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Dokumentenidentifikation DE69701352T2 19.10.2000
EP-Veröffentlichungsnummer 0879219
Titel MARKER ZUR VERWENDUNG IN DER KOMBINATORISCHEN CHEMISCHEN SYNTHESE
Anmelder Abbott Laboratories, Abbott Park, Ill., US
Erfinder HOCHLOWSKI, Edie, Jill, Green Oaks, US;
SOWIN, J., Thomas, Wadsworth, US;
NORBECK, W., Daniel, Crystal Lake, US;
GRILLOT, Marie, Anne-Laure, Winnetka, US;
SWENSON, E., Rolf, Grayslake, US
Vertreter Schieber und Kollegen, 80469 München
DE-Aktenzeichen 69701352
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, ES, FR, GB, IT, LI, NL
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 10.09.1997
EP-Aktenzeichen 979414927
WO-Anmeldetag 10.09.1997
PCT-Aktenzeichen US9715975
WO-Veröffentlichungsnummer 9811036
WO-Veröffentlichungsdatum 19.03.1998
EP-Offenlegungsdatum 25.11.1998
EP date of grant 01.03.2000
Veröffentlichungstag im Patentblatt 19.10.2000
IPC-Hauptklasse C07B 61/00

Beschreibung[de]
MARKER ZUR VERWENDUNG IN DER KOMBINATORISCHEN CHEMISCHEN SYNTHESE TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung handelt von einem Verfahren zum Codieren und Identifizieren einzelner Verbindungen einer kombinatorischen chemischen Bibliothek, die auf einer Vielzahl fester Träger synthetisiert wurden. Der Verfahren bietet eine Möglichkeit zum Markieren der festen Träger mit einer codierenden Kennzeichnung, die mit Hilfe von Infrarot- oder Raman-Spektroskopie decodiert werden kann, während sie am festen Träger angelagert ist.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Typischerweise umfassen Methoden für die Synthese einer Vielzahl unterschiedlicher Verbindungen aufeinanderfolgende, chemische Modifikationen vorhandener Moleküle. Zu den Modifikationen gehören das Hinzufügen einer chemischen Einheit zu einer wachsenden Sequenz oder die Modifikation einer funktionellen Gruppe. Chemische Einheiten können viele Formen annehmen, sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische, einschließlich die von Verbindungen, die reaktive funktionelle Gruppen haben, z. B. Nucleophile, Elektrophile, Diene, Alkylierungsmittel, Acylierungsmittel, Diamine, Nucleotide, Aminosäuren, Zucker, Fette oder Derivate davon, organische Monomere, Synthone und Kombinationen daraus. Alternativ können Reaktionen beteiligt sein, die u. a. zu einer Alkylierung, Acylierung, Nitrierung, Halogenierung, Oxidation, Reduktion, Hydrolyse, Substitution, Elimination oder Addition führen. Dieser Verfahren kann Nicht-Oligomere, Oligomere oder Kombinationen hieraus in extrem kleinen Mengen hervorbringen, entsprechenden Fällen, durch die vorhandenen Marker bestimmt werden kann. Zu den Nicht-Oligomeren gehören eine Vielzahl organischer Moleküle, z. B. Heterocyclen, Aromaten, Alicyclische Verbindungen, Aliphatische Verbindungen und Kombinationen hieraus, wie z. B. Steroide, Antibiotika, Enzyminhibitoren, Liganden, Hormone, Arzneimittel, Alkaloide, Opioide, Terpene, Porphyrine, Toxine, Katalysatoren sowie Kombinationen hieraus. Zu den Oligomeren gehören Oligopeptide, Oligonucleotide, Oligosaccharide, Polylipide, Polyester, Polyamide, Polyurethane, Polyether, Poly(phosphorderivate) wie Phosphate, Phosphonate, Phosphoramide, Phosphonamide, Phosphite, Phosphinamide usw., Poly(schwefelderivate) wie Sulfone, Sulfonate, Sulfite, Sulfonamide, Sulfenamide usw., wobei in den Phosphor- und Schwefelderivaten die indizierten Heteroatome in den meisten Fällen an C, H, N, O und Kombinationen hieraus gebunden sind.

Reaktionen können Modifikationen an einer Vielzahl zufälliger Stellen einer zentralen Kernmolekularstruktur oder Modifikationen an spezifischen Stellen mit beinhalten. Zum Beispiel kann man eine polycyclische Verbindung bromieren, wobei die Bromierung an einer Vielzahl von Stellen geschehen kann, oder man verwendet ein Bromierungsmittel, das für eine bestimmte Stelle spezifisch ist, z. B. N-Bromsuccinimid. Typischerweise betreffen Reaktionen Einzelstellen oder äquivalente Stellen, z. B. eine oder zwei Hydroxylgruppen eines Glykols. In den meisten Fällen besteht die Hauptsynthese aus mindestens zwei Stufen, in denen andere Verbindungen als bifunktionelle angehängt werden unter Verwendung der gleichen Bindungsfunktionalität, z. B. Aminosäuren und Amidbindungen, Nucleotide und Phosphatesterbindungen, oder Nachahmerverbindungen davon, z. B. Aminoisocyanate und Harnstoffbindungen.

Die Synthesestrategie variiert je nach Natur der Produktgruppe, die hergestellt werden soll. Daher muss die Strategie die Fähigkeit in Betracht ziehen, die Natur des Produktes zu ändern, während es möglich ist, die Ergebnisse der vorhergehenden Stufen beizubehalten und, die Bedürfnisse der zukünftigen Stufen vorauszusehen. Wo die verschiedenen Einheiten zur gleichen Familie gehören, z. B. Nucleotide, Aminosäuren und Zucker, sind die synthetischen Strategien relativ gut ermittelt und häufig konventionelle chemische Techniken sind verfügbar. So können für Nucleotide Phosphoramidit- oder Phosphitchemietechniken eingesetzt werden; für Oligopeptide können Schutzmechanismen, z. B. Fluorenylmethyl (Fmoc), oder t- Butyloxycarbonyl (Boc) verwendet werden; für Zucker können die Strategien weniger konventionell sein, aber eine Vielzahl von Schutzgruppen, reaktiven Funktionseinheiten und Bedingungen sind für die Synthese von Polysacchariden eingeführt. Für andere Formen chemischer Techniken ist die Natur der einzelnen Einheit zu betrachten, und entweder sind synthetische Möglichkeiten bekannt oder sie müssen in geeigneter Weise ausgearbeitet werden.

Vor kurzem wurde n Techniken entwickelt, bei denen einzelne Einheiten sequenziell in einer kontrollierten oder zufälligen Weise hinzugefügt werden, um alle oder einen Großteil der möglichen Verbindungen herzustellen, die aus den verschiedenen Auswahlmöglichkeiten in jedem der aufeinanderfolgenden Schritte der Synthese resultieren. Ein Nachteil ist, daß einzelne Verbindungen nur in geringen Mengen vorhanden sind. Auch wenn die biologische Aktivität einer bestimmten Verbindung bestimmt werden, kann, gilt dies nicht notwendigerweise für die chemische Struktur dieser Verbindung. Verbindungen, die mit solchen Techniken hergestellt werden, müssen für Methoden zur Bestimmung ihrer Zusammensetzung zugänglich sein.

Es gibt ein beträchtliches Interesse an der Entdeckung von Methoden zur Herstellung von Verbindungen, die nicht auf die aufeinanderfolgende Addition ähnlicher Komponenten begrenzt sind, sondern häufig eine mehrstufige Synthese beinhalten, bei der die Reagenzien und/oder Bedingungen variiert werden, um eine Vielzahl von Verbindungen bereitzustellen. Es werden jedoch praktische Möglichkeiten benötigt, um die Strukturen der vielen Verbindungen zu kennzeichnen, die aus der Vielfalt der Modifikationen resultieren.

Daher besteht ein Bedarf, den Reaktionsverlauf für die identifizierte Verbindung oder deren Struktur aufzuzeichnen (siehe Geysen et al., Chemistry & Biology 3 (8): 679-688 (1996) und Chen et al., J. Org. Chem. 60 (17): 5736-5738 (1995)).

Da die Größe von Verbindungsbibliotheken zunimmt, führen bereits vorhandene Möglichkeiten zum Aufklären von Strukturen und Isolieren von Produkten zu erheblichen Ineffizienzen und Unbestimmtheiten, die die genaue Strukturbestimmung behindern. Daher besteht ein beträchtlicher Bedarf an neuen Methoden, die die Synthese komplexer kombinatorischer chemischer Bibliotheken ermöglichen, die wiederum die genaue Strukturbestimmung einzelner Verbindungen in der Bibliothek, die von Interesse sind, ohne weiteres ermöglichen.

KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren für die Codierung einzelner Verbindungen einer kombinatorischen chemischen Bibliothek unter Verwendung von angehängten Infrarot- oder Raman-Chromophoren. Das Verfahren ist vorgesehen für die partielle oder vollständige Identifikation eines Bibliotheksglieds oder des Synthesewegs, der zur Erzeugung dieser Verbindung auf einem beliebigen festen Träger führt.

Der feste Träger ist eindeutig markiert, um ein bestimmtes, normalerweise chemisches Ereignis, das mit der Synthese dieser Verbindung auf dem Träger zusammenhängt, unter Verwendung von codierenden Identifikationsmolekülen, zu definieren, die die aufeinanderfolgenden Ereignisse aufzeichnen, denen der Träger- Partikel während der Synthese ausgesetzt ist, wodurch ein Reaktionsweg für die auf dem Träger produzierte Verbindung erhalten wird.

Jede codierende Kennzeichnung ist unter den vorliegenden Synthesebedingungen stabil, bleibt während des Stadiums der Synthese, des Tests und der Bibliotheksabspaltung mit dem Träger verbunden, definiert eindeutig ein bestimmtes Ereignis während der Synthese, das eine bestimmte Reaktionswahl während einer bestimmten Stufe der Synthese wiederspiegelt, und ist von anderen Verbindungen unterscheidbar, die während des Tests vorhanden sein können. Die codierende Kennzeichnung ist kovalent an den festen Träger gebunden.

Indem jeder Stufe oder jeder Kombination von Stufen (z. B. "Reagenz A hinzugeben" oder "Reagenz A hinzugeben, danach Reagenz B, und 2 Stunden auf 100ºC erhitzen")der Synthesereihe eine Kennzeichnung zugeordnet wird, die die Auswahl der Variablen wie Reaktand, Reagenz, Reaktionsbedingungen oder eine Kombination daraus definiert, können die Kennzeichnungen dazu verwendet werden, den Reaktionsweg jedes definierbaren und trennbaren Substrats zu bestimmen. Die spektroskopische Analyse der Kennzeichnungen ermöglicht die leichte Identifikation des Reaktionswegs bei picomolaren oder geringeren Konzentrationen. Es kann eine Charakteristik eines Syntheseprodukts, normalerweise eine chemische oder biologische Charakteristik, durch verschiedene Screeningtechniken bestimmt werden, und dann kann der Reaktionsweg identifiziert werden und dadurch die Struktur jenes Produkts, das die gewünschte Charakteristik aufweist, aufgrund des/der Marker, der/die mit dem Produkt verbunden ist/sind.

Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Tatsache, daß der Code direkt vom Kügelchen abgelesen werden kann, was den Umfang der mit dem Marker kompatiblen Chemie sowie den Umfang der Test-Möglichkeiten erweitert: der/die Marker verbleiben während der partiellen oder vollständigen Freigabe der Bibliotheksentität auf dem Kügelchen.

Die Verwendung des unmittelbaren Multimarkersystems vermeidet die Notwendigkeit, eine komplizierte Cosynthese durchzuführen, die die Ausbeute reduziert und mehrere Schutzgruppen benötigt, und vermeidet die Notwendigkeit, sequentielle Marker (z. B. Nucleinsäure- oder Peptidoligomermarker) zu benutzen, die notwendigerweise chemisch labil sind. Sowohl die Notwendigkeit von mehreren Schutzgruppen als auch die immanente Instabilität aller bekannten sequentiellen Markermoleküle begrenzen stark die Chemie, die für die Synthese des Bibliothekselements oder des Liganden verwendet werden kann.

Die codierenden Kennzeichnungen dieser Erfindung werden in Kombination verwendet und bilden ein binäres oder höherwertiges Codiersystem, das die Verwendung einer relativ kleinen Zahl von Kennzeichnungen zum Codieren einer relativ großen Zahl von Reaktionsprodukten ermöglicht. Zum Beispiel können in einem Binärcode N Kennzeichnungen 2N verschiedene Verbindungen eindeutig identifizieren. So lassen sich mit 30 unterscheidbaren Markern mehr als 10&sup9; verschiedene Synthesen codieren. Ein ternäres Codiersystem könnte die gleiche Anzahl an Synthesen mit bedeutend weniger als 30 unterscheidbaren Markern codieren.

Darüberhinaus verringert die Verwendung eines binären oder höherwertigen Multimarkersystems enorm die Zahl der Marker, die zum Codieren des Reagenzes/der Reaktandenauswahl in jedem Schritt einer Synthese notwendig sind. Wenn zum Beispiel ein bestimmter Syntheseschritt mit 125 verschiedenen Auswahlmöglichkeiten für das Reagenz ausgeführt werden könnte, würde das Binärsystem lediglich 7 Marker benötigen. Desweiteren käme ein ternäres System mit wesentlich weniger Markern aus. Dies kann den Unterschied zwischen einem praktikablen und einem unpraktikablen Codiersystem ausmachen, da es möglicherweise nicht machbar ist, die große Anzahl unterscheidbarer Marker zu erhalten und zu verwenden, die von anderen Systemen benötigt werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung der Misch- und Spaltsynthesemethode zum Aufbau einer kombinatorischen chemischen Bibliothek.

Fig. 2 ist eine schematische Darstellung für die Verwendung von codierenden Kennzeichnungen (Markern) zum Identifizieren einzelner Glieder einer kombinatorischen chemischen Bibliothek, die durch eine Misch- und Spaltsynthesemethode hergestellt wurden.

Fig. 3 ist eine schematische Darstellung einer ersten Ausführungsform für die Verwendung von Linkern und Markern für die Bildung einer kombinatorischen chemischen Bibliothek.

Fig. 4 ist eine schematische Darstellung einer zweiten Anwendungsform für die Verwendung von Linkern und Markern für die Bildung einer kombinatorischen chemischen Bibliothek.

Fig. 5 ist eine schematische Darstellung für die Verwendung von Promarkern zum Codieren von Verbindungen einer kombinatorischen chemischen Bibliothek.

Fig. 6 ist eine schematische Darstellung für die Verwendung von Linke m und Markern oder Promarkern zum Codieren von Verbindungen einer kombinatorischen chemischen Bibliothek.

Fig. 7 zeigt die Verwendung eines Lysinlinkers zum Anlagern von codierenden Kennzeichnungen (Markern) an feste Träger in einer kombinatorischen chemischen Bibliothek.

Fig. 8 zeigt das erste FTIR-Spektrum.

Fig. 9 zeigt das zweite FTIR-Spektrum.

Fig. 10 zeigt das dritte FTIR-Spektrum.

Fig. 11 zeigt das vierte FTIR-Spektrum.

Fig. 12 zeigt das fünfte FTIR-Spektrum.

Fig. 13 zeigt das sechste FTIR-Spektrum.

Fig. 14 zeigt ein Raman-Spektrum.

Fig. 15 zeigt ein Raman-Spektrum.

Fig. 16 zeigt ein Raman-Spektrum.

Fig. 17 zeigt ein Raman-Spektrum.

Fig. 18 zeigt ein Raman-Spektrum.

Fig. 19 zeigt ein Raman-Spektrum.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG A. Definition der Ausdrücke

Der Ausdruck ",Halogenide", wie er hier verwendet wird, steht für Brom (Br), Chlor (Cl), Fluor (F) oder Iod (I).

Der Ausdruck Harz, wie er hier verwendet wird, bezeichnet Harze des Typs, die häufig in der Technik der synthetischen Peptiddarstellung oder in der organischen Festphasensynthese verwendet werden. Beispiele für solche Harze sind, ohne darauf beschränkt zu sein, Methylbenzhydrylamin (MBHA), Benzhydrylamin (BHA) oder Merrifield-Harz (d. h. chlormethyliertes Polystyrol), Wang-Harz, Tentagel, Rink usw.

Geeignete Schutzgruppen für Amide sind t-Butyloxycarbonyl (BOC), Benzyloxycarbonyl (Cbz), 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), Allyloxycarbonyl (Alloc), Biphenyloxycarbonyl (Bpoc) und Triphenylmethyl (Trityl).

Zu den gängigen Lösungsmitteln gehören N,N- Dimethylformamid (DMF), 1,2-Dimethoxyethan (DME), Dichlormethan (DCM), Dimethylacetamid (DMA).

Gängige Kupplungsreagenzien zur Herstellung von Amidbindungen sind: N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), N,N'- Diisopropylcarbodiimid (DIC), Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat (BOP), Bis(2- oxo-3-oxazolidinyl)phosphinchlorid (BOPCl), Brom-trispyrrolidino-phosphoniumhexafluorphosphat (PyBroP).

Weitere gängige Abkürzungen sind: 4-Dimethylaminopyridin (DMAP), Trifluoressigsäure (TFA), Triethylamin (TEA), 1,3- Diaminopropionsäure (DAP).

Innerhalb des Kontexts dieser Patentanmeldung werden IR- und Raman-Spektroskopie synonym verwendet, da beide Methoden die Energiedifferenz zwischen dem Grundzustand und dem angeregten Zustand bestimmter funktioneller Gruppen messen, die auch als Chromophore bekannt sind. Der gewöhnliche Fachmann würde meinen, daß es sich um zwei verschiedene Methoden handelt. IR erfordert eine Änderung des Dipolmoments im angeregten Zustand, während Raman eine Änderung der Polarisation der funktionellen Gruppe benötigt. Daher ist ein Nitril für beide Spektroskopieformen geeignet, da es polarisiert werden kann und einen Dipol aufweist. Ein Acetylen eignet sich jedoch weit mehr für Raman, da es polarisierbar ist und sein Dipolmoment vernachlässigbar ist. Ein Acetylen kann jedoch ein signifikantes Dipolmoment aufweisen, wenn jeder Alkinkohlenstoff an signifikant unterschiedliche Substituenten gebunden ist.

8. Codierverfahren

In der kombinatorischen Synthese werden Klassen strukturell verwandter Verbindungen oder Bibliotheken auf festen Trägern konstruiert. Jede einzelne Verbindung der Bibliothek (z. B. jede einzelne chemische Struktur) liegt in jeweils mehreren Kopien auf einer Vielzahl an festen Trägern vor. Die vorliegende Erfindung liefert einen Verfahren zum Codieren einzelner Verbindungen einer kombinatorischen chemischen Bibliothek, die auf einer Vielzahl fester Träger synthetisiert wurden, und umfasst den Schritt kovalente Anlagerung einer codierenden Kennzeichnung, die durch Infrarot- oder Raman- Spektroskopie nachgewiesen werden kann, an jeden einzelnen der vielen festen Träger. Die codierende Kennzeichnung besteht aus einem oder mehreren Markern und/oder Promarkern, die durch IR- und/oder Raman-Spektroskopie nachweisbar sind. Das Vorhandensein oder das Fehlen der Kennzeichnung auf dem festen Träger oder das Verhältnis von einer oder mehreren Kennzeichnungen auf dem festen Träger liefert einen Code für die einzelne chemische Struktur auf dem Träger oder die chemischen Schritte, die zum Erzeugen dieser Struktur verwendet wurden.

Eine Bibliothek ist definiert als eine Sammlung einzelner chemischer Entitäten. Eine Bibliothek kann unter Verwendung von zwei Strategien hergestellt werden. In einer Strategie wird die Bibliothek durch die organische Festphasensynthese diskreter Verbindungen auf einzelnen festen Trägern wie Kügelchen präpariert. Die große Zahl der Verbindungen, die in einer Bibliothek erzeugt werden, wird durch eine Misch- und Spaltstrategie erhalten, die in der kombinatorischen Chemie gängig ist. Die Chemie zur Herstellung der Bibliothek kann aus einer Anlagerung eines geeignet geschützten Kerns mit mehreren verschiedenen Stellen bestehen. Bei jedem Schritt der Misch- und Spaltstrategie wird eine Schutzgruppe entfernt und Diversomere (diverse Reaktanden, die eine Funktionalität für die chemische Anlagerung besitzen) werden angelagert. Gemäß einer zweiten Strategie wird die Bibliothek durch die sequenzielle Addition jedes Diversomers an den erweiterten chemischen Kern hergestellt, der aus den vorherigen Diversomeren wie Festphasenpeptid- oder Oligonucleotidsynthese hervorgegangen ist.

In einer bevorzugten Ausführung wird ein Verfahren der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit der Misch- und Spaltmethode (siehe Fig. 1) verwendet. Wie in Fig. 1 dargestellt ist, wird ein Pool fester Träger, mit geeigneten Stellen für die Bibliothekssynthese derivatisiert, in so viele Subpools wie nötig gespalten und jeder Subpool mit einem anderen Reagenz umgesetzt. Die Subpools werden dann miteinander gemischt und erneut gespalten, wodurch eine statistische Verteilung jedes derivatisierten Kügelchens in jedem Subpool sichergestellt wird. Der zweite Schritt der Synthese wird danach ausgeführt und jeder Subpool mit einem anderen Reagenz umgesetzt. Die Pools werden gemischt und gespalten und ein weiterer Syntheseschritt wird ausgeführt. In dem in Fig. 1 gezeigten Beispiel werden in jedem der drei Schritte drei Reagenzien verwendet und insgesamt 3³ = 27 Verbindungen durch die Ausführung von lediglich 3 · 3 = 9 Reaktionen sowie zwei Misch- und Spaltschritten hergestellt.

Allgemein gilt, wenn n Reagenzien bei jedem Schritt verwendet und m Schritte ausgeführt werden, werden nm Verbindungen durch die Ausführung von n · m Reaktionen synthetisiert. Jeder feste Träger wird mit nur einer Verbindung derivatisiert. Die Menge der Verbindung auf einem festen Träger ist abhängig von der Größe des festen Trägers und liegt in der Größenordnung von 10 Pikomol bis 1 Nanomol. Eine Verbindungsidentifikation nach Freigabe vom Träger unter Verwendung von Standardanalysemethoden (¹H NMR, ¹³C NMR) ist deshalb nicht möglich, es sei denn, es werden ungewöhnlich große Kügelchen verwendet. Die Massenspektroskopie wird für gewöhnlich eingesetzt, ist jedoch unzureichend.

Die Verwendung eines codierenden Verfahrenes der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit einer Misch- und Spaltstrategie ist schematisch in Fig. 2 dargestellt. Bei jedem chemischen Schritt und für jeden Subpool der Bibliothek wird ein Satz mit einer oder mehreren codierenden Kennzeichnungen, die für den Syntheseschritt und die in diesem Schritt verwendeten Reaktanden eindeutig sind, kovalent an den festen Träger gebunden. Das Ablesen der Marker nach der Bibliothekssynthese an einem bestimmten festen Träger liefert den chemischen Verlauf für diesen spezifischen Träger und deshalb die Struktur der Verbindung, die auf diesem festen Träger vorhanden ist.

In einer Ausführung ist der feste Träger (z. B. ein Kügelchen) so ausgelegt, daß zwei Stellen für die Einlagerung vorhanden sind. Eine erste Stelle ermöglicht die Einlagerung der einzelnen Verbindung der Bibliothek über einen passenden Linker.

Eine zweite Stelle ermöglicht die Einlagerung des Markers. Als Beispiel wird ein IR-unterscheidbarer Marker chemisch am epsilon-Stickstoff eines alpha-geschützten Lysins (Lys), Ornithins (Prn) oder Daps gebunden. Jeder chemische Schritt wird durch die kovalente Anlagerung von alphageschütztem Lys, Orn oder Dap, welche den/die IR-Marker enthalten, an das Kügelchen codiert. Bei der weiteren Ausführung jedes einzelnen Schritts der Bibliothekssynthese wird die alpha- Schutzgruppe von Lys, Orn oder Dap entfernt und ein anderes alpha-geschütztes Lys, Orn oder Dap mit einem anderen unterscheidbaren IR-Marker angebunden. Auf diese Weise lassen sich viele Reaktionen markieren.

Die alpha-Schutzgruppe kann eine Fmoc-, Bpoc, Alloc- oder eine andere gängige Schutzgruppe sein, deren Abspaltung kompatibel mit und orthogonal zum verwendeten Linker und der verwendeten Bibliothek ist. Die IR-Signatur des Kügelchens kann entweder vor oder nach der Abspaltung ausgelesen werden, und, auf der Basis des beobachteten IR-Signals kann die Reaktionsweg des Kügelchens ermittelt werden.

1. Feste Träger

Feste Träger für die Verwendung in der kombinatorischen chemischen Synthese sind auf diesem Gebiet bestens bekannt (siehe z. B. International Patent Publication No WO94/08051). Ein gängiger fester Träger ist ein Polystyrolkügelchen. Je nach Natur des synthetischen Verfahrens oder des Tests für das Endprodukt kann ein bestimmtes Kügelchen mehr oder weniger wünschenswert sein. Auch wenn Kügelchen besonders geeignet sind, können andere feste Träger eingesetzt werden, z. B. Glaskapillaren oder Hohlfasern wie Baumwolle, bei denen die Größe des festen Trägers die gewünschte Variation der Reaktionsverläufe zulässt. Jede günstige Zusammensetzung kann für Partikel oder Kügelchen verwendet werden, bei der während der unterschiedlichen Verfahrenschritte die mechanische Integrität erhalten bleibt, die funktionalisiert werden kann, bereits funktionelle Gruppen besitzt oder die Reaktion mit einer aktiven Substanz erlaubt, die die serielle Synthese sowie die Anlagerung von Kennzeichnungen zuläßt, ohne weiteres gemischt und gespalten werden kann, und die eine einfache Ablösung von Markern und Produkten ermöglicht.

Ein bevorzugter fester Träger ist ein Kügelchen. Verwendbare Kügelchen sind z. B. Cellulosekügelchen, poröse Glaskügelchen, Silicagel, Polystyrolkügelchen, insbesondere mit Divinylbenzol quervernetzte Polystyrolkügelchen, aufgepropfte Copolymerkügelchen wie Polyethylenglykol/Polystyrol, Polyacrylamidkügelchen, Latexkügelchen, Dimethylacrylamidkügelchen, insbesondere solche, die mit N,N'- bis-Acryloylethylendiamin quervernetzt sind und N-t -Butoxycarbonyl-β-alanyl-N'-acryloylhexamethylendiamin- Zusammensetzungen enthalten, z. B. Glaspartikel, die mit einem hydrophoben Polymer wie quervernetztem Polystyrol oder einem fluorierten Ethylenpolymer beschichtet sind, worauf lineares Polystyrol aufgepropft ist; und ähnliche. Allgemeine Übersichten über nützliche feste Träger (Partikel), die eine kovalent gebundene, reaktive Funktionalität enthalten, sind in Atherton et al., Prospectives in Peptide Chemistry, Karger, 101-117 (1981), Amamath et al., Chem. Rev., 77: 183-217 (1977) und Fridkin, The Peptides, Vol. 2, Chapter 3, Academic Press, Inc., (1979), pp. 333-363 zu finden.

Ein weiterer bevorzugter fester Träger ist ein Polystyrol- oder Polyethylenglykolharz. Solche Harze können von kommerziellen Quellen (Wang, NovaSyn-PEG) bezogen werden oder gemäß den Standardprozeduren hergestellt werden, die auf diesem Gebiet bestens bekannt sind. Die Darstellung eines Wang- Polystyrolharzes wird später in den Beispielen ausführlich beschrieben.

Je nach Natur der Synthese können die Kügelchen oder das Harz auf vielfache Weise funktionalisiert werden, um die Anbindung des Startreaktanden zu ermöglichen. Zu den auf dem Kügelchen vorhandenen Funktionalitäten gehören Hydroxy, Carboxy, Aminohalogen, Amino, Thio, aktives Halogen (Cl oder Br) oder Pseudohalogen (z. B. -CN, Toluolsulfonyl, Methansulfonyl, Bromsulfonyl, Trifluorsulfonyl). Bei der Auswahl der Funktionalität sollte der Tatsache einige Aufmerksamkeit geschenkt werden, daß die Kennzeichnungen normalerweise auch an das Kügelchen gebunden werden. Dabei ist zu berücksichtigen, ob die gleiche oder eine andere Funktionalität mit dem Produkt und der Kennzeichnung verbunden werden soll, sowie die Frage, ob die beiden Funktionalitäten mit den Schritten Produkt- oder Kennzeichnungsanlagerung und Markerablösung kompatibel sind, wie erforderlich. Verschiedene Bindungsgruppen können für das Produkt eingesetzt werden, so daß eine spezifische Menge des Produkts selektiv freigesetzt werden kann. In manchen Fällen kann der Träger geschützte Funktionalitäten haben, deren Schutz teilweise oder vollständig vor jedem Schritt aufgehoben werden kann, und die im letzten Fall erneut geschützt werden können. Zum Beispiel kann eine Aminogruppe mit einer Carbobenzoxygruppe wie in der Polypeptidsynthese oder eine Hydroxygruppe mit einem Benzylether geschützt werden.

2. Codierende Kennzeichnungen

Codierende Kennzeichnungen, die gemäß eines Verfahrenes der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können alle chemischen Verbindungen sein, die kovalent an den festen Träger gebunden werden können und ohne weiteres nachweisbar sind. In einer bevorzugten Ausführung sind die Kennzeichnungen Infrarot(IR)- oder Raman-aktive Chromophore. Solche Chromophore sind auf diesem Gebiet bestens bekannt. Um die Kennzeichnung von chemischen Strukturen in der kombinatorischen Bibliothek zu unterscheiden, wird bevorzugt, daß die codierende Kennzeichnung Absorptionsbanden im Bereich von etwa 1700 cm&supmin;¹ bis etwa 2500 cm&supmin;¹ aufweist. Beispielhafte und bevorzugte Chromophoren mit Absorptionsbanden im Bereich von 1700 cm&supmin;¹ bis 2500 cm&supmin;¹ sind Nitrile, Acetylene, Cyclopentylketone, gamma-Lactone, deuteriummarkierte organische Verbindungen usw. Tabelle 1 zeigt die Struktur und die charakteristischen Absorptionswellenlängen beispielhafter Nitril- und Acetylenmarker für IR- bzw. Raman- Spektroskopie. Tabelle 1 ist jedoch nicht als Beschränkung zu verstehen.

Tabelle 1a Nitrilhaltige Verbindung Nitril-Wellenlänge (cm&supmin;¹)
Tabelle 1b
Wenn über Amid an Lysin gebunden Acetylenhaltige Verbindung Acetylen-Wellenläncie (cm-1)

Wo die für die Konstruktion der kombinatorischen Bibliothek verwendeten chemischen Reaktionen derart sind, daß sie möglicherweise Wechselwirkungen mit der Anlagerung einer codierenden Kennzeichnung aufweisen, kann das aktuelle Infrarot- oder Raman-aktive Chromophor später aus einem IR- oder Raman- Promarker gebildet werden, der an den festen Träger gebunden ist. Beispielhafte Promarker sind Verbindungen, die eine geschützte Amin-, eine geschützte Thiol-, Aldehyd-, Oxim-, primäre Amid- oder N-Formylgruppe enthalten. Spezifische Beispiele für Promarker (R) und die daraus resultierenden aktiven Chromophore (R&sub1; und R&sub2;) sind in Tabelle 2 zu finden.

Tabelle 2

Eine schematische Darstellung für die Verwendung einer solchen Vorstufe für die Kennzeichnung befindet sich in Fig. 5. Wie in Fig. 5 dargestellt, kann ein IR-Promarker über eine Amidbindungskupplungsreaktion kovalent an ein freies Amin des Polystyrolharzes gebunden werden. Nach Freigabe des neuartigen chemischen Gebildes vom Kügelchen und Aufheben des Schutzes für alle funktionellen Gruppen am Promarker wird der IR-Marker durch chemische Derivatisierung des Promarkers aktiviert und abgelesen.

Zu den Methoden für die Aktivierung gehört die Verwendung von Cyanbromid oder Phosphoroxychlorid zur Bildung von Cyanamiden, Thiocyanaten, Nitrilen und Isonitrilen. Spezifische Beispiele für Aktivierungsmittel sind weiter unten dargestellt. Cyanamide aus Aminen:

Das mit einem freien Amin derivatisierte Kügelchen wird in eine 0,25 M Lösung von Cyanbromid in DMF eingetaucht. Nach 18 Stunden wird das Kügelchen entfernt und mit DMF, DCM und Diethylether gewaschen.

Thiocyanate aus Thiolen:

Das mit einem freien Thiol derivatisierte Kügelchen wird in eine 0,25 M Lösung von Cyanbromid in DMF eingetaucht. Nach 18 Stunden wird das Kügelchen entfernt und mit DMF, DCM und Diethylether gewaschen.

Nitrile aus Aldehyden:

(Erst Bildung des Oxims, dann Dehydrierung des Oxims)

Oximbildung: Das Kügelchen wird in eine 0,25 M Lösung von 1 : 1 Hydroxylaminhydrochlorid-TEA in 1 : 1 THF-Ethanol eingetaucht. Nach 18 Stunden wird das Kügelchen entfernt und mit Methylenchlorid und Methanol gewaschen.

Nitril aus Oxim: Das Kügelchen wird in eine 0,25 M Lösung von POCl&sub3; in 1,2-Dichlorethan eingetaucht. Die Lösung wird 2 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die Lösung wird abgekühlt und das Kügelchen entfernt und mit DCM und Methanol gewaschen.

Alternativ wird das Kügelchen in reines POCl&sub3; eingetaucht und 2 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die Lösung wird abgekühlt und das Kügelchen entfernt und mit DCM und Methanol gewaschen.

Nitrile aus primären Amiden:

Das Kügelchen wird in eine 0,25 M Lösung von POCl&sub3; in 1,2-Dichlorethan eingetaucht. Die Lösung wird 2 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die Lösung wird abgekühlt und das Kügelchen entfernt und mit DCM und Methanol gewaschen.

Alternativ wird das Kügelchen in pures POCl&sub3; eingetaucht und 2 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die Lösung wird abgekühlt und das Kügelchen entfernt und mit DCM und Methanol gewaschen.

Isonitrile aus N-Formylamiden:

Das Kügelchen wird in eine 0,25 M Lösung von POCl&sub3; in 1,2-Dichlorethan eingetaucht. Die Lösung wird 2 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die Lösung wird abgekühlt und das Kügelchen entfernt und mit DCM und Methanol gewaschen. Alternativ wird das Kügelchen in pures POCl&sub3; eingetaucht und 2 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die Lösung wird abgekühlt und das Kügelchen entfernt und mit DCM und Methanol gewaschen.

Mehrfachcodes

Ein Verfahren unter Verwendung von Promarkern kann für die Codierung so vieler chemischer Schritte wie notwendig wiederholt werden (siehe Fig. 6). Gemäß Fig. 6 werden Boc- und Fmoc-geschützte Amingruppen einer Behandlung mit TFA unterzogen, um die Boc-Schutzgruppe zu entfernen. Ein gewünschter Linker und ein Bibliotheksgerüst werden dann an das ungeschützte Amin angelagert. Die Gerüstgruppe enthält Alloc- und Bpoc- Schutzgruppen für die spätere Manipulation. Die Alloc- Schutzgruppe kann entfernt werden, z. B. durch die Behandlung mit Palladium (Pd(O)). Ein erster Satz Diversomere kann dann an den Kern angelagert werden. Die Fmoc-Schutzgruppe an dem anderen Amin wird danach entfernt, z. B. durch Behandlung mit Piperidin.

Im Anschluss an die Aufhebung des Schutzes des Amins wird ein Promarker an das freie Amin angelagert. Nach einem Misch- und Spaltschritt wird die Bpoc-Schutzgruppe entfernt und ein zweiter Satz Diversomere an die Bibliotheksverbindung angelagert. Eine zweite Behandlung mit Piperidin entfernt die Fmoc-Schutzgruppe am Promarker und ermöglicht die Kupplung neuer Marker. Die Misch- und Spaltmethoden, mit Aufhebung des Schutzes zusätzlich zu nachfolgenden Monomeren, kann dann fortgesetzt werden, bis ein einzelnes Kügelchen mit Markern sowie der gewünschten Bibliotheksverbindung derivatisiert ist. Der Vorteil dieses Systems besteht darin, daß die Freisetzung der Bibliotheksverbindung von dem Kügelchen nicht die Freisetzung der Marker fördert. Eine Analyse nach der Abspaltung mit Hilfe der notwendigen spektrophotometrischen Methode ermöglicht die Verbindungsidentifikation des einzelnen Kügelchens.

Auch wenn die Beschreibung für Promarker erfolgte, kann die Mehrfachcodierung auch für bereits funktionsfähige Marker verwendet werden.

3. Anlagerung der codierenden Kennzeichnung an festen Träger

Die Kennzeichnungen werden kovalent an den festen Träger angelagert. Das genaue Mittel für die Anlagerung von Kennzeichnungen an den festen Träger ist, wie auf diesem Gebiet bestens bekannt, abhängig von der chemischen Struktur der Kennzeichnung und der Natur des festen Trägers. Zum Beispiel kann die kovalente Anlagerung einer Nitrilsäure-Kennzeichnung an einen festen Polystyrolträger durch Bildung einer Amidbindung von der Nitrilsäure an eine Aminfunktion des Polystyrolkügelchens hergestellt werden. Wenn die codierende Kennzeichnung ein Acetylen-Nitril ist, kann die kovalente Anlagerung an den festen Träger unter Verwendung eines mit Palladium katalysierten Acetylens erfolgen, das an eine Haloaromatische Verbindung kuppelt, die auf dem festen Träger generiert wurde. Eine ausführliche Beschreibung einer solchen Bindungsstrategie ist in den Beispielen zu finden.

Die Verwendung der oben bekannt gegebenen Methoden führt zu einer direkten kovalenten Bindung der Kennzeichnung an den festen Träger. In einer alternativen Ausführung ist eine Bindekomponente oder ein Linker zwischen dem Träger und der Kennzeichnung angeordnet. Bei Einsatz eines Linkers kann die Anlagerung an den festen Träger entweder vor (siehe Fig. 3) oder nach (Fig. 4) der Anlagerung der codierenden Kennzeichnung oder des codierenden Markers erfolgen.

Falls die Ablösung des Produkts erwünscht ist, gibt es zahlreiche Funktionalitäten und Reaktanden, die verwendet werden können. Praktischerweise können Ether verwendet werden, wo substituierter Benzylether oder Derivate davon, z. B. Benzylhydrylether, Indanylether usw., unter sauren oder leicht reduzierenden Bedingungen abgespalten werden kann. Alternativ kann die β-Eliminierung eingesetzt werden, wo eine milde Base zum Freisetzen des Produkts dienen kann. Acetale, einschließlich deren Thioanaloga, können verwendet werden, wo milde Säure, insbesondere in Gegenwart einer einfangenden Carbonylverbindung, dienlich sein kann. Durch Kombination von Formaldehyd, HCl und einer Alkoholkomponente wird ein α-Chlorether gebildet. Dieser kann dann mit einer Hydroxyfunktion auf dem Kügelchen gekuppelt werden, um das Acetal zu bilden. Mehrere photolabile Bindungen können eingesetzt werden, z. B. O-Nitrobenzoyl-, 7-Nitroindanyl-, 2-Nitrobenzhydrylether oder -ester. Ester und Amide können als Linker dienen, wo halbsaure Ester oder Amide gebildet werden, insbesondere mit cyclischen Anhydriden und nachfolgender Reaktion mit Hydroxyl- oder Aminofunktionen auf dem Kügelchen unter Verwendung eines Kupplungsmittels wie DCC. Peptide können als Linker verwendet werden, wo die Sequenz einer enzymatischen Hydrolyse unterworfen wird, insbesondere wo das Enzym eine spezifische Sequenz erkennt. Carbonate und Carbamate können unter Verwendung von Kohlensäurederivaten, z. B. Phosgen, Carbonyldiimidazol und milde Base, hergestellt werden. Der Linker kann unter Verwendung einer Säure, Base oder eines starken Reduktionsmittels abgespalten werden.

Wo ein Linker verwendet wird, können Funktionalitäten auf dem festen Träger durch eine nicht-labile Bindung wie eine Esterbindung, Amidbindung, Aminbindung, Etherbindung oder über ein Schwefel, Silicon oder ein Kohlenstoffatom modifiziert werden, je nachdem, ob das Produkt vom Kügelchen oder Harz entfernbar sein soll. Praktischerweise ist die Bindung an dem Kügelchen oder Harz permanent. Alternativ kann die Bindung zwischen dem Linker und dem Kügelchen oder Harz labil oder abspaltbar sein. Je nach Natur der Bindungsgruppe, die an den Partikel gebunden ist, sind reaktive Funktionalitäten auf dem Kügelchen möglicherweise nicht notwendig, wenn die Art der Bindung die Insertion in eine Einfach- oder Doppelbindung zulässt, wie es bei Carbenen und Nitrenen oder anderen hochreaktiven Spezies der Fall ist. In diesem Fall kann die spaltbare Bindung in der Bindungsgtuppe zur Verfügung gestellt werden, die das Produkt mit dem Kügelchen verbindet.

Ein bevorzugter Linker ist ein Lys-, Orn- oder Dap- Linker, der mit einer photoabspaltbaren Schutzgruppe an der epsilori-, gamma- oder delta-Aminogruppe geschützt ist. Begrenzte Bestrahlung führt zu einer partiellen Abspaltung dieser photoabspaltbaren Gruppe, also zur Freigabe einer Stelle für die Einlagerung der IR- oder Raman-Marker. Eine schematische Darstellung für die Verwendung eines solchen Linkers befindet sich in Fig. 7.

Wie aus Fig. 7 ersichtlich, wird ein kommerziell erhältliches Polystyrol(PS)- oder Polystyrol/Polyethylenglycol(PS/PEG)-Harz, das mit einer Aminomethylgruppe derivatisiert ist, an ein orthogonal funktionalisiertes Lysin, oder Ornithin oder Dap-basierte Einheit gekuppelt. Die alpha-Aminogruppe wird mit einem saure- oder baselabilen Linker derivatisiert, auf dem die Bibliothek konstruiert werden soll. Ein Beispiel für einen solchen Linker ist - die geschützte 4-Hydroxymethylphenoxyessigsäure (Wang- Linker), die eine Schutzgruppe trägt, die die Alkoholfunktion maskiert. Die delta-, gamma- oder epsilon-Aminosäure wird mit einer photoabspaltbaren Schutzgruppe derivatisiert.

Eine erste codierende Kennzeichnung (Marker 1) wird dadurch eingelagert, daß das Harz zeitlich begrenzt dem Licht ausgesetzt wird, um partielle Schutzgruppenabspaltung an der epsilon-Position herbeizuführen, wodurch die reaktive Aminofunktion teilweise freigegeben wird. Dieses Amin wird dann mit einer IR- oder Raman-codierenden Kennzeichnung gekuppelt unter Verwendung von chemischen Standardreaktionen (z. B. Aminbildung, wenn der IR- oder Raman-Marker eine Carbonsäurekomponente enthält). Pools von verschieden codiertem Harz werden dann erhalten. Der erste Schritt der Bibliothekssynthese wird ausgeführt, gefolgt von einem Misch- und Spaltschritt. Der zweite Schritt der Bibliothekssynthese wird ausgeführt, gefolgt von einer Bestrahlung, um die verbliebene Schutzgruppe auf der epsilon-Aminogruppe teilweise zu entfernen.

Eine zweite codierende Kennzeichnung (Marker 2) wird dann eingeführt und die Pools wieder gemischt und gespalten. Dieses Verfähren kann wiederholt ausgeführt werden, um so viele chemische Schritte wie erforderlich, zu codieren. Am Ende der Synthese wird ein einzelnes Kügelchen mit der codierenden Kennzeichnung und der Bibliotheksverbindung derivatisiert. Die Freisetzung der Bibliotheksverbindung von dem Kügelchen fördert nicht die Freisetzung der codierenden Kennzeichnung. Die Analyse des Kügelchens nach der Abspaltung, mit Hilfe der entsprechenden spektroskopischen Methode, erlaubt die Verbindungsidentifikation für das einzelne Kügelchen.

II. Identifikationsverfahren

Unter einem verwandten Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifikation einzelner Verbindungen einer kombinatorischen chemischen Bibliothek. Die differentielle Anlagerung von einer oder mehreren markierenden Kennzeichnungen bei jedem Schritt während der Synthese, bei dem es als wünschenswert erachtet wird, einzelne Pools des festen Trägermaterials zu codieren, erzeugt einen Code. Nach Abschluss der Synthese einer kombinatorischen Bibliothek, die die oben erwähnten codierenden Kennzeichnungen enthält, kann der einzelne Syntheseweg, auf dem ein beliebiges Kügelchen erzeugt wurde, durch Aufnahme eines Infrarot- oder Raman-Spektrums von diesem Kügelchen, entweder bevor oder nachdem die chemische Bibliotheksentität entfernt wird, identifiziert werden. Eine Analyse der Bandenfrequenzen, die durch eine (oder beide) Spektroskopietechnik(en) beobachtet wurde, führt zu einer eindeutigen Zuordnung des Synthesewegs.

IR- oder Raman-aktive Marker können eingesetzt werden, um einen Code aufgrund ihres Vorhandenseins oder Fehlens zu erzeugen (d. h. in einem binären Codeschema Werte wie 001, 010, 100, 011, 101, 111) oder durch eine Multicode-Signatur, bei der das Verhältnis der Marker zueinander ebenfalls kennzeichnend ist (d. h. Marker-1/Marker-2 (1 : 1), Marker-1/Marker-2 (4 : 1), Marker- 1/Marker-2 (1 : 4) usw.), oder wo das Verhältnis der Marker zu einem externen Standard wie einer Polystyrolbande ebenfalls signifikant ist (d. h. Marker-1/Marker-2 (1 : 1), Marker-1/Marker-2 (2 : 2) usw.).

Durch Bereitstellung von N codierenden Kennzeichnungen, von denen jede M unterscheidbare Zustände aufweist, können MN unterschiedliche Synthesen eindeutig codiert werden. Wenn M = 2 ist (z. B. können die zwei Zustände das Vorhandensein oder das Fehlen einer Kennzeichnung sein), würde die Synthese durch einen Code auf der Basis 2 oder einen Binärcode definiert. Im Fall M = 3 (wo die drei Zustände das Vorhandensein der Kennzeichnung in zwei unterscheidbaren Konzentrationen oder deren Fehlen sein könnten) wäre die Synthese einen Code mit der Basis 3 definiert. Bei M> 2 spricht man von Codes höherer Ordnung. Der Vorteil von Codes höherer Ordnung gegenüber einem Binärcode ist der, daß weniger Kennzeichnungen notwendig sind, um die gleiche Menge an Informationen über die Synthese zu codieren. Die gebildeten Produkte werden als Ergebnis einer seriellen Synthese definiert. Bei jedem Schritt der Synthese gibt es mehrere Reaktanden und/oder Reagenzien und/oder Bedingungen, die zu einem Merkmal des -Produkts bezüglich eine identifizierbaren und normalerweise separierbaren Entität, z. B. Marker, führen. Die Synthese kann einzelne Reaktanden mit einbeziehen, die in das Produkt eingelagert werden. Alternativ kann ein Schritt ein oder mehrere Reaktionen beinhalten, die zu einer Modifikation eines Reaktionszwischenprodukts führen. In vielen Fällen sind Kombinationen dieser Möglichkeiten beteiligt.

Unter Verwendung eines Codes auf der Basis 2 oder Binärcodes (M = 2) und drei Kennzeichnungen (N = 3) lassen sich 8 (2³) Agenzien in einem bestimmten Schritt einer Synthese codieren. In gleicher Weise lassen sich mehr Informationen über die Synthese durch mehr Kennzeichnungen codieren. Z. B. würden 9 Kennzeichnungen (N = 9) und ein Code auf der Basis 2 (M = 2) die Codierung von bis zu 2&sup9; oder 5¹² verschiedenen Reagenzauswahlmöglichkeiten erlauben. Ein Beispiel für die Verwendung eines Binärcodes und sechs Kennzeichnungen ist nachfolgend dargestellt. Die sechs Kennzeichnungen sind als R&sub1; - R&sub6; gekennzeichnet.

Für diese Darstellung werden die Kennzeichnungen R&sub1; bis R&sub6; in einer Misch- und Spaltmethode verwendet, wie weiter oben beschrieben und in den Fig. 1 und 2 dargestellt ist. Die einzelnen Verbindungen der kombinatorischen Bibliothek werden durch spektrophotometrische Analyse jedes Pools identifiziert. Ein Binärcode wird verwendet, um das Vorhandensein (J) oder die Abwesenheit (N) jeder einzelnen Kennzeichnung zu kennzeichnen. Beispielhafte Ergebnisse für eine solche Analyse sind in Tabelle 3 aufgeführt.

Tabelle 3a
Tabelle 3b

Die Identifikation der chemischen Natur oder der Syntheseschritte, die zur Konstruktion einer unbekannten Verbindung verwendet werden, lässt sich durch Bestimmen des Binärcodes für diese Unbekannte und Vergleich mit den vorher festgelegten Binärcodes aus Tabelle 3 bewerkstelligen. Wenn zum Beispiel eine unbekannte Verbindung eine spektrophotometrische Aktivität nur bei einer Wellenlänge von 2207 cm&supmin;¹ und 2225 cm&supmin;¹ aufweist (d. h. der Wellenlänge von R&sub3; und R&sub5;), würde ein Binärcode von (001 010) anzeigen, daß die Unbekannte unter Verwendung der beiden Pools C und Y erzeugt wurde.

Die Verwendung eines Codes mit der Basis 3 (M = 3) ermöglicht die Codierung und Identifikation einer größeren Anzahl von Bibliotheksverbindungen unter Verwendung von ebenso vielen oder sogar weniger Kennzeichnungen. Zum Beispiel würde die Verwendung eines Codes auf der Basis 3 (M = 3) und von drei Kennzeichnungen (N = 3) ermöglichen, 27 (3³) Bibliotheksverbindungen zu codieren und zu identifizieren.

Eine weitere Möglichkeit zum Identifizieren von Bibliotheksverbindungen nach einem Verfahren der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Bestimmung des Verhältnisses von codierenden Kennzeichnungen auf einzelnen festen Trägern. Ein Beispiel für eine solche Möglichkeit für die Identifikation befindet sich in Tabelle 4. Die Angaben in dieser Tabelle illustrieren die Bildung von 25 Pools markierter fester Träger unter Verwendung der Acetylen-Nitril-Kennzeichnungen aus Tabelle 1.

Tabelle 4

Eine ausführliche Beschreibung für die Verwendung einer solchen Verhältnismethode zur Identifizierung ist in den Beispielen zu finden.

Die nachfolgenden Beispiele stellen bevorzugte Ausführungen der vorliegenden Erfindung dar und begrenzen die Ansprüche oder Spezifikationen in keinster Weise. Ein gewöhnlicher Fachmann wird ohne weiteres verstehen, daß Änderungen und Modifikationen an diesen Ausführungen vorgenommen werden können, ohne vom wahren Umfang der Erfindung abzuweichen.

BEISPIELE Beispiel 1. Synthese von markiertem Wang-Harz

Chromtrioxid (CrO&sub3;, 7,0 g, 70 mM) wurde in einem Kolben unter Argonatmosphäre gesetzt. Trimethylsilylchlorid ((CH3)&sub3;SiCl, 9,7 mL 76 mM) wurde über eine Spritze 5 Minuten lang hinzugegeben und die Lösung 30 Minuten bei 35ºC gerührt. DCM (200 mL) wurde hinzugegeben und das Argongas durchsprudelte heftig die Suspension, um überschüssiges (CH&sub3;)&sub3;SiCl zu verdampfen. Iod (I&sub2;, 12,2 g, 48 mM) und Polystyrol (10 g, 96 mM) wurde hinzugegeben und die Suspension 4 Stunden bei Raumtemperatur kräftig gerührt. Eine Lösung von gesättigtem Natriumbisulfit wurde dann langsam hinzugegeben, bis ein Farbumschlag von orange auf grün in der Suspension und keine weitere Blasenbildung mehr beobachtet wurde. Die Suspension wurde auf einen Glasfiltertrichter aufgegeben und das Harz nacheinander mit destilliertem Wasser, DMF, Wasser, 2 N HCl, destilliertem Wasser, DMF, destilliertem Wasser, Methanol, DCM und Methanol gewaschen (500 mL Aliquote, wobei jedem Lösungsmittel 5 Minuten für die Gleichgewichtseinstellung gelassen wurde). Das dabei gebildete p-Iodpolystyrol (unten dargestellt) wurde unter Vakuum getrocknet und aufbewahrt.

Das oben synthetisierte p-Iodpolystyrol (5 g) wurde in trockenem DCM (200 mL, destilliert von CaH) gelöst, 1 Stunde bei Raumtemperatur quellen gelassen und dann unter einer Argonatmosphäre in einem Eisbad auf 0ºC abgekühlt. Chlormethylmethylether (10 mL, 130 mM) und SnCl&sub4; (90,5 mL, 4,3 mM) wurde langsam zu dieser gerührten Suspension über separate Spritzen hinzugegeben. Die Suspension wurde eine weitere Stunde bei 0ºC unter einer Argonatmosphäre gerührt, auf einen Filtertrichter aufgebracht und nacheinander mit Dioxan/destilliertem Wasser (1 : 1), Dioxan/2 N HCl (1 : 1), destilliertem Wasser, Dioxan, destilliertem Wasser, Methanol, DCM und Methanol gewaschen (500 mL Aliquote, wobei jedem Lösungsmittel 5 Minuten für die Gleichgewichtseinstellung gelassen wurde). Das Produkt, p-Iod-p-chlormethylpolystyrol (unten dargestellt), wurde unter Vakuum getrocknet und aufbewahrt. Elementaranalyse ergab: Cl = 11,61 Gewichts-%, I = 24,93 Gewichts-%.

Das Chlormethyliodpolystyrol (3,22 g) wurde in DMA (100 mL) gelöst und bei Raumtemperatur 30 Minuten quellen gelassen. 4-Hydroxybenzylalkohol (7,7 g, 62 mM) und Natriummethoxid (1,7 g, 31 mM) wurde zu der Suspension hinzugegeben und das Reaktionsgemisch 48 Stunden unter Rückfluß unter einer Argonatmosphäre erhitzt. Die Suspension wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, auf einen Filtertrichter aufgegeben und nacheinander mit Dioxan/destilliertem Wasser (1 : 1), Dioxan/2 N HCl (1 : 1), destilliertem Wasser, Dioxan, destilliertem Wasser, DMF, destilliertem Wasser, DMF, destilliertem Wasser, Methanol, DCM und Methanol gewaschen (500 mL Aliquote, wobei jedem Lösungsmittel 5 Minuten für die Gleichgewichtseinstellung gelassen wurde). Das Produkt (Wang- Iodpolystyrol, unten dargestellt) wurde unter Vakuum getrocknet und aufbewahrt.

Das wie oben beschrieben synthetisierte Wang- Iodpolystyrol (100 mg) wurde in einem Lösungsmittelgemisch aus DMF/destilliertem Wasser/TEA (9 : 1 : 1) (insgesamt 5 mL Lösungsmittel) gelöst und 30 Minuten bei Raumtemperatur quellen gelassen. Eine vorgemischte Lösung aus DMF (0,5 mL) mit 5-Cyano- 1-pentin (100 mg, 1,07 mM) und 2-Methoxy-5-cyanophenylacetylen (50 mg, 0,32 mM) wurde zur Suspension der Polymerkügelchen hinzugegeben. Kaliumcarbonat (50 mg, 0,36 mM) und Tetrabutylammoniumbromid (50 mg, 0,16 mM) wurde hinzugegeben und die Suspension unter Argonatmosphäre 30 Minuten gerührt. Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (0) (25 mg, 0,02 mM) wurde schnell hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf 80ºC erhitzt, bei dieser Temperatur 16 Stunden unter einer Argonatmosphäre gerührt und dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Als das Gemisch Raumtemperatur erreicht hatte, wurde eine gesättigte Ammoniumacetatlösung (5 mL) hinzugegeben und das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dimethoxyethan (5 mL) wurde dann hinzugegeben und das Gemisch weitere 30 Minuten gerührt, danach auf einen Filtertrichter aufgegeben und nacheinander mit destilliertem Wasser, DMF, destilliertem Wasser, 2 N HCl, destilliertem Wasser, DMF, destilliertem Wasser, Methanol, DCM und Methanol gewaschen (je 50 mL, wobei jedem Lösungsmittel 10 Minuten für die Gleichgewichtseinstellung zwischen den Waschschritten gelassen wurde), um markiertes Wang- Harz zu erhalten (unten dargestellt, wobei R&sub1; entweder das 5- Cyano-1-pehtin oder das 2-Methoxy-5-cyano-phenylacetylenderivat ist und beide möglicherweise auf einem einzelnen Kügelchen angordnet sind).

Beispiel 2 Synthese und Decodierung einer markierten OH kombinatorischen Bibliothek A. Herstellung von unterschiedlich markiertem Wang 1. Markiertes Wang 1

Das wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisierte Wang- Iodpolystyrol (100 mg) wurde in einem Lösungsmittelgemisch aus DMF/destilliertem Wasser/TEA (9 : 1 : 1) (5 mL) gelöst und 30 Minuten bei Raumtemperatur quellen gelassen. Eine vorgemischte Lösung aus DMF (0,5 mL), die 5-Cyano-1-pentin (50 mg, 0,53 mM) und 2-Methoxy-5-cyanophenylacetylen (50 mg, 0,32 mM) enthält, wurde zu der Polymerkügelchensuspension hinzugegeben, gefolgt von Kaliumcarbonat (50 mg, 0,36 mm) sowie Tetrabutylammoniumbromid (50 mg, 0,16 mM), und die Suspension 30 Minuten unter Argonatmosphäre gerührt. Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (0) (25 mg, 0,02 mM) wurde schnell hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf 80ºC erhitzt, bei dieser Temperatur 16 Stunden unter einer Argonatmosphäre gerührt und dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Als das Gemisch Raumtemperatur erreicht hatte, wurde eine gesättigte Ammoniumacetatlösung (5 mL) hinzugegeben und das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. DME (5 mL) wurde dann hinzugegeben und das Gemisch weitere 30 Minuten gerührt, danach auf einen Filtertrichter aufgegeben und nacheinander mit destilliertem Wasser, DMF, destilliertem Wasser, 2 N HCl, destilliertem Wasser, DMF, destilliertem Wasser, Methanol, DCM und Methanol gewaschen (je 50 mL, wobei jedem Lösungsmittel 10 Minuten für die Gleichgewichtseinstellung zwischen den Waschschritten gelassen wurde). Das Produkt wurde unter Vakuum getrocknet um markiertes Wang 1 zu erhalten.

2. Markiertes Wang 2

Das wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisierte Wang- Iodpolystyrol (100 mg) wurde in einem Lösungsmittelgemisch aus DMF/destilliertem Wasser/TEA (9 : 1 : 1) (5 mL) gelöst und 30 Minuten bei Raumtemperatur quellen gelassen. Eine vorgemischte Lösung aus DMF (0,5 mL), die 5-Cyano-1-pentin (100 mg, 1,07 mM) und 2-Methoxy-5-cyanophenylacetylen (25 mg, 0,16 mM) enthält, wurde zu der Polymerkügelchensuspension hinzugegeben, gefolgt von Kaliumcarbonat (50 mg, 0,36 mm) sowie Tetrabutylammoniumbromid (50 mg, 0,16 mM), und die Suspension 30 Minuten unter einer Argonatmosphäre gerührt.

Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (0) (25 mg, 0,02 mM) wurde schnell hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf 80ºC erhitzt, bei dieser Temperatur 16 Stunden unter einer Argonatmosphäre gerührt und dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Als das Gemisch Raumtemperatur erreicht hatte, wurde eine gesättigte Ammoniumacetatlösung (5 mL) hinzugegeben und das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dimethoxyethan (5 mL) wurde dann hinzugegeben und das Gemisch weitere 30 Minuten gerührt, danach auf einen Filtertrichter aufgegeben und nacheinander mit destilliertem Wasser, DMF, destilliertem Wasser, 2 N Rd, destilliertem Wasser, DMF, destilliertem Wasser, Methanol, DCM und Methanol gewaschen (je 50 mL, wobei jedem Lösungsmittel 10 Minuten für die Gleichgewichtseinstellung zwischen den Waschschritten gelassen würde). Das Produkt wurde unter Vakuum getrocknet um markiertes Wang 2 zu erhalten.

3. Markiertes Wang 3

Das wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisierte Wang- Iodpolystyrol (100 mg) wurde in einem Lösungsmittelgemisch aus DMF/destilliertem Wasser/TEA (9 : 1 : 1) (5 mL) gelöst und 30 Minuten bei Raumtemperatur quellen gelassen. Eine vorgemischte Lösung aus DMF (0,5 mL), die 5-Cyano-1-pentin (200 mg, 1,07 mM) und 6-Methoxy-6-paracyanophenyl-6-methyl-1-hexin (50 mg, 0,22 mM) enthält, wurde zu der Polymerkügelchensuspension hinzugegeben, gefolgt von Kaliumcarbonat (50 mg, 0,36 mm) sowie Tetrabutylammoniumbromid (50 mg, 0,16 mM), und die Suspension 30 Minuten unter einer Argonatmosphäre gerührt. Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (0) (25 mg, 0,02 mM) wurde schnell hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf 80ºC erhitzt, bei dieser Temperatur 16 Stunden unter einer Argonatmosphäre gerührt und dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Als das Gemisch Raumtemperatur erreicht hatte, wurde eine gesättigte Ammoniumacetatlösung (5 mL) hinzugegeben und das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. DME (5 mL) wurde dann hinzugegeben und das Gemisch weitere 30 Minuten gerührt, danach auf einen Filtertrichter aufgegeben und nacheinander mit destilliertem Wasser, DMF, destilliertem Wasser, 2 N Rd, destilliertem Wasser, DMF, destilliertem Wasser, Methanol, DCM und Methanol gewaschen (je 50 mL, wobei jedem Lösungsmittel 10 Minuten für die Gleichgewichtseinstellung zwischen den Waschschritten gelassen wurde). Das Produkt wurde unter Vakuum getrocknet, um markiertes Wang 3 zu erhalten.

4. Markiertes Wang 4

Das wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisierte Wang- Iodpolystyrol (100 mg) wurde in einem Lösungsmittelgemisch aus DMF/destilliertem Wasser/TEA (9 : 1 : 1) (5 mL) gelöst und 30 Minuten bei Raumtemperatur quellen gelassen. Eine vorgemischte Lösung aus DMF (0,5 mL), die 5-Cyano-1-pentin (100 mg, 1,07 mM) und 6-Methoxy-6-paracyanophenyl-6-methyl-1-hexin (12,5 mg, 0,06 mM) enthält, wurde zu der Polymerkügelchensuspension hinzugegeben, gefolgt von Kaliumcarbonat (50 mg, 0,36 mm) sowie Tetrabutylammoniumbromid (50 mg, 0,16 mM), und die Suspension 30 Minuten unter einer Argonatmosphäre gerührt. Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (0) (25 mg, 0,02 mM) wurde schnell hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf 80ºC erhitzt, bei dieser Temperatur 16 Stunden unter einer Argonatmosphäre gerührt und dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Als das Gemisch Raumtemperatur erreicht hatte, wurde eine gesättigte Ammoniumacetatlösung (5 mL) hinzugegeben und das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. DME (5 mL) wurde dann hinzugegeben und das Gemisch weitere 30 Minuten gerührt, auf einen Filtertrichter aufgegeben und nacheinander mit destilliertem Wasser, DMF, destilliertem Wasser, 2 N HCl, destilliertem Wasser, DMF, destilliertem Wasser, Methanol, DCM und Methanol gewaschen (je 50 mL, wobei jedem Lösungsmittel 10 Minuten für die Gleichgewichtseinstellung zwischen den Waschschritten gelassen wurde). Das Produkt wurde unter Vakuum getrocknet um markiertes Wang 4 zu erhalten.

8. Anlagerung einer kombinatorischen Bibliothek an markiertes Wang

Das markierte Wang kann zum Aufbau der kombinatorischen Bibliothek wie unten dargestellt verwendet werden, wobei R&sub2; unterschiedliche funktionelle Gruppen für die Anlagerung weiterer Untereinheiten an jede Verbindung enthalten kann.

1. Bibliotheksverbindung 1

Zum wie oben beschrieben hergestellten markierten Wang 1 (5 mg) wurden 1 mL Pyridin und 2 mL Buttersäureanhydrid hinzugegeben und das Gemisch bei Raumtemperatur 4 Stunden gerührt. Die Suspension wurde dann auf einen Filtertrichter aufgegeben und nacheinander mit Ethanol, DCM, Methanol (jeweils 10 mL) gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Ein Fourier- Transformations-Transflektant-Infrarot(FTIR)-Spektrum von einem einzelnen Kügelchen aus dieser Reaktiofl enthielt Nitrilbanden bei 2247 und 2226 cm&supmin;¹. Siehe Spektrum 1 (Fig. 8).

2. Bibliotheksverbindung 2

Zum wie oben beschrieben hergestellten markierten Wang 2 (5 mg) wurden 2 mL DCM hinzugegeben und die Suspension 30 Minuten quellen gelassen. Danach wurde n-Fmoc-Alanin (20 mg, 0,064 mM) hinzugegeben, gefolgt von 1,3-Diisopropylcarbodiimid (0,2 mL, 0,12 mM) und einer katalytischen Menge Dimethylaminopyridin. Das Reaktionsgemisch wurde 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann auf einen Filtertrichter aufgegeben und nacheinander mit DCM, DMF, Wasser, Methanol, DCM, Methanol (jeweils 5 mL) gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Ein FTIR- Spektrum von einem einzelnen Kügelchen aus dieser Reaktion enthielt Nitrilbanden bei 2247 und 2226 cm&supmin;¹. Siehe Spektrum 2 (Fig. 9).

3. Bibliotheksverbindung 3

Zum wie oben beschrieben hergestellten markierten Wang 3 (5 mg) wurden 1 mL Pyridin und 2 mL Essigsäureanhydrid hinzugegeben und das Gemisch 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Suspension wurde dann auf einen Filtertrichter aufgegeben und nacheinander mit Ethanol, DCM, Methanol (jeweils 10 mL) gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Ein FTIR-Spektrum von einem einzelnen Kügelchen aus dieser Reaktion enthielt Nitrilbanden bei 2247 und 2229 cm&supmin;¹. Siehe Spektrum 3 (Fig. 10).

4. Bibliotheksverbindung 4

Zum wie oben beschrieben hergestellten markierten Wang 4 (5 mg) wurden 2 mL DCM hinzugegeben und die Suspension 30 Minuten quellen gelassen. Danach wurde n-Fmoc-Isoleucin (20 mg, 0,06 mM) hinzugegeben, gefolgt von DIC (0,2 mL, 0,12 mM) und einer katalytischen Menge DMAP. Das Reaktionsgemisch wurde 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann auf einen Filtertrichter aufgegeben und nacheinander mit DCM, DMF, Wasser, Methanol, DCM, Methanol (jeweils 5 mL) gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Ein FTIR-Spektrum eines einzelnen Kügelchens aus dieser Reaktion enthielt Nitrilbanden bei 2247 und 2229 cm&supmin;¹. Siehe Spektrum 4 (Fig. 11).

C. Abspaltung von Bibliotheksverbindungen 4

Das markierte Wang kann zum Identifizieren der kombinatorischen Bibliothek verwendet werden, nachdem die Bibliotheksverbindung wie unten dargestellt abgespalten wurde.

1 mg markierte Bibliothek von jedem der vier Reaktionsgemische, die weiter oben beschrieben wurden (B1-B4), wurde zusammengebracht. 1 ml TFA/destilliertes Wasser (95 : 5) wurde hinzugegeben und das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde dann auf einen Filtertrichter aufgegeben, nacheinander mit DCM, Methanol, Wasser, Methanol gewaschen (jeweils 5 mL, wobei jedem Lösungsmittel 15 Minuten für die Gleichgewichtseinstellung zwischen den Waschschritten gelassen wurde) und dann unter Vakuum getrocknet. Zwei einzelne Kügelchen aus dieser Abspaltreaktion wurden zufällig ausgewählt und für jedes Kügelchen ein FTIR-Spektrum aufgenommen. Ein Vergleich dieser FTIR-Spektren mit den Spektren der Bibliotheksverbindungen 1-4 (B1-B4 weiter oben) zeigte deutlich, daß die beiden Kügelchen zu Bibliothek 2 bzw. 4 gehörten. Siehe Spektren 5 (Fig. 12) und 6 (Fig. 13).

Beispiel 3. Raman-Spektroskopie-Codierung Synthese von Raman-markiertem Wang 1,5-Decadiin

Wang-Iodpolystyrol (100 mg), synthetisiert wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde in einem Lösungsmittelgemisch aus DMF/destilliertes Wasser/TEA (9 : 1 : 1) (5 mL) gelöst und bei Raumtemperatur 30 Minuten quellen gelassen. 1,5-Decadiin (100 mg) in DMF (2 mL) wurde zu der Polymerkügelchensuspension hinzugegeben. Kaliumcarbonat (50 mg, 0,36 mm) und Tetrabutylammoniumbromid (50 mg, 0,16 mM) wurde dann hinzugegeben und die Suspension 30 Minuten unter Argonatmosphäre gerührt. Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (0) (25 mg, 0,02 mM) wurde schnell hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf 80ºC erhitzt, bei dieser Temperatur 16 Stunden unter einer Argonatmosphäre gerührt und dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Als das Gemisch Raumtemperatur erreicht hatte, wurde eine gesättigte Ammoniumacetatlösung (5 mL) hinzugegeben und das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. DME (5 mL) wurde dann hinzugegeben und das Gemisch weitere 30 Minuten gerührt, danach auf einen Filtertrichter aufgegeben und nacheinander mit destilliertem Wasser, DMF, destilliertem Wasser, 2 N HCl, destilliertem Wasser, DMF, destilliertem Wasser, Methanol, DCM und Methanol gewaschen (je 50 mL, wobei jedem Lösungsmittel 10 Minuten für die Gleichgewichtseinstellung zwischen den Waschschritten gelassen wurde). Das Produkt wurde unter Vakuum getrocknet um ein markiertes Kügelchen mit nur einem Ramanaktiven Acetylenmarker zu ergeben.

Beispiel 4. Raman-Spektroskopie-Codierung von Aminopolystyrolharz Synthese von Raman-markiertem Aminopolystyrol 10,12-Tricosadiinsäure

Aminopolystyrolharz (100 mg) wurde in DCM (getrocknet durch Abdestillieren von Calciumhydrid) getrocknet und 15 Minuten quellen gelassen. 10,12-Tricosadiinsäure (50 mg, 0,12 mM), DIC (30 mg, 0,24 mmol) und eine katalytische Menge (< 1mg) DMAP wurde hinzugegeben und das Gemisch 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Harz wurde auf einen Trichterfilter aufgegeben und nacheinander mit Dimethylformamid, Wasser, Methanol, DCM, Methanol gewaschen (je 30 mL, wobei jedem Lösungsmittel 15 Minuten zum Aufsaugen und Quellen und für die Gleichgewichtseinstellung gelassen wurde).

10, 12-Heptacosadiinsäure

Das obige Verfahren wurde auch für die Anlagerung von 10,12-Heptacosadiinsäure Verwendet.

Beispiel 5. Synthese von Raman-codiertem oder Verhältniscodierten Lysinpolystyrol Lysinmarker-Linker-Harz-Synthese

Aminomethylpolystyrol (100 mg, 1,2 mM/g) wurde 30 Minuten in DCM quellen gelassen, und zu dieser Suspension wurden nacheinander N-α-Boc-N-ε-Fmoc-Lysin (115 mg, 2 Äquiv), N,N- Diisopropylethylamin (55 mL, 4 Äquiv.) und PyBroP (74 mg, 2 Äquiv.) hinzugegeben und das Reaktionsgemisch 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch auf einen Trichterfilter aufgegeben und nacheinander mit je 5 ml DCM, Methanol, DMF, Wasser und Methanol gewaschen, dann unter Vakuum getrocknet.

Der Fmoc-Schutz wurde am resultierenden N-α-Boc-N-ε-Fmoc- Lysinaminopolystyrol durch Rühren mit 20% Piperidin in DMF für 30 Minuten aufgehoben, danach wurde das Gemisch auf einen Filtertrichter aufgegeben und nacheinander mit je 5 ml DCM, Methanol, DMF, Wasser und Methanol gewaschen, dann unter Vakuum getrocknet.

Phenylpropionsäure, 10,12-Tricosadiinsäure - Molverhältnis (1 : 1, Marker 4 u. 7)

Das resultierende N-α-Boc-Lysinaminopolystyrol wurde 30 Minuten in DCM quellen gelassen, und zu dieser Suspension wurde ein Gemisch aus Phenylpropionsäure (35 mg, 2 Äquiv., Marker 4), 10,12-Tricosadiinsäure (83 mg, 2 Äquiv., Marker 7), DIC (55 mL, 4 Äquiv.) und PyBroP (74 mg, 2 Äquiv.) hinzugegeben und das Reaktionsgemisch 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch auf einen Trichterfilter aufgegeben und nacheinander mit je 5 ml DCM, Methanol, DMF, Wasser und Methanol gewaschen, dann unter Vakuum getrocknet. Durch dieses Verfahren wurde codiertes, geschütztes Lysinaminopolystyrol, verfügbar für Bibliotheksanlagerung, gebildet. Spektrum 7 (Fig. 14) ist ein Raman-Spektrum dieser Entität.

Phenylpropionsäure, 10,12-Tricosadiinsäure - Molverhältnis (1 : 4, Marker 4 u. 7)

Aminomethylpolystyrol (100 mg, 1,2 mN/g) wurde 30 Minuten in DCM quellen gelassen, und zu dieser Suspension wurde nacheinander N-α-Boc-ε-Fmoc-Lysin (115 mg, 2 Äquiv.), DIC (55 mL, 4 Äquiv.) und PyBroP (74 mg, 2 Äquiv.) hinzugegeben und das Reaktionsgemisch 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch auf einen Trichterfilter gegeben und nacheinander mit je 5 ml DCM, Methanol, DMF, Wasser und Methanol gewaschen, dann unter Vakuum getrocknet.

Der Fmoc-Schutz wurde am resultierenden N-α-Boc-N-ε-Fmoc- Lysinaminopolystyrol durch Rühren mit 20% Piperidin in DMF für 30 Minuten aufgehoben. Danach wurde das Gemisch auf einen Filtertrichter gegeben und nacheinander mit je 5 ml DCM, Methanol, DMF, Wasser und Methanol gewaschen, dann unter Vakuum getrocknet.

Das resultierende N-α-Boc-Lysinaminopolystyrol wurde 30 Minuten in DCM quellen gelassen, und zu dieser Suspension wurde ein Gemisch aus Phenylpropionsäure (16 mg, 1 Äquiv., Marker 4), 10,12-Tricosadiinsäure (166 mg, 4 Äquiv., Marker 7), DIC (55 mL, 4 Äquiv.) und PrBroP (74 mg, 2 Äquiv.) hinzugegeben und das Reaktionsgemisch 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch auf einen Trichterfilter aufgegeben und nacheinander mit je 5 ml DCM, Methanol, DMF, Wasser und Methanol gewaschen, dann unter Vakuum getrocknet. Durch dieses Verfahren wurde codiertes, geschütztes Lysinaminopolystyrol, verfügbar für die Bibliotheksanlagerung, gebildet. Spektrum 8 (Fig. 15) ist ein Raman-Spektrum dieser Entität.

Masseverhältnis (1 : 2, Marker 4 u. 7)

Das oben beschriebene N-α-Boc-Lysinaminopolystyrol wurde 30 Minuten in DCM quellen gelassen, und zu dieser Suspension wurde Phenylpropionsäure (Marker 4, 50 mg), 10,12- Tricosadiinsäure (Marker 7, 100 mg), DIC (55 mL, 4 Äquiv.) und PyBroP (74 mg, 2 Äquiv.) hinzugegeben und das Reaktionsgemisch 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch auf einen Trichterfilter aufgegeben und nacheinander mit je 5 ml DCM, Methanol, DMF, Wasser und Methanol gewaschen, dann unter Vakuum getrocknet. Durch dieses Verfahren wurde codiertes, geschütztes Lysinaminopolystyrol, verfügbar für die Bibliotheksanlagerung, gebildet.

Masseverhältnis (1 : 4, Marker 4 u. 7)

Das oben beschriebene N-α-Boc-Lysinaminopolystyrol wurde 30 Minuten in DCM quellen gelassen, und zu dieser Suspension wurde Phenylpropionsäure (Marker 4, 25 mg), 10,12- Tricosadiinsäure (Marker 7, 100 mg), DIC (55 mL, 4 Äquiv.) und PyBroP (74 mg, 2 Äquiv.) hinzugegeben und das Reaktionsgemisch 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch auf einen Trichterfilter aufgegeben und nacheinander mit je 5 ml DCM, Methanol, DMF, Wasser und Methanol gewaschen, dann unter Vakuum getrocknet. Durch dieses Verfahren wurde codiertes, geschütztes Lysinaminopolystyrol, verfügbar für die Bibliotheksanlagerung, gebildet. Fig. 16 ist ein Raman- Spektrum für diese Entität. Dieses Beispiel zeigt, daß Verhältnis nicht notwendigerweise Äquivalenz bedeutet. Masseverhältnisse können ebenfalls verwendet werden.

Masseverhältnis (1 : 10, Marker 2 u. 7)

Das oben beschriebene N-α-Boc-Lysinaminopolystyrol wurde 30 Minuten in DCM quellen gelassen, und zu dieser Suspension wurde p-(Phenylethinyl)-benzoesäure (Marker 2, 10 mg), 10,12- Tricosadiinsäure (Marker 7, 100 mg), DIC (55 mL, 4 Äquiv.) und PyBroP (74 mg, 2 Äquiv.) hinzugegeben und das Reaktionsgemisch 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch auf einen Trichterfilter aufgegeben und nacheinander mit je 5 ml DCM, Methanol, DMF, Wasser und Methanol gewaschen, dann unter Vakuum getrocknet. Durch dieses Verfahren wurde codiertes, geschütztes Lysinaminopolystyrol, verfügbar für die Bibliotheksanlagerung, gebildet.

Masseverhältnis (1 : 1, Marker 4 u. 6)

Das oben beschriebene N-α-Boc-Lysinaminopolystyrol wurde 30 Minuten in DCM quellen gelassen, und zu dieser Suspension wurde Phenylpropionsäure (Marker 4, 50 mg), 2-(Pyrimidin)dodec- 10-insäure (Marker 6, 50 mg), DIC (55 mL, 4 Äquiv.) und PyBroP (74 mg, 2 Äquiv.) hinzugegeben und das Reaktionsgemisch 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch auf einen Trichterfilter aufgegeben und nacheinander mit je 5 ml DCM, Methanol, DMF, Wasser und Methanol gewaschen, dann unter Vakuum getrocknet. Durch dieses Verfahren wurde codiertes, geschütztes Lysinaminopolystyrol, verfügbar für die Bibliotheksanlagerung, gebildet.

Masseverhältnis (1 : 4, Marker 4 u. 6)

Das oben beschriebene N-α-Boc-Lysinaminopolystyrol wurde 30 Minuten in DCM quellen gelassen, und zu dieser Suspension wurde Phenylpropionsäure (Marker 4, 25 mg), 2-(Pyrimidin)dodec- 10-insäure (Marker 6, 100 mg), DIC (55 mL, 4 Äquiv.) und PyBroP (74 mg, 2 Äquiv.) hinzugegeben und das Reaktionsgemisch 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch auf einen Trichterfilter aufgegeben und nacheinander mit je 5 ml DCM, Methanol, DMF, Wasser und Methanol gewaschen, dann unter Vakuum getrocknet. Durch dieses Verfahren wurde codiertes, geschütztes Lysinaminopolystyrol, verfügbar für die Bibliotheksanlagerung, gebildet.

p-(4'-Methoxyphenylethinyl)benzoesäure-markiertes Harz (Marker 1)

Das oben beschriebene N-α-Boc-Lysinaminopolystyrol wurde 30 Minuten in DCM quellen gelassen, und zu dieser Suspension wurde p-(4'-Methoxyphenylethinyl)benzoesäure (Marker 1, 100 mg), DIC (55 ml, 4 Äquiv.) und PyBroP (74 mg, 2 Äquiv.) hinzugegeben und das Reaktionsgemisch 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch auf einen Trichterfilter aufgegeben und nacheinander mit je 5 ml DCM, Methanol, DMF, Wasser und Methanol gewaschen, dann unter Vakuum getrocknet. Durch dieses Verfahren wurde codiertes, geschütztes Lysinaminopolystyrol, verfügbar für die Bibliotheksanlagerung, gebildet. Fig. 17 liefert das entsprechende Raman-Spektrum.

p-(Phenylethinyl) benzoesäure-markiertes Harz (Marker 2)

Das oben beschriebene N-α-Boc-Lysinaminopolystyrol wurde 30 Minuten in DCM quellen gelassen, und zu dieser Suspension wurde p-(Phenylethinyl)benzoesäure (Marker 2, 100 mg), DIC (55 mL, 4 Äquiv.) und PyBroP (74 mg, 2 Äquiv.) hinzugegeben und das Reaktionsgemisch 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch auf einen Trichterfilter aufgegeben und nacheinander mit je 5 ml DCM, Methanol, DMF, Wasser und Methanol gewaschen, dann unter Vakuum getrocknet. Durch dieses Verfahren wurde codiertes, geschütztes Lysinaminopolystyrol, verfügbar für die Bibliotheksanlagerung, gebildet. Fig. 18 liefert das entsprechende Raman-Spektrum.

p-(4'-Fluorphenylethinyl)benzoesäure-markiertes Harz (Marker 3)

Das oben beschriebene N-α-Boc-Lysinaminopolystyrol wurde 30 Minuten in DCM quellen gelassen, und zu dieser Suspension wurde p-(4'-Fluorphenylethinyl)benzoesäure (Marker 3, 100 mg), DIC (55 mL, 4 Äquiv.) und PyBroP (74 mg, 2 Äquiv.) hinzugegeben und das Reaktionsgemisch 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch auf einen Trichterfilter aufgegeben und nacheinander mit je 5 ml DCM, Methanol, DMF, Wasser und Methanol gewaschen, dann unter Vakuum getrocknet. Durch dieses Verfahren wurde codiertes, geschütztes Lysinaminopolystyrol, verfügbar für die Bibliotheksanlagerung, gebildet. Fig. 19 liefert das entsprechende Raman-Spektrum.

Phenylpropionsäure-markiertes Harz (Marker 4)

Das oben beschriebene N-α-Boc-Lysinaminopolystyrol wurde 30 Minuten in DCM quellen gelassen, und zu dieser Suspension wurde Phenylpropionsäure (Marker 4, 100 mg), DIC (55 mL, 4 Äquiv.) und PyBroP (74 mg, 2 Äquiv.) hinzugegeben und das Reaktionsgemisch 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch auf einen Trichterfilter aufgegeben und nacheinander mit je 5 ml DCM, Methanol, DMF, Wasser und Methanol gewaschen, dann unter Vakuum getrocknet. Durch dieses Verfahren wurde codiertes, geschütztes Lysinaminopolystyrol, verfügbar für die Bibliotheksanlagerung, gebildet.

2-(Thiazolyl)dodec-10-insäure-markiertes Harz (Marker 5)

Das oben beschriebene N-α-Boc-Lysinaminopolystyrol wurde 30 Minuten in DCM quellen gelassen, und zu dieser Suspension wurde 2-(Thiazolyl)dodec-10-insäure (Marker 5, 100 mg), DLC (55 mL, 4 Äquiv.) und PyBroP (74 mg, 2 Äquiv.) hinzugegeben und das Reaktionsgemisch 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch auf einen Trichterfilter aufgegeben und nacheinander mit je 5 ml DCM, Methanol, DMF, Wasser und Methanol gewaschen, dann unter Vakuum getrocknet. Durch dieses Verfahren wurde codiertes, geschütztes Lysinaminopolystyrol, verfügbar für die Bibliotheksanlagerung, gebildet.

2-(Pyrimzdin)dodec-10-insäure-markiertes Harz (Marker 6)

Das oben beschriebene N-α-Boc-Lysinaminopolystyrol wurde 30 Minuten in DCM quellen gelassen, und zu dieser Suspension wurde 2-(Pyrimidin)dodec-10-insäure (Marker 6, 100 mg), DIC (55 mL, 4 Äquiv.) und PyBroP (74 mg, 2 Äquiv.) hinzugegeben und das Reaktionsgemisch 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch auf einen Trichterfilter aufgegeben und nacheinander mit je 5 ml DCM, Methanol, DMF, Wasser und Methanol gewaschen, dann unter Vakuum getrocknet. Durch dieses Verfahren wurde codiertes, geschütztes Lysinaminopolystyrol, verfügbar für die Bibliotheksanlagerung, gebildet.

10,12-Tricosadiinsäure-markiertes Harz (Marker 7)

Das oben beschriebene N-α-Boc-Lysinaminopolystyrol wurde 30 Minuten in DCM quellen gelassen, und zu dieser Suspension wurde 10,12-Tricosadiinsäure (Marker 7, 100 mg), DIC (55 mL, 4 Äquiv.) und PyBroP (74 mg, 2 Äquiv.) hinzugegeben und das Reaktionsgemisch 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch auf einen Trichterfilter aufgegeben und nacheinander mit je 5 ml DCM, Methanol, DMF, Wasser und Methanol gewaschen, dann unter Vakuum getrocknet. Durch dieses Verfahren wurde codiertes, geschütztes Lysinaminopolystyrol, verfügbar für die Bibliotheksanlagerung, gebildet.

Weiteres markiertes Harz

Das oben beschriebene Verfahren wurde auch zum Markieren von Harz mit o-Biphenyl-non-8-insäure, o-Methoxyphenyl-non-8- insäure und o-Fluorphenyl-non-8-insäure aus Tabelle 1b verwendet.

Beispiel 6. Codieren des ersten Syntheseschritts über amidgebundene Infrarotmarker A. Einlagerung von Markern zum Markieren der ersten Position auf Aminomethylpolystyrolharz 1. Aufgabe von zweifach geschütztem Lysin auf Aminomethylharz

Zu einer Suspension von 2,00 g (2,4 mmol) Aminomethylharz in 30 mL DCM wurden nacheinander 2,25 g (4,8 mmol) N-alpha-Boc-N -epsilon-Fmoc-Lysin, 1,69 mL (9,6 mmol) DIC und 2,24 g (4,8 mmol) PyBroP hinzugegeben. Die Suspension wurde 1,5 Stunden bei Raumtemperatur rotiert und abtropfen gelassen. Die gleichen Mengen an Reagenzien wurden erneut zum Harz hinzugegeben und die resultierende Suspension 1,5 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Die Suspension wurde abtropfen gelassen, und das Harz nacheinander mit fünf 30-mL-Teilen DMF und fünf 30-mL-Teilen DCM gewaschen und vakuumgetrocknet. Mit diesem Verfahren wurde eine Lysinbeladung von 0,65 mmol/g erreicht, wie durch quantitative Bestimmung von Fmoc festgestellt wurde.

2. Aufhebung des Fmoc-Schutzes

Ein 600-mg-Teil Lysin-beladenes Harz wurde in 6 Pools von je 100 mg aufgeteilt. 2 ml einer 20%igen Lösung von Piperidin in DMF wurde zu jedem Pool hinzugegeben. Die resultierenden Suspensionen wurden bei Raumtemperatur 10 Minuten geschüttelt und abtropfen gelassen. Das Verfahren wurde wiederholt, wobei 30 Minuten geschüttelt wurde. Die Suspensionen wurden abtropfen gelassen, mit sieben 5-mL-Teilen DMF gewaschen und vakuumgetrocknet. 3. Anlagerung der IR-Marker

2 mL DMF, eine Lösung der gewünschten IR-Marker (Nitrilsäuren aus Tabelle 1, 0,13 mmol) in DMF, 32 mL (0,20 mmol) DIC und eine katalytische Menge DMAP wurden nacheinander zu jedem der sechs Harzpools hinzugegeben. Die Gemische wurden 16 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt, abtropfen gelassen, und das Harz in jedem Pool mit fünf 5-mL-Teilen DMF und fünf 5- mL-Teilen DCM gewaschen und vakuumgetrocknet. FTIR-Spektren von Einzelkügelchen wurden für jeden Pool aufgenommen und zeigten die richtige Einlagerung der Marker.

4. Aufhebung des Boc-Schutzes

3 mL einer 50%igen Lösung von TFA in DCM wurden zu jedem der sechs Pools des markierten Harzes aus Schritt 3 oben hinzugegeben. Die Suspensionen wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt und abtropfen gelassen. Das Verfahren wurde wiederholt. Nach dem Abtropfen wurde das Harz in jedem Pool mit fünf 3-ml-Teilen Dichlormethan, fünf 3-mL-Teilen 5%igem Diisopropylethylamin in DCM und fünf 3-mL--Teilen DCM gewaschen. Das Harz wurde dann vakuumgetrocknet.

4-Hydroxymethylphenoxyessigsäurepentafluorphenolester-Linker

Dieses Derivat wurde gemäß dem Verfahren präpariert, das von Atherton et al. (Tetrahedron, 1988, 44, 843-857) beschrieben wurde. Eine Lösung von 2,22 g (12,08 mmol) Pentafluorphenol in 10 mL Dioxan wurde zu einer Lösung von 2,00 g (10,98 mmol) 4- Hydroxymethylphenoxyessigsäure in 20 mL trockenem Dioxan hinzugegeben. Das Gemisch wurde auf 0ºC abgekühlt. Eine Lösung von 2,49 g (12,08 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid in 10 mL Dioxan wurde hinzugegeben, und das Gemisch 1 Stunde in einem Eisbad und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wurde unter Vakuum aufkonzentriert und ergab einen weißen Feststoff. Rekristallisation aus Diethylether-Hexan lieferte den gewünschten Ester als einen weißen Feststoff: Schmelzpunkt 114,5-115ºC (Lit. 111-112ºC).

5. Anlagerung des Linkers an die sechs markierten Harzpools

2 mL DMF und 57 mg (0,20 mmol) 4- Hydroxymethylphenoxyessigsäurepentafluorphenolester wurde zu jedem der sechs Pools des markierten Harzes hinzugegeben. Die Gemische wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt und dann abtropfen gelassen. Die Harze wurden dann mit fünf 5-mL- Teilen DMF und fünf 5-mL-Teilen DCM gewaschen und unter Vakuum getrocknet.

Das oben beschriebene Verfahren für sechs Pools wurde verwendet, um mindestens 50 eindeutige Codes zu erzeugen (siehe unten). Der gewöhnliche Fachmann wird jedoch erkennen, daß mehr Kombinationen und Verhältnisse für zahlreiche Codes erhältlich sind.


Anspruch[de]

1. Verfahren zum Codieren einzelner Glieder einer kombinatorischen chemischen Bibliothek, die auf einer Vielzahl fester Träger synthetisiert werden, das die kovalente Anbindung einer codierenden Identifizierung, die durch Infrarot- oder Raman-Spektroskopie nachgewiesen werden kann, an jedem der Vielzahl der festen Träger umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die codierende Identifizierung eine einzelne chemische Struktur, der Bibliothek codiert.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die codierende Identifizierung eine bestimmte chemische Reaktion auf einem festen Träger codiert.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die codierende Identifizierung eine oder mehrere Absorptionsbanden im Bereich von etwa 1700 cm&supmin;¹ bis etwa 2500 cm&supmin;¹ aufweist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die codierende Identifizierung ein Nitril, ein Acetylen, ein Cyclopentylketon, ein gamma-Lacton oder eine deuteriummarkierte organische Verbindung ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin die codierende Identifizierung ein Nitril ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die codierende Identifizierung aus einer Gruppe gewählt ist, die aus den folgenden Strukturen besteht:

oder aus Kombinationen hieraus.

8. Verfahren nach Anspruch 5, worin die codierende Identifizierung ein Acetylen ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die codierende Identifizierung aus einer Gruppe gewählt ist, die aus den folgenden Strukturen besteht:

und

oder aus Kombinationen hieraus.

10. Verfahren nach Anspruch 1, worin die codierende Identifizierung über eine Lysin-basierte Linkerkomponente kovalent an die festen Träger gebunden ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin der Lysin-basierte Linker an die festen Träger über seine alpha-Aminogruppe gebunden, und an die codierende Identifizierung über seine epsilon-Aminogruppe gebunden ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, worin die codierende Identifizierung aus einer Proidentifizierung gebildet wird, die kovalent an den festen Träger gebunden ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin die Proidentifizierung ein geschütztes Amin, geschütztes Thiol, Aldehyd, primäres Amid oder eine N-Formylgruppe enthält.







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