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Dokumentenidentifikation DE69509664T2 17.02.2000
EP-Veröffentlichungsnummer 0778949
Titel STABILE ERSATZTRIGLYZERIDE ZUR VERWENDUNG IN KONTROLLEN ODER IN KALIBRATOREN KILINISCH-CHEMISCHER VERFAHREN UND PROZESS FÜR IHRE HERSTELLUNG
Anmelder Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, Calif., US
Erfinder DUFFY, Thomas, H., Santa Ana, CA 92705, US;
GRANDJEAN, Carter, J., Norco, CA 91760, US;
SCHALL, Roy, F., Jr., Glendora, CA 91740, US
Vertreter PAe Reinhard, Skuhra, Weise & Partner, 80801 München
DE-Aktenzeichen 69509664
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, IT, LI
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 31.08.1995
EP-Aktenzeichen 959279464
WO-Anmeldetag 31.08.1995
PCT-Aktenzeichen IB9500722
WO-Veröffentlichungsnummer 9607105
WO-Veröffentlichungsdatum 07.03.1996
EP-Offenlegungsdatum 18.06.1997
EP date of grant 12.05.1999
Veröffentlichungstag im Patentblatt 17.02.2000
IPC-Hauptklasse G01N 33/96
IPC-Nebenklasse C12Q 1/61   

Beschreibung[de]
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es wurde gezeigt, daß Ersatzstoffe für Triglyceride (Pseudotriglyceride oder PSTG) in klinisch-chemischen Kontrollen, Kalibratoren, Standards und in ähnlichen Erzeugnissen verwendet werden können. Die Ersatzstoffe sind Gemische aus mit Glycerin veresterten Fettsäuren mittlerer Kohlenstofflänge (C&sub3;- C&sub1;&sub8;), die relativ preiswert sind, was sie als Kontrollstoffe nützlich macht. Zusätzlich wurde gefunden, daß einzelne Bestandteile, die in verschiedenen Gebieten der Chemie verwendet werden, für diese Anwendung verwendet werden können, ohne daß Emulgatoren benötigt werden. Diese Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Verwendung der Ersatzstoffe.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Messung sowohl von Lipase als auch von Triglyceriden ist in der klinischen Chemie wichtig als Indikator für das Vorliegen von Erkrankungen des Pankreas, Hyperlipidämie, Koronorarterienverschluß etc. Da die Lipase das Enzym ist, welches Triglyceride hydrolysiert, kann ein Test zur Bestimmung dieser beiden Faktoren verwendet werden. Wenn der Lipase-Bestandteil konstant gehalten wird, kann der Test dazu verwendet werden, Triglyceride in der Probe zu bestimmen. Andererseits kann der Lipasegehalt bestimmt werden, wenn Triglycerid konstant gehalten wird.

Da Glyceride spezifische Substrate für das Enzym Lipase (Pankreas-Lipase, EC 3.1.1.3, Triacylglycerin-Acylhydrolase) sind, erfordern Verfahren zur Messung von Lipase die Verwendung von Triglycerid, z. B. gereinigtes Olivenöl, ein natürlich vorkommender Glycerinester der Ölsäure (Triolein), zur Bestimmung der Enzym-Aktivität. Obwohl Triglycerid-Öle wie Olivenöl nicht teuer sind, sind sie nicht wasserlöslich und werden beim Stehenlassen von einer Proteinmatrix abgeschieden, wodurch bei der Verwendung als Kontrollen oder Kalibratoren äußerst instabile Ablesewerte erhalten werden.

Es gibt eine erhebliche Menge an Literatur zur Verwendung von Triglyceriden für Anwendungen in der klinischen Chemie. (Es sei z. B. auf US-A-4 011 045 verwiesen.) Diese Triglyceride werden aus Eigelb extrahiert oder aus tierischem oder menschlichem Blut isoliert. Bei Verwendung dieser Stoffe treten jedoch inhärente Schwierigkeiten auf, wie z. B.:

1. Sie sind instabil bei Einfrier/Auftau-Behandlung.

2. Sie können einen Niederschlag bilden, und dieses Präzipitieren beeinflußt als Begleiterscheinung andere zu bestimmende Elemente, wie z. B. Calcium und Phosphat.

3. Sie neigen dazu, leicht und schnell von Mikroben kontaminiert zu werden, wobei diese Kontaminierung die Produkte, in denen sie benutzt werden, ungünstig beeinflußt.

4. Es handelt sich normalerweise um schlecht charakterisierte Gemische, wodurch Probleme bei der Reproduzierbarkeit entstehen.

5. Ihre Testwerte sind nicht stabil und nehmen mit der Zeit zu.

Einige Hersteller von klinisch-chemischen Kontrollen versuchen, diese Probleme zu umgehen, indem sie das Triglycerid durch Glycerin ersetzen, um die Chemie des wirklichen Triglycerids nachzuahmen. Dieser Ansatz hatte begrenzten Erfolg, da die Hydrolysestufe, die bei bestimmten Tests essentiell ist, eliminiert wird, und für einige Tests, bei denen eine Messung der hydrolysierten Fettsäuren notwendig ist, Glycerin vollkommen ungeeignet ist. Andere Kontrollstoffe verwenden verschie dene oberflächenaktive Mittel, um die normalerweise unlöslichen Triglyceride in Lösung zu halten oder zu emulgieren.

Andere Stoffe, die als Lipase-Substrate gut funktionieren, wurden in der Vergangenheit von anderen nachgewiesen und könnten demnach möglicherweise als Ersatz für Triglyceride in Kontrollen, Kalibratoren, Standards und ähnlichen Stoffen verwendbar sein. Einige dieser synthetischen Triglyceridanaloga sind 2,3-Dimercaptopropan-1-ol-tributyrat, β-Naphthyllaurat, p-Naphthylmyristat, Phenyllaurat und Sorbitester, Methylumbelliferon- und N-Methylindoxylmyristat. Während jede dieser Verbindungen als Lipase-Substrat verwendet wurde und demnach theoretisch als Ersatz für natürliche Triglyceride in Kontrollen dienen könnte, sind sie weitaus zu teuer und/oder unlöslich in Serum, um in der Praxis verwendbar zu sein.

Es sei z. B. auch auf EP-A-0 184 765 verwiesen, welche ein Kontroll- oder Kalibrierserum zur Lipid-Diagnose betrifft, das als Parameter die Apolipoproteine A1, A2 und B humanen Ursprungs, die für die Lipid-Diagnose im normalen pathologischen Konzentrationsbereich wichtig sind, in einer einzelnen haltbaren Form zur Verabreichung enthält.

Diese Erfindung betrifft eine neue und innovative Verwendung von Ersatzstoffen für humane, tierische oder Eigelb-Triglyceride in Kontrollen, Kalibratoren, Standards und ähnlichen Präparaten für Tests in der klinischen Chemie. Unerwarteterweise wurde entdeckt, daß diese Stoffe, die vorher in nicht verwandten Gebieten der Chemie Anwendung gefunden haben, geeignete Lipase-Substrate sind. Die Ersatzstoffe enthalten mit Glycerin veresterte Fettsäuren mittlerer Kohlenstofflänge (C&sub3;- C&sub1;&sub8;), die Gemische aus Mono-, Di- und Triglyceriden bilden, welche derzeit gewerblich als Träger für nicht-wasserlösliche, öllösliche Pharmazeutika und als die Haut geschmeidig machende Öle für Gesichtscremen und Kosmetika verwendet werden. Sie sind begrenzt in Wasser und in auf Wasser basierenden Proteinlösungen löslich und liefern beim Stehenlassen stabile Triglycerid-Meßwerte, ohne daß wie in anderen Erzeugnissen zu sätzliche Stabilisatoren benötigt werden. Ähnliche Stoffe, die ebenfalls verwendet werden können, enthalten Glycerinmonolinoleat, Glycerintripropionat, Mono-, Di- oder Triglyceride von Caprylat und Caprat, Monocapryloylglycerin und Glycerintributyrat, sind aber nicht auf diese beschränkt. Bei Verwendung dieser Stoffe wurden die Probleme der Gefrier/Auftau-Instabilität, Präzipitation, der mikrobiellen Kontamination und der schlechten Charakterisierbarkeit (und damit Reproduzierbarkeit), auf die man mit früheren Stoffen gestoßen ist, vermieden. Diese neuen Stoffe sind außerdem weitaus weniger teuer in der Verwendung als frühere Stoffe und Verfahren, was sie für die Verwendung zur Herstellung von klinischen Kontrollstoffen anwendbar macht. Diese Erfindung behandelt nicht nur die Identifizierung des Stoffs, sondern auch Verfahren für dessen Verwendung.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung befaßt sich mit der Identifizierung neuer Quellen von PSTG zur Verwendung in klinisch-chemischen Kontrollen, Kalibratoren, Standards und verwandten Erzeugnissen (zusammengefaßt als Kontrollstoffe bezeichnet). Diese Erfindung betrifft außerdem die Verwendung der Ersatzstoffe. Es wurde entdeckt, daß die preiswerten PSTG bevorzugt sind, was für die Verwendung zur Herstellung von kommerziellen Kontrollstoffen praktisch ist. Diese PSTG sind außerdem sicher in der Handhabung. Diese preiswerten Stoffe waren im allgemeinen eher Mischungen als reine Einkomponenten-Artikel.

Die PSTG wurden, wie in den folgenden Beispielen gezeigt, in Matrizen auf Proteinbasis analysiert, um deren Verhalten zu ermitteln. Zur Analyse der Lösungen wurden kommerziell erhältliche klinische Analysatoren, z. B. Ektachem (hergestellt von Kodak), Dimension D-380 (von DuPont), Express (von Ciba Corning) und ACA (von DuPont) verwendet, um die Triglycerid-Gehalte im Serum abzulesen. Die Verfahren beinhalten die spezifische Messung von Glycerin nach Hydrolyse der fettsäurehalti gen Anteile. Die Ersatzstoffe enthielten Mono-, Di- oder Triglyceride von Fettsäuren mittlerer Kohlenstoffkettenlänge (C&sub3;- C&sub1;&sub8;): Capmul MCM und Capmul MCM-90 (Markenzeichen der Karlshamns Inc.), 1-Monodecanoyl-rac-glycerin, Glycerintributyrat (Tributyrin), Glycerintripropionat (Tripropionat), Monocaproyloylglycerin (Sigma Chemical Co.) und Linolsäure-Mono-. glycerid (z. B. Myverol von Eastman Chemical Co.). Es wurde gefunden, daß Gemische aus C&sub3;-C&sub1;&sub8;-Mono-, -Di- oder -Triglyceriden, die nicht aus tierischen, humanen oder anderen natürlichen Quellen isoliert wurden, hierbei besonders zweckmäßig sind. Das obige ist eine repräsentative aber nicht erschöpfende Liste der möglichen Ersatzstoffe. Es wurde gefunden, daß die Löslichkeit dieser Verbindungen nicht nur durch die Zahl der Glycerin-Substituenten, sondern auch durch die Kettenlänge jedes Substituenten beeinflußt wird. Wenn zum Beispiel alle drei Hydroxylgruppen von Glycerin verestert sind, wird die Löslichkeit der Glyceride mit Substituenten, deren Länge mehr als 6 Kohlenstoffatome (C&sub6;) übertrifft, soweit unlöslich, daß sie ohne Zugabe von emulgierenden Mitteln (oberflächenaktiven Stoffen) unbrauchbar werden, während bei Veresterung nur einer Hydroxylgruppe, wobei zwei Hydroxylgruppen übrigbleiben, um die Löslichkeit zu unterstützen, Glyceride mit Fettsäureketten der Substituenten bis zu einer Länge von C&sub1;&sub8; verwendet werden können.

Wie oben angedeutet, sind die Stoffe, die hierbei verwendet werden, häufig Gemische, Zum Beispiel ist Capmul MCM ein Gemisch aus 80% Monoglycerid und 20% Diglycerid. Die Fettsäurezusammensetzung hiervon ist ein weiter nicht-spezifiziertes Gemisch von mit Glycerin veresterten Capryl- und Caprinsäuren, die die obige Glyceridzusammensetzung ergeben. Sie enthält < 1% freie Fettsäure und < 1% freies Glycerin. Capmul MCM-90 ist ein Gemisch der folgenden Zusammensetzung: > 90% Monoglycerid und ≤10% Diglycerid. Die Fettsäurezusammensetzung hiervon ist ein weiter nicht-spezifiziertes Gemisch von mit Glycerin veresterten Capryl- und Caprinsäuren, die die obige Glyceridzusammensetzung ergeben. Sie enthält < 1% freie Fettsäure und < 1% freies Glycerin.

Triglycerid-Gehalte im Serum normaler fastender Menschen reichen von 44-210 mg/dl. Um zu ermitteln, ob normale und abnormale Triglycerid-Gehalte durch Verwendung von Ersatzstoffen simuliert werden konnten, wurden serielle Verdünnungen einer konzentrierten Lösung von Capmul MCM in humanem Serum hergestellt (siehe Beispiel 3). Die Ergebnisse dieser Tests zeigen die Linearität und die quantitative Rückgewinnung von PSTG in einer Grundlage aus humanem Serum (siehe Beispiel 3). Diese quantitative Rückgewinnung scheint nicht zeitabhängig zu sein (siehe Beispiel 1).

Zusätzlich wurde weitere Arbeit geleistet, um zu ermitteln, daß quantitative Rückgewinnungen von PSTG bei der Mehrheit klinischer Analysatoren und über einen Bereich von PSTG-Stoffen konsistent sind (siehe Beispiele 4-7).

Für die Verwendung in klinischen Stoffen müssen minimale Stabilitätskriterien erfüllt werden, z. B. sollte nach 10 Tagen kühler Lagerung (2-8ºC) eine Rückgewinnung von plus oder minus 10% erreicht werden, wenn das PSTG einer Protein-Basis in normalen oder nicht normalen Mengen zugesetzt wird. Die Ergebnisse der Stabilitätsstudien deuten darauf hin, daß diese PSTG gewerblich als Kontrollstoffe, Kalibrierstoffe oder Standards (siehe Beispiel 2) verwendbar wären. Für die Anwendbarkeit müssen sich die Proben weiterhin bei Verdünnung linear verhalten, da humane klinische Proben hoher Konzentration verdünnt werden, um in den getesteten Konzentrationsbereich des Tests zu gelangen (Beispiel 3).

Nachdem für das PSTG einmal die quantitative Rückgewinnung und eine angemessene Stabilität nach Zugabe in eine Protein-Grundlage gezeigt wurde, wurde das Material in einer Anzahl von Anwendungen eingesetzt, bei denen aus Eigelb oder humanem oder tierischem Blut isolierte Triglyceride von anderen Labors verwendet wurden, um nämlich Stoffe zu entwickeln, die als Kontrollstoffe für klinische Tests zur quantitativen und qualitativen Bestimmung von Triglyceriden in humanem Serum verwendet werden könnten (siehe Beispiele 4 und 8). Diese Stoffe sind nicht nur in humanem Serum verwendbar, sondern auch in Grundlagen, die aus dem Serum anderer Tiere, humanem oder tierischem Albumin oder Mischungen hiervon, Harn, Rückenmarksflüssigkeit, Speichel oder anderen proteinhaltigen Flüssigkeiten oder Mischungen jeder der vorgenannten Flüssigkeiten zusammengesetzt sind.

Die obigen Ausführungen beschreiben die von den Erfindern für am besten erachtete Weise zur Verwendung von PSTG-Stoffen. Es wird jedoch angenommen, daß die PSTGs anstelle von aus Eigelb oder aus tierischem oder menschlichem Blut isolierten Triglyceriden in sämtlichen analytischen Verfahren, ohne Einschränkung beinhaltend Radioimmunoassay, ELISA und andere analytische Techniken, verwendet werden könnte. Zum Beispiel wird bei den meisten Immunoassays zur Identifizierung eines Antigens entweder ein markiertes Antigen oder ein markierter Antikörper verwendet. PSTG-Antigen oder -Antikörper könnten unter Verwendung verschiedener etablierter Techniken markiert werden, z. B. durch Zugabe eines radioaktiven Markers, eines enzymatischen Markers, eines fluoreszierenden Markers, eines chemilumineszierenden Markers oder anderer Marker, die den Stoff in einem immunochemischen analytischen Verfahren verwendbar machen würden. Die Marker würden als Reportergruppen in den Immunoassays dienen. Es wird weiterhin angenommen, daß PSTGs gereinigt oder vielleicht sogar ohne Reinigung in anderen analytischen Verfahren, wo derzeit eher Triglyceride eingesetzt werden, die aus Eigelb oder aus tierischem oder menschlichem Blut isoliert wurden, verwendet werden.

Es wird weiterhin angenommen, daß die PSTGs als Immunogene verwendet werden könnten, um einen Antikörper zu entwickeln. Polyklonale, monoklonale oder andere Antikörper könnten gegen die Ersatzstoffe für Triglyceride gezüchtet werden. Die Technologie zur Herstellung von Antikörpern (polyklonal oder monoklonal) ist gut etabliert (siehe z. B. Immunology, zweite Ausgabe, I. Roitt et al., Gower Medical Publishing, London, 1989, Seite 8.2)

Entweder die PSTGs oder der daraus hergestellte Antikörper könnten auf einem festen Träger immobilisiert werden. Zahlreiche Träger könnten verwendet werden, z. B. Agaroseharze (Sepharose etc.), Glaskügelchen etc. Ein immobilisierter Antikörper gegen Triglycerid könnte als schnelles und effizientes Reinigungswerkzeug dienen, um reines Triglycerid aus Rohansätzen zu erhalten. Ebenso könnte ein reiner Antikörper erhalten werden, indem immobilisiertes PSTG-Material verwendet wird. Diese Immun-Affinitätschromatographieverfahren sind in der Literatur gut etabliert. Das Vorangegangene zeigt, wie immobilisierte Liganden verwendet werden können, soll aber nicht so ausgelegt werden, daß ihre Verwendbarkeit eingeschränkt ist. Beispielsweise könnte ein immobilisierter Antikörper gegen einen Ersatzstoff für Triglycerid als desorbierendes Mittel verwendet werden, um Triglycerid-freies Serum zu erhalten.

Die hier beschriebenen Stoffe und Verfahren können außerdem dazu verwendet werden, den Lipase-Gehalt zu bestimmen. In diesem Fall würde das Triglycerid konstant gehalten werden und die Bestimmung würde folgende Schritte umfassen:

1. Behandlung des Serums, das die zu bestimmende Lipase enthält, indem man Schweine-Colipase (ein Lipase-Cofaktor, der die Hydrolysereaktion der Lipase beschleunigt) und Phenylmethylsulfonylfluorid (welches Nicht-Lipase-Esterase inhibiert, die sonst auch mit dem Substrat reagieren würde - siehe z. B. Teitz, N.W. "Textbook of Clinical Chemistry", W.B. Saunders Company, Philadelphia (1986), S. 739) zugibt.

2. Zugabe von Reagenz, das ein Triglycerid oder einen Ersatzstoff für Triglyceride enthält, die mit Glycerin veresterte C&sub3;-C&sub1;&sub8;-Fettsäuren zur Bildung von Mono- , Di- oder Triglyceriden enthalten, die nicht aus tierischen, humanen oder anderen natürlichen Quellen oder Gemischen hiervon isoliert wurden, in eine Proteinlösung, zusammen mit einem oder mehreren Indikatorreagenzien, und

3. Bestimmung eines der Produkte der Hydrolysereaktion (entweder Glycerin oder Fettsäuren) mit bekannten Verfahren (siehe z. B. Peace, A.J. und Kaplan, L.A. "Methods in Clinical Chemistry", C.V. Mosby Company, St. Louis (1987), S. 849) nach einer festgelegten Reaktionszeit und Vergleich der so bestimmten Menge mit der Menge, die von einer standardisierten Menge Lipase in der gleichen Zeit produziert wird. Die Lipase-Aktivität in der Probe ist proportional zur Menge dieser Reaktionsprodukte. Abwandlungen dieses Lipase-Testverfahrens können von Fachleuten vorhergesehen werden.

Die folgenden Beispiele beschreiben Stabilitäts- und Anwendungsaspekte der PSTG in verschiedenen Geräten. Diese Stoffe und die daraus hergestellten Produkte sind außerdem für manuelle Verfahren verwendbar. (Zu einer allgemeinen Diskussion von Verfahren mit Triglycerid, siehe z. B. "Methods in Clinical Chemistry", A.J. Pesce et al., C.V. Mosby Co., St. Louis, 1987, Kapitel 18, S. 1215-1227.) Es ist jedoch nicht beabsichtigt, daß diese Beispiele die Verwendbarkeit von PSTG oder Verfahren für deren Verwendung einschränken.

BEISPIEL 1 Einfluß der Zeit auf die Verdünnung:

Unter Verwendung von humanem Serum als Matrix der Wahl wurden 7,5 mg PSTG von Karlshamn (Capmul® MCM, Chargen-Nr. 30418-6) in einer Glasflasche zu 30 ml Serum gegeben und bei Raumtemperatur einer Trommelmischung unterzogen. Die Konzentration an zugegebenem Capmul betrug 25 mg/dl. Es wurden keine zusätzlichen solubilisierenden Stoffe verwendet. Der Lösung wurden regelmäßig Proben entnommen und ihre Triglycerid-Konzentration getestet, wobei ein lipasehaltiger Test, der für Triglycerid spezifisch ist, auf einem Ciba Corning Express 550 Clinical Chemistry Analyzer verwendet wurde. Die folgende Tabelle zeigt, daß das Material mit dem Express-Analyzer eine Trigly cerid-Konzentration liefert, daß nach 94 Minuten vollständige Auflösung eingetreten ist und, daß die gemessenen Konzentrationen mit der Zeit stabil bleiben. Außerdem betrug die gemessene Konzentration auf dem Express 550 212% der zugegebenen Menge, was zeigt, daß PSTG so reagiert, als wäre es stärker wirksam als endogenes Triglycerid. (Die Schwankung der Konzentrationsdaten wird durch die Ungenauigkeit des Meßverfahrens hervorgerufen und liegt deutlich innerhalb der Genauigkeit, die für den Express 550 erwartet wird.)

Tabelle 1

BEISPIEL 2 Einfluß von Zeit und Temperatur auf die PSTG-Aktivität:

Ähnlich wie im obigen Beispiel 1 wurden 15 mg PSTG in Amberglasflaschen zu 30 ml humanem Serum gegeben. Die Lösungen wurden mit dem Express 550 auf ihre Triglycerid-Konzentration getestet, und getrennte Proben wurden bei 5ºC, 23ºC und 30ºC aufbewahrt. Die Proben wurden in Intervallen von bis zu 12 Tagen auf ihre Triglycerid-Konzentration getestet. Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse. Alle Konzentrationen sind in mg/dl angegeben. Die Daten zeigen, daß die Kontrollstoffe, die bei 5ºC gelagert wurden, ungefähr 3 Jahre stabil sind, wenn man die unten gezeigten beschleunigten Lagerfähigkeitsuntersuchungen bei 30ºC extrapoliert.

Tabelle 2

BEISPIEL 3 Einfluß der Konzentration auf die PSTG-Aktivität:

Zu 30 ml humanem Serum wurden 32 mg PSTG gegeben. Das Gemisch wurde 60 Stunden bei 5ºC gedreht, wonach Aliquots entnommen wurden und diese weiter mit humanem Serum verdünnt wurden. Die Triglycerid-Aktivität der endgültigen Lösungen wurde mit einem DuPont ACA III Clinical Analyzer bestimmt. Die folgende Tabelle zeigt die erhaltenen Daten. Konzentrationseinheiten sind in mg/dl angegeben.

Tabelle 3

In dieser Tabelle entspricht die Grundlinien-Konzentration der Triglycerid-Aktivität, die aufgrund endogenen Materials in dem humanen Serum vorhanden ist, und die berechnete PSTG-Konzentration ist die tatsächliche Konzentration, die auf der eingewogenen Menge PSTG beruht. Aus dieser Tabelle wird klar, daß bei allen ausgewerteten Konzentrationen das Verhältnis, das der Gesamtkonzentration minus Grundlinien-Konzentration, geteilt durch die berechnete Konzentration entspricht, ziemlich konstant bei ungefähr 2,9 bleibt. Dieses Verhältnis kann abhängig vom Analysator, mit dem die Bestimmung durchgeführt wird, oder von dem speziellen PSTG unterschiedlich sein, aber es bleibt dennoch konstant.

Daß die Rückgewinnung des gemessenen Triglycerids bei Verwendung von PSTG quantitativ und reproduzierbar ist, ist in Tabelle 3 aus Beispiel 3 durch die Berechnung eines Verhältnis ses, welches bei ungefähr 2,9 konstant bleibt, gezeigt. Dieses Verhältnis wird wahrscheinlich abhängig davon, welches PSTG ausgewählt wird, unterschiedlich sein, aber für jedes PSTG wird ein festes Verhältnis erhalten werden. Dies erlaubt dann, daß das PSTG als Standard oder Kalibrierstoff oder als Kontrolle verwendet werden kann. Ein Kalibrator oder Standard würde wie folgt hergestellt werden: Zugabe von 689,7 mg PSTG (speziell in diesem Fall Capmul MCM) zu einem Liter Serum, dem die endogenen Triglyceride entzogen wurden, um einen Kalibrierwert von 200 mg/dl zu erreichen. Die Berechnung erfolgt folgendermaßen:

689,7 mg/l · 2,9 · 0,1 l/dl = 200 mg/dl

Um andere Kalibrierwerte zu erhalten, muß proportional mehr oder weniger PSTG pro Liter behandelten Serums zugegeben werden. Für andere PSTG neben Capmul MCM oder andere analytische Verfahren würde der geeignete Faktor verwendet werden, um die gewünschte Konzentration an "Triglycerid" zu erreichen.

BEISPIEL 4 PSTG-Aktivität, bestimmt mit dem Dupont D-380 Analyzer:

Wenn unterschiedliche Typen PSTG bis auf eine Endkonzentration von 210 mg/dl zu humanem Serum, das einen endogenen Triglycerid-Wert von ungefähr 90 mg/dl aufweist, gegeben werden und 6 Stunden bei 5ºC gemischt wird, liefern diese stabile PSTG-Werte. Proben dieser Lösungen werden bei 5ºC gelagert und mit der Zeit auf Triglycerid-Aktivität getestet. Die folgende Tabelle zeigt Daten für diese PSTG bei Analyse mit einem Dupont D-380 Analyzer.

Tabelle 4

Myverol ist ein destilliertes Glycerylmonolinoleat, Tripro ist Glyceryltripropionat, Capmul ist ein Gemisch aus Mono- und Diglyceriden von Caprylat und Caprat, Mono-C&sub8; ist Monocapryloylglycerin und Tribut ist Glyceryltributyrat.

BEISPIEL 5 PSTG-Aktivität, bestimmt mit dem DuPont ACA III:

Die Proben wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben gemischt. Die folgende Tabelle zeigt die Daten für diese PSTG bei Analyse mit einem DuPont ACA III Analyzer.

Tabelle 5

BEISPIEL 6 PSTG-Aktivität, bestimmt mit dem Ciba Corning Express 550:

Die Proben wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben gemischt. Folgende Tabelle zeigt die Daten für diese PSTG bei Analyse auf dem Ciba Corning Express 550.

Tabelle 6

BEISPIEL 7 PSTG-Aktivität, bestimmt mit dem Kodak Ektachem 700XRC Analyzer:

Die Proben wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben gemischt. Folgende Tabelle zeigt die Daten für diese PSTG bei Analyse mit einem Kodak Ektachem 700XRC Analyzer. Hier ist nur ein einziger Zeitpunkt gezeigt, was aber sehr gut dazu dient, zu zeigen, daß diese PSTG auch auf diesem Analyzer recht gut funktionieren.

Tabelle 7

BEISPIEL 8 Verwendung eines PSTG (Capmul) in einer fertigen chemischen Kontrolle:

Ausreichend Capmul MCM (ein PSTG) wird zu einer fertigen chemischen Kontrolle mit einer Grundlage aus humanem Serum gegeben, so daß beim Test der Kontrolle mit einem DuPont D-380 ein endgültiger Triglycerid-Wert von ungefähr 200 mg/dl erhalten wird. Die chemische Kontrolle enthält ungefähr 50 getrennte zu analysierende Stoffe, und in der folgenden Tabelle sind einige repräsentative zu analysierende Stoffe gezeigt, zusammen mit PSTG, welches Hauptbestandteil des Triglycerids ist. Das Kontrollmaterial wurde bei 5ºC aufbewahrt, und die Aktivität der verschiedenen zu analysierenden Stoffe wurde zu den angegebenen Zeitintervallen bestimmt.

Tabelle 8

Die Daten in dieser Tabelle zeigen deutlich die Stabilität dieses PSTG in Gegenwart zahlreicher anderer Komponenten.


Anspruch[de]

1. Kontrolle, Kalibrator oder Standard für die klinische Chemie, dadurch gekennzeichnet, daß er/sie umfaßt:

Einen Ersatzstoff für Triglycerid, der mit Glycerin veresterte C&sub3;-C&sub1;&sub8;-Fettsäuren zur Bildung von Mono-, Di- oder Triglyceriden enthält, die nicht aus tierischen, humanen oder anderen natürlichen Quellen oder Mischungen hiervon isoliert wurden, die Lipase-Substrate sind und in einer Proteinlösung löslich sind.

2. Kontrolle, Kalibrator oder Standard nach Anspruch 1, wobei die Proteinlösung humanes oder anderes tierisches Serum enthält oder humanes oder anderes tierisches Albumin oder eine humane oder andere tierische proteinhaltige Flüssigkeit, wobei diese Flüssigkeit vorzugsweise Rückenmarksflüssigkeit oder Speichel ist.

3. Kontrolle, Kalibrator oder Standard nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Ersatzstoff für Triglycerid aus Glycerylmonolinoleat, Glycerintripropionat, Monocapryloylglycerin, Glyceryltributyrat und Gemischen aus Mono- und Diglyceriden von Caprylat und Caprat ausgewählt wird und vorzugsweise ein Gemisch aus mit Glycerin veresterten Capryl- und Caprinsäuren zur Bildung eines weiteren Gemisches von Mono- und Diglyceriden ist.

4. Verfahren zur Herstellung eines Kontrollpräparats für die klinische Chemie zur Verwendung in einem Test zum Nachweis der Gegenwart oder der Menge eines Triglycerids, dadurch gekennzeichnet, daß es mit Glycerin veresterte C&sub3;- C&sub1;&sub8;-Fettsäuren zur Bildung von Mono-, Di- oder Triglyceriden enthält, die nicht aus tierischen, humanen oder anderen natürlichen Quellen oder Mischungen hiervon isoliert wurden, die Lipase-Substrate sind und in einer Proteinlösung löslich sind.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Kontrollmaterial eine klinische Kontrolle, ein Kalibrator oder ein Standard ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei der Ersatzstoff für Triglycerid aus Glycerylmonolinoleat, Glycerintripropionat, Monocapryloylglycerin, Glyceryltributyrat und Gemischen aus Mono- und Diglyceriden von Caprylat und Caprat ausgewählt wird und vorzugsweise ein Gemisch aus Capryl- und Caprinsäuren ist, die mit Glycerin zur Bildung eines weiteren Gemisches von Mono- und Diglyceriden verestert sind.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die Proteinlösung humanes oder anderes tierisches Serum enthält, oder humanes oder anderes tierisches Albumin oder eine andere humane oder tierische proteinhaltige Flüssigkeit, wobei diese Flüssigkeit vorzugsweise Rückenmarksflüssigkeit oder Speichel ist.

8. Verfahren zur Herstellung einer klinischen Kontrolle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:

(a) Auswahl der Glyceride und

(b) Zugabe der Glyceride zu einer wäßrigen, proteinhaltigen Umgebung.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Triglycerid-Bestandteil aus Glycerylmonolinoleat, Glycerintripropionat, Glyceryltributyrat und Gemischen aus Mono- und Diglyceriden von Caprylat und Caprat ausgewählt wird.

10. Verwendung eines Kontrollpräparats für die klinische Chemie nach Anspruch 1 in einem Test zum Nachweis der Gegenwart oder der Menge eines Triglycerids.







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