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Dokumentenidentifikation DE69422124T2 13.07.2000
EP-Veröffentlichungsnummer 0647408
Titel Verfahren zur Herstellung eines Proteinisolats mit erhöhtem Gehalt an Isoflavonen
Anmelder Protein Technologies International, Inc., Saint Louis, Mo., US
Erfinder Shen, Jerome L., St. Louis, Missouri 53109, US;
Guevara, Balagtas F., Sunset Hills, Missouri 63127, US;
Spadafora, Frank E., St Louis, Missouri 63104, US
Vertreter derzeit kein Vertreter bestellt
DE-Aktenzeichen 69422124
Vertragsstaaten BE, DE, FR, GB, IT, NL
Sprache des Dokument En
EP-Anmeldetag 12.10.1994
EP-Aktenzeichen 943074690
EP-Offenlegungsdatum 12.04.1995
EP date of grant 15.12.1999
Veröffentlichungstag im Patentblatt 13.07.2000
IPC-Hauptklasse A23J 3/16

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein mit Isoflavon angereichertes Pflanzenproteinisolat und auf ein Verfahren zum Herstellen desselben.

Isoflavone treten in einer Mannigfaltigkeit von Gemüsepflanzen auf, einschließlich Pflanzenproteinmaterialien wie beispielsweise Sojabohnen. Beispiele dieser Verbindungen, so weit sie sich auf die vorliegende Erfindung beziehen, umfassen Daidzin, 60AC-Daidzin, Daidzein, Genistin, 60AC-Genistin, Genistein, Glycitin, Biochanin-A, Formononetin und Coumestrol. Typischerweise sind diese Verbindungen mit dem inhärenten bitteren Aroma von Sojabohnen verbunden, und bei der Herstellung von herkömmlichen Produkten wie beispielsweise Isolaten und Konzentraten stand im Fokus, diese Materialien zu entfernen. Beipielsweise werden in einem herkömmlichen Verfahren für die Herstellung eines Sojaproteinisolats, bei dem Sojaflocken mit einem wäßrigen alkalischen Medium extrahiert werden, viele der Isoflavone in dem Extrakt löslich gemacht und verbleiben in der Molke gelöst, welche üblicherweise im Anschluß an Säurefällung des Proteins unter Bilden eines Isolats verworfen wird. Restliche in dem säuregefällten Proteinisolat verbleibende Isoflavone werden üblicherweise durch erschöpfendes Waschen des Isolats entfernt.

Es ist kürzlich anerkannt worden, daß die Isoflavone, die in Pflanzenproteinen wie beispielsweise Sojabohnen enthalten sind, das Wachstum von menschlichen Krebszellen inhibieren können, wie beispielsweise Brustkrebszellen und Prostatakrebszellen, wie in den folgenden Artikeln beschrieben: "Genistein Inhibition of the Growth of Human Breast Cancer Cells: Independence from Estrogen Receptors and the Multi-Drug Resistance Gene" von Peterson und Barnes, Biochemical and Biophysical Research Communications, Band 179, Nr. 1, Seiten 661-667, August 30, 1991; "Genistein and Biochanin A Inhibit the Growth of Human Prostrate Cancer Cells but not Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Autophosphorylation" von Peterson und Barnes, The Prostate 22 : 335-345 (1993) und "Soybeans Inhibit Mammory Tumors in Models of Breast Cancer" von Barnes et al. Mutagens and Carcinogens in the Diet, Seiten 239-253 (1990).

Ein Proteinmaterial, geeignet für Verabreichung in einer Diät, und welches reich an diesen Verbindungen ist, bei welchem vorhergehende Verfahren für die Herstellung von kommerziellen Proteinmaterialien große Bemühungen zum Entfernen gemacht haben, würde deshalb von beträchtlichem Wert für die Prophylaxe und Therapie von verschiedenen Krebsen sein.

Die vorliegende Erfindung liefert somit ein Verfahren zum Herstellen eines mit Isoflavon angereicherten Pflanzenproteinisolats, wobei das Verfahren umfaßt:

(a) Extrahieren eines Pflanzenproteinmaterials, enthaltend Isoflavone, mit einem wäßrigen Extraktionsmittel mit einem pH oberhalb des isoelektrischen Punkts des Materials unter Herstellen eines wäßrigen Extrakts von Protein und Isoflavonen,

(b) Einstellen des pH des wäßrigen Extrakts auf etwa den isoelektrischen Punkt des Proteinmaterials unter Fällen des Proteinmaterials und

(c) Abtrennen des gefällten Proteinmaterials und Waschen des gefällten Materials mit Wasser in einer Menge, bezogen auf das Gewicht, welche geringer als das Vierfache des Gewichts des gefällten Materials ist, und vorzugsweise geringer als das Zweifache des Gewichts des gefällten Materials unter zur Verfügung stellen eines mit Isoflavon angereicherten Proteinisolats.

In den letzten dieser Stufen wird, weil weiteres Waschen der Fällung minimiert wird, Entfernung von restlichen Isoflavonen verhindert, und das Verfahren liefert ein mit Isoflavon angereichertes Isolat. Zusätzlich werden, weil die Isoflavone leicht in dem verwendeten wäßrigen Extraktionsmittel zum Solubilisieren des Proteins löslich gemacht werden, spezifische Gewichtsverhältnisse von Proteinmaterial zu Wasser vorzugsweise verwendet, die Löslichmachung der Isoflavone während Extraktion zu maximieren.

Das sich ergebende Produkt kann dann in ein Nahrungsmittel oder in einen Vorläufer für ein Nahrungsmittel ohne irgendeine oder ohne wesentliche weitere Entfernung von Isoflavonen eingeführt werden.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung haben die Isoflavone von größtem Interesse die folgende allgemeine Formel (I):

[wobei R¹, R², R³ und R&sup4; gleich oder unterschiedlich sind, und jedes ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe oder eine Methoxygruppe darstellt] und Glucoside dieser Verbindungen. Genauer ausgedrückt, diese Verbindungen und Glucoside davon, welche aus Pflanzenproteinmaterialien isoliert worden sind, umfassen Daidzin, 60AC-Daidzin, Daidzein, Genistin, 60AC-Genistin, Genistein, Glycitin, Biochanin A, Formononetin und Coumestrol. Bevorzugte Isoflavone bei der vorliegenden Erfindung für die Zwecke von Isolatanreicherung umfassen Daidzin, 60AC-Daidzin, Daidzein, Genistin, 60AC-Genistin und Genistein.

Obwohl die vorliegende Erfindung im Hinblick auf Sojabohnenprodukte beschrieben wird und das Verfahren besonders geeignet für die Herstellung eines mit Isoflavon angereicherten Isolats aus Sojabohnenmaterialien ist, ist das vorliegende Verfahren trotzdem allgemein auf die Herstellung von Proteinisolaten aus einer Vielzahl von Pflanzenproteinquellen anwendbar, welche Isoflavone enthalten, und die folgende Beschreibung, so weit wie sie sich auf Sojabohnen und Produkte davon bezieht, gilt mutatis mutandis auch für andere Pflanzenproteinmaterialien, und insbesondere für Proteinmaterialien, die von anderen Samen einer Ölfrucht abstammen.

Das Ausgangsmaterial für die vorliegende Erfindung ist vorzugsweise Sojabohnenflocken, aus denen das Öl mittels Lösungsmittelextraktion entfernt worden ist. In der ersten Stufe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden die Flocken mit einem wäßrigen Extraktionsmittel mit einem pH oberhalb etwa des isoelektrischen Punkts des Proteinmaterials, vorzugsweise einem pH von 6,0 bis 10,0 und einem bevorzugtesten pH von 6,7 bis 9,7 extrahiert. Typische alkalische Reagenzien können gewünschtenfalls verwendet werden, den pH des wäßrigen Extraktionsmittels zu erhöhen, und es gibt keine besondere Beschränkung in Bezug auf die Natur von diesen, obwohl Reagenzien von Nahrungsmittelgrad einschließlich Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid und Calciumhydroxid bevorzugt sind. Die gewünschten Isoflavonverbindungen werden typischerweise in dem wäßrigen Extraktionsmittel solubilisiert und, um Gewinnung dieser Verbindungen in dem wäßrigen Extraktionsmittel zu maximieren, wird das Gewichtsverhältnis von Flocken zu wäßrigem Extrakt vorzugsweise auf bestimmte Niveaus kontrolliert, um so viel der inhärenten Isoflavone in den Proteinmaterialien löslich zu machen, wie möglich ist.

Extraktion der Proteine und Isoflavone kann in einer Vielzahl von Wegen einschließlich Gegenstromextraktion der Flocken, vorzugsweise bei einem Gewichtsverhältnis von wäßrigem Extraktionsmittel zu Flocken von 5 : 1 bis 12 : 1 durchgeführt werden, bei dem der anfängliche Extrakt verwendet wird, die Flocken zurück zu extrahieren und einen wäßrigen Extrakt von Protein und Isoflavonen zur Verfügung zu stellen. Alternativ kann ein Zwei-Stufen-Extraktionsverfahren verwendet werden, bei dem das Gewichtsverhältnis von Extraktionsmittel zu Flocken in der anfänglichen Stufe vorzugsweise etwa 8 : 1 umfaßt, und dann findet eine zweite Extraktion der Flocken mit frischem Extraktionsmittel vorzugsweise bei einem Gewichtsverhältnis von Extraktionsmittel zu Flocken von etwa 3 : 1 bis etwa 6 : 1 statt, so daß das kombinierte Gewichtsverhältnis von Extraktionsmittel zu Flocken in beiden Stufen vorzugsweise nicht ein Gesamtgewichtsverhältnis von Extraktionsmittel zu Flocken von etwa 11 : 1 bis 14 : 1 übersteigt.

Obwohl nicht kritisch, kann Extraktion bei Temperaturen bis zu etwa 49ºC (120ºF) für eine Zeitdauer zwischen etwa 5 und 60 Minuten, vorzugsweise etwa 15 Minuten, durchgeführt werden. Der pH des wäßrigen Proteinextrakts, der die zuvor beschriebenen Isoflavone enthält, wird dann auf etwa den isoelektrischen Punkt des Proteins eingestellt, vorzugsweise durch die Zugabe einer eßbaren Säure wie beispielsweise Essig-, Schwefel-, Phosphor- oder Salzsäure oder irgendeinem anderen geeigneten sauren Reagenz. Der isoelektrische Punkt für Sojaprotein ist allgemein zwischen etwa 4,0 und 5,0, und bevorzugter von etwa 4, 4 bis 4,6, und er ist auf einen pH innerhalb eines dieser Bereiche, auf den der Extrakt vorzugsweise eingestellt wird. Einstellung des pH auf den isoelektrischen Punkt fällt das Protein in der Form eines Quarks. Typischerweise wird bei der Herstellung eines herkömmlichen Proteinisolats das säuregefällte Protein von dem verbleibenden wäßrigen Extrakt, beschrieben als die Molke, abgetrennt und wird dann unter Entfernen von restlichen Aromas gewaschen oder behandelt. Das gewaschene Isolat wird dann vorzugsweise entwässert, wobei ein getrocknetes Isolat mit einem Proteingehalt auf einer Trockenbasis gebildet wird, welches normalerweise und vorzugsweise 90% überschreitet. Übermäßiges Waschen ist oft verwendet worden, unerwünschte Aromas zu entfernen, welche verschiedenen "phenolischen" Verbindungen in Sojabohnen wie beispielsweise den Isoflavonen zuzuschreiben sind.

Bei der vorliegenden Erfindung wird Waschen des gefällten Proteinmaterials minimiert, um wesentlich Entfernung der Isoflavone aus dem Proteinniederschlag zu reduzieren und dadurch ein mit Isoflavon angereichertes Isolat zur Verfügung zu stellen. Beispielsweise kann durch Minimieren des Waschens des gefällten Proteinmaterials die Gewinnung von Isoflavonen in dem getrockneten Proteinisolat mehr als verdoppelt werden. Waschen des säuregefällten Proteins mit Wasser ist deshalb beschränkt, vorzugsweise auf ein einzelnes Waschen mit Wasser, während dessen das Gewichtsverhältnis von Wasser zu Ausgangsproteinmaterial vorzugsweise zwischen etwa 2 : 1 und 4 : 1 liegt. Dieses reduzierte Waschen des säuregefällten Quarks liefert ein Isolat, angereichert mit den gewünschten Isoflavonen.

Das säuregefällte Protein wird dann vorzugsweise durch eine Kombination von Zentrifugation oder Konzentration entwässert und kann in einer herkömmlichen Weise getrocknet werden. Es ist nicht beabsichtigt, daß die vorliegende Erfindung durch irgendein besonderes Mittel des Entwässerns beschränkt wird, obwohl es bevorzugt wird, herkömmliche Trocknungstechniken zu verwenden, wie beispielsweise Sprühtrocknen, wodurch ein getrocknetes Isolat gebildet wird. Proteinisolate, hergestellt in der zuvor angegebenen Weise, liefern Isolate, welche erhöhte Mengen von Isoflavonen haben, im Vergleich zu einem herkömmlichen Isolat, wie in den nachfolgenden spezifischen aber nicht beschränkenden Beispielen veranschaulicht ist.

BEISPIEL 1

Um die erhöhten Spiegel von Isoflavonen in Proteinisolaten, hergestellt aufgrund der vorliegenden Erfindung, zu veranschaulichen, wurde ein herkömmliches Proteinisolat und Verfahren zum Herstellen desselben zuerst fertiggestellt, Gewinnung der gewünschten Isoflavone in einem herkömmlichen Verfahren zu zeigen. 45 kg (100 lbs) von entfetteten Sojabohnenflocken wurden in einen Extraktionstank gebracht und mit 454 kg (1000 lbs) auf 32ºC (90ºF) erhitztem Wasser extrahiert, zu dem ausreichend Calciumhydroxid unter Einstellen des pH auf 9,7 hinzugefügt wurde. Dieses lieferte ein Gewichtsverhältnis von Wasser zu Flocken von 10 : 1. Die Flocken wurden von dem Extrakt abgetrennt und mit 272 kg (600 lbs.) wäßrigem Extrakt mit einem pH von 9,7 und einer Temperatur von 32ºC (90ºF) rückextrahiert. Diese zweite Extraktionsstufe lieferte ein Gewichtsverhältnis von Wasser zu Flocken von 6 : 1. Die Flocken wurden mittels Zentrifugation entfernt, und die ersten und zweiten Extrakte wurden kombiniert und auf einen pH von 4, 5 mit Salzsäure eingestellt. Der säuregefällte Quark wurde von der Molke mittels Zentrifugation getrennt und dann mit Wasser in einer Gewichtsmenge von siebenmal derjenigen des Ausgangsmaterials unter zur Verfügung stellen eines Proteinisolats gewaschen. Analyse des Quarks, Molke, verbrauchten Flocken und Ausgangsmaterials wurde für Genistin (welches Genistin, Genistein und 60AC-Genistin einschließt) und Daidzin (welches Daidzin, Daidzein und 60AC-Daidzin einschließt) fertiggestellt. Analyse dieser Isoflavone wurde mithilfe des im nachfolgenden beschriebenen Verfahrens fertiggestellt:

VERFAHREN FÜR DIE MESSUNG VON GESAMTGENISTIN UND DAIDZIN

1. 0,25 g Sojaprodukt wird ausgewogen und zu 20 ml Extraktionslösung hinzugegeben, bestehend aus 80 Teilen Methylalkohol, 10 Teilen Wasser und 10 Teilen 3 N HCl.

2. Zusätzliche 20 ml 4 N HCl werden hinzugegeben, und die Mischung wird 10 Minuten lang gerührt.

3. Die Lösung wird mit einem Kondensator eine Stunde lang unter Rückfluß gekocht. 4. Die Lösung wird abgekühlt und durch Whatman #4 Filterpapier filtriert.

5. Ein 10 ml Aliquot wird entfernt, zu dem 10 ml Millipore Wasser und 0,4 ml Essigsäure hinzugegeben und gemischt werden.

6. Jede Lösung wird in eine HPLC Säule eingespritzt und in Bezug auf die zuvor angegebenen Isoflavonspiegel mittels UV Absorption gemessen.

Analyse des gefällten Quarks, Sojamolke, verbrauchten Flocken und Ausgangsmaterials für die zuvor angegebenen Isoflavone ist in Tabelle 1 dargelegt. Die Ergebnisse sind auch als ein Prozentsatz Gewinnung der bezeichneten Isoflavone aus dem Spiegel, der in dem Ausgangsmaterial enthalten ist, gezeigt.

TABELLE 1

Das zuvor angegebene Beispiel veranschaulicht deutlich, daß die gewünschten Isoflavone in einem herkömmlichen Verfahren hauptsächlich in der Molke konzentriert sind, welches zu geringen Spiegeln von Isoflavonen in den meisten herkömmlichen Proteinisolaten führt.

BEISPIEL 2

45 kg (100 lbs.) entfettete Sojabohnenflocken wurden in einen Extraktionstank gebracht und in einem kontinuierlichen Zweistufen-Gegenstromverfahren mit 363 kg (800 lbs.) auf 32ºC (90ºF) erhitztem Wasser extrahiert, zu dem ausreichend Calciumhydroxid zum Einstellen des pH auf 9,7 hinzugefügt war. Dieses lieferte ein Gewichtsverhältnis von Wasser zu Flocken von 8 : 1. Die Flocken wurden durch Zentrifugation entfernt, und der wäßrige Extrakt wurde auf einen pH von 4,5 eingestellt, um das Protein zu fällen, welches dann von der Molke durch Zentrifugation abgetrennt wurde. Der Quark wurde mit Wasser von Raumtemperatur gewaschen, welches gleich einem Gewichtsverhältnis des Zweifachen des Gewichts der Flocken war. Analyse wurde fertiggestellt, wie in Beipiel 1 beschrieben, und der Gewinnungsspiegel von Isoflavonen ist in Tabelle 2 dargelegt.

TABELLE 2

Die Gewinnungsergebnisse zeigen einen wesentlichen Anstieg in der Isoflavongewinnung in dem Quark im Vergleich zu Beispiel 1, wodurch ein mit Isoflavon angereichertes Sojaproteinisolat zur Verfügung gestellt wird.

BEISPIEL 3

Der säuregefällte Quark wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt, mit jener Ausnahme jedoch, daß im Anschluß an Säurefällung der Quark mit Wasser von Raumtemperatur gleich einem Gewichtsverhältnis des Vierfachen des Gewichts der Flocken gewaschen wurde. Die Gewinnung von Isoflavonen aus diesem Verfahren ist in Tabelle 3 aufgelistet.

TABELLE 3

Während Gewinnungsdaten einen wesentlichen Anstieg an Isoflavongewinnung in dem Quark im Vergleich zu Beispiel 1 zeigen, ist die Gewinnung geringer als in Beispiel 2 beschrieben ist.


Anspruch[de]

1. Verfahren zum Herstellen eines mit Isoflavon angereicherten Pflanzenproteinisolats, aufweisend:

(a) Extrahieren eines Pflanzenproteinmaterials, enthaltend Isoflavone, mit einem wäßrigen Extraktionsmittel mit einem pH Wert über dem isoelektrischen Punkt des Materials unter Herstellen eines wäßrigen Extrakts von Protein und Isoflavonen;

(b) Einstellen des pH Werts des wäßrigen Extrakts auf etwa den isoelektrischen Punkt des Proteinmaterials, um das Proteinmaterial zu fällen; und

(c) Abtrennen des gefällten Proteinmaterials und Waschen des gefällten Materials mit Wasser in einer Menge, bezogen auf das Gewicht, welche geringer als das Vierfache des Gewichts des Proteinmaterials ist, unter zur Verfügung stellen eines mit Isoflavon angereicherten Proteinisolats.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Extraktion bei einem pH von 6,0 bis 10,0 durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei Extraktion bei einem pH von 6,7 bis 9,7 durchgeführt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der pH des Extraktes auf einen Wert von 4,4 bis 4,6 eingestellt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Pflanzenproteinmaterial mit dem Extraktionsmittel bei einem Gewichtsverhältnis von Extrakt zu Material von 5 : 1 bis 12 : 1 extrahiert wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei Extraktion des Pflanzenproteinmaterials eine Doppelextraktion umfaßt, so daß das kombinierte Gewichtsverhältnis von Extraktionsmittel zu Material von beiden Extraktionen nicht ein Gesamtgewichtsverhältnis von 11 : 1 bis 14 : 1 überschreitet.

7. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das gefällte Proteinmaterial mit Wasser in einer Gewichtsmenge gewaschen wird, welche geringer als zweimal das Gewicht des Proteinmaterials ist.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, einschließend die Stufe des Entwässerns des mit Isoflavon angereicherten Isolats.







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