erhöht und die schützenden neutralisierenden Antikörper, nachgewiesen durch HAI, werden 6 Wochen nach der Verabreichung von HAB in DMPC/Cholesterin-SPLVs in Molverhältnissen von 30 : 70 bzw. 70 : 30 bis auf das 35-fache erhöht. Die Erhöhung der Lipidkonzentration führt auch zu einer Zunahme des Adjuvans-Effekts, wie mit Formulierungen mit einem Molverhältnis von 50 : 50 gezeigt wurde.

Die Tabelle 5 zeigt den Adjuvans-Effekt von DMPC/Cholesterin-SPLVs (Molverhältnis 70 : 30) auf Influenza B/Ann Arbor-Hämagglutinin (HA). HA, das in freier Form verabreicht wird, ist ein verhältnismäßig gutes Immunogen bei einer Dosis von 5 ug, es ruft jedoch einen niedrigen Antikörper-Titer hervor, wenn es in einer Dosis von 0,5 ug verabreicht wird. Liposomales HA ergibt bei diesen beiden Dosierungen Antworten, die bis zu 80-mal stärker sind als das freie HA.

Die Tabelle 6 zeigt den Adjuvans-Effekt von DMPC/Cholesterin-SPLVs und Aluminiumhydroxid-Gel. Wie aus der Tabelle 6 (Versuch 1) ersichtlich, führt die Verabreichung von HAB mit DMPC/Cholesterin-Liposomen (200 mg Lipid-Ausgangskonzentration) zu einer starken Anti-HA IgG- Antwort, die bis zu 100-fach stärker ist und sie führt zu einem HAI (neutralisierenden) Antikörper-Titer, der 10 mal höher ist als derjenige von HAB allein.

Durch Erhöhung der Lipid-Ausgangskonzentration auf 500 mg wird der Adjuvans-Effekt noch weiter verstärkt (auf das 500-fache bzw. das 30-fache). Wenn die gleichen Formulierungen zusammen mit Aluminiumhydroxid-Gel verabreicht werden, werden selbst diese hohen Titer noch auf bis zum 3-fachen erhöht. Der kombinierte Adjuvans-Effekt für Liposome und Aluminiumhydroxid ist aus der Tabelle 6, Versuch II, eindeutig ersichtlich. Wie bei dem ersten Versuch steigert liposomales HAB die Antikörper-Antworten auf bis zu dem 200-fachen gegenüber dem freien HAB (5 ug-Dosis). Die Verabreichung zusammen mit Aluminiumhydroxid-Gel erhöht beträchtlich auch diese Titer auf bis zum 5-fachen. Am erstaunlichsten ist die Beobachtung, daß dann, wenn eine Dosis von 0,5 ug liposomalem HAB zusammen mit Aluminiumhydroxid verabreicht wird, eine Antwort entsprechend 5 ug liposomalem HAB zu beobachten ist.

Die Tabelle 7 zeigt die Ergebnisse, die mit HA erhalten wurden, das für die Impfung nach der Aufspaltung (Splitting) des Influenza-Virus mit einem Detergenz verwendet wurde. Die Ergebnisse der Tabelle 7 zeigen, daß 5 mg HA in CHSTris-Liposomen einen starken Adjuvans-Effekt hervorriefen, ungeachtet dessen, ob diese Antigen-Menge in 13,6 oder in 1,9 mg Lipid eingeschlossen war. Die gleiche Beoachtung kann im Falle von DMPC/Cholesterin-Formulierungen gemacht werden.

Außerdem ergab eine 1 : 10-Verdünnung der CHSTris- Formulierung (0,5 ug HA) Titer, die um das Mehrfache höher waren als die nicht-eingeschlossene Antigen-Kontrolle bei 0,5 ug oder 5 ug HA.

Die obengenannten Ergebnisse zeigen insgesamt, daß die Herabsetzung des Lipidgehaltes in der Formulierung den Adjuvans-Effekt der Liposome nicht beeinflußt.

Aluminium-Adjuvantien werden in Formen und Mengenanteilen verwendet, die dem Fachmann auf diesem Gebiet allgemein bekannt sind. Kommerzielle Präparate von Aluminiumhydroxid-Gel, die Impfstoffe wie Tetanus-Toxoide enthalten, liegen in dem Bereich von etwa 0,2 bis etwa 1 mg Aluminium/ml. Der sichere obere Bereich ist für Human- Impfstoffe weit höher, wobei bis zu 15 mg oder mehr Aluminiumhydroxid pro Dosis bekannt sind ohne Beschränkung für Veterinär-Anwendungen.

Impfstoffe werden üblicherweise in einer Dosierungsform verabreicht. Unter einer "Dosierungsform" ist hier irgendeine pharmazeutische Form der Verabreichung eines Impfstoffes einschließlich einer subkutanen, oralen, intramuskulären und okularen Verabreichung und die Verwendung von Lebend-Impfstoffen, von geschwächten oder synthetischen oder partiellen Formen zusammen mit Adjuvantien und gegebenenfalls Immunmodulatoren wie Cytokine zu verstehen. Die Kombinationen der obengenannten Elemente werden so hergestellt, daß die Dosierungsform geeignet ist zur Erzielung einer Immun-Antwort in dem behandelten Tier einschließlich des Menschen, die so leicht und so wirksam wie möglich erfolgt.

Die Dosierungsformen einschließlich der liposomalen Dosierungsformen, die aus dem erfindungsgemäßen Verfahren resultieren, können für die Therapie bei Tieren, wie Säugetieren einschließlich des Menschen, für die Behandlung von Infektionen oder Zuständen verwendet werden, welche die Zuführung eines Immunogens in seiner bioaktiven Form erfordern. Zu diesen Zuständen gehören, ohne daß die Erfindung darauf beschränkt ist, Krankheitszustände, beispielsweise solche, die mit Impfstoffen behandelt werden können. Eine extrakorporale Behandlung von immunansprechenden Geweben kann ebenfalls in Betracht gezogen werden.

Die Dosierungsformen umfassen auch Micellenformen des Adjuvans sowie ein Adjuvans, das in ein Gel wie Aluminiumgele eingearbeitet ist, Flüssigkristalle, Pulver, Präzipitate und Lösungen. Bei speziellen Ausführungsformen kann die Dosierungsform eine Einheitsdosierungsform sein, die konfiguriert und angepaßt ist an eine Einzel-Verabreichung.

Die Art der Verabreichung der Dosierungsform kann die Stellen und Zellen in dem Organismus bestimmen, an denen die Dosierungsform zugeführt wird. Die Dosierungsformen einschließlich der Liposomen-Dosierungsformen der Erfindung können allein verabreicht werden, im allgemeinen werden sie jedoch im Gemisch mit einem pharmazeutischen Träger verabreicht, der ausgewählt wird unter Berücksichtigung des gewünschten Verabreichungsweges und der pharmazeutischen Standardpraxis. Die Dosierungsformen können parenteral, beispielsweise intramuskulär oder subkutan, injiziert werden. Die Dosierungsformen können aber auch auf oralem Wege verabreicht werden. Für die parenterale Verabreichung können sie beispielsweise in Form einer sterilen wäßrigen Lösung verwendet werden, die andere gelöste Stoffe, beispielsweise ausreichend Salze oder Glucose, um die Lösung isotonisch zu machen, enthalten kann. Es können auch andere Verwendungszwecke, je nach den speziellen Eigenschaften des Präparats, vom Fachmann in Betracht gezogen werden.

Für die Verabreichung an Menschen bei der Präventions- oder Heilbehandlung von Erkrankungszuständen, die auf die Impftherapie ansprechen, bestimmt der verschreibende Arzt letztlich die geeignete therapeutisch wirksame Dosis für einen bestimmten Human-Patienten und diese kann vari ieren in Abhängigkeit von dem Alter, dem Gewicht und der Ansprechempfindlichkeit des Individuums sowie der Art und Schwere der Erkrankung des Patienten. Die Dosierung des Antigens in einer liposomalen Dosierungsform entspricht im allgemeinen derjenigen oder ist geringer als diejenige, die für das freie Antigen verwendet wird. In einigen Fällen kann es jedoch erforderlich sein, Dosen außerhalb dieser Grenzwerte zu verabreichen.

Beispiel 1 Herstellung von Adjuvans-Liposomen mit einem Antigen

50 mg CHStris (gepulvert) wurden in ein 15 ml-Reagensglas gegeben. Es wurden 100 ul Bromelain-Fragment von HA in einem wäßrigen Puffer zugegeben (673 ug HAB, 0,01 M Phosphat-gepufferte Salzlösung in 0,9% NaCl (Gew.-%)). Die Mischung wurde über einen Zeitraum von 2 h bei 22,5 ± 2,5ºC intermittierend verwirbelt (verquirlt) und stehen gelassen, bis keine große Klumpen mehr sichtbar waren. Die resultierenden Liposome wurden dreimal in 10 ml einer wäßrigen Pufferlösung gewaschen, wobei dazwischen jeweils 15 min lang zentrifugiert wurde (10 000 UpM, J-20-Rotor (Beckman, Palo Alto, CA)). Das fertige Pellet wurde in einem Puffer auf 4,0 ml gebracht und in einer bernsteinfarbenen Phiole (Bernsteinphiole) unter Stickstoff versiegelt.

Beispiel 2 Herstellung von Adjuvans-Liposomen mit einem Antigen

500 mg CHStris (gepulvert) wurden in ein 15 ml-Reagensglas eingeführt. 1 ml HA in einer wäßrigen Pufferlösung wurde zugegeben (300 ug HA, 0,01 M Phosphat-gepufferte Salzlösung in 0,9% NaCl). Die Mischung wurde über einen Zeitraum von 2 h bei 22,5 ± 2,5ºC intermittierend verwirbelt. Die resultierenden Liposome wurden dreimal in einer 10%igen wäßrigen Pufferlösung gewaschen, wobei dazwischen jeweils 15 min lang zentrifugiert wurde (10 000 UpM, J-20-Rotor (Beckman, Palo Alto, CA)). Das fertige Pellet wurde in einem Puffer auf 4,0 ml gebracht und in einer bernsteinfarbenen Phiole (Bernsteinphiole) unter Stickstoff versiegelt.

Beispiel 3 Herstellung von Adjuvans-Liposomen mit einem Antigen

500 mg CHStris (gepulvert) wurden in ein 15 ml-Reagensglas eingeführt. 1 ml Bromelain-Fragment von HA in einem wäßrigen Puffer wurde zugegeben (673 ug HAB, 0,01 M Phosphat-gepufferte Salzlösung in 0,9% NaCl). Die Mischung wurde über einen Zeitraum von 2 h bei 22,5 ± 2,5ºC verwirbelt. Die resultierenden Liposome wurden dreimal in 10 ml einer wäßrigen Pufferlösung gewaschen, wobei dazwischen jeweils 15 min lang zentrifugiert wurde (10 000 UpM, J-20-Rotor). Das fertige Pellet wurde in dem Puffer auf 4,0 ml gebracht und in einer bernsteinfarbenen Phiola (Bernsteinphiole) unter Stickstoff versiegelt.

Beispiel 4 Herstellung von Adjuvans-Liposomen mit einem Antigen

500 mg CHStris (gepulvert) wurden in ein 15 ml-Reagensglas eingeführt, 2 ml Bromelain-Fragment von HA in einem wäßrigen Puffer wurden zugegeben (1100 ug HAB, 0,9% NaCl). Die Mischung wurde über einen Zeitraum von 2 h bei 22,5 ± 2,5ºC intermittierend verwirbelt. Die resultierenden Liposome wurden dreimal in 10 ml einer 0,9%igen NaCl- Lösung gewaschen, wobei jeweils dazwischen 15 min lang zentrifugiert wurde (10 000 UpM, J-20-Rotor). Das fertige Pellet wurde in dem Puffer auf 4,0 ml gebracht und in einer bernsteinfarbenen Phiole (Bernsteinphiole) unter Stickstoff versiegelt.

Beispiel 5 Herstellung von Adjuvans-Liposomen mit einem Antigen

1500 mg CHStris (gepulvert) wurden in ein 15 ml-Reagensglas eingeführt. Es wurden 3 ml Bromelain-Fragment von HA in einem wäßrigen Puffer wurden zugegeben (673 ug HAB, 0,01 M Phosphat-gepufferte Salzlösung in 0,9% NaCl). Die Mischung wurde über einen Zeitraum von 2 h bei 22,5 ± 2,5ºC intermittierend verwirbelt. Die resultierenden Liposome wurden dreimal in 10 ml einer wäßrigen Pufferlösung gewaschen, wobei jeweils dazwischen 15 min lang zentrifugiert wurde (10 000 UpM, J-20-Rotor). Das fertige Pellet wurde in dem Puffer auf 4,0 ml gebracht und in einer bernsteinfarbenen Phiole (Bernsteinphiole) unter Stickstoff versiegelt.

Beispiel 6 Herstellung von Adjuvans-Liposomen mit einem Antigen

500 mg CHSNatrium (gepulvert) wurden in ein 15 ml- Reagensglas eingeführt. Es wurde 1 ml Bromelain-Fragment von HA in einem wäßrigen Puffer zugegeben (673 ug HAB, 0,01 M Phosphat-gepufferte Salzlösung in 0,9% NaCl). Die Mischung wurde über einen Zeitraum von 2 h bei 22,5 ± 2,5ºC intermittierend verwirbelt. Die resultierenden Liposome wurden dreimal in 10 ml einer wäßrigen Pufferlösung gewaschen, wobei jeweils dazwischen 15 min lang zentrifugiert wurde (10 000 UpM, J-20-Rotor). Das fertige Pellet wurde in dem Puffer auf 4,0 ml gebracht und in einer bernsteinfarbenen Phiole (Bernsteinphiole) unter Stickstoff versiegelt.

Beispiel 7 Nachgewiesener Adjuvans-Effekt

Liposome, die HAB enthielten, wurden wie in Beispiel 2 hergestellt. Es wurden die Einschluß-Werte durch SRID bestimmt und die Liposome wurden in einer Salzlösung bis auf eine Konzentration von 10 ug Protein/ml verdünnt und in einer Glasphiole mit einem Gummistopfen und einer Crimpdichtung versiegelt.

Fünf männlichen Hartley-Meerschweinchen mit einem Gewicht von 450 bis 500 g (Buckberg Lab Animals, Landis Store, PA) wurden intramuskulär 0,5 ml der Liposom-Suspension oder 0,5 ml freie HAB in die rechte Hinterpfote inji ziert (5 ug). Vier Wochen nach der Immunisierung wurden die Meerschweinchen mit Äther schwach anästesiert und durch Herzpunktion wurden etwa 4 ml Blut entommen. Das Blut wurde über Nacht sich bei Raumtemperatur verklumpen (gerinnen) gelassen. Das Blut wurde zentrifugiert und das Serum wurde abgezogen und bis zum Test bei 4ºC aufbewahrt. Am Tag nach der Blutentnahme wurden den Meerschweinchen erneut 0,5 ml freies oder liposomales HAB intramuskulär injiziert (5 ug), diesmal in die linke Hinterpfote. Es wurde auf die gleiche Weise Blut gesammelt bis zu ein Jahr nach der anfänglichen Injektion.

Die Gesamtmenge der Anti-HA IgG-Antikörper in den Serumproben wurde durch einen Enzym-Immunoassay (EIA) bestimmt und die neutralisierenden Antikörper wurden durch einen Hämagglutinations-Inhibierungs-Assay (HAI) bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1, 2 und 3 angegeben.

Beispiel 8 Herstellung von Adjuvans-Liposomen mit einem Antigen

100 mg Cholesterin und 400 mg DMPC wurden in einen 500 ml-Rundkolben gegeben und in 3 ml Chloroform suspendiert und durch Rotationsverdampfen zu einem Film getrocknet. Es wurden 20 ml wasserfreier Äther zu dem Kolben zugegeben, danach wurden 1,5 ml HA in einem wäßrigen Puffer zugegeben (915 ug HA, 0,01 M Phosphat-gepufferte Salzlösung in 0,9% NaCl) - "wäßriger Puffer"). Die Mischung wurde mit einer Folie locker abgedeckt und in einem Wasserbad von 40ºC mit Ultraschall behandelt, während gleichzeitig der Äther mit einem schwachen Stickstoffgasstrom verdampft wurde. Die resultierende Lipid-Paste wurde unter Stickstoff gründlich getrocknet, bis keine Spur Äther mehr zu riechen war. Es wurden 10 ml Puffer in den Kolben gegeben und die Liposom-Suspension wurde in ein 15 ml-Reagensglas überführt. Die resultierenden Liposome wurden dreimal in 10 ml eines wäßrigen Puffers gewaschen, wobei dazwischen jeweils 10 min lang zentrifugiert wurde (10 000 UpM, J-20-Rotor (Beckman, Palo Alto, CA)). Das fertige Pellet wurde in einem Puffer auf 6,0 ml gebracht und in einer bernsteinfarbenen Phiole (Bernsteinphiole) unter Stickstoff versiegelt.

Beispiel 9 Herstellung von Adjuvans-Liposomen mit einem Antigen

100 mg Cholesterin und 400 mg DMPC wurden in einen 500 ml-Rundkolben gegeben und in 3 ml Chloroform suspendiert und getrocknet durch Rotationsverdampfen zu einem Film. Es wurden 20 ml wasserfreier Äther in den Kolben gegeben und danach wurden 1,5 ml HAB in einem wäßrigen Puffer zugegeben (1000 ug HAB, 0,01 M Phosphat-gepufferte Salzlösung in 0,9% NaCl). Die Mischung wurde mit einer Folie locker abgedeckt und in einem Wasserbad von 40ºC mit Ultraschall behandelt, während gleichzeitig der Äther in einem schwachen Stickstoffgasstrom verdampft wurde. Die resultierende Lipid-Paste wurde unter Stickstoff gründlich getrocknet, bis keine Spur Äther mehr zu riechen war. Es wurden 10 ml wäßriger Puffer in den Kolben gegeben und die Liposom-Suspension wurde in ein 15 ml-Reagensglas überführt. Die resultierenden Liposome wurden dreimal in 10 ml einer wäßrigen Pufferlösung gewaschen, wobei dazwischen jeweils 10 min lang zentrifugiert wurde (10 000 UpM, J-20- Rotor (Beckman, Palo Alto, CA)). Das fertige Pellet wurde in einem Puffer auf 6,0 ml gebracht und in einer bernsteinfarbenen Phiole (Bernsteinphiole) unter Stickstoff versiegelt.

Beispiel 10 Herstellung von Adiuvans-Liposomen mit einem Antigen

92 mg Cholesterin und 108 mg DMPC wurden in einen 100 ml-Rundkolben eingeführt und in 3 ml Chloroform suspendiert und getrocknet mit einem Rotationsverdampfer zur Bildung eines Films. Es wurden 10 ml wasserfreier Äther in den Kolben gegeben, danach wurden 2,0 ml HAB in einem wäßrigen Puffer zugegeben (1100 ug HAB, 0,01 M Phosphat-gepufferte Salzlösung in 0,9% NaCl). Die Mischung wurde mit einer Folie locker abgedeckt und in einem Wasserbad von 40ºC mit Ultraschall behandelt, während gleichzeitig der Äther mit einem schwachen Stickstoffgasstrom verdampft wurde. Die resultierende Lipid-Paste wurde unter Stickstoff gründlich getrocknet, bis keine Spur von Äther mehr zu riechen war. Es wurden 10 ml wäßriger Puffer in den Kolben gegeben und die Liposom-Suspension wurde in ein 15 ml-Reagensglas überführt. Die resultierenden Liposome wurden dreimal in 10 ml einer wäßrigen Pufferlösung gewaschen, wobei dazwischen jeweils 10 min lang zentrifugiert wurde (10 000 UpM, J-20-Rotor (Beckman, Palo Alto, CA)). Das fertige Pellet wurde in einem Puffer auf 6,0 ml gebracht und in einer bernsteinfarbenen Phiole (Bernsteinphiole) unter Stickstoff versiegelt.

Beispiel 11 Herstellung von Adjuvans-Liposomen mit einem Antigen

40 mg Cholesterin und 160 mg DMPC wurden in einen 100 ml-Rundkolben eingeführt und in 3 ml Chloroform suspendiert und getrocknet durch Rotationsverdampfen zur Bildung eines Films. Es wurden 10 ml wasserfreier Äther in den Kolben gegeben, danach wurden 2,0 ml HAB in einem wäßrigen Puffer zugegeben (1100 ug HAB, 0,01 M Phosphat-gepufferte Salzlösung in 0,9% NaCl). Die Mischung wurde mit einer Folie locker abgedeckt und in einem Wasserbad von 40ºC mit Ultraschall behandelt, während gleichzeitig der Äther in einem schwachen Stickstoffgasstrom verdampft wurde. Die resultierende Lipid-Paste wurde unter Stickstoff gründlich getrocknet, bis keine Spur von Äther mehr zu riechen war. Es wurden 10 ml Puffer in den Kolben gegeben und die Liposom-Suspension wurde in ein 15 ml-Reagensglas überführt. Die resultierenden Liposome wurden dreimal in 10 ml einer wäßrigen Pufferlösung gewaschen, wobei dazwischen jeweils 10 min lang zentrifugiert wurde (10 000 UpM, J-20-Rotor (Beckman, Palo Alto, CA)). Das fertige Pellet wurde in dem Puffer auf 6,0 ml gebracht und in einer bernsteinfarbenen Phiole (Bernsteinphiole) unter Stickstoff versiegelt.

Beispiel 12 Herstellung eines mit Liposomen gemischten Gels

Aluminiumhydroxid-Gel, 2%ig (AlhydrogelTM; Connaught Laboratories, Inc., Swiftwater, PA), das 7,29 mg/ml Aluminium enthielt, wurde in Kombination mit 1,02 ml der erfindungsgemäßen Liposome, hergestellt wie in Beispiel 10, verwendet. Die Liposome wurden mit 0,67 ml Aluminiumhydroxid-Gel und 5,31 ml Salzlösung gemischt. Die End-Aluminiumkonzentration betrug 0,7 mg/ml und die HAB-Konzentration betrug 10 ug/ml. Die Mischung wurde in einer Glasphiole mit einem Gummistopfen und einer Crimpdichtung versiegelt.

Beispiel 13 Adjuvans-Effekt

HAB enthaltende Liposome wurden wie in Beispiel 9 hergestellt. Die Einschlußwerte wurden durch SRID bestimmt und die Liposome wurden in einer Salzlösung bis auf eine Konzentration von 10 ug Protein/ml verdünnt und in einer Glasphiole mit einem Gummistopfen und einer Crimpdichtung versiegelt.

5 männlichen Hartley-Meerschweinchen mit einem Gewicht von 450 bis 500 g (Buckberg Lab Animals, Landis Store, PA) wurden 0,5 ml der Liposom-Suspension oder 0,5 ml der Liposom-Suspension oder 0,5 ml freie HAB in die rechte Hinterpfotebein intramuskulär injiziert (5 ug). 4 Wochen nach der Immunisierung wurden die Meerschweinchen mit Äther schwach anästhesiert und es wurden etwa 4 ml Blut durch Herzpunktur entnommen. Das Blut wurde sich bei Raumtemperatur über Nacht verklumpen (gerinnen) gelassen. Das Blut wurde zentrifugiert und das Serum wurde abgezogen und bis zum Test bei 4ºC aufbewahrt. Am Tag nach der Blutentnahme wurde den Meerschweinchen erneut 0,5 ml freie oder liposomale HAB (5 ug) intramuskulär injiziert, diesmal in die linke Hinterpfote. Auf die gleiche Weise wurde Blut gesammelt bis zu einem Jahr nach der anfänglichen Injektion.

Die Gesamtmenge der Anti-HA IgG-Antikörper in den Serumproben wurde durch einen Enzym-Immunoassay (EIA) bestimmt und die neutralisierenden Antikörper wurden durch einen Hämagglutionations-Inhibierungs-Assay (HAI) bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 4, 5 und 6 angegeben.

Beispiel 14 Melanom-Behandlung

Liposome, die das Gangliosid GD&sub3; enthielten (freundlicherweise bereitgestellt von Dr. P. Livingston, Sloan Kettering Institute for Cancer Research, New York, New York) wurden mit einem Lipid: Antigen (GD&sub3;) Gew./Gew.- Verhältnis von 10 : 1 und 100 : 1 hergestellt unter Verwendung von 10 mg Lipid auf 1 mg GD&sub3; und 150 mg Lipid auf 1,5 mg GD&sub3;. Es wurde Liposome hergestellt unter Verwendung entweder von CHStris oder DMPC/Cholesterin (Mol-% 70 : 30).

Das in einer Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS, jedoch ohne Ca&spplus;&spplus; oder Mg&spplus;&spplus;) bei pH 7,2 suspendierte GD&sub3;- Antigen wurde entweder in CHStris-Lipid-Liposome oder DMPC/Cholesterin (Mol-% 70 : 30)-Lipid-Liposome eingeschlossen. Es wurden CHStris/GD&sub3;-MLV-Liposome hergestellt nach dem nachstehend beschriebenen Verfahren (A) und DMPC/Cholesterin/GD&sub3;-SPLV-Liposome wurden nach dem nachstehend beschriebenen Verfahren (B) hergestellt.

Mäusen wurden 4 mal das liposomale Antigen-Präparat injiziert und der Antikörpertiter wurde bestimmt. Es wurde ein Antikörper gegenüber dem Melanom-GD&sub3; gebildet. Es wurde jedoch festgestellt, daß andere Melanom-Impfstoff- Präparate höhere Antikörper-Titer in Mäusen ergaben als das erfindungsgemäße Präparat unter den hier beschriebenen Bedingungen.

Verfahren A

10 mg CHStris (gepulvert) und 1 mg GD&sub3; (Gew./Gew.- Verhältnis 10 : 1) in 50 ul PBS wurden in ein Reagensglas eingeführt und die Lipide wurden 2 h lang bei Raumtemperatur unter zwischenzeitlichem Verwirbeln sich hydratisieren gelassen. Das Lipid-Material wurde in 10 ml PBS ohne Ca&spplus;&spplus; oder Mg++ wieder suspendiert und 30 min lang bei 13 000 UpM zentrifugiert, wobei das Ganze zweimal durchgeführt wurde. Das fertige Liposomen-Pellet wurde in 2,5 ml PBS wieder suspendiert. Das Liposom-Präparat wurde in einer bernsteinfarbenen Phiole (Bernsteinphiole) unter Stickstoff bis zum Test versiegelt.

Es wurde eine weitere Formulierung mit einem Lipid/Antigen-Verhältnis von 100 : 1 wie oben hergestellt unter Verwendung von 150 mg CHStris und 1,5 mg GD&sub3; in 300 ul PBS.

Verfahren B

2 mg Cholesterin und 8 mg DMPC in 0,5 ml Chloroform wurden durch Rotationsverdampfung in einem 25 ml-Rundkolben getrocknet, in 2 ml wasserfreiem Äther wieder gelöst und mit 1,5 mg GD&sub3; in 60 ul PBS gemischt. Die resultierende Mischung wurde bei 40ºC unter einem N&sub2;-Strom mit Ultraschall behandelt zur Bildung einer Lipid-Paste, die unter N&sub2; weiter getrocknet wurde. Das trockene Material wurde in 10 ml PBS wieder suspendiert und bei 10 000 UpM 10 min lang dreimal zentrifugiert. Das fertige Liposom- Pellet wurde auf 2,28 ml gebracht und mit Alhydrogel (0,7 mg Al/ml) ergänzt. Es wurde eine zusätzliche Formulierung mit einem Lipid/Antigen-Verhältnis von 100 : 1 wie oben hergestellt unter Verwendung von 120 mg DMPC, 30 mg Cholesterin und 1,5 mg GD&sub3; in 0,45 ml PBS.

Beispiel 15 Weitere Immunantwort-Studien

Um die Rolle der Dosis sowohl von HA (Split-Antigen) als auch von Lipid weiter zu untersuchen, wurden Meerschweinchen mit Liposom-Formulierungen mit 5 ug oder 0,5 ug HA, die jeweils in variierenden Lipid-Mengen eingeschlossen waren, inokuliert (Tabelle 7).

Zwei CHStris Formulierungen wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt zur Bildung einer Dosis von 5,0 mg HA und entweder 13,6 mg Lipid (MLV, CHStrist H) oder 1,9 mg Lipid als Multilamellen-Vesikula von CHS (MLV, CHStris, L) . Die Bezeichnungen "H" und "L" beziehen sich auf eine große und eine geringe Menge an Lipid in den jeweiligen Dosierungen. Die Abgrenzung zwischen groß und gering ist willkürlich, sie ist jedoch geeignet bei der Bestimmung der Rolle, welche die relative Lipid-Menge in bezug auf die Impfstoff-Wirksamkeit spielt. Wie in Beispiel 8 beschrieben wurden 2 DMPC/CHOL-Formulierungen hergestellt zur Bildung einer Dosis von 5,0 mg HA und entweder 9,7 mg Lipid aus stabilen plurilamellaren Vesikula, Dimyristoylphosphatidylcholin/Cholesterin (SPLV, DMPC/C, H) oder 2,9 mg Lipid (SPLV, DMPC/C, L).

Außerdem wurde jede H-Formulierung, die eine verhältnismäßig große Menge Lipid pro 0,5 ml Inokulum enthielt, in PBS im Verhältnis 1 : 10 weiter verdünnt und die resultierenden Suspensionen, die 0,5 Mg HA und entweder 1,4 mg CHStris oder 1,0 mg DMPC/CHOL enthielten, wurden ebenfalls in die gleiche Phiole inokuliert. Die Inokulation von Meerschweinchen und die Bestimmung der Antikörper durch EIA oder HAI wurde wie in Beispiel 7 und in Beispiel 15 beschrieben durchgeführt.

Tabelle 1 Verbesserung der Immunogenizität von HA und HAB durch ein steroidales Adjuvans Anti-HA-Antikörper-Titer (Einheten/ml)

Legende: Die HA oder HAB enthaltenden Liposome wurden mit den angegebenen lipid-Konzentrationen hergestellt (beispielhafte Formulierungen sind angegeben). Die Einschluß- Werte wurden durch eine einzelne radiale Immun-Diffusion (SRDI) bestimmt und die Liposome wurden in einer Salzlösung verdünnt bis zu einer Dosis von 0,5 ug oder 5 ug pro 0,5 ml Dosis. Diese wurden Hartley-Meerschweinchen i.m. nach 0 und nach 4 Wochen injiziert. Zu den angegebenen Zeitpunkt wurde Blut durch Herzpunktur entnommen. Die Serum-Antikörper-Titer (Gesamtmenge an Anti-HG IgG und neutralisierenden Antikörpern) wurden durch EIA-Assay bzw. HAI-Assay bestimmt. Die Werte representieren den geometrischen Mittelwert von 3 bis 5 Meerschweinchen pro Gruppe. Tabelle 2: Effekt des HAB-Einschlusses in dem Liposom auf die Fähigkeit, das Immunsystem zu aktivieren

(Primär-Behandlung) Anti-HA-Antikörper-Titer (Einheten/ml)

Legende: Die HAB enthaltenden Liposome wurden aus CHS wie in Beispiel 3 hergestellt. Der Einschluß-Werte wurde durch SRID bestimmt und die Liposome wurden in einer Salzlösung verdünnt bis zu einer Dosis von 5 ug oder 15 ug Protein pro 0,5 ml Dosis. Diese wurden in Hartley-Meerschweinchen IM zum Zeitpunkt 0 injiziert und nach 4 Wochen versterkt. i.m. den angegebenen Zeitpunkt wurde Blut durch Herzpunktur entnommen. Die Serum-Antikörper-Titer (Gesamtmenge von Anti-HA IgG und neutralisierenden Antikörpern) wurden durch EIA-Assay bzw. HAI-Assay bestimmt. Die Werte repräsentieren den geometrischen Mittelwert von 4 bis 5 Meerschweinchen pro Gruppe. Tabelle 3

Effekt des steroidalen Adjuvans nach dem Zumischen oder Einschließen von HAB Anti-HA-Antikörper-Titer (Einheten/ml)

Legende: HAB wurde in Liposome eingeschlossen oder mit leeren Liposomen gemischt. Alle Liposome wurden hergestellt unter Verwendung von 500 mg Lipid. Das Inokulum enthielt 5 ug HBA oder HA/0,5 ml. Der Versuch wurde durchgeführt wie in der Legende der Tabelle 1 beschrieben.

Tabelle 4: Verbesserung der Immunogenizität von HAB durch Verwendung von DMPC/Cholesterin-SPLV's mit verschiedenen Molverhältnissen und Lipid- Konzentrationen

Legende: Die HAB enthaltenden DMPC/Cholesterin-SPV's wurden in den angegeben Lipid-Konzentrationen und Molverhältnissen hergestellt. Die Einschlußwerte wurden durch SRID bestimmt und die Liposome wurden in einer Salzlösung verdünnt bis zu einer Dosis von 5 ug pro 0,5 ml Dosis. Diese wurden in Hartley-Meerschweinchen i.m. injiziert nach 0 Wochen und nach 4 Wochen. Zu den angegebenen Zeitpunkt wurde Blut durch Herzpunktur entnommen. Die Serum-Antikörper-Titer (Gesamtmenge an Anti-HA IgG und neutralisierenden Antikörpern) wurden durch EIA-Assay bzw. HAI-Assay bestimmt. Die Werte stellen den geometrischen Mittelwert von 4 bis 5 Meerschweinchen pro Gruppe dar.

Tabelle 5 Verbesserung der Immunogenizität von HA durch Verwendung von DMPC/Cholesterin-SPV's

Legende: HA enthaltenden DMPC/Cholesterin-VPLV's (Molverhältnis 70 : 30) wurden wie in Beispiel 1 hergestellt. Die Einschlußwerte wurden durch SRID bestimmt und die Liposome wurdenin einer Salzlösung verdünnt bis zu einer Dosis von 0,5 ug oder 5,0 ug pro 0,5 ml Dosis. Diese wurden in Hartley-Meerschweinchen i.m. nach 0 und nach 4 Wochen injiziert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde durch Herzpunktur Blut entnommen. Die Serum-Antikörper-Titer (Gesamtmenge an Anti-HA IgG und neutralisierenden Antikörpern) wurden durch EIA-Assay bzw. HAI-Assay bestimmt. Die Werte stellen den geometrischen Mittelwert von 4 bis 5 Meerschweinchen pro Gruppe dar.

Tabelle 6 Verbesserung der Immunogenizität von HAB durch Verwendung von DMPC/Cholesterin-SPLV's und Aluminiumhydroxid-Gel

Legende: Die HAB enthaltenden CMPC/Cholesterin-SPV's (Molverhältnis 70 : 30) wurden in den angegeben Lipid-Konzetrationen hergestellt. Die Liposome in dem Versuch II wurden steril filtriert durch einen 0,4 um/0,2 um-Filterstapel. Die Einschluß-Werte wurden durch SRID bestimmt und die Liposome wurden in einer Salzlösung verdünnt. Diese wurden in Hartley-Meerschweinchen i.m. nach 0 und 4 Wochen injiziert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde Blut durch Herzpunktur entnommen. Die Serum-Antikörper-Titer (Gesamtmenge an Anti-HA IgG und neutralisierenden Antikörpern) wurden durch EIA-Assay bzw. HAI-Assay bestimmt. Die Werte stellen den geometrischen Mittelwert von 4 bis 5 Meerschweinchen pro Gruppe dar. Tabelle 7

Anti-HA-Antikörper in Seren von Mäusen, die mit HA, das in Liposome eingeschlossen war, immunisiert worden waren

A) Die Liposome (MLV, SPLV) wurden hergestellt entweder mit 500 mg (H) oder mit 50 mg (L) Lipid (CHST oder DMPC/C, Molverhältnis 70 : 30)

B) Geometrischer Mittelwert-Titer (n-51), bestimmt durch Enzym-gebundenen Immuno-Assay (EIA) und Hämagglutinations-Inhibierung (HAI)


Anspruch[de]

1. Dosierungsform, umfassend ein Antigen und ein Liposom, umfassend eine Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterols als ein Adjuvans, worin das Antigen und das Liposom in einer Immunisierungsdosis vorliegen.

2. Dosierungsform nach Anspruch 1, worin die Salzform die Form eines Tris(hydroxymethyl)aminomethan- oder Natriumsalzes umfaßt.

3. Dosierungsform nach einem der Ansprüche 1 oder 2, worin die organische Säure eine Carbonsäure, eine Dicarbonsäure oder eine Polycarbonsäure umfaßt.

4. Dosierungsform nach Anspruch 3, worin die organische Säure eine aliphatische Carbonsäure mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen umfaßt.

5. Dosierungsform nach Anspruch 3, worin die organische Säure eine aliphatische Dicarbonsäure mit bis zu 7 Kohlenstoffatomen umfaßt.

6. Dosierungsform nach Anspruch 5, worin das aliphatische Dicarbonsäurederivat ein Succinat ist.

7. Dosierungsform nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Liposom eine Salzform von Cholesterin-hemisuccinat umfaßt.

8. Dosierungsform nach Anspruch 7, worin das Liposom eine Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Salzform von Cholesterin-hemisuccinat umfaßt.

9. Dosierungsform nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Liposom ein multilamellares Vesicel ist.

10. Dosierungsform nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Liposom einen Durchmesser von mindestens 1 Mikron hat.

11. Dosierungsform nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das Antigen ausgewählt ist aus der Gruppe von Proteinen, Peptiden, Polysacchariden, Nucleinsäuren, Lipiden, Glycolipiden, Lipoproteinen, Lipopolysacchariden, synthetischen Peptiden oder bakteriellen, viralen, protozoalen Geweben oder Zellfraktionen.

12. Dosierungsform nach Anspruch 11, worin das Antigen ein Influenza-Antigen ist.

13. Dosierungsform nach Anspruch 12, worin das Influenza-Antigen Hämagglutinin oder ein Fragment davon ist.

14. Dosierungsform nach Anspruch 13, worin das Antigen ein Bromelain-Fragment von Hämmagglutinin umfaßt.

15. Dosierungsform nach Anspruch 12, worin das Influenza-Antigen die Bromelain-Fraktion umfaßt.

16. Dosierungsform nach Anspruch 12, worin das Influenza-Antigen Neuraminidase umfaßt.

17. Dosierungsform nach einem der Ansprüche 1 bis 16, die außerdem einen Immunmodulator umfaßt.

18. Dosierungsform nach Anspruch 17, worin der Immunmodulator ein Cytokin ist.

19. Dosierungsform nach einem der Ansprüche 1 bis 18, worin das Antigen in das Liposom eingeschlossen ist.

20. Dosierungsform nach einem der Ansprüche 1 bis 19, die außerdem einen geeigneten pharmazeutischen Träger umfaßt.

21. Zusammensetzung zur Potenzierung oder Auslösung einer Immunantwort in einem Tier, einschließlich eines Menschen, das eine Immunisierungsdosis einer Dosisform nach einem der Ansprüche 1 bis 20 mit einem pharmazeutischen Vehiculum umfaßt.







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