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Dokumentenidentifikation DE69513156T2 27.04.2000
EP-Veröffentlichungsnummer 0751823
Titel KOVALENT GEBUNDENER ÜBERZUG
Anmelder PerSeptive Biosystems, Inc., Framingham, Mass., US;
Purdue Research Foundation, West Lafayette, Ind., US
Erfinder AFEYAN, Noubar, B., Lexington, MA 02173, US;
REGNIER, Fred, E., West Lafayette, IN 47906, US;
MU, Ning, Arlington, MA 02174, US
Vertreter Müller, Schupfner & Gauger, 21244 Buchholz
DE-Aktenzeichen 69513156
Vertragsstaaten DE, GB
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 24.02.1995
EP-Aktenzeichen 959119181
WO-Anmeldetag 24.02.1995
PCT-Aktenzeichen US9502318
WO-Veröffentlichungsnummer 9523022
WO-Veröffentlichungsdatum 31.08.1995
EP-Offenlegungsdatum 08.01.1997
EP date of grant 03.11.1999
Veröffentlichungstag im Patentblatt 27.04.2000
IPC-Hauptklasse B01J 20/32
IPC-Nebenklasse B01D 15/08   

Beschreibung[de]
Hintergrund der Erfindung

Die Erfindung betrifft im allgemeinen Verfahren zur Herstellung kovalent gebundener, hydrophiler Überzüge auf hydrophoben Oberflächen.

Chromatographischen Materialien auf der Basis von Polystyroldivinylbenzol (PS-DVB) wie die von der Firma PerSeptive Biosystems (Cambridge, MA) hergestellten POROS(Warenzeichen)-Materialien erwiesen sich bei der Trennung von Makromolekülen als geeignet. U. S. -Patentschrift Nr. 5 019 270 (1991). Allerdings ist der natürliche hydrophobe Charakter von Kohlenwasserstoffbasierenden chromatographischen Trägermaterialien wie PS-DVB für ihre Verwendung bei Protein-Trennungen ein cfravierender Nachteil. Boardman und Patridge, Biochem. J., 59: 543 (1955). Die hydrophoben Wechselwirkuncfen zwischen Träger und Proteinen sind stark genug, so daß die Proteine entweder bei der Adsorption oder während der Elution denaturiert werden können. Zudem sind PS-DVB-Chromatographieträger schwer zu derivatisieren, da sie keine aktiven funktionellen Gruppen zur direkten Derivatisierung besitzen. Frechet et al., "Future Trends in Polymer Science and Technology", E. Martuscelli, Ed., Technomic Publishing Co., Inc., Basel, 1.987.

Die aromatischen Ringe der Monomeren wurden bereits vor der Polymerisation unter Herstellung diverser funktioneller für Protein-Trennungen nicht geeigneter PS-DVB- Packmaterialien derivatisiert. Frechet et al., Pure&Appl. Chem., 60: 353 (1988). Die an die Ringe angeknüpften funktionellen Ringe können die Oberfläche von PS-DVB nicht maskieren, und die hydrophoben Reste der Proteine können immer noch mit der hydrophoben Oberfläche wechselwirken. PS-DVB-Perlen wurden durch Anknüpfen hydrophiler funktioneller Gruppen sowohl an den aromatischen Ring als auch an die Polymerskelette modifiziert. Yang et al., Chromatographia, 20: 735 (1985), Yang und Verzele, J. Chromatogr., 387: 197 (1987). Bei Verwendung dieser modifizierten PS-DVB-Materialien mußten der mobilen Phase während der Chromatographie aufgrund der hydrophoben Wechselwirkungen allerdings organische Lösungsmittel zugesetzt werden.

Die Sulfonierung von PS-DVB und das anschließende Überziehen mit Polyethylenimin nach Vernetzung und Quaternisierung erzeugte ein starkes Anionenaustauscher-Packmaterial. Rounds et al., J. Chromatogr., 397: 25 (1987). Der Nachteil dieses Überzugs besteht darin, daß das Polyamin-Polymere nur zur Herstellung von Anionenaustauschern eingesetzt werden konnte. Die Herstellung eines breiten Spektrums von PS-DVB-basierenden Packmaterialien unter Verwendung dieser Überzug war unmöglich.

Pharmacia (Uppsala, Schweden) stell funktionelle PS- DVB-basierende Packmaterialien zur Protein-Trennung unter dem Warennamen MONOBEADS durch gesetzlich geschütz te Verfahrensweisen her. Bei einigen Anwendungen wurde ein Pfropfcopolymer von Polyoxyethylen und vernetzten Polymeren wurde als Träger zur Bindung von Proteinen konstruiert, allerdings wurde bisher über sehr wenige chromatographischen Eigenschaften berichtet. E. Bayer, deutsche Patentschrift Nr. DE 35 00 180 (1986) und U.S. -Patentschrift Nr. 4 908 405 (1990)

Auf einem hydrophoben polymeren Träger wie PS-DVB wurden Moleküle eines gelösten Stoffes, der hydrophile und hydrophobe Bereich aufweist, adsorbiert und unter Herstellung eines hydrophilen Überzuges auf dem Träger vernetzt. U. S. -Patentschrift Nr. 5 030 352 (1991). Die Vernetzung und Polyrnerisation von Epichlorhydrin und Glycidol wurde beschrieben. Auch über die Bildung eines vernetzten Überzugs von Glycidylmethacrylat, das auf PS-DVB adsorbiert ist, und die anschließende Derivatisierung des Überzugs mit Methacrylsäure in Gegenwart von Ammoniumpersulfat und Tetramethylenethylendiamin wurde beschrieben. Die Literatur offenbart, daß die Moleküle des Überzugs untereinander unter Bildung einer kontinuierlichen Schicht chemisch vernetzt werden und daß die vernetzte Schicht durch hydrophobe-hydrophobe Wechselwirkung an der PS-DVB-Oberfläche adsorbiert ist. Die Literatur versäumte es darauf hinzuweisen, daß sich zwischen Überzug und PS-DVB kovalente Bildungen ausbildeten.

Eine Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Verfahren zur Bildung kovalenter Bindungen zwischen den hydrophilen Überzügen und der Oberfläche hydrophober Materialien wie PS-DVB. Eine weitere Aufga be der Erfindung besteht in der Bereitstellung kovalenter hydrophiler Überzügen auf hydrophoben Oberflächen wie PS-DVB-Polymeren, die zur Maskierung der hydrophoben Oberflächen hydrophil genug sind und durch die sich das Polymere bei der Protein-Trennung einsetzen läßt, ohne daß es zu einer Protein-Denaturierung kommt. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung kovalenter Überzüge, die leicht unter Herstellung diverser unterschiedlicher funktioneller Gruppen zur Verwendung bei verschiedenen chromatographischen Anwendungen derivatisiert werden können.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung stellt Verfahren zur Herstellung hydrophiler kovalent an hydrophobe Oberflächen gebundener Überzüge sowie durch das Verfahren hergestellte Materialien bereit. Nach den erfindungsgemäßen Verfahren können kovalente hydrophile Überzugen an die hydrophobe Oberfläche von Polymeren wie PS-DVB gebunden werden, damit die Polymere bei diversen chromatographischen Anwendungen verwendet werden können.

Bei einer Ausführungsform wird ein oberflächenreiches Polymeres mit hydrophober Oberfläche, das ungesättigte Gruppen besutzt, bereitgestellt. Auch eine erste Polyglycidylmethacrylat- oder Methacrylsäure-freie Verbindung, die einen hydrophoben Bereich enthält, der kovalent und flexibel an einen hydrophilen. Bereich gebunden ist, wobei der hydrophobe Bereich eine ungesättigte Gruppe aufweist, wird bereitgestellt. Alternativ wird die erste Verbindung Methacrylsäure-frei bereitgestellt. Die hydrophobe Oberfläche wird mit einer flüssigen, bezüglich der Oberfläche hydrophilen Phase, die solvatisierte Moleküle der ersten Verbindung enthält, zusammengebracht. Die Moleküle der Verbindung lagern sich auf der hydrophoben Oberfläche ab, wobei die hydrophoben Bereiche proximal zur Oberfläche ausgerichtet und an ihr adsorbiert sind und die hydrophilen Bereiche von der Oberfläche nach außen in die flüssige Phase hineinragen. Sodann werden die ungesättigten Gruppen des hydrophoben Bereichs der Moleküle der ersten Verbindung mit den ungesättigten Gruppen auf der hydrophoben Oberfläche unter Herstellung eines hydrophilen kovalent an die Oberfläche des Polymeren gebundenen hydrophilen Überzugs vorzugsweise über eine Radikalreaktion vernetzt.

Das hydrophile überzogene Polymere kann z. B. eine chromatographische Matrix definieren. Bei einer Ausführungsform kann die hydrophobe Oberfläche ein Divinylbenzol-vernetztes Folystyrol(PS-DVB)-Polymeres enthalten. Hochvernetzte PS-DVB-Packmaterialien weisen auf ihrer Oberfläche nicht umgesetzt verbleibende Doppelbindungen auf. Malinsky et al., J. Macromol. Sci. Chem., A5: 1071 (1971). PS-DVB-Polymere, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, enthalten vorzugsweise ungesättigte Gruppen auf der Oberfläche des Polymeren in einem Gehalt von wenigstens etwa 0,23 mmol/g. Bei der Bildung des kovalenten Überzugs auf dem PS-DVB-Polymeren werden aktive Vinylgruppen auf dem PS-DVB-Polymeren, die bei einigen chromatographischen Anwendungen unerwünschte Additionsreaktionen eingehen könnten, entfernt.

Der hydrophile, kovalent an die hydrophobe Oberfläche gebundene Überzug wird zur Maskierung der hydrophoben Bereiche und der hydrophoben Oberfläche mit genügend hydrophilen Gruppen konstruiert. Es können kovalente hydrophile Überzüge aufgebaut werden, die in einem breiten pH-Bereich, z. B. pH 2-12, stabil sind und die die hydrophobe Oberfläche zur Verwendung für Protein- Trennungen hydrophil genug gestalten. Die kovalenten hydrophilen Überzüge besitzen eine Fransenstruktur mit kovalenten hydrophilen Polymerketten, die die hydrophobe Oberfläche des Polymeren vor einem Kontakt mit Proteinen abschirmen und die Ladekapazität durch Vergrößerung der verfügbaren spezifischen Oberfläche erhöhen.

Die erste Verbindung enthält sowohl einen hydrophilen als auch einen hydrophoben Bereich. Der hydrophobe Bereich, der eine ungesättigte Gruppe enthält, wird an die hydrophobe Oberfläche adsorbiert, was die Vernetzung der ungesättigten Gruppe an der ersten Verbindung mit der ungesättigten Gruppe auf der hydrophoben Oberfläche erleichtert. Die erste Verbindung kann mehrere hydrophile und mehrere hydrophobe Bereiche aufweisen. Die hydrophilen Bereiche schirmen die hydrophobe Oberfläche und die hydrophoben Bereiche ab, und die hydrophoben Bereiche stellen funktionelle Gruppen bereit, die unter Herstellung stationärer Phasen für verschiedene chromatographische Anwendungen derivatisiert werden können.

Gegebenenfalls kann die erste Verbindung unter Herstellung einer hydrophilen Gruppierung wie Hydroxyl, Alde hyd, Carbonsäure, Sulfonsäure oder quaternäres Amin zur Erhöhung der Hydrophilie des Überzugs derivatisiert werden. Zur Erleichterung der Derivatisierung des Überzugs kann die erste Verbindung eine reaktive Gruppe wie ein Hydroxyl aufweisen, die mit einer zweiten Verbindung, die eine hydrophile Gruppierung aufweist, kovalent umgesetzt werden. Bei einer Ausführungsform kann die erste Verbindung modifizierten, durch Tosylierung eines Teils der Alkoholgruppen des PVA und anschließende Eliminierung unter Bildung von Doppelbindungen gebildeten Polyvinylalkohol (PVA) enthalten. Der modifizierte (PVA) ist geeignet, da er keine instabilen Bindungen aufweist, sehr hydrophil und biologisch verträglich ist, ungesättigte Gruppen enthält und leicht zu derivatisierende Hydroxylgruppen aufweist.

Bei einer Ausführungsform kann ein Hydroxyl der ersten Verbindung, beispielsweise modifizierter PVA, mit Glycidol derivatisiert werden. Mehrere Glycidolmoleküle können unter Zugabe von Bortrifluoridetherat polymer an das Hydroxyl der ersten Verbindung des Überzugs unter Herstellung eines kovalenten Überzugs, das Polymerketten mit mehreren Hydroxylen enthält, gebunden werden. Die Hydroxyle des kovalent gebundenen Überzugs können auch unter Herstellung mehrerer Carbonsäuregruppen oxidiert werden. Bei einer anderen Ausführungsform kann das Hydroxyl der ersten Verbindung auf dem Überzug mit einer zweiten Verbindung, z. B. einem Epihalogenhydrin wie Epibromhydrin, unter Herstellung eines endständigen Halogenides, das mit einem Amin unter Herstellung eines quaternären Amins umgesetzt werden kann, auf dem kovalenten Überzug umgesetzt werden. Bei einer anderen Ausführungsform kann die erste Verbindung Po ly(gylcidylmethacrylat), das frei ist von Methacrylsäure, enthalten. Bei dieser Ausführungsform werden die ungesättigten Gruppen des Poly(glycidylmethacralates) mit den ungesättigten Gruppen der hydrophoben Oberfläche des Polymeren unter Herstellung einer kovalenten hydrophilen Überzug auf dem Polymeren umgesetzt. Die Poly(glycicylmethacrylat)-Überzug kann unter Herstellung einer hydrophilen Gruppierung wie Carbonsäure, Sulfonsäure oder quaternäres Amin, z. B. durch Reaktion der ungesättigten Gruppen der Poly(glycidylmethacrylat)-Überzug mit einer ungesättigten Gruppe einer zweiten Verbindung, die eine hydrophile Gruppierung enthält, derivatisiert werden. Beispielsweise können ungesättigte Gruppen der Poly(glycidylmethacrylat)-Überzug mit einer ungesättigten Gruppe einer zweiten Verbindung wie Acrylsäure, 2-Acrylamido-2-methyl-1-propansulfonsäure, [3-(Methacryloylamino)propyl]trimethylammoniumchlorid, 2-Acrylamidoglycolsäure, Itaconsäure oder Ethylvinylketon umgesetzt werden. Die Umsetzung einer ungesättigten Gruppe von Poly(glycidylmethacrylat) mit ungesättigten Gruppen des Polymeren und einer ungesättigten Gruppe der zweiten Verbindung kann gleichzeitig in einem Schritt durch eine freie radikalische Reaktion durchgeführt werden. Kovalente Poly(glycidylmethacrylat)-Überzugen auf der Oberfläche von PS-DVB können also leicht synthetisiert und derivatisiert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann demnach zum Aufbau kovalenter hydrophiler Überzugen auf der Oberfläche hydrophober PS-DVB-Polymere verwendet werden und zur Behebung der Schwierigkeit der Bildung kovalenter Bindungen zwischen Überzugen und den PS-DVB-Oberflächen. Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen stellen ein hydrophiles beschichtetes Polymeres bereit, das chemisch bei hohen und niedrigen pH-Extrema stabil ist. Beschichtete Polymere werden hergestellt, die leicht derivatisierbar sind und die in einem breiten Bereich von chromatographischen Anwendungen zur Herstellung von biologischen und anderen Molekülen eingesetzt werden können.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Fig. 1A-1C stellen eine schematische Erläuterung der Synthese einer hydrophilen Überzug, die kovalent an die Oberfläche eines PS-DVB-Trägers gebunden ist, dar.

Fig. 2 ist ein Reaktionsschema und erläutert die Synthese von modifiziertem Polyvinylalkohol (PVA).

Fig. 3 ist ein mögliches Reaktionsschema der Vernetzung von modifiziertem PVA mit der Oberfläche eines PS- DVB-Polymeren.

Fig. 4 ist ein Reaktionsschema der Umsetzung eines modifizierten PVA-beschichteten PS-DVB-Polymeren mit Glycidol.

Fig. 5 ist ein Reaktionsschema der Derivatisierung einer PVA-beschichteten PS-DVB-Oberfläche unter Herstellung von Carbonsäure-Gruppen unter Bildung eines schwachen Kationen-Austauschers.

Fig. 6 ist ein Reaktionsschema der Derivatisierung einer PVA-beschichteten PS-DVB-Oberfläche zur Herstellung quaternärer Amine unter Bildung eines starken Anionen- Austauschers.

Fig. 7 ist ein Reaktionsschema und erläutert die Synthese von polymerem Glycidylmethacrylat.

Fig. 8 ist ein Reaktionsschema der Reaktion von Poly (glycidylmethacrylat) mit einer PS-DVB-Polymeroberfläche.

Die Fig. 9A und 9B sind ein mögliches Reaktionsschema der Reaktion von PS-DVB mit Poly(glycidylmethacrylat) und einer zweiten Verbindung, die eine ungesättigte Gruppe und eine hydrophile funktionelle Gruppe enthält.

Die Fig. 10 und 11 sind graphische Darstellungen der Peak-Höhe gegenüber der Injektionsanzahl in einer Reihe von Protein-Adsorptionstests durch ein Glycidolbehandeltes, PVA-beschichtetes PS-DVB-Polymeres.

Fig. 12 ist eine graphische Darstellung des Retentionsvolumen gegen die Ammoniumsulfat-Konzentration einer Glycidol-behandelten PVA-Überzug auf PS-DVB.

Fig. 13 ist eine graphische Darstellung des Retentionsvolumens gegen die Ionenstärke von Phosphatpuffer für Lysozym auf einem Glycidol-behandelten PVAbeschichteten PS-DVB-Polymeren.

Fig. 14 ist eine graphische Darstellung des Retentionsvolumens gegen den pH-Wert für Lysozym auf einem Glycidol-behandelten, PVA-beschichteten PS-DVB- Polymeren.

Fig. 15 ist ein Absorptionschromatogramm gegen die Zeit bei einem Protein-Trenntest auf einem schwachen Kationen-Austauscher mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min.

Fig. 15B ist ein Absorptionschromatogramm gegen die Zeit bei einem Protein-Trenntest auf einem schwachen Kationen-Austauscher bei einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml/min.

Fig. 16A ist ein Absorptionschromatogramm gegen die Zeit bei einem Protein-Trenntest unter Verwendung eines starken Anionen-Austauschers mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min.

Fig. 16B ist ein Absorptionschromatogramm gegen die Zeit bei einem Protein-Trenntest unter Verwendung eines starken Anionen-Auatauschers mit einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml/min.

Fig. 17 ist eine graphische Darstellung der Peak-Höhe (Absorptionsfähigkeit) gegen die Injektionsanzahl bei einem Proteinadsorptionstest durch ein Poly(glycidylmethacrylat)-beschichtete PS-DVB-Säule.

Fig. 18 ist eine graphische Darstellung des Retentionsvolumens gegen den pH-Wert für Ovalbumin und Lysozym auf einer Poly(glycidylmethacrylat)-beschichteten PS- DVB-Säule.

Ausführliche Beschreibung A. Allgemeines

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung hydrophiler Überzugen bereit, die kovalent an die hydrophoben Oberflächen von Polymeren wie Folystyroldivinylbenzol (PS-DVB) gebunden sind. Unter Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren können hydrophile kovalent an die hydrophoben Oberflächen gebundenen Überzugen aufgebaut werden, die über einen breiten ph-Bereich stabil sind und leicht derivatisierbar sind und bei einem breiten Bereich von Protein-Trenntechniken angewandt werden können.

Zur Bildung der kovalenten hydrophilen Überzugen wird ein Polymere mit einer hydrophoben Oberfläche, die eine ungesättigte Gruppe aufweist, bereitgestellt. Eine erste Verbindung wird ebenfalls bereitgestellt, die einen hydrophilen und einen hydrophoben Bereich aufweist, wo bei der hydrophobe Bereich eine ungesättigte Gruppe enthält. Bei einer Ausführungsform wird eine erste Poly(glycidylmethacrylat)-freie Verbindung bereitgestellt. Bei einer anderen Ausführungsform wird eine erste Methacrylsäure-freie Verbindung bereitgestellt. Die hydrophobe Oberfläche des Polymeren wird mit einer flüssigen bezüglich der Oberfläche hydrophilen Phase, die solvatisierte Moleküle der ersten Verbindung enthält, zusammengebracht. Die Moleküle der ersten Verbindung werden dabei auf der hydrophoben Oberfläche in Orientierung mit ihren hydrophoben Bereichen, die in Richtung der Oberfläche orientiert und darauf adsorbiert sind und mit ihrem hydrophilen Bereich, der sich von der Oberfläche in die flüssige Phase nach außen erstreckt, orientiert, abgelagert. Die ungesättigte Gruppe des hydrophoben Bereiches des Moleküls der ersten Verbindung wird dann mit den ungesättigten Gruppen der hydrophoben Oberfläche und der Herstellung einer hydrophilen kovalent an die Oberfläche des Polymeren gebundene hydrophile Überzug, z. B. über eine frei radikalische Reaktion, vernetzt. Die Orientierung der hydrophoben Bereiche, die die ungesättigte Gruppe enthalten gegegenüber der hydrophoben Oberfläche, die eine ungesättigte Gruppe enthält, erleichtert den Vernetzungsschritt.

Bei einer Ausführungsform können die hydrophilen Überzugen kovalent an die Oberfläche von Polystyrol gebunden sein, das mit Divinylbenzol (PS-DVB)-Teilchen vernetzt ist. PS-DVB-Teilchen können durch in der Technik beschriebene Verfahren hergestellt werden. (Siehe z. B. Kun et al., J. PolmyerSci. PartC, Nr. 16, Seiten 1.457-1469 (1967); J. PolymerSci., Part A1, Bd. 6, Seiten 2689-2701 (1968) und Ugelstad, U. S. -Patentschrift Nr. 4 186 120 (1980)). Diese und andere der Fachwelt bekannte Techniken offenbaren die Bedingungen der Emulsions- und Suspensionspolymerisation oder die in einer Ugelstad Patentschrift offenbarte Hybrid-Technik, durch die sich Polystyroldivinylbenzol-Teilchen herstellen lassen. Nach dem Polymerisationsverfahren verbleiben auf der PS-DVB-Oberfläche Doppelbindungen. Malinsky et a. l., J. Macromol. Sci. Chem., A5: 1071 (1971). Der Bruchteil des Divinylbenzols in dem Reaktionsgemisch kann bei dem Polymerisationsverfahren erhöht werden, um die mechanische Festigkeit von PS-DVB zu erhöhen und um die Anzahl der Doppelbindungen zu erhöhen.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren können die ungesättigten Gruppen der PS-DVB-Oberfläche mit einer ungesättigten Gruppe eines hydrophoben Bereiches einer Verbindung, die eine hydrophile Gruppe enthält, unter Bildung einer hydrophilen kovalent an die PS-DVB-Oberfläche gebundenen Überzug umgesetzt werden. Bei einer Ausführungsform können die hydrophilen Überzugen kovalent an perfusive POROS-PS-DVB-Teilchen (PerSeptive Biosystems, Inc., Cambridge, MA) gebunden werden. Perfusive PS-DVB-Teilchen sind in der U. S. -Patentschrift Nr. 5 019 270 (1991.) beschrieben, deren Offenbarung hiermit als Referenz mitumfaßt ist. Die Geometrien der Poren der perfusiven PS-DVB-Teilchen sind zur Bereitstellung einer hohen spezifischen Oberfläche zur Wechselwirkung mit gelösten Stoffen und zur Zulassung sehr hoher Fluidgeschwindigkeiten ohne einen AuflösungsveriLust bei vielen chromatographischen Anwendungen ausgelegt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform können kovalent beschichtete POROS R/H-. und POROS R/M-perfusive PS-DVB-Chromatographiematrixteilchen (PerSeptive Biosystems, Inc., Cambridge, MA) hergestellt werden. Das H- und M-Material enthält Teilchen von 10 um bzw. 20 um Durchmesser. Die Dichte der oberflächlichen Vinyl- Gruppen in diesen Produkten beträgt ungefähr 0,23 mmol/g, wie gemessen durch eine Quecksilberacetat- Titrationsverfahren des bei Das, Anal. Chem., 26: 1086 (1954) offenbarten Typs. Diese Materialien sind demnach bei der Durchführung geeignet, da sie eine hohe Oberflächendichte ungesättigter Gruppen aufweisen.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren lassen sich hydrophile Beschichten kovalent an die hydrophoben Oberflächen von PS-DVB binden, die in einem breiten Bereich von chromatographischen Bedingungen wie pH-Bereiche und Ionen-Stärke stabil sind. Bei einer Ausführungsform kann die hydrophile Überzug eine Fransenstruktur aufweisen. Die Fig. 1A-1C erläutern schematisch den Aufbau einer hydrophilen Überzug mit einer Fransenstruktur, die kovalent an eine PS-DVB-Oberfläche gebunden ist. Wie in Fig. 1A erläutert, wird ein Polymeres mit hydrophoben und hydrophilen Bereichen in Lösung auf der Oberfläche eines hydrophoben PS-DVB-Trägers adsorbiert. Die hydrophilen Bereiche des Polymeren enthalten hydrophile Gruppen, dargestellt durch die offenen Kreise in Fig. 1. Die hydrophoben Bereiche, dargestellt durch X des Polymeren sind auf der hydrophoben Oberfläche über hydrophobe-hydrophobe Wechselwirkungen adsorbiert. Ungesättigte Gruppen in dem hydrophoben Bereich X des Polymeren werden dann durch eine freie radikalische Reaktion mit ungesättigten Gruppen der Oberfläche von PS-DVB unter Bildung einer kovalent gebundenen hydrophilen Überzug umgesetzt, wie in Fig. 1B erläutert.

Zur Erhöhung der Hydrophilie wird die Überzug dann derivatisiert, so daß sie weitere hydrophile Gruppen enthält. Zur Derivatisierung der Überzug können die Reaktiven in Fig. 1 durch ein offenes Quadrat dargestellten Gruppen der Polymer-Überzug mit einer Verbindung umgesetzt werden, die weitere hydrophile Gruppen (offerte Kreise) enthält. Dies erzeugt eine hydrophile Überzug mit einer Fransenstruktur, die lange Polymer-Ketten aufweist, die von der Oberfläche emporragen, wie in Fig. 1C erläutert.

Die hydrophile FransenÜberzug umhüllt die hydrophobe Oberfläche und ist kovalent daran gebunden. Die Polymer-Ketten, die die hydrophilen Gruppen aufweisen, sind in der Überzug in einer Oberflächendichte vorhanden, die zur wirksamen Maskierung der hydrophoben Oberfläche und zur wesentlichen Eliminierung der hydrophoben Wechselwirkung zwischen einer Protein-Lösung und Bereichen der hydrophoben Oberfläche vorhanden. Die hydrophilen Gruppen der Polymer-Ketten der FransenÜberzug können z. B. ein Hydroxyl, Carbonsäure, quaternäres Amin oder Sulfonsäure aufweisen. Hydrophile Überzugen können demnach kovalent an hydrophobe Oberflächen von Polymeren wie PS-DVB-Teilchen unter Herstellung von hydrophilen beschichteten Teilchen gebunden werden, die bei einem breiten Bereich von chromatographischen Anwendungen eingesetzt werden können.

B. Modifizierte Polyvinylalkohol-basierende Überzugen

Bei einer Ausführungsform kann eine erste Verbindung, die modifizierten Vinylalkohol (PVA) enthält, kovalent an die hydrophobe Oberfläche eines Polymeren wie Polystyroldivinylbenzol (PS-DVB) unter Herstellung einer kovalenten hydrophilen Überzug gebunden werden. Modifizierte PVA-Moleküle können durch Tosylierung von ungefähr einem Viertel der Hydroxyl-Gruppen des Polyvinylalkohol (PVA)-Polymeren (75% hydrolysiert) unter Herstellung guter Abgangsgruppen synthetisiert werden. Anschließende wird t-Butoxid bei einer Elminierungsreaktion unter Bildung ungesättigter Gruppen in den PVA- Molekülen verwendet, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Reaktionsschema ist in Fig. 2 gezeigt. Bei der Behandlung mit t-Butoxid in DMSO lieferten die tosylierten sekundären Hydroxyl-Gruppen ausschließlich Eliminierungsprodukte. Snider und Soho, J. Org. Chem., 29: 742 (1964). Wie in Fig. 2 erläutert, besitzt der modifizierte Polyvinylalkohol einen hydrophilen Bereich, der Hydroxyl-Gruppen enthält und einen hydrophoben Bereich, der ungesättigte Gruppen enthält.

Der modifizierte PVA kann zur Herstellung einer kovalenten hydrophilen Überzug auf der hydrophoben Oberflächen eines PS-DVB-Polymeren wie POROS RH (PerSeptive Biosystems, Inc., Cambridge, MA) verwendet werden. Bei dieser Ausführungsform werden PS-DVB-Polymerperlen einer Lösung des modifizierten PVA, aufgelöst in einem polaren Lösungsmittelsystem wie einem DMSO-Isopropanol- Gemisch, zugesetzt, um die Adsorption der Doppelbindungen der modifizierten PVA-Moleküle an die PS-DVB- Oberfläche herbeizuführen, bis die Oberfläche von PS- DVB vollständig beschichtet ist. Die Triebkraft ist die Minimierung des hydrophoben Kontaktbereiches der hydro- phoben Bereiche der modifizierten PVA-Moleküle und der PS-DVB-Oberfläche mit dem polaren Lösungsmittel. Die Hydroxyl-reichen hydrophoben Bereiche des modifizierten PVA ragen im Gegensatz dazu in das Lösungsmittel hinein. Im Gleichgewicht besitzen die adsorbierten modifizierten PVA-Moleküle wahrscheinlich ein Schlingen- und zugartiges Aussehen auf der PS-DVB-Oberfläche, wie in Fig. 1A gezeigt. Die beschichteten PS-DVB-Perlen können leicht in Wasser dispergiert werden.

Das kovalente Vernetzen der ungesättigten Gruppen des hydrophoben Bereiches der PVA-Moleküle mit den ungesättigten Gruppen der POROSTM PS-DVB-Oberfläche kann bei einer Ausführungsform durch eine freie radikalische Reaktion unter Verwendung von Ammoniumpersulfat (APS) und N,N,N',N' -Tetramethylethylendiamin (TEMED) in einem wäßrigen Lösungsmittel unter Rückfluß durchgeführt werden, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die kovalente Bindung einer hydrophilen modifizierten PVA-Überzug an einen PS-DVB-Träger ist schematisch in den Fig. 1A und 1B erläutert. Die Orientierung der ungesättigten Gruppen in dem hydrophoben Bereich der modifizierten PVA- Moleküle in der wäßrigen Lösung in Richtung der PS-DVB- Oberfläche erleichtert die Reaktion. Kovalente Bindungen können auch zwischen nebeneinander liegenden PVA- Molekülen, die auf der PS-DVB-Oberfläche adsorbiert sind, gebildet werden. Ein mögliches Reaktionsschema des Vernetzungsprozesses ist in Fig. 3 gezeigt. Die Verwendung von PVA ist zweckmäßig, da weitere Derivati sierungen über die Hydroxyl-Gruppen der Überzug durchgeführt werden können.

C. Derivatisierung von modifizierten PVA-Überzugen

Die Hydroxyl-Gruppen der kovalenten PVA-Überzug auf der PS-DVB-Oberfläche können durch Umsetzung mit einer zweiten Verbindung, die eine hydrophile Gruppierung enthält, zur Erhöhung der Hydrophilie der Überzug derivatisiert werden. Die Hydroxyl-Gruppen der PVA-Überzug können derivatisiert werden, z. B. wie in Fig. 4 gezeigt, mit Molekülen von Glycidol über eine Ringöffnungsreaktion mit Bortrifluoridetherat, wie in Beispiel 1 beschrieben. Bei der Reaktion wird polymeres Glycidol auf die Hydroxyl-Gruppen der Überzug über Ether-Bindungen unter Herstellung einer gefransten Oberfläche, die hydrophile Tentaceln aufweist, die von der Oberfläche emporragen und schematisch in Fig. 1C erläutert sind, gepfropft. Somit werden lange, fransige, hydrophile Ketten, die mehrere Hydroxyl-Gruppen enthalten, auf die kurzen hydrophilen Schleifen der modifizierten PVA-Überzug gepropft. Dies verbessert die Ladekapazität und Hydrophilie und maskiert wirksam eine verbleibende hydrophobe Oberfläche. Die hydrophilen Ketten, die Hydroxyl-Gruppen enthalten, maskieren die hydrophobe Oberfläche des PS-DVB und erlauben eine wirksamere Protein--Trennung. Die Glycidol-behandelte PVA-Überzug ist hydrophil, neutral und in einem pH- Bereich von 2-12 stabil.

Modifizierte PVA-beschichtete PS-DVB-Polymere können unter Bildung einer hydrophilen Überzug, die einen Kationen- oder Anionen-Austauscher enthält, derivatisiert werden. Hydrophil beschichtete POROS-Träger können demnach synthetisiert werden, die die Perfusionseigenschaften des unbehandelten POROS-Trägers beibehalten und eine gute Leistung bei Protein-Trennungen zeigen. Ein schwacher Kationen-Austauscher kann, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt werden. Wie in Fig. 5 erläutert, können die Alkohol-Gruppen des Glycidolbehandelten PVA-beschichteten PS-DVB mit Periodat und Kaliumpermanganat unter Herstellung von Carbonsäure- Gruppen unter Bildung eines schwachen Kationen-Austauschers oxidiert werden. Die Matrix kann bei hohen Fließgeschwindigkeiten, z. B. 4 ml/min. ohne Auflösungsverlust verwendet werden.

Bei einer anderen Ausführungsform kann das modifizierte, PVA-beschichtete PS-DVB unter Bildung eines starken Anionen-Austauschers derivatisiert werden. Ein starker Anionen-Austauscher kann durch Einbau eines Halogens in die PVA-Überzug und anschließenden Ersatz des Halogens durch eine tertiäre Amin-Gruppe gebildet werden. Wie in Fig. 6 erläutert, können die Hydroxyl-Gruppen der modifizierten PVA-Überzug mit einem Epihalogenhydrin, z. B. Epibromhydrin und einem Katalysator wie Bortrifluoridetherat unter Herstellung kurzer halogenierter, z. B. bromierter, Ketten in der PVA-Überzug reagiert werden. Eine Substitutionsreaktion mit einem nucleophilen Amin wie Dimethylethanolamin erzeugt dann quaternäre Amine auf der Überzug, wie in Beispiel 1 beschrieben.

D. Poly(glycidylmethacrylat)-Überzugen

Bei einer anderen Ausführungsform können die ungesättigten Gruppen auf der Oberfläche eines hydrophoben Polymeren wie PS-DVB mit einer ersten Verbindung, die Poiy(glycidylmethacrylat), das frei ist von Methacrylsäure, unter Bereitstellung einer kovalenten, hydrophilen Überzug auf der Oberfläche des PS-DVB umgesetzt werden. Polymeres Glycidylmethacrylat wird aus Glycidylmethacrylat über eine Ringöffnungspolymerisationsreaktion, die durch ein Bortrifluoridetherat katalysiert wird, wie z. B. in der U. S. -Patentschrift Nr. 5 030 325 (1991) beschrieben, hergestellt. Das Reaktionsschema ist in Fig. 7 gezeigt. Das resultierende Polymere besitzt eine Polyether-Hauptkette mit Methacrylat-Gruppen an jeder Wiederholungseinheit. Plasma-Desorptionsmassenspektrometrie (PDMS)-Analyse des polymeren Glycidylmethacrylat-Produktes zeigte, daß die Reaktion ein Gemisch von Polymethacrylaten mit Kettenlängen von 3 bis 15, überwiegend 4 bis 11 hauptsächlich in linearer Form statt in cyclischer Strukturen erzeugte.

Das PS-DVB wird einem Lösungsmittelgemisch von Wasser- Isopropanol oder Wasser-PEG, das solvatisierte Poiy(glycidylmethacrylat)-Moleküle enthält, zugesetzt. Letzteres wird aufgrund der niedrigeren Viskosität und der Neigung zu einer besseren Überzug bevorzugt. Kurzes Entgasen und Ultraschallbehandeln sind zur Dispergierung des PS-DVB in dem Lösungsmittelsystem, zur Entfernung der in den Poren eingeschlossenen Luft und zum Eindringenlassen des Polymeren in die Poren, notwendig.

In dem Lösungsmittelsystem orientieren sich die Poiy (glycidylmethacrylat)-Moleküle mit ihren hydrophoben Bereichen, die eine ungesättigte Gruppe enthalten, in Richtung der hydrophoben Oberfläche von PS-DVB, was die Reaktion erleichtert. Die Synthese von Poly(glycidylrnethacrylat) und die Adsorption an PS--DVB unter Bildung einer nicht kovalenten Überzug ist in der U. S. -Patentschrift Nr. 5 030 352 (1991) beschrieben, deren Offenbarung hiermit als Referenz mitumfaßt ist. Die Referenz zeigt, daß die nicht kovalente Poly(glycidylmethacrylat)-Überzug durch Umsetzung mit Methacrylsäure in Gegenwart von Ammoniumpersulfat und TEMED derivatisiert werden kann. Allerdings offenbart die Referenz nicht, daß kovalente Bindungen zwischen der vernetzten Poly(glycidylmethacrylat)-Überzug und der PS-DVB-Oberfläche gebildet werden.

Die ungesättigten Gruppen des hydrophoben Bereiches des Poly(glycidylmethacrylates) können anschließend mit undesättigten Gruppen der PS-DVB-Oberfläche über eine radikalische Vernetzungsreaktion vernetzt werden, was in higur 8 gezeigt ist. Die radikalische Vernetzungsreaktion kann in einer wäßrigen Lösung von Ammoniumpersulfat (ABS) und TEMED durchgeführt werden. Die Vernetzung der einzelnen Polymer-Ketten tritt ebenfalls auf. Styrol und Methacrylate wurden über eine freie radikalische Polymerisation copolymerisiert. H. R. Allcock und F. W. Lampe, "Contemporary Polymer Chemistry", 2. Bd., Prentice-Hall Inc., 1990. Das beschichtete PS-DVB wurde durch chromatographische Methoden bewertet und seine Hydrophilie gezeigt. Bei der Reaktion reagieren die Vinyl-Gruppen des PS-DVB-Polymeren unter Bildung von FCohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen, was nicht umgesetzte Vinyl-Gruppen in dem Polymeren eliminiert. Dies ist zweckmäßig, da sich herausgestellt hat, daß Vinyl- Gruppen die chromatographische Leistung von PS-DVB- Polymeren verschlechtert, da sie unter einigen Bedingungen Additionsreaktionen eingehen können. Das, Anal. Chem:, 26: 1086 (1954).

Durch Hydrolyse der Poly(glycidylmethacrylat)-Überzug in starker Base und anschließender Titration der Carboxyl-Gruppen, die kovalent an PS-DVB gebunden sind, hat sich herausgestellt, daß die Dichte der Carbonsäure-Gruppen auf der PS-DVB-Oberfläche ungefähr 8,1 mmol/g beträgt. Dies zeigte, daß sich zwischen der Poly(glycidylmethacrylat)-Überzug und dem PS-DVB- Polymeren in dem Vernetzungsschritt Kohlenstoff- Kohlenstoff-Bindungen bilden.

E. Derivatisierung von Poly(glycidylmethacrylat) - Überzugen

Das Poly(glycidylmethacrylat)-beschichtete PS-DVB kann durch Umsetzung mit einer zweiten Verbindung derivatisiert werden, die eine hydrophile Gruppierung enthält unter Herstellung einer Vielzahl von derivatisierten beschichteten Polymeren. Die Reaktion von Poly(glycidylmethacrylat) mit der PS-DVB-Oberfläche sowie mit einer zweiten Verbindung, die eine hydrophile Gruppe enthält, kann in einer Stufe erfolgen, wie in den Fig. 9A und 9B gezeigt. Die zweite Verbindung enthält eine ungesättigte Gruppe, die mit einer ungesättigten Gruppe des Poly(glycidylmethacrylates) reagiert. Die zweite Verbindung enthält auch eine funktionelle Gruppe (als Symbol PS), die als stationäre Phase geeignet ist und hydrophil ist.

Beispielsweise kann Poly(glycidylmethacrylat)-beschichtetes PS-DVB mit einer zweiten Verbindung wie Acrylsäure zum Einbau von Carbonsäure-Gruppen in die Überzug unter Bildung eines schwachen Kationen-Austauschers umgesetzt werden. Bei der Umsetzung werden die ungesättigten Gruppen des Poly(glycidylmethacrylates) mit ungesättigten Gruppen der Acrylsäure-Moleküle umgesetzt. Das Vernetzen von PS-DVB mit Poly(glycidylmethacrylat) und von Poly(glycidylmethacrylat) mit Acrylsäure kann in einem Schritt mit einem Radikalstarter erfolgen.

Bei einer anderen Ausführungsform wird ein starkes Kationen-Austauschersorbenz durch Umsetzung der ungesättigten Gruppen des Poly (glycidylmethacrylat) -beschichteten PS-DVB mit ungesättigten Gruppen einer zweiten Verbindung, 2-Acrylamido-2-methyl-1-propansulfonsäure, durch eine freie radikalische Reaktion synthetisiert. Die 2-Acrylamido-2-methyl-1-propansulionsäure enthält eine hydrophile Sulfonsäure-Gruppe und eine Doppelbindung. Alternativ kann die zweite Verbindung 2-Acrylamidoglycolsäure enthalten, die beim Vernetzen mit der Überzug einen schwach sauren Kationen- Austauscher bildet. Itaconsäure, die zwei Carbonsäure- Gruppen enthält, kann ebenfalls zur Herstellung eines schwachen Kationen-Austauschermaterials verwendet werden. Zur Bildung eines starken Anionen-Austauschers kann die zweite Verbindung [3-(Metha-cryolylamino)pro pyl]trimethylammoniumchlorid enthalten. Alternativ kann die zweite Verbindung jede funktionelle Gruppe enthalten, die als chromatographische stationäre Phase geeignet ist. Zur Bildung von Chromatographiematerialien mit hydrophober Wechselwirkung (HIC) kann die zweite Verbindung beispielsweise Ethylvinylketon enthalten.

Sämtliche derivatisierten Poly(glycidylmethacrylat)- Überzugen besitzen eine fransige Oberfläche und eine außergewöhnlich hohe Protein-Ladekapazität. Die dynamische Ladekapazität der Kationen-Austauscher für Lysozym beträgt 80 mg/g bis 144 mg/g und die dynamische Ladekapazität für die Anionen-Austauscher für Rinderserumalbumin betrug ungefähr 90 mg/g.

Somit ermöglichen es die hier offenbarten Methoden, daß hydrophile Überzugen auf hydrophoben Oberflächen wie PS-DVB hergestellt werden, die für einen breiten Bereich von chromatographischen Bedingungen stabil sind und die zur Verwendung in einem breiten Bereich von chromatographischen Anwendungen derivatisiert werden können. Bei einer Ausführungsform können kovalente Überzugen auf hydrophoben perfusiven PS-DVB-Teilchen unter Herstellung einer hydrophilen beschichteten chromatographischen Matrix mit außergewöhnlicher Ladekapazität aufgebaut werden, die es ermöglicht, daß Proteine und andere Moleküle schnell bei hohen Fließgeschwindigkeiten getrennt werden.

Beispiel 1: Modifiziertes PVA-beschichtetes PS-DVB Synthese von modifiziertem PVA

Polyvinylalkohol (Aldrich, Milwaukee, WI; MW 2000, 75% hydrolysiert, 1,02 g) wurde in 20 ml trockenem DMSO aufgelöst, wozu p-Toluolsulfonylchlorid (Aldrich, 99%, 2, 48 g, 0, 013 mol) trockenes Pyridin (Aldrich, 0,5 ml) und 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) (Aldrich, 99%, 0,02 g) gegeben wurden. Das Gemisch wurde unter einer Stickstoff-Atmosphäre 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Mehrere Tropfen Hexan wurden sodann zugetropft, um das Polymere auszufällen, das anschließend filtriert und Diethylether gewaschen wurde, schließlich wurde das Polymere unter Vakuum getrocknet. Destilliertes N,N'- Diisopropylethylamin (Aldrich, 1,2 ml) und Kalium-t- butoxid (Aldrich, 1,46 g) wurden in 20 ml trockenem DSMO vermischt und diese Lösung wurde in das Reaktionsgemisch der ersten Reaktion über eine Spritze übergeführt. Das Gemisch wurde 12 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend 2 h bei 50ºC erhitzt. Zur Isolierung des Produktes wurde das modifizierte Polymere durch Zugabe mehrerer Tropfen n-Hexanen ausgefällt, filtriert und mit 10 ml Hexanen gewaschen und schließlich unter Vakuum getrocknet.

Synthese von modifiziertem PVA-beschichteten PS-DVB

Das Endprodukt der PVA-Modifikationsreaktion wurde in einen 50 ml Rundkolben übergeführt und in 20 ml DMSO gelöst. Isopropanol wurde zugegeben, bis die Lösung leicht trübe wurde. POROS R/H Packmaterial (10 micron Teilchengröße, PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA 1,5 g) wurde diesem Gemisch zugesetzt. Nach Entgasen und kurzem Ultraschallbehandeln wurde das Gemisch 24 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wurde das Packmaterial filtriert und in 40 ml Wasser redispercriert. Nach Entgasen und Ultraschallbehandeln wurde APS (Aldrich, 0,92 g) und TEMED (Bio-Rad, Richmond, CA) (40 ul) zugesetzt und die Suspension wurde unter sanftem mechanischem Rühren 20 h unter Rückfluß erhitzt. Kaliumhydroxid (2,24 g) wurde dem Gemisch zugesetzt und die Reaktion wurde unter Rückfluß für weitere 4 h fortgesetzt. Das Packmaterial wurde abfiltriert und mit Wasser, Methanol und Aceton gewaschen und unter Vakuum getrocknet.

Glycidol-Behandlung von PVA-beschichtetem PS-DVB

Das PVA-beschichtete POROS R/H-Material (1,5 g) wurde in 30 ml Dichlormethan, das 0,5 ml Glycidol (Aldrich) enthielt, dispergiert. Das Gemisch wurde kurz entgast und Ultraschallbehandeln. 2 ml Dichlormethan und 40 ul Bortrifluoridetherat (Aldrich) caurden in einem Teströhrchen gemischt und die Lösung tropfenweise der Suspension unter konstantem Schwenken zugesetzt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur unter Schwenken für 20 min durchgeführt. Wasser (20 ml) wurde dem Gemisch zugesetzt, um die Reaktion zu stoppen und das Packmaterial wurde filtriert und mit Wasser, Methanol und Aceton bevor dem Trocknen unter Vakuum gewaschen.

Die Veresterung der Hydroxyl-Gruppen mit Trifluoressigsäureanhydrid und die anschließende Mikroanalyse zeigten, daß die Anzahl der Hydroxyl-Gruppen fast Sfach anstieg, was nahelegte, daß die hydrophilen Ketten im Durchschnitt 4-5 Einheiten lang waren.

Die Protein-Gewinnung des PVA-beschichteten POROSTM in einer 50 · 4,6 mm-Säule nach Glycidol-Behandlung wurde getestet. PS-DVB-Träger adsorbieren Proteine durch hydrophobe Wechselwirkungen. Boardman and Patridge, Biochem. J., 69: 543 (1955). Wiederholte Injektionen eines Proteins sollten zu einer konstanten Peak-Höhe führen, wenn die Adsorption von Proteinen nicht irreversibel ist. Die Chromatographie wurde mit einem Varian 5000 gradienten Pumpsystem (Walnut Creek, CA) gekoppelt mit einem Lamda-Max 481 variablen Wellenlängendetektor von Waters (Milford, MA) durchgeführt. Die Proben wurden mit einem Rheodyne (Cotati, CA) Injektorventil, ausgestattet mit einer 20 ul-Schlinge, injeziert. Sämtliche Trennungen wurden bei Umgebungstemperatur durchgeführt. Die hydrophobe Adsorption von Protein-Lösungen (5 mg/ml oder 1 mg/ml) von Cytochrom C, Ribonuclease A, a-Chymotrypsinogen, Ovalbumin, Rinderserumalbumin und Bacitracm (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) wurden getestet. Die mobile Phase war 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7 bei 1 ml/min. mit einem Injektionsvolumen von 20 ul). Nach jeder Injektion wurde die Säule mit 1% Trifluoressigsäure gereinigt. Fig. 10 ist eine graphische Darstellung der Peak-Höhe gegen die Injektionsanzahl für diesen Test auf der Glycidin-behandelten modifizierten PVA-Überzug. Wie in Fig. 10 erläutert, zeigten die meisten Proteine keine oder eine geringe Adsorption.

Bei einem anderen Test wurde die Adsorption von Lysozym bei 1% (w/v) und 0, 0001% (w/v) überprüft. Die Ergebnisse sind in Fig. 11 gezeigt, die eine graphische Darstellung der Peak-Höhe gegen die Injektionszahl ist. Die Peak-Höhe war bei beiden Konzentrationen konstant, was erläutert, das wenig oder keine Adsorption von Lysozym auftrat. Da eine unbeschichtete POROS-Säule derselben Größe 6400 ptg Lysozym adsorbieren konnte, erläutert dies, daß die Glycidol-behandelte PVA-Überzug die hydrophobe Wechselwirkung mit Proteinen im Vergleich zu der unbeschichteten PS-DVB-Matrix wesentlich verringerte. Die ausgefranste hydrophile Überzug maskiert demnach die hydrophoben Gruppen auf dem PS-DVB und verstärkt die chromatographische Leistung des beschichteten Polymeren.

Die Hydrophilie des beschichteten Polymeren bei hoher Ionenstärke wurde ebenfalls getestet. Fig. 9 ist eine graphische Darstellung des Retensionsvolumens gegen die Ammoniumsulfat-Konzentration der Glycidol-behandelten PVA-Überzug für Rinderserumalbumin und Ovalbumin. Die mobile Phase war Anmioniumsulfat in 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7 bei 1 ml/min. Fig. 12 erläutert, daß bei hoher Ammoniumsulfat--Konzentration keine Änderung der Flutionszeit für diese Proteine erfolgt. Dies zeigt, daß bei hoher Ionenstärke keine hydrophobe Wechselwirkung zwischen der Überzug und den Proteinen auftritt. Die Glycidol-behandelte covalente PVA--Überzug ist hydrophil auch bei hoher Tonenstärke.

Das Vorliegen von geladenen Gruppen auf der Oberfläche der Glycidyl-behandelten PVA-Überzug wurde getestet. Das Retensionsvolurnen der Proteine, Cytochrom C, Ribonuclease A, α-Chymotrypsinogen, Ovalbumin, Rinderserumalbumin und Bacitracin wurde bei pH 7 mit Phosphatpuffer-Konzentrationen, die von 10 bis 500 mmol variierten, getestet. Die Proteine zeigten keine Veränderung des Elutionsvolumens, was nahelegt, daß keine ionische Wechselwirkungen zwischen den Proteinen und der Überzug besteht. Eine graphische Darstellung des Retensionsvolumens gegen die Ionenstärke des Phosphatpuffers für hysozym ist in Fig. 13 gezeigt. Das konstante Elutionsvolumen über einen Bereich der Ionenstärke zeigt, daß keine Säure-Gruppen auf der Oberfläche vorhanden waren.

Die pH-Stabilität der Überzug wurde bei pH 2-12 überprüft. Konstante Elutionsvolumina für sowohl Säure als auch basische Proteine (Cytochrom C, Ribonuclease A, α- Chymotrypsinogen, Ovalbumine, Rinderserumalbumin und Bacitracin) wurden über den gesamten pH-Bereich erhalten. Fig. 14 ist eine graphische Darstellung des Elutionsvolumens gegen den pH-Wert für Lysozym. Derselbe Test wurde zweimal nach Waschen der Säule mit mobilen Phasen von pH 2 und pH 12 24 h lang wiederholt. Wiederum wurden dieselben Ergebnisse erhalten. Somit ist die Überzug bei extremen pH-Werten stabil.

Herstellung eines schwachen Kationen-Austauschers

Die vicinalen Diole des Glycidoi-behandelten PVAbeschichteten PS-DVB wurden durch Zugabe von Kaliumperiodat (1,84 g, 8 mmol), Kaliumcarbonat (0,28 g, 2 mmol) und Kaliumpermanganat (0, 024 g, 0, 15 mmol) zu 1 l deionisiertem Wasser unter Schütteln zur Auflösung der drei Komponenten oxidiert. Das Glycidol-behandelte POROS-Packmaterial (1 g) wurde in 70 ml der oxidierenden Lösung dispergiert und nach sorgfältigem Entgasen und kurzer Ultraschallbehandlung wurde das Gemisch bei Raumtemperatur 12 h geschüttelt. Anschließend wurde das Packmaterial filtriert und sorgfältig mit Wasser gewaschen. Der schwache Kationen-Austauscher besaß eine statische Ladekapazität von 49 mg/g und eine dynamische Ladekapazität von 44 mg/g. Die Säure-Base-Titration zeigte, daß die Dichte der Carbonsäure-Gruppen 0,9 mmol/g betrug.

Fig. 15 zeigt die Trennung der Proteine Myoglobin (1), Ribonuclease A (2), Cytochrom C (3) und Lysozym (4) unter Verwendung des schwachen Kationen-Austauschers. Die mobile Phase war: (A) 0,02 m Phosphatpuffer, pH 6,5; und (B) A 0,5 M NaCl. Fig. 15A ist bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min mit einem Gradienten von 0-100% B in 16 min erhaltenes Chromatogramm. Fig. 15B ist ein bei einer höheren Fließgeschwindigkeit, ml/min mit einem Gradienten von 0-100% B in 4 min erhaltenes Chromatogramm. Fig. 15 zeigt, daß bei hoher Geschwindigkeit der mobilen Phase kein Auflösungsverlust auftrat. Bei einer Fließgeschwindigkeit von ml/min wurde die Trennung der vier Proteine in weni ger als 3,5 min erreicht. Die meisten herkömmlichen Ionenaustauscher erfahren einen Abfall in der Auflösung bei einer Fließgeschwindigkeit von über 1 ml/min. Afeyan et al., J. Chromatography, 519: 1 (1990).

Herstellung eines starken Anionen-Austauschers

Das PVA-beschichtete POROS R/H-Packmaterial (1 g) wurde in 20 ml Dichlormethan dispergiert, entgast und kurz einer Ultraschallbehandlung und anschließend der Zugabe von Epibromhydrin (300 ul, Aldrich) unterzogen. Zwei ml Dichlormethan und 30 ul Bortrifluoridetherat wurden in einem Teströhrchem gemischt und diese Lösung wurde der Packmaterial/Epibramhydrin-Suspension unter konstantem Schwenken zugetropft. Die Reaktion wurde 20 min bei Raumtemperatur unter Schwenken fortgesetzt. Das Packmaterial wurde abfiltriert und mit Methanol und Aceton gewaschen und schließlich unter Vakuum getrocknet. Das bromierte POROS-Material wurde in 30 ml einer 10%igen (v/v) Lösung von Dimethylethanolamin (Aldrich) in Dimethylformamid (DMF) dispergiert. Nach Entgasen und Ultraschallbehandeln wurde das Gemisch mechanisch 6 h bei 50ºC gerührt. Das Packmaterial wurde anschließend abfiltriert und Methanol und Aceton vor dem Trocknen unter Vakuum gewaschen. Der starke Anionen-Austauscher besaß eine statische Ladekapazität von 50 mg/g und eine dynamische Ladekapazität von 42 mg/g.

Die Trennung von Myoglobin (1), Conalbumin (2), Ovalbumin (3) und Sojabohnentrypsin-Tnhibitor (4) wurde unter Verwendung des starken Anionen-Austauschers und einer mobilen Phase über eine 50 · 4, 6 mm Säule mit (A) 0, 01 M Tris-HCl-Puffer, pH 8; und (B) A +0,05 M NaCl getestet. Fig. 16A ist ein bei 1 ml/min mit einem Gradienten von 0-100%B in 16 min erhaltenes Chromatogramm. Fig. 16B ist ein bei 4 ml/min mit einem Gradienten von 0-100%B in 4 min erhaltenes Chromatogramm. Unter Verwendung des starken Anionen-Austauschers konnten die vier Proteine in weniger als 4 min getrennt werden. Somit behielt das hydrophile beschichtete PS-DVB die Auflösung sogar bei sehr hohen Fließgeschwindigkeiten bei.

Beispiel 2: Poly(glycidylmethacrylat)-beschichtetes PS- DVB Synthese von polymerem Glycidylmethacrylat

Ein ml frisch destilliertes Glycidylmethacrylat (Aldrich) in 6 ml Dichlormethan wurde in einem 100 ml Fundkolben vorgelegt. Fünf ul Bortrifluoridetherat in 2 ml Dichlormethan wurden anschließend der Glycidylmethacrylat-Lösung langsam unter Rühren zugesetzt. Der Fundkolben wurde in Aluminium-Folie eingeschlagen und bei Raumtemperatur 24 h geschüttelt. 6 ml Wasser wurden sodann zugesetzt, um die Reaktion zu beenden und anschließend 4 ml Isopropanol. Dichlormethan wurde durch Vakuumeindampfen aus dem Gemisch entfernt und etwa 16 ml einer Wasser/Isopropanol (70 : 30) Lösung wurden zugesetzt, um das polymere Glycidylmethacrylat zu erzeugen. Das Dichlormethan wurde durch Vakuumeindampfen entfernt und das Polymere wurde mit drei 30 ml Portionen Diethylether extrahiert. Die Extrakte wurden verei nigt über Wasser-freiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Diethylether wurde über Vakuumeindampfen entfernt und das isolierte Polymere wurde unter Hochvakuum getrocknet.

Synthese von Poly(glycidylmethacrylat)beschichtetem PS- DVB

Ein Gramm POROS PS-DVB-Teilchen (PerSeptive BioSystems, Cambridge, MA) mit einer Teilchengröße von 10 um und einer Porengröße von 1000 A wurden dem Polymeren Glycidylmethacrylat zugesetzt und nach kurzer Ultraschallbehandlung und Entgasen wurde das Gemisch 24 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach Filtrieren und dreimaligem Waschen mit 50 ml Wasser wurden die Polymerbeschichteten PS-DVB-Perlen in einen Dreihalskolben übergeführt. 30 ml 3% (w/v) Ammoniumpersulfat-Lösung und 20 ul TEMED wurden zugesetzt. Nach dem Entgasen und Ultraschallbehandlung wurde die Vernetzungsreaktion bei Raumtemperatur 24 h unter Stickstoff durchgeführt. Die beschichteten Polymer-Perlen wurden sorgfältig mit Wasser und Methanol und Aceton gewaschen und getrocknet.

Ovalbumin, Rinderserumalbumin, Ribonuclease A, Cyctochrom C und Lysozym (20 ul) wurden auf eine 50 · 4,6 mm beschichtete Matrixsäule (1000 A, 10 um) mit einer mobilen Phase von 0,05 M Phosphatpuffer bei pH 7,0 und einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min aufgegeben. PS- DVB-Träger adorbieren Proteine über hydrophobe Wechselwirkungen. Boardman and Patridge, Biochem. J., 69: 543 (1955). Wiederholte Injektionen eines Proteins sollten zu einer konstanten Peak-Höhe führen, wenn keine irreversible Adsorption von Proteinen vorliegt. Die Probenkonzentration betrug 0,5-1%. Die Ergebnisse sind in Fig. 17 gezeigt, eine graphische Darstellung der Peak- Höhe (Adsorption bei 280 nm UV) gegenüber der Injektionszahl. Fig. 17 erläutert, daß der größte Teil der getesteten Proteine keine Peak-Höhen-Zunahme zeigt, außer Lysozym, was eine leichte Peak-Höhen-Zunahme von der ersten zur zweiten Injektion zeigte. Dies bedeutet, daß einige restliche hydrophobe Flecken noch vorhanden waren.

Die chemische Stabilität der Überzug wurde durch Testen des beschichteten Polymeren über den pH-Bereich von 2-10 bewertet. Fig. 18 ist eine graphische Darstellung des Retentionsvolumens gegen den pH-Wert mit einer mobilen Phase von 0,05 M Phosphatpuffer bei 1 ml/min für Ovalbumin und Lysozym. Fig. 18 zeigt, daß über den Bereich von pH 2-10 das Retentionsvolumen von Lysozym und Ovalbumin konstant blieb, was bedeutet, daß die Überzug in diesem pH-Bereich stabil ist.

Herstellung eines schwachen Ionen-Austauschers

Die beschichteten PS-DVB-Perlen wurden 30 ml 0,1% (v/v) Acrylsäure-Lösung (Aldrich) zugesetzt und nach Entgasen und Ultraschallbehandlung wurde 1 g Ammoniumpersulfat zum Start der Vernetzung und Derivatisierung zugesetzt. Die Reaktion wurde 23 h bei Raumtemperatur durchgeführt, anschließend wurden 20 ul TEMED zuge setzt. Die Reaktion wurde von eine Stunde fortgesetzt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 ul Hydroquinon gestoppt. Die Teilchen wurden mit Wasser, Methanol und Aceton gewaschen und sodann filtriert und getrocknet.

Herstellung eines starken Kationen-Austauschers

Das Poly(glycidylmethacrylat)-beschichtete PS-DVB- Packmaterial einer Porengröße von 1000 A und einer Teilchengröße von 10 um wurde in 30 y.±l Wasser dispergiert. Nach Entgasen und Ultraschallbehandeln wurden 0,45 g 2-Acrylamido-2-methyl-1-propansulfonsäure (Aldrich) in dem Gemisch aufgelöst. APS (0,9 g) wurde zugesetzt und das Gemisch wurde unter einer Stickstoff- Atmosphäre 23 h mechanisch gerührt. 20 ul Tetramethylethylendiamin (TEMED) wurden zugesetzt und die Reaktion wurde noch eine Stunde fortgesetzt. Die Packmaterialien wurden filtriert und mit Wasser, Methanol und Aceton gewaschen.

Herstellung eines starken Anionen-Austauschers

Das Poly(glycidylmethacrylat)-beschichtete PS-DVB einer Porengröße von 1000 A und einer Teilchengröße von 10 um (1 g) wurde erneut in 30 ml Wasser dispergiert. Nach Entgasen und Ultraschallbehandlung wurden 0,5 g [3- (Methacryloylamino)propyl]trimethylammoniumchlorid (Aldrich) und Ammoniumpersulfat (APS) (0, 9 g) mit dem Gemisch vermischt. Das Gemisch wurde unter Stickstoff 23 h mechanisch gerührt, anschließend wurde TEMED (20 ul) zugesetzt und die Reaktion wurde noch eines Stunde gerührt. Das Packmaterial wurde filtriert und mit Wasser, Methanol und Aceton gewaschen.

Herstellung eines schwachen Kationen-Austauschers

Das Poly(glycidylmethacrylat)-beschichtete Packmaterial (1000 A, 10 um, 1 g) wurde in 30 ml Wasser wieder aufgelöst. Nach Entgasen und Ultraschallbehandeln wurden 0,45 g 2-Acrylamidoglycolsäure (Aldrich) und APS zugesetzt und das Gemisch wurde mechanisch unter Stickstoff-Atmosphäre 23 h gerührt. 20 ul TEMED wurden sodann zugesetzt und die Reaktion wurde noch eine Stunde lang fortgesetzt. Die Packmaterialien wurden filtriert und Wasser, Methanol und Aceton gewaschen.

Herstellung eines schwachen Kationen-Austauschers 1 g des Poly(glycidylmethacrylat)-beschichteten PS-DVB- Packmaterials (POROS R/H, 10 um) wurden erneut in 30 ml Wasser dispergiert. Nach Entgasen und Ultraschallbehancieln wurde Itaconsäure (0, 03 g) und APS (0, 9 g) zugesetzt und das Gemisch mechanisch unter einer Stickstoff-Atmosphäre 23 h gerührt. TEMED (20 ul) wurde sodann zugesetzt und die Reaktion noch eine Stunde fortgesetzt. Diese Packmaterialien wurden filtriert und mit Wasser, Methanol und Aceton gewaschen.

Herstellung von HIC-Packmaterial

Das Poly(glycidylmethacrylat)-beschichtete PS-DVB-Polymere (1,5 g) wurde erneut in 40 ml Wasser dispergiert. Nach Entgasen und Ultraschallbehandlung wurde frisch destilliertes Ethylvinylketon (0, 08 ml) und 0, 5 ml THF dem Gemisch zugesetzt. Die Reaktion wurde mit APS gestartet und das Gemisch wurde mechanisch 23 h unter einer Stickstoff-Atmosphäre gerührt. TEMED (30 ul wurde zugesetzt und die Reaktion wurde noch eine Stunde lang fortgesetzt. Die Packmaterialien wurden filtriert und mit Wasser, Methanol und Aceton gewaschen.


Anspruch[de]

Verfahren zur Herstellung eines hydrophilen, an eine hydrophobe Oberfläche eines Polymeren kovalent gebundenen Überzugs, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

a) Bereitstellen eines Polymeren mit hoher spezifischer Oberfläche, das ungesättigte Gruppen enthält;

b) Bereitstellen einer ersten Verbindung, die einen kovalent und flexibel an einen hydrophilen Bereich gebundenen hydrophoben Bereich enthält, wobei der hydrophobe Bereich eine ungesättigte Gruppe enthält;

c) Zusammenbringen der hydrophoben Oberfläche mit einer flüssigen, bezüglich der Oberfläche hydrophilen Phase, die solvatisierte Moleküle der ersten Verbindung enthält, unter Ablagerung von Molekülen der Verbindung auf der hydrophoben Oberfläche in Ausrichtung mit den hydrophoben, in der Nähe der Oberfläche liegenden Bereichen und adsorbiert an die Oberfläche, wobei sich die hydrophilen Bereiche von der Oberfläche aus nach außen in die flüssige Phase erstrecken; und

d) kovalentes Vernetzen der ungesättigten Gruppe des hydrophoben Bereichs der Moleküle der ersten Verbindung mit den ungesättigten Gruppen auf der hydrophoben Oberfläche unter Herstellung eines hydrophilen, an die Oberfläche des Polymeren kovalent gebundenen Überzugs, wobei die erste Verbindung entweder a) poly(glycidylmethacrylat)-frei; oder b) methacrylsäure-frei ist, in welchem Fall der Vernetzungsschritt (d) eine Radikalreaktion ist und die erste Verbindung Poly(glycidylmethacrylat) sein kann.

2. Verfahren, das außerdem den Schritt e) der Derivatisierung der ersten Verbindung im Anschluß an Schritt (d) unter Herstellung einer hydrophilen Gruppierung einschließt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Polymere mit hoher spezifischer Oberfläche divinylbenzolvernetztes Polystyrol umfaßt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die erste Verbindung mehrere hydrophile Bereiche und mehrere hydrophobe Bereiche enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die erste Verbindung einen modifizierten Polyvinylalkohol umfaßt.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die ungesättigte Gruppe der Moleküle der ersten Verbindung durch eine Radikalreaktion mit den ungesättigten Gruppen auf der hydrophoben Oberfläche kovalent vernetzt wird.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die hydrophile Gruppierung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxyl, Aldehyd, Carbonsäure, Sulfonsäure und quaternärem Amin.

8. Verfahren nach Anspruch 2 oder einem davon abhängigen Anspruch, wobei das in Stufe e) erhaltene hydrophile, überzogene Polymere eine Chromatographie-Matrix definiert.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der hydrophile, kovalent an die hydrophobe Oberfläche gebunden Überzug von pH 2 bis pH 12 stabil ist.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Anspruche, wobei der kovalente Überzug eine ausgefranste Struktur mit genügend hydrophilen Gruppen zur Maskierung der hydrophoben Bereiche und der hydrophoben Oberfläche aufweist.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Titration der ungesättigten Gruppen auf der hydrophoben Oberfläche des Polymeren wenigstens etwa 0,23 mmol/g Polymer ergibt.

12. Verfahren nach Anspruch 2 oder einem davon abhängigen Anspruch, wobei die erste Verbindung außerdem eine reaktive Gruppe enthält und Schritt (e) die kovalente Umsetzung der reaktiven Gruppe der ersten Verbindung mit einer zweiten Verbindung, die eine hydrophile Gruppierung enthält, umfaßt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei

(a) die reaktive Gruppe der ersten Verbindung ein Hydroxyl umfaßt, die zweite Verbindung Glycidol umfaßt; und Schritt (e) die Polymerisation mehrerer Glycidol-Moleküle mit der reaktiven Gruppe der ersten Verbindung unter Herstellung eines kovalenten Überzugs, der Hydroxyl-Gruppen aufweist, umfaßt, wobei weiterhin Schritt (e) gegebenenfalls die Oxidation von Hydroxyl-Gruppen des kovalent gebundenen Überzugs unter Herstellung von Carbonsäuregruppen umfaßt; oder

(b) die reaktive Gruppe der ersten Verbindung ein Hydroxyl und die zweite Verbindung ein Epihalogenhydrin umfaßt; und Schritt (e) die Umsetzung des Epihalogenhydrins mit der reaktiven Gruppe der ersten Verbindung unter Herstellung eines endständigen Halogens auf dem kovalenten Überzug und die Umsetzung des endständigen Halogens auf dem kovalenten Überzug mit einem Amin unter Herstellung eines quaternären Amins auf dem kovalenten Überzug umfaßt, oder

(c) Schritt (e) die Reaktion des Poly(glycidmethacrylat)-Überzugs mit einer zweiten Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Acrylsäure, 2-Acrylamido-2-methyl-1-propansulfonsäure, [3-(Methacryloylamino)propyl]trimethylammoniumchlorid, 2-Acrylamidoglycolsäure, Itaconsäure und Ethylvinylketon, umfaßt und die Schritte d) und e) außerdem gegebenenfalls gleichzeitig durchgeführt werden.

14. Hydrophiles Material, das in Kontakt mit einer Proteinlösung zur Hemmung der Denaturierung hiervon geeignet ist, wobei das Material eine hydrophobe Oberfläche aufweist, die mit einem hydrophilen, an die Oberfläche kovalent gebundenen Überzug überzogen ist, wobei der Überzug eine ausgefranste Struktur aufweist, die eine Vielzahl von langen Polymerketten enthält, die sich von der Oberfläche aus erstrecken und mehrere hydrophile Gruppen enthalten, wobei die Ketten in einer Oberflächendichte vorhanden sind, die zur wirksamen Maskierung der hydrophoben Oberfläche und für eine wesentliche Aasschaltung der hydrophoben Wechselwirkung zwischen der Proteinlösung und Bereichen der hydrophoben Oberfläche ausreichen.

15. Hydrophiles Material nach Anspruch 14, worin die hydrophobe Oberfläche teilchenförmiges, mit Divinylbenzol vernetztes Polystyrol enthält; und/oder die hydrophilen Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxyl, Carbonsäure, quaternärem Amin und Sulfonsäure.







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