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Dokumentenidentifikation DE69515028T2 29.06.2000
EP-Veröffentlichungsnummer 0751988
Titel DIE HOCHEFFIZIENTE HERSTELLUNG UND ISOLIERUNG VON VIRUSPARTIKELN
Anmelder The Immune Response Corp., Carlsbad, Calif., US
Erfinder PRIOR, P., Christopher, Wayne, US;
WEBER, M., David, Phoenixville, US;
GORE, S., Richard, Southampton, US;
HARTER, J., James, Media, US;
HRINDA, E., Michael, Gwynned Valley, US;
MITSCHELEN, J., Jonathan, Perkiomenville, US;
IRISH, W., Thomas, Pottstown, US;
BAY, M., Pierre, Philadelphia, US;
TARR, C., George, Norristown, US
Vertreter Uexküll & Stolberg, 22607 Hamburg
DE-Aktenzeichen 69515028
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 22.03.1995
EP-Aktenzeichen 959141706
WO-Anmeldetag 22.03.1995
PCT-Aktenzeichen US9503668
WO-Veröffentlichungsnummer 9525789
WO-Veröffentlichungsdatum 28.09.1995
EP-Offenlegungsdatum 08.01.1997
EP date of grant 09.02.2000
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.06.2000
IPC-Hauptklasse C12N 7/02
IPC-Nebenklasse C12N 5/02   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung ist auf ein Verfahren zum Herstellen viraler Partikel aus nicht-lytischen Zellen, wobei diese viralen Partikel als Immunogene und/oder Impfstoffe nützlich sind, unter Verwendung eines Perfusionsbioreaktorsystems gerichtet. Die Erfindung ist auch auf ein Verfahren zum Isolieren retroviraler Partikel unter Verwendung von Anionenaustauschchromatographie gerichtet.

Entwicklungen, über die berichtet worden ist

Klassische Laborverfahren zum Herstellen signifikanter Mengen viraler Partikel aus nicht-lytischen Zellen umfassen hauptsächlich die Expansion oder Vermehrung und das Poolen mehrerer Batch- Kulturen. Die Scale-up-Methoden sind problematisch, da sie beträchtliche Sicherheitsmaßnahmen und Aufwendungen für Arbeiter, Ausrüstung und Abfallbeseitigung erfordern, um die Biohazard- Sicherheitseinschließungs-Standards von staatlicher Seite zu erfüllen, insbesondere wenn eine Produktion hochinfektöser Viren mitumfaßt ist. Zusätzlich umfaßt die Herstellung viraler Impfstoffe im allgemeinen, infizierte Zellen in geringen Dichten zu kultivieren, was bei langsam produzierenden Systemen, wie dem Retrovirus HIV-1 (Lentiviridae), zu relativ niedrigen Virustitern führt.

Der pandemische Status von HIV-Infektionen hat zu intensiven Anstrengungen geführt, HIV und andere retrovirale Partikel für die Konstruktion zahlreicher davon abgeleiteter Antigene herzustellen. PCT WO 88/09670 im Namen von Jonas Salk und Dennis J. Carlo ist auf die Herstellung nicht-infektöser/inaktivierter HIV-Immunogene, im Folgenden als Immunogene vom Salk-Typ bezeichnet, denen die Hüllglykoproteine gp 160 oder gp 120 fehlen, gerichtet. Das übliche Verfahren zum Herstellen dieser Immunogene und HIV-Impfstoffe (die sowohl HIV-1 als auch HIV-2 umfassen) umfaßt das Kultivieren von HIV-infizierten Zellen in mehreren Chargen oder Batches und das Isolieren von HIV-Partikeln unter Einsatz von Inaktivierungs-, Filtrations- und Ultrazentrifugations-(isopyknische Sedimentation auf Sucrose-Gradienten) -schritten (im Folgenden bezeichnet als das "klassische Verfahren") ist in Fig. 1 gezeigt. Die letztgenannte Technik ist besonders volumenlimitierend, arbeitsintensiv und erfordert eine hohe Kapitalinvestition für ein Scale-up. Auch produziert das Verfahren nur ungefähr 10 Dosen Immunogen vom Salk-Typ mit einem Gesamtproteingehalt von ungefähr 100 ug/ml oder 8-10 ug/ml durch auf p24 basierendem ELISA pro 1 Liter Zellkultursuspension. Folglich bot sich die zu der Dosierungsform führende Verarbeitung selbst nicht für eine industrielle Produktion an aufgrund ihrer geringen Ausbeute und der Notwendigkeit, Verfahrensschritte mit mehreren Einheiten infektöser Flüssigkeiten auszuführen, ganz abgesehen von der Notwendigkeit, einen Impfstoff mit einem extrem hohen Reinheitsgrad, der für eine Verabreichung an Menschen geeignet ist, zu erzielen. Folglich werden sicherere, weniger arbeitsintensive und wirtschaftlichere Scale-up-Verfahren mit hoher Trennschärfe für die Herstellung viraler Partikel und insbesondere eine Produktion in größerem Maßstab benötigt.

Perfusionsbioreaktorsysteme sind als Alternativen zu traditionellen, in einer Mehrzahl von Batches ausgeführten Kulturen beschrieben worden, um hohe Zelldichten und ihre sezernierten Biomoleküle zu produzieren. W. R. Tolbert et al., Perfusion Culture Systems for Production, auf Seite 97 in Large-Scale Mammalian Cell Culture, herausgegeben von J. Feder und W. R. Tolbert, Academic Press, Inc. (1985), offenbaren eine Verwendung von Perfusionsbioreaktorsystemen, um hohe Zelldichten zu erzeugen, während metabolische Abfallprodukte in einem Perfusionsstrom entfernt und teilweise Zellen in einem Erntestrom geerntet werden. W. R. Tolbert et al. offenbaren auch eine Verwendung von Perfusionsbioreaktorsystemen, um hohe Zelldichten zu erzeugen und aufrechtzuerhalten, während gleichzeitig sezernierte Biomoleküle und metabolische Abfallprodukte in einem Perfusionsstrom entfernt werden. G. Schmid et al., J. Biotech., 22, 31 (1992), offenbaren, daß die Verwendung eines Perfusionsbioreaktorsystems mit und ohne teilweises Zurückhalten oder Retention einer Hybridom-Suspensionskultur nahezu identische Antikörperkonzentrationen und spezifische Produktivitäten erzeugt, aber eine Zunahme der Zahl lebensfähiger Zellen und der Raum-Zeit-Ausbeute um einen Faktor von 2,5 bewirkt.

M. Kloppinger et al.: Flow Cytometric Process Monitoring of Hybridoma Cells in Batch and Perfusion Culture, auf Seite 125 in Advances in Animal Cell Biology und Technology for Bioprocesses, herausgegeben von R. E. Spier et al., Butterworth & Co. Ltd. (1989), offenbaren, daß ein Perfusionsbioreaktor IgG in einem zellfreien enthaltenden Medium mit einer sechsfach höheren IgG- Produktion im Vergleich zu Batch-Kulturen perfundiert. M. Tokashiki et al.; High Density Culture of Hybridomas Recycling High Molecular Weight Components, auf Seite 355, in Advances in Animal Cell Biology and Technology for Bioprocesses, herausgegeben von R. E. Spier et al., Butterworth & Co. Ltd. (1989) offenbaren die Verwendung eines Perfusionsbioreaktorsystems, um eine Hybridomkultur hoher Dichte bei gleichzeitigem Zurückhalten oder gleichzeitiger Retention von Komponenten von hoher relativer Molekülmasse, die von den Hybridomen produziert werden, herzustellen, während Substanzen von niedriger relativer Molekülmasse, einschließlich metabolischer Abfallprodukte, aus dem Kulturmedium perfundiert werden. Keine dieser Referenzen offenbart jedoch die Verwendung eines Perfusionsbioreaktors für die Herstellung von viraler Partikeln oder legt diese nahe.

Die Produktion viraler Partikel in Bioreaktorsystemen wird in der folgenden Referenzliteratur beschrieben. L. Fabry et al.; High Density Microcarrier Cell Culture For Viral Vaccine Production, auf Seite 361 in Advances in Animal Cell Biology and Technology for Bioprocesses, herausgegeben von R. E. Spier et al., Butterworth & Co. Ltd. (1989), offenbaren die Verwendung eines Perfusionsbioreaktors zum Vermehren einer verankerungs-unabhängigen Zellinie bis zu Konfluenz bei gleichzeitiger Perfusion von metabolischen Abfallprodukten, gefolgt von der Infektion der Zellinie mit einer Poliovirus-Generation. L. Fabry et al. offenbaren auch, daß die Kinetiken der Virusreplikation und die spezifische Geschwindigkeit der Produktion von viralen Partikeln für den Perfusionsbioreaktor ähnlich sind zu jenen, die in herkömmlichen Kulturen hergestellt werden. L. Fabry et al. offenbaren nicht die Verwendung eines Perfusionsbioreaktors für die Vermehrung eines Zellsystems mit gleichzeitiger Produktion von viralen Partikeln und legen diese auch nicht nahe. J. B. Clarke und J. B. Griffiths, Cytotechnology, 4, 145 (1990), offenbaren den Betrieb von zwei Bioreaktorsystemen unter Verwendung von Suspensionskulturen für batchweise erfolgende Herstellungsvorgänge von HIV. J. B. Clarke und J. B. Griffiths offenbaren auch den Betrieb eines Festbett-Bioreaktorsystems, bei welchem HIV produzierende Zellen, die in einem Träger zurückgehalten werden, in Wachstumsmedium suspendiert werden, daraus entfernt werden und in frischem Wachstumsmedium resuspendiert werden. J. B. Clarke und J. B. Griffiths offenbaren jedoch nicht die Produktion viraler Partikel in einem Perfusionsbioreaktor, der ein Wachstumsmedium und virusinfizierte, nicht-lytische Zellen unter Bedingungen enthält, bei welchen Wachstumsmedium aus dem Bioreaktor perfundiert wird, Zellen und das Virus enthaltendes Wachstumsmedium aus dem Bioreaktor geerntet wird und frisches Wachstumsmedium dem Bioreaktor hinzugefügt wird.

Nach der Produktion viraler Partikel aus einer Zellkultur sind Verfahren zur Isolierung von viralen Partikeln, insbesondere retroviralen Partikeln, problembeladen. Herkömmliche, in einer Mehrzahl von Batches erfolgende Kulturen produzieren große Volumen von Lösungen mit niedrigen Virustitern. Die Handhabung dieser niedrigen Virustiter in großen Lösungsvolumen stellt ein signifikantes Abfallbeseitigungsproblem dar. Zusätzlich müssen diese Lösungen bis zu einem hohen Reinheitsgrad gereinigt werden, um signifikante Mengen von Zelltrümmern, metabolischen Abfallprodukten und Wachstumsmediumfaktoren von den gewünschten viralen Partikeln zu entfernen. Darüber hinaus enthält das Kulturmedium typischerweise einen hohen Prozentsatz an fötalem Rinderserum als Wachstumsfaktor, das eine komplexe Mischung von Komponenten darstellt, die Isolierungsverfahren negativ beeinflußt. Die Isolierung von HIV-Retroviren ist besonders problematisch, da die Viren in niedrigen Titern in einem teuren und stark serumhaltigen Medium produziert werden und ihre Isolierung mehrere Ultrazentrifugationsschritte, die hochgradig durchsatzlimitierend und arbeitsintensiv sind, erfordert. Folglich werden ein hoher Bedarf an Arbeitskräften, große Mengen an Reinigungsmaterialien, eine intensive Nutzung der Betriebsausrüstung und eine signifikante Aufstellfläche in einer teuren BSL3-Anlage benötigt, um retrovirale Partikel zu isolieren. Zusätzlich muß man Fremdsubstanzen in dem Wachstumsmedium, in dem die retroviralen Partikel produziert werden, kontrollieren. Folglich wird ein alternatives kosteneffizientes und Scale-up-fähiges Verfahren zum Isolieren von retroviralen Partikeln benötigt.

Zahlreiche Referenzliteratur offenbart Verfahren zum Isolieren individueller Virusproteine. WO 9113906 offenbart, das nicht fusionierte rekombinante HIV-Virusprotein gp120 durch Ionenaustauschchromatographie zu fraktionieren und die CD4-spezifische Bindungsaffinität aufweisende Fraktion durch hydrophobe Wechselwirkungs- und Größenausschlußchromatographie zu reinigen. U.S. 4,531, 311 offenbart, rekombinantes reverse Transkriptase-Protein von HIV von verunreinigenden zellulären Proteinen durch Verwendung eines Kationenaustauscherharzes abzutrennen. JP 61051571 offenbart, ein Schweineherpesvirus-Antigen durch seine Adsorption an ein ionisches Austauscherharz, gefolgt von der selektiven Elution des Antigens unter Verwendung eines Puffers, zu reinigen. C. M. Nalin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87(19) 7593 (1990), und C. M. Nalin et al., J. Cell Biochem. Suppl. 14D, 108 (1990), offenbaren die Reinigung von rekombinantem Rev-Protein von HIV durch Ionenaustausch- und Gelfiltrationschromatographie. J. Rittenhouse et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 17171(1), 60 (1990) offenbaren, rekombinante HIV-1- und HIV-2-Proteasen durch Ionenaustauschchromatographie an Mono S. gefolgt von Pepstatin- Agarose-Chromatographie, zu reinigen. A. Billich et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 371(3) 265 (1990), offenbaren, rekombinante HIV-1-Protease durch Kationenaustauschchromatographie an Mono S mit zuvor erfolgender Gelfiltrationschromatographie an Superose R und Ultrafiltration zu reinigen. J. K. K. Li et al., J. Cell Biochem. Suppl. 11C, 181 (1987), offenbaren die Gradienten- Reinigung von Mäuse-Mamma-Tumorvirus, einem B-Typ-Virus, gefolgt von dem Aufbrechen des Virus und der Trennung der viralen Strukturpolypeptide unter Verwendung von aufeinanderfolgender Affinitäts- und Ionenaustauschchromatographie. J. E. Newman et al., Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 86 Meet., 329 T-43 (1986), offenbaren, Strukturproteine von HTLV-3 durch Leiten über ein Lentil-Lectin-Affinitätsharz, gefolgt von einer weiteren Reinigung unter Einsatz von HPLC-Ionenaustauschchromatographie- und Gelfiltrationsschritten, zu isolieren. Diese Referenzen offenbaren jedoch nicht oder legen jedoch nicht nahe, daß ein retroviraler Partikel, insbesondere ein HIV-Partikel, durch Anionenaustauschchromatographie gereinigt werden kann.

Mehrere Referenzen offenbaren die Anwendung von Ionenaustauschchromatographie auf die Reinigung von viralen Partikeln. EP 0302,692 offenbart, Hepatitis A-Virus (HAV) durch Anionenaustauschchromatographie zu reinigen, um DNA zu entfernen. JO 2195877 offenbart, ein Retrovirus oder Komponenten davon zu reinigen, indem man sie mit einem Cellulosesulfatgel oder vernetzten Polysaccharidsulfatgel (kationisches Adsorptionsmittel) in Kontakt bringt und nachfolgend davon eluiert. EP 0459,842 offenbart, einen Kationenaustauschchromatographieschritt zur Reinigung von retroviralen Partikeln zu verwenden. Diese Referenzen offenbaren jedoch nicht oder legen jedoch nicht nahe, daß ein retroviraler Partikel, insbesondere ein HIV-Partikel, durch Anionenaustauschchromatographie gereinigt werden kann, indem die Partikel an das Harz binden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung ist speziell auf ein Verfahren zum Reinigen viraler Partikel gerichtet, welches umfaßt, die viralen Partikel mit einem Tentakel-Anionenaustauscherharz in Kontakt zu bringen und die viralen Partikel von dem Tentakel-Anionenaustauscherharz zu eluieren, wobei das Tentakel-Anionenaustauscherharz ein Harz ist, bei dem sich derjenige Teil desselben, der die Kapazität hat, einen negativ geladenen Partikel zu binden, am Ende oder in der Nähe des Endes einer Spacer-Einheit befindet, das sich distal zu der Anbringungsstelle der Spacer-Einheit an die Grundgerüst- Komponente des Harzes befindet. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind die viralen Partikel retrovirale Partikel.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 ist ein Diagramm zur Gewinnung von HIV-Partikeln durch das "klassische Verfahren", das eine stromaufwärts befindliche Produktionskomponente, die ein in einer Mehrzahl von Batches erfolgendes Kultursystem verwendet, und eine stromabwärts befindliche Isolierungskomponente, die Inaktivierungs-, Filtrations- und Ultrazentrifugationsschritte verwendet, aufweist.

Fig. 2 ist ein Diagramm zur Gewinnung von HIV-Partikeln durch ein Verfahren, das eine stromaufwärts befindliche Produktionskomponente, die ein Perfusionsbioreaktorsystem verwendet, und eine stromabwärts befindliche Isolierungskomponente, die Inaktivierungs-, Filtrations- und Anionenaustauschchromatographieschritte verwendet, aufweist.

Fig. 3 zeigt Fraktionierungschromatogramme von HIV-1 an einer C4-Umkehrphasen-HPLC-Säule (Vydac®) für Folgendes: die Referenzstandardcharge von HIV-1-Partikeln, hergestellt durch das in einer Mehrzahl von Batches erfolgende Kultursystem des "klassischen Verfahrens" (Chromatogramm A); eine Charge von HIV-1- Partikeln, hergestellt durch das "klassische", in einer Mehrzahl von Batches erfolgende Kultursystem (Chromatogramm B); und zwei Chargen von HIV-1-Partikeln, hergestellt durch das Perfusionsbioreaktorsystem (Chromatogramme C und D). Jedes Chromatogramm wurde mittels ungefähr 100 ug Produkt, das durch Erwärmen auf 80ºC für 15 min in 6 M Guanidin-HCl (Gu-HCl) und 10 mM Dithiothreitol (DTT) denaturiert worden ist, erstellt. Die Elutionsmuster wurden unter Verwendung eines Gradienten von Acetonitril mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min. gemessen gegen "Arbitrary Absorbance Units" (AU; arbiträre Absorptionseinheiten), erhalten.

Fig. 4 ist ein Western Blot, der Antigen-Anfärbungsprofile einer Charge von HIV-1-Partikeln in Konzentrationen von 0,1, 0,25, 0,5 und 1 ug/mM (unter Verwendung von aus HIV-infizierten Patienten isolierten Human New York-Antiseren), hergestellt durch das Perfusionsbioreaktorsystem und isoliert unter Einsatz von Inaktivierungs-, Filtrations- und Anionenaustauschchromatographieschritten (jeweils Bahnen 2-5), und die Anfärbungsprofile für die Referenzstandardcharge von HIV-1-Partikeln in einer Konzentration von 1 ug/mM, hergestellt durch das "klassische Verfahren" (Bahn 6), bezogen auf Markersubstanzen mit niedriger relativer Molekülmasse (Bahn 1) zeigt.

Fig. 5 ist eine SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese), die das Anfärbungsprofil für die Referenzstandardcharge von HIV- 1-Partikeln, hergestellt durch das "klassische Verfahren" (Bahn 7), das Anfärbungsprofil von HIV-Partikeln, isoliert aus der abschließenden Ernte eines Perfusionsbioreaktorsystems, das für fünf Wochen betrieben worden war (Bahn 6) und die Anfärbungsprofile von HIV-1-Partikeln, isoliert aus der Ernte während der ersten, zweiten, dritten, vierten und fünften Woche des Perfusionsbioreaktorsystembetriebs (jeweils Bahnen 1-5), und das Anfärbungsprofil für Markersubstanzen mit niedriger relativer Molekülmasse (Bahn 8) zeigt.

Fig. 6 zeigt einen 52-tägigen Perfusionsbioreaktorlauf zur Vermehrung von HIV-infizierten Zellen mit gleichzeitiger HIV-1- Produktion, wobei drei Steady-State-Bedingungen zwischen den Tagen 10 bis 24, den Tagen 28 bis 43 und schließlich den Tagen 46 bis 51 aufrechterhalten wurden. Das Maß der Produktivität, die p24-Konzentration, ist als Funktion der durchschnittlichen Zelldichte für die drei Phasen von Steady-State (SS)-Bedingungen gezeigt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Wie oben und durchgehend innerhalb der Beschreibung der Erfindung verwendet, sollen die folgenden Begriffe, sofern nicht anders angegeben, die folgenden Bedeutungen haben:

Definitionen

"Patient" bedeutet Mensch und andere Säugetiere.

"Virale Partikel" umfassen vollständige Virionen (Viren) wie auch verwandte virale Partikel, aber nicht einzelne virale Proteine. Die Herkunft der viralen Partikel für die Zellkultivierung kann aus einem virusinfizierten Patienten oder aus im Labor durch wiederholte Passage auf empfänglichen Zellsystemen vermehrten Viren sein. Beispiele viraler Partikel umfassen Kapside, Core- Partikel (Partikel der zentralen Virionstruktur), Virionen, die an einem oder mehreren Hüllproteinen verarmt oder bei denen ein oder mehrere Hüllproteine entfernt sind, Virionenhüllen ohne den nukleären Kapsid-Core, Virionenhüllfragmente und schadhafte oder unvollständige Virionen. Bevorzugte virale Partikel sind retrovirale Partikel.

"Retrovirale Partikel" bedeutet jene Viren, die RNA als ihr genomisches Material enthalten, einschließlich der humanen Immundefektviren (HIV), wie HIV-1 und HIV-2, HIV, das an gp 120- und/oder 160-Proteinen verarmt ist, HTLV-1, HTLV-2, AKR-Virus AKR-L#1, Moloney-Leukämievirus und BLV. Bevorzugte retrovirale Partikel umfassen HIV, HIV, das an gp 120- und/oder 160-Proteinen verarmt ist, HTLV-1 und HTLV-2, und ist mehr bevorzugt HIV-1.

"Zellsystem" umfaßt T-Lymphome, HUT-78, H9, HZ 321, W/Fu Fibroblastenzellinie 78A1, SC-1, menschliche Monozyten, CEM- Zellen und Molt-4-Zellen.

"Wachstumsmedium" bedeutet eine Lösung, die eine Nährstoffmischung enthält, die die Vermehrung und das Überleben eines Säugetierzellsystems unterstüzt. Das Wachstumsmedium kann gegebenenfalls Serum oder Proteine enthalten.

"Tentakel-Anionenaustauscherharz" bedeutet ein Harz, bei dem sich derjenige Teil desselben, der die Kapazität hat, einen negativ geladenen Partikel zu binden, am Ende oder in der Nähe des Endes einer Spacer-Einheit befindet, das sich distal zu der Anbringungsstelle der Spacer-Einheit an die Grundgerüst-Komponente des Harzes befindet. Ein Beispiel eines Tentakel-Anionenaustauscherharzes ist TMAE Fractogel® von E. M. Merck.

Bevorzugte erfindungsgemäße Aspekte in dem Verfahren zum Herstellen viraler Partikel sind, wie folgt:

wobei die viralen Partikel von dem Tentakel-Anionenaustauscherharz mit einem Anionenharz in Kontakt gebracht werden und die viralen Partikel von dem Anionenaustauscherharz eluiert werden;

wobei das Anionenaustauscherharz ein Q-SEPHAROSE-Harz ist;

wobei das Eluieren mit ungefähr 0,6 bis ungefähr 2 M NaCl ausgeführt wird;

wobei das Eluieren mit ungefähr 1 M NaCl ausgeführt wird;

wobei das Tentakel-Anionenaustauscherharz TMAE FRACTOGEL® ist;

wobei das Reinigen ferner umfaßt, das Tentakel-Anionenaustauscherharz mit ungefähr 0,1 bis ungefähr 0,55 M NaCl nach dem In-Kontakt-Bringen und vor dem Eluieren zu waschen, und/oder

wobei die viralen Partikel retrovirale Partikel sind, mehr bevorzugt die retroviralen Partikel HTLV-1, HTLV-2, HIV-1, HIV-2 oder HIV, das an den gp 120- und/oder 160-Proteinen verarmt ist, sind und weiter bevorzugt die retroviralen Partikel HIV-1 sind.

Erfindungsgemäß verwendbare Perfusionsbioreaktorsysteme sind so konfiguriert, daß sie die Retention von Zellen und viralen Partikeln in dem Bioreaktor erlauben, eine kontinuierliche Perfusion von Wachstumsmedium in den und aus dem Bioreaktor aufrechterhalten und das Ernten (Entfernen) von die Zellen und virale Partikel enthaltendem Wachstumsmedium und das Auffrischen des Wachstumsmediums (Ersatz des geernteten Wachstumsmediums durch frisches Wachstumsmedium) vereinfachen. Diese Bioreaktoren können für eine innere und/oder äußere Perfusion bezogen auf den Bioreaktor konfiguriert sein. Ein erfindungsgemäß verwendetes Bioreaktorsystem ist in Fig. 2 gezeigt.

Das Perfusionsbioreaktorsystem in Fig. 2 verwendet einen äußeren Hohlfaserperfusionsfilter mit einem Rohrleitungsmodul, das Zellen von der Retentatseite der Filtermembran zurück in den Reaktor zirkulieren läßt, während Abfallprodukte enthaltendes Wachstumsmedium von der Permeatseite entnommen wird. Die Porengröße des Filters wird so gewählt, daß es eine vollständige oder nahezu vollständige Retention viraler Partikel innerhalb des Bioreaktors gibt, wie bei Verwendung eines 500 kd MWCO®-Ultrafilters bis zu einem Filter mit einer Porengröße von 0,1 u. Unter der Kontrolle eines Füllstandsfühlers speist eine Förderpumpe frisches Medium ein, um innerhalb des Reaktors ein konstantes Volumen aufrechtzuerhalten. Zellen werden aseptisch durch ein Tauchrohr, das unter die Flüssigkeitsoberfläche in dem Bioreaktor reicht, geerntet. Dieses System bietet sich für Kulturen hoher Dichte an, wo es entscheidend ist, Zellen bei hoher Lebensfähigkeit und Vermehrungsrate zu halten, um Rückstände oder Bruchstücke in dem Bioreaktor zu minimieren.

Der Bioreaktor ist so eingestellt, daß er mit einer Perfusionsrate arbeitet, die die optimale Zelldichte für ein Zellsystem unterstützt, bevor die Zellvermehrungsrate und Lebensfähigkeit signifikant abnehmen. Darüber hinaus muß zur Aufrechterhaltung optimaler Zelldichte, Vermehrungsrate und Lebensfähigkeit das Wachstumsmedium geerntet werden, um die Zelldichte auf ein solches Maß "zurückzufahren", daß die Zelldichte nicht die maximale Dichte übersteigt. Die Zellen sollten geerntet werden, bevor die Zellen eine im stationären Zustand vorliegende Vermehrung erreichen, und die Zellen sollten im wesentlichen eine Steady-State-log-Phasen-Vermehrung aufweisen. Die Ernte kann kontinuierlich oder mit Unterbrechungen erfolgen. Der Prozentsatz des Volumens des Wachstumsmediums, der geerntet werden sollte, ist ungefähr gleich der Vermehrungsrate des Zellsystems (u), die gleich [ln (Zelldichte am Ende/Zelldichte zu Anfang)]/(Zeit am Ende - Zeit zu Anfang) · 100 ist. Wenn beispielsweise die Zelldichte alle 24 Stunden um 30% zunimmt, dann sollten pro Tag 30% des Reaktorvolumens geerntet werden. Für tägliche Ernten werden ungefähr 20% bis ungefähr 80% des Wachstumsmediums pro Tag geerntet; mehr bevorzugt werden ungefähr 20% bis ungefähr 50% des Wachstumsmediums pro Tag geerntet. Diese Ernte verringert auch die Bruchstücke in dem Bioreaktor durch Entfernung von toten Zellen, bevor sie lysieren. Darüber hinaus ermöglicht eine tägliche Ernte des Wachstumsmediums die Entfernung von viralen Partikeln in einem einzelnen, konzentrierten Produktstrom.

Der erfindungsgemäß verwendete Perfusionsfilter hat eine Porengröße, die einen Molekülmassen-Cut-off (Molekülmassenrückhaltevermögen), der sowohl das Zellsystem als auch virale Partikel zurückhält und eine Perfusion aufrechterhält, unterstützt. Die Bestimmung des Molekülmassen-Cut-off oder -rückhalte vermögens wird durch die Größe der viralen Partikel, die zurückgehalten werden sollen, bestimmt. Für eine erfindungsgemäße Produktion von HIV-Partikeln halten Sepracor, Inc., Typ A- Hohlfaserfilter mit 0,1 u-Poren und A/G Technology, Inc., Hohlfaser-Ultrafilter mit einem Molekülmassen-Cut-off von 500000 Dalton sowohl das Zellsystem als auch virale Partikel zurück und halten eine ungeschmälerte Perfusionsflußrate für durchschnittliche Zeitspannen von 5 bis 10 Tagen aufrecht, bevor ein Verstopfen die Perfusionsrate beeinflußt. Als eine Alternative zum Vorsehen eines einzelnen Filters unterstützen eine Mehrzahl von Perfusionsfiltern, die nacheinander verwendet werden, eine Perfusion während eines kontinuierlichen Virusproduktionslaufs; z. B. unterstützt eine Mehrzahl von 5 Perfusionsfiltern einen kontinuierlichen Bioreaktorlauf von ungefähr 5 Wochen.

Die Perfusionsfilterkomponente kann auch so betrieben werden, daß die automatische Regeneration eines Filters ermöglicht wird, wie beispielsweise durch eine aseptische in situ-Reinigung eines Perfusionsfilters mit einer alkalischen Lösung, wie wäßrigem Natriumhydroxid. Wenn der Transmembrandruck eines Filters einen bestimmten festgelegten Wert erreicht, da er zu verstopfen beginnt, beendet eine Regeleinrichtung die Zirkulation von das Zellsystem und virale Partikel enthaltendem Wachstumsmedium durch den Filter, spült den Filter mit mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS), um Zellen zu entfernen, reinigt den Filter mit einer alkalischen Lösung und spült den Filter mit PBS, bevor der Filter wieder in Dienst gestellt wird. Dieser Regenerationsschritt ermöglicht es, einen Filter an einem Bioreaktor für hohe Zelldichten ungefähr 3 Monate bei einer kontinuierlichen maximalen Perfusionsrate von ungefähr 4 Reaktorvolumen pro Tag zu betreiben. Dieses Ausmaß an Automatisierung verringert Entscheidungen und Manipulationen durch das Bedienungspersonal und reduziert auch Kosten, die mit der Verwendung von Hohlfasern verbunden sind. Das Trio-Klärsystem (Sepracor, Inc.) ist für diesen Filterregenerierungsschritt modifiziert.

Das Inokulum für den Bioreaktor wird gemäß bekannten Verfahren für die Gewebekultur hergestellt. Beispielsweise wird ein Zellsystem in einen T75-Gewebekulturkolben, der Wachstumsmedium enthält, das in der Lage ist, dessen Vermehrung zu unterstützen, wie RPMI 1640/10% fötales Rinderserum, zur Initiierung der Vermehrung gefüllt. Die Kultur wird nachfolgend in Rollflaschen expandiert, um mindestens ungefähr 2 · 10&sup5; Zellen/ml in dem Bioreaktor bereitzustellen. Höhere Beimpfungsdichten sind bevorzugt, um die Vermehrungsphase auf ungefähr 5 bis ungefähr 10 Tage zu minimieren. Nach der Inokulation des Bioreaktors mit einem HIV-infizierten Zellsystem wird, wenn die Zelldichte ungefähr 1 · 10&sup6; Zellen/ml erreicht, die Perfusion bei ungefähr einem Reaktorvolumen/Tag begonnen. Bei ungefähr 2 · 10&sup6; Zellen/ml wird die Perfusion auf ungefähr zwei Reaktorvolumen/Tag erhöht und bei ungefähr 4 · 10&sup6; Zellen/ml wird die Perfusion auf die maximale Rate von 4 Volumen/Tag erhöht. Da vier Reaktorvolumen/Tag eine maximale Dichte von mehr als 8 · 10&sup6; Zellen/ml unterstützen werden.

Die Zellen und virale Partikel enthaltenden Bioreaktorernten können gemäß bekannten Verfahren isoliert werden.

Retrovirale Partikel werden ebenfalls gemäß der Erfindung isoliert. Zu Beginn werden Bioreaktorernten, die Zellen und retrovirale Partikel enthalten, unter Verwendung eines Filters mit einer Porengröße von ungefähr 0,5 bis ungefähr 1,7, vorzugsweise ungefähr 0,7 bis ungefähr 1,5, mehr bevorzugt ungefähr 1,2 u geklärt, um die retroviralen Partikel hindurchzufiltrieren und Zellen und andere Rückstände zurückzuhalten. Die geklärten Ernten von infektiösen retroviralen Partikeln werden gepoolt und gut gemischt, um Homogenität sicherzustellen.

Die infektiösen retroviralen Partikel werden dann einer Inaktivierung durch Zugeben von β-Propiolacton (BPL) (zu ungefähr 0,25 ml BPL/l Überstand) unter kontinuierlichem Rühren, gefolgt von einer Inkubation der Mischung bei ungefähr 2ºC bis ungefähr 8ºC, vorzugsweise bei ungefähr 4ºC bis ungefähr 6ºC für ungefähr 18 bis ungefähr 24 h, unterworfen. Der Pool wird dann auf 37ºC erwärmt und bei dieser Temperatur ungefähr 2 bis ungefähr 5, vorzugsweise ungefähr 3 bis ungefähr 4 Stunden gehalten, um restliches BPL zu hydrolysieren. Dieser Schritt dient dazu, die Infektivität des Virus chemisch zu verringern, indem die verschiedenen Strukturkomponenten, wie Lipide, Proteine, Nukleinsäuren u. s. w., alkyliert werden. Eine BPL-Inaktivierung wird nicht als ein definitiver Inaktivierungsschritt angesehen und als solche sollten die mit BPL behandelten retroviralen Partikel nach wie vor als infektiös angesehen und als solche behandelt werden.

Die die mit BPL behandelten retroviralen Partikel enthaltende Lösung wird dann ungefähr zehn- bis ungefähr zwanzigfach durch Tangentialfluß-Ultrafiltration unter Verwendung einer Polysulfonmembran mit einem Molekülmassen-Cut-off von 300000 konzentriert. Das Konzentrat wird dann gegen ungefähr 5 bis ungefähr 10 Volumen PBS bei einem pH von ungefähr 7 bis ungefähr 8, vorzugsweise ungefähr 7,5 zur Gewährleistung der erforderlichen Pufferbedingungen für den nachfolgenden Anionenaustauschchromatographieschritt und zur Erhöhung der Bindungskapazität während jenes Chromatographieschritts diafiltriert. Dieser Schritt dient dazu, mehr als 90% des Albumins in dem Permeat zu entfernen, während die retroviralen Partikel zurückgehalten werden.

Die diafiltrierte Lösung, die die retroviralen Partikel enthält, wird durch eine oder mehrere Säulen, die Anionenaustauscherharz, wie TMAE Fractogelt (E. M. Merck) oder Q-Sepharose, enthält bzw. enthalten, hindurchgeleitet. Ein Tentakel-Anionenaustauscherharz ist bevorzugt, da die Stelle für das Binden anionischer Partikel auf diesem die höchste Bindungskapazität für Partikel viraler Größe hat und folglich die höchstgradige Reinigung im Vergleich zu Nicht-Tentakel-Anionenaustauscherharzen liefert. Die hohen Fließgeschwindigkeiten der Anionenaustauscherharze vereinfachen eine schnelle Reinigung großer Chargengrößen in einem in einer Einheit erfolgenden Verfahrensschritt im Vergleich zu isopyknischer Sedimentation, die die Verwendung mehrerer Ultrazentrifugen erfordert. Die kurzen Durchlaufdauern von Säulen erlauben es, daß Ausrüstungsgegenstände in den Lagerraum zurückkehren, was Raum für andere Verfahrensschritte, einschließlich Ultrafiltrationsvorgänge, verfügbar macht. Es ist wichtig, daß die Harze hinsichtlich ihrer Stabilität gegenüber NaOH, das zum Ablösen von fest gebundenem biologischen Material von Säulen, zur Desinfektion, Dekontamination und Inaktivierung von Endotoxin verwendet wird, ausgewählt wurden.

Das Anionenaustauscherharz sollte auch die Entfernung von Verunreinigungen vereinfachen, während es die strukturelle Unversehrtheit des der Reinigung unterworfenen viralen Partikels erhält. Anionische Verunreinigungen, wie DNA und Endotoxin, werden gemeinsam mit den viralen Partikeln aufkonzentriert, aber diese speziellen Verunreinigungen binden fest an die Harze, was die selektive Elution der viralen Partikel durch eine hohe Salzkonzentration, wie beispielsweise ungefähr 1,0 M NaCl, erlaubt. Jeder Anionenaustauschchromatographieschritt erzielt eine Verringerung um mindestens zwei log oder um vier log für die kummulative Verringerung anionischer Verunreinigungen für zwei Schritte. Größenausschluß-HPLC-, Western-Blot- und SDS-PAGE- Analysen der eluierten viralen Produkte zeigen ebenfalls keine nachweisbare strukturelle Veränderung bei den eluierten viralen Partikeln für mindestens ungefähr 24 Stunden. Eine Lagerung der eluierten viralen Partikel in dem Elutionspuffer für mehrere Tage führt tatsächlich zu einer nachweisbaren strukturellen Veränderung. Folglich wird die unverzügliche Verdünnung des Eluenten vorgeschlagen, um Dissoziierungsphänomene zu verhindern und Konsistenz der strukturellen Komponenten aufrechtzuerhalten, insbesondere für die Aufrechterhaltung des immunogenen Profils, wenn das Produkt in unvollständigem Freund-Adjuvans emulgiert wird.

Wenn eine diafiltrierte Lösung, die die retroviralen Partikel enthält, durch eine Säule, die das Tentakel-Anionenharz TMAE Fractogel® enthält, geleitet wird, wird das Harz nachfolgend mit ungefähr 0,1 bis ungefähr 0,55 M, vorzugsweise ungefähr 0,3 bis ungefähr 0,5 M, mehr bevorzugt ungefähr 0,5 M NaCl bei einem pH von ungefähr 6 bis ungefähr 7,5, vorzugsweise einem pH von ungefähr 6,2 bis ungefähr 6,8, mehr bevorzugt bei einem pH von ungefähr 6,5 gewaschen und unter Verwendung einer höheren NaCl- Konzentration bei ungefähr 0,6 bis ungefähr 2 M, vorzugsweise ungefähr 0,8 bis ungefähr 1,4 M, mehr bevorzugt ungefähr 1 M NaCl bei ungefähr 6 bis ungefähr 7,5, vorzugsweise einem pH von ungefähr 6,2 bis ungefähr 6,8, mehr bevorzugt einem pH von ungefähr 6,5 eluiert. Die Säule kann mit ungefähr 0,7 bis ungefähr 1,3 M, vorzugsweise ungefähr 1 M NaOH desinfiziert werden.

Die die retroviralen Partikel, insbesondere HIV, enthaltende eluierte Lösung wird in ausreichender Weise ungefähr vier- bis ungefähr achtfach, vorzugsweise sechsfach verdünnt, um die Salzkonzentration auf den Bereich von ungefähr 0,05 bis ungefähr 0,25 M, vorzugsweise ungefähr 0,1 bis ungefähr 0,2 M NaCl bei einem pH von ungefähr 6,2 bis ungefähr 7,7, vorzugsweise einem pH von ungefähr 6,6 bis ungefähr 7,5 zu verringern, um das teilweise Auseinanderfallen der HIV-1-Partikel zu verhindern, wenn sie der höheren NaCl-Konzentration des Eluenten für längere Zeitspannen, wie beispielsweise für mehr als ungefähr 18 Stunden, ausgesetzt werden. Die erste Säule ist der kritischste und effizienteste Reinigungsschritt in dem Verfahren, wobei eine ungefähr vierzigfache Reinigung im Verhältnis zu dem Gesamtprotein erzielt wird. Eine SDS-PAGE-Analyse zeigt, daß sich die Hauptmenge der Mediumkomponenten in dem Säulendurchlauf befindet, mehr Verunreinigungen durch das Waschen mit der NaCl-Waschflüssigkeit entfernt werden und für HIV-Partikel ein erkennbares Proteinmuster verglichen mit einem HIV-1-Referenzstandard aus der Elutionsfraktion bestimmt werden kann.

Nach Verdünnung und Mischen, um Homogenität sicherzustellen, wird die Lösung von retroviralen Partikeln auf ein zweites Anionenaustauscherharz, wie eine Q-Sepharose®-Säule, aufgegeben. Die zweite Applikation wird unter Verwendung von ungefähr der halben Menge Harz im Vergleich zu der Verwendung des ersten Harzes ausgeführt, wenn das erste Harz ein Tentakel-Anionenaustauscherharz war. Eine Chromatographie unter Verwendung von Q- Sepharose® wird ausgeführt, indem das Harz mit ungefähr 0,3 bis ungefähr 0,8 M, mehr bevorzugt ungefähr 0,6 M NaCl gewaschen wird und virale Partikel unter Verwendung eines Eluenten, wie in der ersten Harzanwendung beschrieben, eluiert werden.

Virale Partikel enthaltende Eluentfraktionen von ungefähr 1 M werden nach dem zweiten Anionenaustauschchromatographieschritt fünffach unter Verwendung eines Ultrafiltrations-Platten-und- Rahmen-Systems, das eine Polysulfan-Membran mit einem Molekülmassen-Cut-off von 300000 enthält, konzentriert. Das Konzentrat wird dann gegen Kochsalzlösung diafiltriert, um die Salzkonzentration auf isotonische Stärke zu verringern und Phosphatkonzentrationen in Vorbereitung einer Produktformulierung zu verringern. Das gereinigte Produkt wird bei -70ºC eingefroren und einer Cobalt- Bestrahlung (ungefähr 2 bis ungefähr 4,5 Megarad) für ungefähr 24 Stunden unterworfen. Diese Prozedur dient als der definitive Inaktivierungsschritt, indem Nukleinsäuren zu Stücken von ungefähr 200 Basenpaaren, wie durch PCR-Analyse bestimmt wurde, geschert werden.

Das Produkt wird verdünnt mit 0,9%iger Kochsalzlösung für eine Injektion formuliert, um die erforderliche Antigenkonzentration (p24-Konzentration) zu erzielen, und wird aseptisch mit einem gleichen Volumen von unvollständigem Freund-Adjuvans ungefähr 1 Stunde unter Verwendung einer Schüttelvorrichtung gemischt. Das fertige Material (Hauptimmunogen), das nun für eine aseptische Abfüllung bereit ist, erscheint als eine viskose, gebrochen weiße Emulsion.

Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele, die die erfindungsgemäßen Verfahren veranschaulichen, exemplifiziert, aber nicht beschränkt.

Die für eine Produktion von viralen Partikeln verwendete Wirtszellinie ist eine T-Lymphom-Zellinie, die chronisch mit infiziert ist und als IPL 1 bezeichnet wird, für die ein serumfreies Wachstumsmedium (IMAT) entwickelt wurde, das eine gute Virusproduktion und mit Zellen, die in 10% fötalem Rinderserum (FBS) kultiviert werden, vergleichbare Vermehrungsraten aufrechterhält. IMAT wird gebildet, indem Komponenten aus der folgenden Liste

KOMPONENTE KONZENTRATION

Transferrin, human (HOLO) HI (Miles) 0,010 g/l

Insulin, human rekombinant, Zn 0,010 g/l

Albumin, humanes Serum (25%) 5,0 ml/l

Cholesterol 0,00045 g/l

DL-α-Tocopherolacetat 0,0002 g/l

Lebertran 0,001 g/l

Linolsäure 0,000021 g/l

DL-α-Liponsäure 0,0000515 g/l

Tween 80 0,0025 ml/l

Ethanolamin, F. B. 0,000611 g/l

Pluronic F-68, NF-Qualität 1,000 g/l

RPMI 1640, das 4 g/l Glucose und 0,3 g/l L-Glutamin enthält, zugesetzt werden. Die Verringerung des Proteingehalts des serumfreien Mediums trägt zu der Effizienz der folgenden Weiterverarbeitung bei.

Zellen aus der Manufacturer's Working Cell Bank (MWCB) werden in T-Kolben, gefolgt von Spinner-Gefäßen oder Rollflaschen, wobei man von T25 → T75 → T150 → 850 cm²-Rollflasche fortschreitet, expandiert bzw. vermehrt, um ein Inokulum für den Bioreaktor bereitzustellen. Zum Zeitpunkt des Beimpfens mit einer minimalen Dichte von 2 · 10&sup5; Zellen/ml befinden sich die Zellen in exponentiellem Wachstum mit Lebensfähigkeiten über 65%. Diese Erfordernisse sind notwendig, um die Verzögerungsphase in dem Bioreaktor auf innerhalb von fünf Tagen nach dem anfänglichen Beimpfen zu minimieren. Wenn die Zellen sich zu vermehren beginnen, 24 Stunden nach dem Beimpfen, und eine Dichte zwischen 5 · 10&sup5; bis 9 · 10&sup5; erreichen, wird eine kontinuierliche Zufuhr von frischem Medium sichergestellt und verbrauchtes Medium wird kontinuierlich entfernt. Die Rate des Mediumaustauschs beginnt bei ungefähr 0,5 Reaktorvolumen/Tag und wird auf 4 Reaktorvolumen/Tag erhöht, wenn die Zelldichte ungefähr 2 bis ungefähr 4 · 10&sup6; Zellen/ml erreicht. In diesem Zustand kontinuierlicher Perfusion werden Zelldichten von ungefähr 8 · 10&sup6; erreicht, was eine Konsequenz eines Hinzufügens von Nährstoffen und eines Entfernens von Abfallprodukten auf kontinuierlicher Basis darstellt. Dementsprechend erzielt eine Perfusion typischerweise ungefähr zehn- bis ungefähr zwanzigfach höhere Zelldichten als die durchschnittliche tägliche Zelldichte, die in Spinner-Gefäßen erzielt wird, wo Zellen batchweise gezüchtet werden.

Die Konfiguration des Reaktors, die eine Retention von Zellen erlaubt, während eine kontinuierliche Perfusion aufrechterhalten wird, ist in Fig. 2 gezeigt. Das Prinzip umfaßt eine äußere Hohlfaser-Filtrationsvorrichtung mit einem Rohrleitungsmodul, das Zellen von der Retentatseite der Filtermembran zurück in den Reaktor zirkuliert, während verbrauchtes Medium von der Permeatseite abgezogen wird. Die Verwendung eines Hohlfaserfilters mit einer Porengröße von 0,1 um für die Entfernung von Abfallprodukten führt zu einer nahezu vollständigen Retention von viralen Partikeln innerhalb des Bioreaktors, wodurch eine Entfernung der viralen Partikel in der täglichen Ernte zusammen mit Zellen vereinfacht wird. Eine Förderpumpe führt frisches Medium zu, das ein konstantes Volumen unter der Kontrolle eines Füllstandsfühlers aufrechterhält. Wir haben bestimmt, daß für die IPL 1B MWCB eine Perfusionsrate von 4 Reaktorvolumen/Tag eine Dichte von ungefähr 6 bis ungefähr 8 · 10&sup7; Zellen/ml unterstützen wird, an welchem Punkt die Zellvermehrung eine stationäre Phase erreicht. Dieser Zustand wird zu einer Verringerung der Lebensfähigkeit der Kultur und/oder der Vermehrungsrate führen. Um Zellen mit einer optimalen Vermehrungsrate aufrechtzuerhalten, ist ein tägliches Ernten von Reaktorfluid, um Dichte "abzubauen", beispielsweise auf ungefähr 3 bis ungefähr 6 · 10&sup6; Zellen/ml, was grob äquivalent zu einem Ernten eines Drittels eines Reaktorvolumens/Tag ist, erforderlich. Dies hält auch hohe Lebensfähigkeit aufrecht und verringert Zellbruchstücke durch die Entfernung toter Zellen. Am wichtigsten ist, daß dieses tägliche Erntevolumen aus dem Inneren des Reaktors eine Entfernung viraler Partikel ermöglicht.

Der erste Schritt bei der Gewinnung und Reinigung viraler Partikel aus der täglichen Ernte erfordert eine Entfernung von Zellen und Zellbruchstücken unter Einsatz von Mikrofiltrationsverfahren. Dies umfaßt eine Verwendung einer "Dead-end"-Filtrationsvorrichtung unter Einsatz einer Membran mit einer Porengröße im Bereich von ungefähr 0,65 bis ungefähr 0,8 um. Diese Prozedur dient dazu, die Zellen und Zellbruchstücke von den viralen Partikeln zu trennen.

Diese Prozedur umfaßt typischerweise ein Hinzufügen von β- Propiolacton (BPL) zu geklärter Ernte zu einer Endkonzentration von 0,25 ml BPL pro Liter Überstand, gefolgt von einer Inkubation bei 4ºC für 18 bis 24 Stunden und dann bei 37ºC für 5 Stunden, um das BPL zu inaktivieren. Der Pool wird nachfolgend 0 bis 6 Tage bis zur Weiterverarbeitung bei 4ºC gehalten. Dieser Inaktivierungsschritt dient dazu, die Infektiosität der viralen Partikel durch Alkylieren der verschiedenen strukturellen Bestandteile des Virus, wie Lipide, Proteine, Nukleinsäuren u. s. w., chemisch zu verringern. Wir betonen, daß dieser BPL- Inaktivierungsschritt keine definitive Virusinaktivierung darstellt, und das Material wird nach wie vor als infektiös angesehen und wird als solches behandelt.

Man läßt das mit BPL behandelte Material Umgebungstemperatur erreichen und dieses wird zehn- bis zwanzigfach durch Tangentialfluß-Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran mit einem Molekülmassen-Cut-off von 300000 konzentriert. Der konzentrierte Pool wird dann gegen 5 bis 10 Volumen von mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,5, diafiltriert. Die Porengröße der in diesem Schritt verwendeten Membran dient dazu, HIV- Partikel zurückzuhalten, während mehr als 90% von menschlichem Serumalbumin und anderen Proteinen aus dem Wachstumsmedium und andere relativ kleine Moleküle in dem Permeat entfernt werden.

Der pH des konzentrierten und diafiltrierten Materials wird auf pH 7,5 eingestellt und auf eine TMAE Fractogel®-Harz enthaltende Säule mit einer linearen Fließgeschwindigkeit von 50 cm/h aufgeladen. Die Säule wird mit ungefähr 3 bis 5 Säulenvolumen 0,5 M NaCl, pH 6,5, gewaschen. Gebundenes Produkt wird dann unter Verwendung von 1,0 M NaCl, pH 6,5, eluiert und der gesamte Peak, der bei 280 nm eine Absorption zeigt, wird gesammelt. Die Säule wird nachfolgend nach Waschen mit 1 bis 2 Säulenvolumen 1,0 N NaOH desinfiziert. Das in der 1,0 M NaCl-Elutionsfraktion enthaltene Produkt wird sechsfach verdünnt, um die Salzkonzentration auf den Bereich von 0,1 bis 0,2 M NaCl und pH 6,5-7,5 zu verringern. Es wird dann auf eine Q-Sepharose Fast Flow®- Säule, die ungefähr die Hälfte der Harzmenge im Vergleich zu der TMAE Fractogel®-Säule enthält, mit einer linearen Fließgeschwindigkeit von 100 cm/h aufgetragen. Die Säule wird mit 3 bis 5 Säulenvolumen 0,6 M NaCl, pH 6,5, gewaschen. Das gebundene Produkt wird erneut unter Verwendung des 1,0 M NaCl-Puffers eluiert.

Die 1,0 M NaCl-Fraktion von der Q-Sepharose Fast Flow®-Säule wird ungefähr fünffach unter Verwendung einer Ultrafiltrations- Platten-und-Rahmen-Vorrichtung, die eine Membran mit einem Molekülmassen-Cut-off von 100000 bis 300000 enthält, konzentriert. Das Konzentrat wird dann gegen PBS, pH 7,5, diafiltriert, um die Salzkonzentration zu verringern. Um einen Produktverlust in Totraum nach der Konzentrierung zu minimieren, wird die Vorrichtung mit 1 Totraumvolumen Kochsalzlösung (0,9% NaCl) gespült und die Waschflüssigkeit der diafiltrierten Fraktion hinzugefügt. Das Material wird bei -70ºC eingefroren und einer Cobalt-Bestrahlung (2 bis 4,5 Megarad für ungefähr 24 Stunden) unterworfen, was als abschließender Virusinaktivierungsschritt dient.

In diesem Stadium wird das vorformulierte Produkt mit 0,9%-iger Kochsalzlösung für eine Injektion verdünnt, um die erforderliche Antigen-Konzentration (p24-Konzentration) zu erzielen, und ungefähr 15 bis 20 Minuten unter Verwendung einer Schüttelvorrichtung aseptisch mit einem gleichen Volumen unvollständigem Freund-Adjuvans gemischt.

Die Arbeit umfaßt die Charakterisierung von erfindungsgemäß hergestelltem, an gp 120 verarmtem HIV-1, das essentiell ist, um einen neuen Referenzstandard zu etablieren, um die Konsistenz von Charge zu Charge zu kontrollieren und Vergleichbarkeit zu durch das "klassische Verfahren" hergestelltem Material zu demonstrieren. Charakterisierungsdaten zeigen eine Vergleichbarkeit des Produkts mit Material, das durch die Batch-Kultur/Sucrose- Gradienten-Methodik hergestellt worden ist, unter Verwendung bekannter HPLC- (Fig. 3), Western Blot- (Fig. 4) und SDS-PAGE- (Fig. 5) -Prozeduren, Produktkonsistenz unabhängig davon, ob aus Ausgangsmaterial zu Beginn oder am Ende des Bioreaktorlaufs isoliert, gemäß Western Blot (Fig. 4) und Produktkonsistenz zwischen verschiedenen Bioreaktorläufen gemäß HPLC (Fig. 3).

Die Ausführung eines typischen Bioreaktorlaufs (Fig. 6) zeigt eine Vermehrungsphase, die bis Tag 6 andauert, zu welchem Zeitpunkt die Produktionsphase begonnen wurde, indem mit der täglichen Zellernte begonnen wurde. Die Produktionsphase dauerte 48 Tage. Fig. 6 zeigt, daß der Bioreaktor bei drei verschiedenen Steady-State-Zelldichten gehalten wurde, indem das Erntevolumen kontrolliert wurde. In diesem Lauf (Fig. 6) wird die Steady- State-Zelldichte bei ungefähr 3,5 · 10&sup6; Zellen/ml zwischen Tag 10 und 24, ungefähr 6 · 10&sup6; Zellen/ml zwischen den Tagen 28 und 43; und ungefähr 7 · 10&sup6; zwischen den Tagen 46 und 51 gehalten. Das Maß für die Produktivität, die p24-Konzentration, ist als Funktion der durchschnittlichen Zelldichte für jede Steady-State- Periode gezeigt. Höhere Zelldichten erhöhen klar die Ausbeute an p24. Zusätzlich ist eine schnellere Vermehrungsrate wünschenswert, da dies ein größeres Erntevolumen erfordert, um eine Steady-State-Zelldichte aufrechtzuerhalten. Da Produkt aus der täglichen Zellernte gewonnen wird, übersetzt sich dies in eine höhere tägliche Ausbeute an viralen Partikeln.


Anspruch[de]

1. Verfahren zum Reinigen viraler Partikel, bei dem man die viralen Partikel mit einem Tentakel-Anionenaustauscherharz in Kontakt bringt und die viralen Partikel von dem Tentakel- Anionenaustauscherharz eluiert, wobei das Tentakel-Anionenaustauscherharz ein Harz ist, bei dem sich derjenige Teil desselben, der die Kapazität hat, einen negativ geladenen Partikel zu binden, am Ende oder in der Nähe des Endes einer Spacer-Einheit befindet, das sich distal zu der Anbringungsstelle der Spacer-Einheit an der Grundgerüst-Komponente des Harzes befindet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man die viralen Partikel des Tentakel-Anionenaustauscherharzes ferner mit einem Anionenaustauscherharz in Kontakt bringt und die viralen Partikel von dem Anionenaustauscherharz eluiert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das Anionenaustauscherharz ein Q-SEPHAROSE-Harz ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man mit etwa 0,6 bis etwa 2 M NaCl eluiert.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man mit etwa 1 M NaCl eluiert.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Tentakel-Anionenaustauscherharz TMAE FRACTOGEL® ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man beim Reinigen das Tentakel-Anionenaustauscherharz ferner mit etwa 0,1 bis etwa 0,55 M NaCl nach dem In-Kontakt-Bringen und vor dem Eluieren wäscht.

8. Verfahren zum Reinigen retroviraler Partikel, bei dem man die retroviralen Partikel mit einem Tentakel-Anionenaustauscherharz in Kontakt bringt und die retroviralen Partikel von dem Tentakel-Anionenaustauscherharz eluiert, wobei das Tentakel-Anionenaustauscherharz ein Harz ist, bei dem sich derjenige Teil desselben, der die Kapazität hat, einen negativ geladenen Partikel zu binden, am Ende oder in der Nähe des Endes einer Spacer-Einheit befindet, das sich distal zu der Anbringungsstelle der Spacer-Einheit an der Grundgerüst- Komponente des Harzes befindet.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem man die retroviralen Partikel des Tentakel-Anionenaustauscherharzes ferner mit einem Anionenaustauscherharz in Kontakt bringt und die retroviralen Partikel von dem Anionenaustauscherharz eluiert.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das Anionenaustauscherharz ein Q-SEPHAROSE-Harz ist.

11. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem man mit etwa 0,6 bis etwa 2 M NaCl eluiert.

12. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem man mit etwa 1 M NaCl eluiert.

13. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem das Tentakel-Anionenaustauscherharz TMAE FRACTOGEL® ist.

14. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem man beim Reinigen das Tentakel-Anionenaustauscherharz ferner mit etwa 0,1 bis etwa 0,55 M NaCl nach dem In-Kontakt-Bringen und vor dem Eluieren wäscht.

15. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die retroviralen Partikel HTLV-1, HTLV-2, HIV-1, HIV-2 oder HIV sind, von dem die gp 120- und/oder 160-Proteine entfernt sind.

16. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die retroviralen Partikel HIV-1 sind.

17. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die retroviralen Partikel HIV sind, von dem die gp 120- oder gp 160-Proteine entfernt sind.







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