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Dokumentenidentifikation DE69132055T2 26.10.2000
EP-Veröffentlichungsnummer 0560912
Titel ORTSGENAUE KONJUGATBILDUNG ZWISCHEN IMMUNGLOBULINEN UND NACHWEISBAREN MARKIERUNGSSTOFFEN
Anmelder Abbott Laboratories, Abbott Park, Ill., US
Erfinder BIENIARZ, Christopher, Highland Park, US;
HUSAIN, Mazhar, Libertyville, US;
BOND, E., Howard, Lake Forest, US
Vertreter Schieber und Kollegen, 80469 München
DE-Aktenzeichen 69132055
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, MC, NL, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 02.12.1991
EP-Aktenzeichen 929021905
WO-Anmeldetag 02.12.1991
PCT-Aktenzeichen US9108971
WO-Veröffentlichungsnummer 9210507
WO-Veröffentlichungsdatum 25.06.1992
EP-Offenlegungsdatum 22.09.1993
EP date of grant 15.03.2000
Veröffentlichungstag im Patentblatt 26.10.2000
IPC-Hauptklasse C07K 1/107
IPC-Nebenklasse C07K 16/00   

Beschreibung[de]
Bereich der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die ortsspezifische Konjugation von Immunglobulinen und nachweisbaren Markierungsstoffen ohne die Veränderung des durch die Komplementarität definierten Bereiches der Immunglobuline, und Verfahren zur Herstellung der Konjugate. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Konjugation von Immunglobulinen und nachweisbaren Markierungsstoffen an spezifischen Stellen an dem Immunglobulin, wobei gleichzeitig die Erreichbarkeit der Analytbindungsstellen auf dem Immunglobulin erhalten bleibt.

Hintergrund der Erfindung

Obwohl eine Vielzahl von Verfahren beschrieben wurden zur Herstellung von Konjugaten aus Immunglobulinen und nachweisbaren Markierungsstoffen, wie Antikörper-, Enzymkonjugate, haben solche Verfahren zu zufälliger Konjugation an vielen Stellen geführt, was zu Heterogenität und einem Mangel an Wiederholbarkeit bei den Konjugaten führt.

Ortsspezifische Kohlenhydrat-Markierung des Fc-Bereiches von Antikörpern mit Enzymen wurde ebenfalls von O'Shannessy et al.,("Labeling of the Oligosaccharide Moieties of Immunglobulins", "Markieren der Oligonsaccharidanteile von Immunglobulinen", Journal of Immunological Methods, Band 99 1987, Seiten 153-161) beschrieben. Jedoch führen Konjugate, die gemäß einem solchen Verfahren hergestellt werden, zu Abständen zwischen dem Enzym und dem Antikörper, die an sich kurz sind, was zu verdrehten, in ihrer Konformation verformten Antikörpern und/oder Enzymen führt.

EP-A-0 326 863 beschreibt Konjugationsverfahren und Konjugatbildungswirkstoffe zum Verknüpfen von Verbindungen, die Kohlenhydratanteile oder Carboxylgruppen enthalten, mit Verbindungen, die Thiolanteile oder elektronenarme Anteile enthalten. Insbesondere ist das Verknüpfen von Immunglobulinen am Fc-Bereich mit Markierungsstoffen wie Enzymen beschrieben. Jedoch führen solche Verfahren und Verknüpfungsreagenzien, die dabei verwendet werden, zu Reaktionsbedingungen bei denen im wesentlichen keine Unterscheidung gemacht wird zwischen den Disulfiden des Fc-Bereiches und dem durch die Komplementarität definierten Bereich des Immunglobulins. Dieser Mangel an Unterscheidung führt zur Veränderung des durch die Komplementarität definierten Bereiches durch die Reduktion von darin enthaltenen Disulfidbindungen, wodurch die Bindungsstellen auf dem Immunglobulin beeinflußt werden.

Demnach gibt es ein Bedürfnis nach einer Technik, um ortsspezifische Konjugate herzustellen, das eine reduktive Spaltung der darin enthaltenen Disulfidbindungen und die Minderung des durch die Komplementarität definierten Bereiches des Antikörpers, verhindert.

EP-A-0 255 424 beschreibt ein Verfahren, bei welchem die Kohlenhydrateinheiten eines Antikörpers mit Periodat oxidiert werden, um Aldehydgruppen zu bilden, und die Aldehydgruppen werden dann mit einer Diamingruppe, die eine Disulfidgruppe enthält wie Cystamin, zur Reaktion gebracht. Um den derivatisierten Antikörper oder das Fragment davon an ein Toxin zu verknüpfen, in das eine Thiolgruppe eingebracht wurde, wird ein Thiol-Disulfid-Austauschverfahren verwendet, wie jenes durch Gilliland and Collier beschrieben (Cancer Research, 40, 3564 (1980)).

EP-A-0 314 127 beschreibt die Verwendung eines Sulfhydrylreaktiven heterobifunktionellen Verknüpfungsmittels, um ein Antikörper-Enzymkonjugat herzustellen.

US-A-4 699 784 beschreibt die Verwendung von Natriumperiodat oder die Verwendung von Neuraminidase gefolgt von Galaktoseoxidase, um Aldehydgruppen in den Kohlenhydrateinheiten eines Antikörpers zu bilden, ohne die Immunreaktivität des Antikörpers zu verändern.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines derivatisierten Immunglobulins, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

(a) ortsspezifisches Oxidieren der glykosylierten Zone des Fc-Bereiches eines Immunglobulins mit einem Oxidans, um mindestens zwei Hydroxylgruppen in der Zone des besagten Immunglobulins in eine Aldehydgruppe umzuwandeln; und

(b) zur Reaktion bringen des oxidierten Immunglobulins aus Schritt (a) mit einer Disulfidverbindung wobei mindestens eine der Aldehydgruppen reduktiv aminiert ist, um einen Disulfidteil auf den Fc-Bereich des Immunglobulins einzuführen; wobei das Verfahren dadurch charakterisiert ist, daß es den folgenden Schritt umfaßt:

(c) das selektive Reduzieren der Disulfidbindungen des Disulfidanteils des behandelten Immunglobulins aus Schritt (b) mit einer Menge eines Reduktionsmittels, die ausreichend ist, um mindestens einen der Disulfidanteile des Immunglobulins in zwei Sulfhydrylgruppen umzuwandeln, aber nicht ausreicht um die Disulfidbindungen im durch die Komplementarität definierten Bereich und im Angelbereich des Immunglobulins zu reduzieren, wodurch die Disulfidbindungen im durch die Komplementarität definierten Bereich und im Angelbereich im wesentlichen unbeeinflußt bleiben.

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Sulfhydrylgruppen, die in den Fc-Bereich von Immunglobulinen eingeführt wurden, geknüpft an Enzyme, wobei der Fab-Anteil des Immunglobulins nicht verändert wird, und eine kontrollierte Distanz zwischen dem Fc-Bereich und dem Enzymmarkierungsstoff besteht. Als ein Ergebnis zeigen die Konjugate, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, größere Bindungskapazität und Signalerzeugungsfähigkeit als jene Konjugate, die gemäß Verfahren, die zuvor beschrieben sind, hergestellt wurden. Die Nachteile die durch kurze, verdrehte und/oder in ihrer Konformation verformte Konjugate erzeugt werden, werden somit vermieden, wobei gleichzeitig daraus verbesserte Langlebigkeit, Spezifität, Empfindlichkeit, und andere Leistungsfaktoren des Konjugats resultieren.

Insbesondere wird die Sulfhydrylgruppe durch den Fc- glykosylierten Anteil des Immunglobulins durch eine Bindungsglied, das eine -NH-Struktur umfaßt, eingeführt, wobei der Fab-Bereich, oder der durch die Komplementarität definierte Bereich, nicht verändert wird. Eine derzeit bevorzugte Klasse solcher substituierter oder derivatisierter Immunglobulinmoleküle ist charakterisiert durch die Formel:

(1) mY(X-R&sub1;-SH)n

wobei:

m eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist;

Y ein Immunglobulinmolekül ist, wobei der Fc-glykosylierte Bereich mit einem Linker reaktiv ist; und wobei entweder:

(i) x ein Aminoalkyl oder eine Semihydrazongruppe ist, vorzugsweise -CH&sub2;NH- oder

R&sub1; ist eine Verknüpfungsgruppe, die ein bis 20 Kohlenstoffatome enthält; und

n ist eine ganze Zahl von 1 bis 20; oder

(ii) X-R&sub1;-SH der Formel (1) kann reduziertes Glutathion oder reduziertes Hydrazidolipoamid sein.

Das derivatisierte Immunglobulinmolekül wird einfach durch seine terminale Sulfhydrylgruppe an verschiedene nachweisbare Komponenten geknüpft, und die entstehenden Konjugate sind in einer Vielzahl von diagnostischen und therapeutischen Anwendungen nützlich.

Die nachweisbaren Komponenten, die an einen solchen derivatisierten Antikörper (Immunglobulin)-Molekül geknüpft werden können sind ihrerseits zunächst derivatisiert, damit sie Sulfhydryl-reaktive funktionelle Gruppen enthalten, die vorzugsweise als terminale Gruppen gebracht sind, in einer sterisch ungehinderten Stelle auf dem nachweisbaren Anteil. Beispiele solcher reaktiven funktionellen Gruppen umfassen Halogenacetate und vorzugsweise Maleimide. Im Fachgebiet bekannte Techniken können zur Herstellung solcher derivatisierten Komponenten, und zur Herstellung solcher Konjugate verwendet werden. Vorzugsweise enthalten Konjugate, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, die derivatisierten Moleküle, die oben beschrieben sind, in Konjugation mit einem Enzym. Das Enzym umfaßt eine Haftgruppe, wie Maleimid, Halogenacetyl (z. B. Jodacetyl, Bromacetyl und Chloracetyl) am Ende einer langen Verknüpfungsgruppe. Diese Konjugate sind besonders nützlich bei Enzymimmunoassays.

Bevorzugte Konjugate enthalten eine bifunktionelle Haftgruppe gemäß der Formel:

wobei:

X und R&sub1; sind wie in Formel (1) definiert; und

L ist eine Verknüpfungsgruppe, die 1 bis 40 Kohlenstoffatome enthält, wobei L gleich oder unterschiedlich wie R&sub1; sein kann.

In Formel (2), wird X an eine Teil (Y) zugefügt, wie in Formel (1) definiert und L wird zugefügt an einen nachweisbaren Teil (E).

Vorzugsweise kann die Klasse solcher Konjugate durch die Formel ausgedrückt werden:

wobei:

X gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

-CH&sub2;NH-,

, einem Fragment aus reduziertem Glutathion, und einem Fragment aus reduziertem Hydrazidolipoamid;

R&sub1; und R&sub2; sind jeweils eine unabhängig gewählte Gruppe bestehend aus 1 bis 20 Kohlenstoffatomen;

R&sub3; ist eine Alkengruppe bestehend aus 1 bis 10 Kohlenstoffatomen; und

k ist eine ganze Zahl von 1 bis 10.

R&sub2; ist vorzugsweise eine Methylcyclohexan-Gruppe.

Eine derzeit bevorzugte Klasse von Konjugaten wird charakterisiert durch die Formel:

(4) (Y)o (Q)n (E)p

wobei

Q die heterobifunktionelle Haftgruppe aus Formel (3) ist;

Y ist definiert wie in Formel (1);

E ist ein nachweisbarer Anteil;

n ist definiert wie in Formel (1); und

o und p sind jeweils eine unabhängig voneinander gewählte ganze Zahl von 1 bis 10.

Vorzugsweise ist in Formel (4) das Verhältnis von o zu p in den Bereich von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 10, und n ist in dem Bereich von etwa 1 bis etwa 10. Die Konjugate gemäß der Formel(4) zeigen eine verbesserte Homogenität und eine niedriegeren Polydispersionsgrad und überraschenderweise eine verbesserte Empfindlichkeit verglichen mit Konjugaten, die hergestellt werden gemäß Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind.

Ein derivatisiertes Immunglobulin wird gemäß der vorliegenden Erfindung durch die sequenziellen Schritte der ortsspezifischen Periodatoxidation von Immunglobulin hergestellt, gefolgt von einer reduktiven Aminierung mit einem geeigneten Polyaminodisulfid-Reagenz und darauf folgender Disulfid-Reduktion.

Kurze Beschreibung der Darstellungen

Fig. 1 zeigt den Vergleich der Aktivität eines karcinoembryonalen Antigens (CEA)/alkalisches Phosphatasekonjugat, hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung, mit einem anti-CEA/alkalischen Phosphatasekonjugat, hergestellt gemäß einem Konjugationsverfahren, das im Fachgebiet bekannt ist.

Fig. 2 zeigt den Vergleich der Aktivität eines anti- Krebsantigens (CA) 19-9/alkalisches Phosphatasekonjugat, hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung, mit einem anti-CA 19-9/alkalisches Phosphatasekonjugat, das gemäß einem Konjugationsverfahren, das im Fachgebiet bekannt ist, hergestellt wurde.

Fig. 3 zeigt den Vergleich der Aktivität eines anti- Biotin/alkalisches Phosphatasekonjugates, hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung, mit einem anti-Biotin/alkalisches Phosphatasekonjugat, das gemäß einem Konjugationsverfahren, das im Fachgebiet bekannt ist, hergestellt wurde.

Fig. 4 zeigt den Vergleich der Aktivität eines Ziegen-antimenschlichen IgE/alkalisches Phosphatasekonjugates, hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung, mit einem Ziegen-antimenschlichen IgE/alkalisches Phosphatasekonjugates, das gemäß einem Verfahren das im Fachgebiet bekannt ist, hergestellt wurde.

Fig. 5 zeigt den Vergleich der Aktivität eines anti- Hypophise Faserproteins (PTP)/alkalisches Phosphatasekonjugates, hergestellt, gemäß der vorliegenden Erfindung, mit einem anti- PTP/alkalisches Phosphatasekonjugates, hergestellt gemäß einem Konjugationsverfahren, das im Fachgebiet bekannt ist (Werte in Klammern zeigen die Enzym/Antikörper-Verhältnisse).

Beschreibung der Erfindung (a) Definitionen

Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck "Immunglobulin" ein Mitglied der Klasse von Proteinmoleküle, die beispielsweise im Plasma, Kolostrum, Tränen und anderen Körperflüssigkeiten vorhanden sind. Ein Immunglobulin, oder Antikörper, bindet spezifisch, nicht kovalent und reversibel an Antigene.

Der hier verwendete Ausdruck "Antikörper" bezieht sich auf eine homogene oder heterogene Population von Immunglobulinen (wie monoklonale Antikörper oder polyklonales Antiserum). Eine Antikörper-Antigen-Komplexbildung tritt auf bei Kontakt zwischen spezifischen Bindungsstellen auf einem Immunglobulin, bekannt als durch die Komplementarität definierte Bereiche, und antigenen Determinanten.

Fünf Immunglobulinklassen werden unterschieden, identifiziert als IgA, IgD, IgE, IgG und IgM. IgG ist das überwiegende Immunglobulin in Plasma, es umfaßt etwa 75% der gesamten PlasmaImmunglobuline und es ist das überwiegende Immunglobulin in den inneren Körperflüssigkeiten, insbesondere extravaskulären Materialien, zur Bekämpfung von Mikroorganismen und deren Toxinen. Es gibt vier Untergruppen von IgG, identifiziert als IgG-1, IgG-2, IgG-3 und IgG-4, die sich durch Unterschiede in den Aminosäuresequenzen unterscheiden. Im menschlichen Serum umfaßt das IgG-1 etwa 65% der PlasmaImmunglobuline.

Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck "Fc-Bereich" den Bereich eines Immunglobulins, der dem Stamm oder Bein des Y- förmigen Immunglobulinmoleküls entspricht, und Formel aus den C-terminalen Abschnitten der beiden schweren Ketten besteht, die durch eine oder mehrere Disulfidbindungen verknüpft sind.

Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck "Fab-Bereich" den Bereich eines Immunglobulins, der nicht der Fc-Bereich ist. Jeder Fab-Bereich besteht aus einer leichten Kette, die über eine Disulfidbindung an den N-terminalen Teil einer schweren Kette angeheftet ist, wobei jeder solcher Fab-Bereiche einer der beiden Arme des Y-förmigen Immunglobulinmoleküls ist. Jeder Fab- Bereich umfaßt eine einzelne Anheftungsstelle in dem hochvariablen Bereich davon, und verhält sich als ein nicht ausfallender univalenter Antikörper.

Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck "Markierung" oder "nachweisbarer Anteil" eine Verbindung, die verwendet werden kann, um ein Immunglobulin zu markieren, üblicherweise durch die Verknüpfung einer solchen Verbindung mit einem Immunglobulin wie in einem Konjugat. Markierungsstoffe können hinsichtlich ihrer Struktur und Funktion stark variieren und umfassen Enzyme, Radiomarkierungsstoffe, Fluorophore, Biotin, Toxine, Medikamente, Haptene, DNA, RNA, Polysaccharide, Polypeptide, Liposome, Chromophore, chemilumineszente Wirkstoffe, gefärbte Partikel und gefärbte Mikropartikel und ähnliches, wobei sie nicht darauf beschränkt sind.

In den R&sub1;- und R&sub2;-Gruppen wie oben definiert, beispielsweise in den Formeln (1), (2) und (3), werden Alkylgruppen bevorzugt, wobei die Methylcyclohexan-Gruppe eine besonders bevorzugte R&sub2;-Gruppe ist. Der Ausdruck "Alkyl" umfaßt gerade und verzweigte Ketten, wenn drei oder mehr Kohlenstoffatome vorhanden sind. Bevorzugte Alkylketten enthalten jeweils weniger als sieben Kohlenstoffatome. Die derzeit am meisten bevorzugten sind Ethyl und Glutathion, wobei R&sub2; vorzugsweise eine Methylcyclohexan-Gruppe ist.

(b) derivatisiertes Immunglobulin

Ein derivatisiertes Immunglobulin wird hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung durch folgende Schritte:

(i) ortsspezifische Oxidation des Immunglobulins, um mindestens zwei Hydroxylgruppen in dem glykosylierten Abschnitt des Fc-Bereiches des Immunglobulins in mindestens zwei Aldehydgruppen umzuwandeln;

(ii) reduktive Alkylierung der Aldehydgruppen, um Disulfidanteile auf den Fc-Bereich des Immunglobulins einzuführen; und

(iii) Reduktion der Disulfidgruppen zu Sulfhydrylgruppen, wobei als Reaktionsbedingungen wässrige flüssige Phasen in jedem Schritt verwendet werden.

Es soll klargestellt werden, daß die Oxidation des Immunglobulinmoleküls, entweder durch chemische Oxidation oder enzymatische Oxidation erreicht werden kann. Beispielsweise umfassen chemische Oxidantien, ohne darauf beschränkt zu sein, Periodat, Brom und ähnliches, und enzymatische Oxidantien umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, die sequenzielle Verwendung von Neuraminidase- und Galaktoseoxidase und ähnliches.

Ähnlich kann die Reduktion der Disulfidgruppen des Immunglobulins, um terminale Sulfhydrylgruppen zu erzeugen, durch entweder chemisches oder enzymatisches Abtrennen der Disulfidgruppen erreicht werden. Beispielsweise kann die chemische Reduktion der Disulfidgruppen in den Fc-eingeführten Linke m durch die Verwendung von Mercaptoethanol, Dithiothreitol (DTT), Natriumborhydrid, Natriumdithionit und ähnlichem erreicht werden. Im Falle der enzymatischen Reduktion der Disulfidgruppen an der Fc-Stelle kann eine solche Reduktion erreicht werden, indem bestimmte chemisch eingeführte Linker, die die Disulfidgruppen enthalten, den geeigneten Enzymen ausgesetzt werden, die die Disulfide katalytisch zu Thiolen reduzieren. So kann die oxidierte Form eines linkerverlängerten Glutathions Thiole erzeugen infolge einer nach Glutathionreduktase- Exposition. Ähnlich kann die oxidierte Form eines linkerverlängerten Lipoamids Thiole erzeugen nach Lipoamiddehydrogenase-Exposition.

Wenn die reduktive Alkylierung mit einer Aminodisulfidverbindung durchgeführt wird, wird eine schiffsche Base gebildet, die durch die Reduktion stabilisiert wird.

Nach jedem der angezeigten Schritte wird das veränderte Immunglobulinprodukt vorzugsweise gereinigt und gemäß Verfahren die im Fachgebiet bekannt sind, konzentriert.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Alkalimetallperiodat, wie Natriumperiodat (NaIO&sub4;), verwendet, um benachbarte Diolanteile in einem Saccharid spezifisch zu Aldehydgruppen zu oxidieren (siehe beispielsweise O'Shannessy et al.). Der glykosylierte Abschnitt des Fc-Bereiches des Immunglobulins erfährt dadurch eine ortsspezifische Oxidation mindestens zweier darin enthaltene Hydroxylgruppen zu zwei Aldehydgruppen. Demgemäß erfährt der durch die Komplementatität definierte Bereich im wesentlichen keine strukturelle Veränderung. Wie durch im Fachgebiet bewanderte verstanden wird, ist eine solche Oxidation abhängig von einer Anzahl an Variablen einschließlich der Konzentrationen des Immunglobulinreaktanden und des periodatoxidierenden Stoffes, dem pH, der Temperatur und der Zeit. Zahlreiche Kombinationen dieser Variablen, können selbstverständlich ebenfalls verwendet werden.

Eine Kontrolle über das Ausmaß der Oxidation kann scheinbar erreicht werden durch das Variieren der Anzahl der erzeugten Aldehydgruppen und letztlich den Grad der Markierung des oxidierten Immunglobulins. Die Anzahl von Aldehydgruppen, die für jedes Immunglobulinmolekül erzeugt wird, ist abhängig von den Oxidationsbedingungen, wobei schärfere Oxidationsbedingungen üblicherweise mehr Aldehydgruppen pro Molekül erzeugen. Vorzugsweise enthält das Immunglobulin zwischen etwa zwei bis etwa zehn Aldehydgruppen für jedes oxidierte Immunglobulinmolekül in dem glykosylierten Abschnitt des Fc- Bereiches des Immunglobulins.

Das entstehende, Aldehydgruppen-enthaltende Immunglobulin wird als nächstes vorzugsweise gereinigt und konzentriert. Die Reinigung wird vorzugsweise durch Chromatographie durchgeführt. Beispielsweise ist es ein derzeit bevorzugtes Verfahren, das Reaktionsmedium, das das veränderte Immunglobulin enthält, durch eine Gelfiltrationssäule hindurchzuleiten wie z. B. durch eine SEPHADEX' G-25-Säule (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, NJ, USA) zum Zwecke der Trennung des modifizierten Immunglobulins. Eine Säule einer solcher Zusammensetzung wird üblicherweise ausgeglichen und eluiert unter Verwendung eines Puffers, wie z. B. Natriumphosphat und Natriumchlorid mit einem pH von vorzugsweise 7,0. Während der Elution werden Fraktionen gesammelt, und diejenigen Fraktionen, die einen passenden zuvor festgelegten Absorptionsspitzenwert (z. B., 280 nm) haben, werden zusammen gefaßt. Die Proteinkonzentration kann aus dem Absorptionsspitzenwert, unter Verwendung eines geeigneten Extinktionskoeffizienten berechnet werden.

Die Konzentration des Aldehydgruppen-enthaltenden Immunglobulins aus einem solchen Pool kann bequem und vorzugsweise erreicht werden. Derzeit wird bevorzugt, eine Zentrifugation bei etwa 5000 · g unter Gebrauch von Röhrchen, die eine Molekulargewichtfiltermembran enthalten, wie z. B. Centricon Röhrchen (Amicon Corp, Danvers, MA, USA), die die Fähigkeit haben, ein Material hindurchzulassen, dessen mittlerer Molekulargewichtsmaximalwert bei etwa 30,000 liegt.

Als nächstes wird das gereinigte, konzentrierte Aldehydgruppen-enthaltende Immunglobulin unter wässrigen Flüssigphasebedingungen mit einem geeigneten Aminodisulfidreagenz oder einem Dihydrazidodisulfidreagenz in Kontakt gebracht, um mindestens eine Disulfidgruppe für jedes Immunglobulin durch die Aldehydgruppen einzuführen.

Obwohl es möglich ist, eine Amino- oder Hydrazidosubstituierte Thiol-(z. B. Sulfhydryl) terminierte Verbindung zu verwenden, werden Disulfidverbindungen gegenüber Thiolterminierten Verbindungen im allgemeinen bevorzugt, um die Erträge des gewünschten Thiolterminierten Gruppensubstituenten zu maximieren, und um unerwünschte Nebenreaktionen zu vermeiden.

Demgemäß kann eine bevorzugte Klasse solcher Disulfidverbindungen, die bei Reaktionen mit einem Aldehydgruppen-enthaltenden Immunglobulin verwendet werden, oxidiertes Glutathion, Hydrazidolipoamid oder eine Verbindung sein, die charakterisiert ist durch die Formel:

(5)

(S) X-R&sub1;-S-S-R&sub1;-X

wobei:

X gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -CH&sub2;NH&sub2; und

und

R&sub1; ist eine Gruppe, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome enthält, vorzugsweise Methylen.

Wie von einem Fachmann verstanden wird, bewirkt der Zusatz von bifunktionellen Reagenzien zu einem Ensemble von Molekülen sowohl intramolekulare Veränderungen an den Molekülen als auch intermolekulare Modifikationen der Moleküle. Demgemäß können die zuvor erwähnten Disulfidverbindungen ähnlich reagieren mit dem Kohlenhydratreichen Fc-Bereichen des Immunglobulins, was entweder bei intramolekularer Reaktion zu einem großen heterozyklischen Ring an dem Fc-Bereich führt, welcher die Disulfidbindungen enthält, oder es kann bei einer intermolekularen Reaktion eine Disulfidgruppe zwischen zwei Immunglobulinen eingeführt werden.

Wenn die Reaktion mit jeder Aldehydgruppe an dem Immunglobulin zur Bildung einer Schiffschen Base führt, kann die Base durch Reduktion stabilisiert werden. Beispielsweise ist bei Reaktion mit einem Diamindisulfidreagenz eine Stabilisierung durch Reduktion der Schiffschen Base nötig, wohingegen, wenn das Kupplungsreagenz Dihydraziddisulfid ist, keine Stabilisierung durch Reduktion erforderlich ist. Eine solche reduktive Stabilisierung wird bequem mit einem Alkalimetall-Cyanoborhydrid erreicht, vorzugsweise Natriumcyanoborhydrid, unter kontrollierten Reaktionsbedingungen. Derzeit bevorzugt ist der Zusatz des Cyanoborhydrids zum Reaktionsmedium innerhalb eines Zeitintervalls von etwa 5 Minuten bis etwa 24 Stunden nach dem Zusatz von Diaminodisulfid, am besten von etwa 15 Minuten bis etwa 60 Minuten nach einem solchen Zusatz von Diaminodisulfid, Die Reduktion der Schiffschen Base führt zu der Bildung einer bivalenten sekundären Amingruppe.

Das entstehende derivatisierte Disulfidgruppen-enthaltende Immunglobulin wird vorzugsweise gereinigt und konzentriert gemäß dem Verfahren und der Ausrüstung, die zur Verwendung bei der Reinigung und Konzentration des oxidierten, Aldehydgruppenenthaltenden Immunglobulins beschrieben sind.

Als nächstes wird das gereinigte, konzentrierte Disulfidgruppen-enthaltende Immunglobulin unter wässerigen Flüssigphasenbedingungen mit einem reduzierenden Mittel in Kontakt gebracht, das dessen Disulfidgruppen reduziert, um sulfhydrylterminierte Gruppen freizusetzen. Wenn ein chemisches reduzierendes Agens verwendet wird, wird ein Dithiol, wie Dithiothreitol, bevorzugt. Wo ein enzymatisches reduzierendes Reagens verwendet wird, werden Glutathionreduktase, Lipoamiddehydrogenase und ähnliches bevorzugt. Die Reduktion der Disulfidgruppen wird im wesentlichen ohne Auswirkungen auf andere Anteile des Immunglobulinmoleküls erzielt, einschließlich der Disulfidgruppen, die in dessen interner wässrige Flüssigphasenbedingungen vorhanden sind. Diese Reduktion ist abhängig von einer Vielzahl von Variablen, einschließlich der Konzentration des Dithiol-reduzierenden Agens, genauso vom pH, wobei Kombinationen von disulfidreduzierenden Bedingungen verwendet werden können. In dieser Hinsicht haben die derzeitigen Erfinder überraschenderweise und unerwarteterweise herausgefunden, daß bei Konzentrationen eines reduzierenden Agens, wie Dithiothreitol, die niedrig genug sind (z. B. etwa 2 mM), nur die Disulfidbindungen, die durch das vorliegende Verfahren in den Fc-Bereich eingeführt wurden, eine Reduktion erfahren, mit der gleichzeitigen Erzeugung von Thiolen, wobei die Disulfidbindungen in dem durch die Komplementarität definierten Bereich und im Angelbereich bei einer solch niedrigen Konzentration des reduzierenden Agens im wesentlichen unbeeinflußt bleiben. Obwohl eine Aldehydgruppe des Fc-Bereiches nur im Vorhandensein von Natriumcyanoborhydrid als einem reduzierenden Reagenz irreversibel mit Amin-haltigen Linke m (z. B. Cystamin und oxidiertem Glutathion) reagieren wird, ist Natriumcyanoborhydrid nicht notwendig, wenn die Linker, die mit Aldehyden des Fc-Bereiches reagieren sollen, eine Hydrazidogruppe (

) enthalten.

Bemerkenswerterweise reduziert der Gebrauch von Natriumcyanoborhydrid zur reduktiven Aminierung der Aldehyde des Fc-Bereiches nicht die Disulfidbindungen in den reaktiven Linke m oder in den Zwischenkettenverbindungen des Immunglobulins.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine im wesentlichen vollständige Umwandlung der Fc eingeführten Disulfidseitenkettengruppen zu sulfhydrylterminierten Seitenketten erreicht. Im Gegensatz dazu tritt die Reduktion der Disulfidgruppen wie zuvor oben beschrieben (EP-A-0 326 863) bei wesentlich höheren Konzentrationen des chemisch reduzierenden Agens auf.

Das entstehende Sulfhydrylgruppen-enthaltende Immunglobulin wird vorzugsweise gereinigt. Derzeit ist die Verwendung eines Reinigungsverfahrens und Ausrüstung wie hierin oberhalb beschrieben zur Verwendung bei der Herstellung des oxidierten, aldehydgruppenenthaltenden Immunglobulins bevorzugt.

Das gereinigte Produkt ist direkt zur Konjugation mit einem nachweisbaren Anteil geeignet.

(c) Konjugate von derivatisiertem Immunglobulin mit nachweisbaren Anteilen.

Ein Fc-ortsspezifisches derivatisiertes Sulfhydrylgruppenenthaltendes Immunglobulin, hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung, kann im wesentlichen mit jedem Protein oder anderen Typ von nachweisbarem Anteil oder Markierungsstoff, der im Fachgebiet bekannt ist, konjugiert werden, um neue und nützliche Konjugate zu erzeugen. Solche nachweisbaren Anteile oder Markierungsstoffe umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Enzyme, Chromogene, lumineszente Stoffe, phosphoreszierende Verbindungen, chemilumineszente Verbindungen, fluoreszierende Verbindungen, und ähnliche. Die sulfhydrylterminierte Seitenkette erlaubt die Herstellung von Konjugaten, wobei die unkonjugierte oder normale Aktivität des Ausgangs-Immunglobulins und des Markierungsstoffs erhalten bleiben, und durch Verwendung des derivatisierten Immunglobulins der vorliegenden Erfindung werden Konjugate hergestellt, wobei Beschränkungen hinsichtlich der Konformationsfreiheit vermieden werden, so daß eine verbesserte Leistung und Stabilität erreicht werden kann.

Ein Markierungsstoff, der zur Verknüpfung mit einem derivatisierten Immunglobulin, hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung, verwendet wird, wird so derivatisiert, daß zumindest eine terminale sulfhydrylreaktive funktionelle Gruppe enthalten ist. Beispiele solcher reaktiven funktionellen Gruppen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Maleimid, Haloacetylgruppen wie z. B. Jodacetyl, Bromacetyl und Chloracetyl, und ähnliches. Techniken, die im Fachgebiet bekannt sind, können zur Herstellung solcher abgeleiten Markierungsstoffe und zur Herstellung solcher Konjugate verwendet werden.

Wie oben beschrieben, sind bevorzugte Konjugate, hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung, diejenigen, die ein Fc-ortsspezifisch derivatisiertes Sulfhydrylgruppenenthaltendes Immunglobulinmolekül umfassen, das mit einem derivatisierten Enzym, mit eine Seitenkettenkopplungsgruppe, die durch eine Maleimid-funktionelle Gruppe terminiert ist, verknüpft ist. Die verwendete Haftgruppe in dem Enzym ist vorzugsweise so gewählt, daß sie nicht die Konformationsfreiheit des Enzyms oder seine Funktion nach der Konjugation einschränkt. In der Kopplungsreaktion reagiert die terminale Sulfhydrylgruppe des derivatisierten Immunglobulinmoleküls mit der terminalen Maleimidgruppe des derivatisierten Enzyms, um das Konjugat zu bilden.

Wie von einem Fachmann verstanden wird, betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung vieler unterschiedlicher Konjugate, die mit einer Haftgruppe wie hierin beschrieben, hergestellt werden. Viele Moleküle eines einzelnen nachweisbaren Teilmoleküls können an ein einzelnes derivatisiertes Immunglobulinmolekül gemäß der Erfindung gebunden werden, oder viele derivatisierte Immunglobulinmoleküle können an ein einzelnes nachweisbares Teilmolekül gebunden werden. Ebenfalls können ein einzelnes Konjugat von verknüpften Molekülen eine Mehrzahl von bifunktionellen Haftgruppen (Q), wie beschrieben, enthalten.

Bei der Herstellung der bevorzugten Konjugate können derivatisierte Enzyme verwendet werden, die unter Verwendung der Techniken, die in EP-A-0 314 127 beschrieben sind, hergestellt wurden. Solche bevorzugten Ausgangsenzyme sind charakterisiert durch die Formel:

wobei:

R&sub2; eine Gruppe ist, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome enthält;

R&sub3; eine Alkylengruppe ist, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthält;

k ist eine ganze Zahl von 1 bis 10;

n ist eine ganze Zahl von 1 bis 20; und

E ist ein Enzym.

Bei den derivatisierten Enzymen gemäß Formel (7) enthält die Verknüpfungsgruppe zwischen dem Enzym (E) und der terminalen Maleimidgruppe vorzugsweise eine relativ lange oligomere Kette von Aminosäuren, von etwa 2 bis etwa 4 Aminosäuren, was nicht nur eine bessere physikalische Trennung zwischen den konjugierten Molekülen liefert, die eine solche Verknüpfungsgruppe enthalten, sondern auch dazu dient, die Wasserlöslichkeit und Dispergierbarkeit eines Konjugates, das eine solche Kette enthält, zu vergrößern.

Um ein Konjugat eines derivatisierten Immunglobulins und eines derivatisierten. Enzyms mit einer Seitenkette, die durch eine Maleimidgruppe terminiert ist, herzustellen, kann jedes geeignete Verfahren, das im Fachgebiet bekannt ist, verwendet werden. Beispielsweise wird ein gereinigtes Sulfhydrylgruppenenthaltendes Immunglobulinmolekül unter wässerigen Flüssigphasenbedingungen mit einem gereinigten Enzym, das eine maleimidterminierte Seitenkette aufweist gemischt. Zahlreiche Kombinationen von Reaktionsbedingungen können bei der Kopplungsreaktion der Sulfhydrylgruppe mit der Maleimidgruppe verwendet werden. Die Kopplungsreaktion wird vorzugsweise im Dunkeln durchgeführt und man gestattet ein Fortschreiten für mindestens 1 Stunde, vorzugsweise über etwa 12 Stunden. Man soll verstehen, daß Zeiträume, die größer als 20 Stunden sind, normalerweise den Ertrag des Konjugates nicht zu steigern scheinen. Die Konjugation oder Kopplungsreaktion läuft anscheinend im wesentlichen bis zur Vollständigkeit ab, auf den Ausgangswerten der molaren Verhältnisse der reagierenden Gruppen basierend.

Es wird bevorzugt ein Konjugat herzustellen, das keine übrigbleibenden freien oder reaktiven Sulfhydrylgruppen besitzt. Demgemäß werden die freien Sulfhydrylgruppen auf den derivatisierten Immunglobulinmolekülen im Konjugat mit einem Abtrennagenz, wie Maleimiden, die mit Alkylgruppen von Methyl bis Heptyl substituiert sind, in Reaktion gebracht. Ein bevorzugtes Abtrennagenz ist N-Ethylmaleimid (NEM). Ein bequemes und derzeit bevorzugtes Abtrennverfahren ist es, zu einem gepufferten wässerigen Produkt Konjugat-enthaltenden Medium eine wässerige Lösung von NEM bis zu einer Endkonzentration von etwa 0,3 mN zuzusetzen, und der Mischung über mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur zu schütteln. Das abgetrennte Konjugat kann direkt zu Immunoassayzwecken verwendet werden.

Die Konjugate, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, sind nützlich bei dem Nachweis eines Analyten in homogenen und heterogenen Immunoassaysystemen, die im Fachgebiet bekannt sind, wie z. B. kompetitiven Immunoassays, Sandwichimmunoassays, immunometrischen Immunoassays und ähnlichen, wobei die Menge einer nachweisbaren Komponente, die hierin verwendet wird, gemessen und in Korrelation zu der Menge des Analyten, der in einer Testprobe vorhanden ist, gesetzt werden kann. Im allgemeinen hängen solche Messungen von der Fähigkeit eines Immunglobulins, z. B. eines Antikörpers davon ab, an einen spezifischen Analyten zu binden, wobei ein Konjugat bestehend aus einem Antikörper zu einem solchen Analyten, der mit einem nachweisbaren Anteil markiert ist verwendet wird, um das Ausmaß einer solchen Bindung festzustellen. Üblicherweise wird das Ausmaß der Bindung durch die Menge des nachweisbaren Teilchens festgestellt, das im Konjugat vorhanden ist, das entweder teilgenommen oder nicht teilgenommen hat an einer Bindungsreaktion mit dem Analyten, wobei die Menge der nachweisbaren Komponente, die nachgewiesen und gemessen wurde, in Korrelation mit der Menge des Analyten gesetzt werden kann, der in der Testprobe vorhanden ist.

Die Konjugate, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, werden in einer kommerziell verpackten Form als eine Zusammensetzung oder Mischung präsentiert, wobei die Kompatibilität der Reagenzien gewährleistet ist, oder als ein Testkit, z. B. eine abgepackte Kombination von einem oder mehreren Behältern, die ein Konjugat enthalten, das gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde und andere geeignete Reagenzien zur Durchführung eines Immunoassays wie hierin beschrieben, und wie im Fachgebiet bekannt ist. Die Reagenzien können weiterhin andere Materialien umfassen, von denen bekannt ist, daß sie für den Assay vom Standpunkt des Anwenders aus nützlich sind, wie z. B. Puffer, Verdünnungsmittel, Standards, Kontrollen und ähnliches.

Die vorliegende Erfindung wird nun, ohne darauf beschränkt zu sein, durch die folgenden Beispiele erläutert:

Beispiel 1 Ortsspezifische Thiolierung von anti-karcinoembryonischen Antigen (anti-CEA)-Immunglobulinen und ihre Verknüpfung an intestinale alkalische Phosphatase vom Kalb. (a) Einführung von Thiolgruppen in den Fc-Bereich des Antikörpers

Eine 1 mL Lösung von anti-CEA-Immunglobulinen (3-4 mg/mL in 0,1 M Triethanolamin (TEA)-Pufferlösung, die 0,16 M Natriumchlorid enthält, pH 8) wurde in ein bernsteinfarbenes Glasfläschchen umgefüllt. Eine 110 pL Lösung von 200 mM Natrium- m-periodat (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) in 0,1 M TEA Pufferlösung, pH 8, die 0,16 M NaCl enthält, wurde der Antikörperlösung hinzugefügt und die erhaltene Mischung wurde 1 Stunde bei 5ºC im Dunkeln leicht auf einem Rührer gerührt.

Der oxidierte Antikörper wurde von der obigen Reaktionsmischung durch Chromatographie auf einer 1 · 45 cm Säule Sephadex G-25 getrennt. Die Säule wurde in Gleichgewicht gebracht und mit 0,1M Natriumphosphat eluiert, pH 7,0, die 0,1 M NaCl enthält. Fraktionen von jeweils etwa 1 mL wurden während der Elution gesammelt und die Absorption wurde bei 280 nm ermittelt. Die Spitzenwertfraktionen wurden zusammengefaßt, und die Proteinkonzentration des Immunglobulinpools wurde aus seiner Absorption bei 280 nm mit einem Extinktionskoeffizienten (E1cm1%) von 13,9 berechnet.

Der Immunglobulinpool wurde auf 1,0 mL durch Zentrifugieren bei 5000 · g konzentriert, unter Verwendung von Zentrikonröhrchen (Amicon, Danvers, Massachusetts, USA), die eine Membran enthalten, die so bemessen ist, daß das Material, das ein mittleres Molekulargewicht bis etwa 30,000 besitzt, hindurchgelassen wird. Das Konzentrat wurde mit 250 uL 0,75M Cystamindihydrochlorid (Sigma Chemical Co.) gemischt, das in 0,1 M Natriumphosphat gelöst wurde, pH 7,0, und eine 0,1M NaCl- Lösung enthält, und die entstehende Mischung wurde bei Raumtemperatur leicht gerührt. Nach etwa 15 Minuten wurden 63 uL von 0,3 mN Natriumcyanoborhydrid (Sigma Chemical Co.) in 0,1M Natriumphosphat gelöst, das 0,1M Natriumchlorid enthält, pH 7,0, hinzugefügt und die entstehende Mischung wurde bei Raumtemperatur auf einem Rührer über Nacht leicht gerührt.

Der derivatisierte Antikörper wurde durch Gelfiltration auf einer 1 · 45 cm Säule Sephadex G-25 aufgearbeitet. Die Säule wurde in Gleichgewicht gebracht und mit 0,1 M molaren Natriumphosphat, pH 7,0, die 0,1 M NaCl und 2 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigäure) enthält, eluiert. Fraktionen von jeweils etwa 1 mL wurden während der Elution gesammelt und die Absorption bei 280 nm ermittelt. Die Spitzenwertfraktionen wurden zusammengefaßt, und die Konzentration des modifizierten Antikörpers aus seiner Absorption bei 280 nm, wie oben beschrieben, berechnet.

Die zusammengefaßte Antikörperfraktion wurde erneut, unter Verwendung von Zentrikontuben derselben Größe und Quelle wie oben beschrieben, auf 1 mL konzentriert und mit 50 uL einer 40 mN Dithiothreitollösung (Sigma Chemical Co.; aufgelöst in 0,1M Natriumphosphatlösung, pH 7,0, 0,1M NaCl und 2 mM EDTA enthaltend) über 15 Minuten bei Raumtemperatur behandelt. Der Überschuß an Dithiothreitol wurde durch Chromatographie auf einer 1 · 45 cm Sephadex G-25 Säule entfernt. Fraktionen von jeweils etwa 1,0 mL wurden gesammelt und die Absorption bei 280 nm wurde gemessen. Die Spitzenwertfraktionen mit einer Absorption bei 280 nm von 0,3 oder höher wurden zusammengefaßt und bis zum Beginn der Konjugation auf Eis gelagert.

b) Derivatbildung aus einem Enzym

Ein 0,6 mL Anteil an intestinaler alkalischer Phosphatase vom Kalb (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana, USA) mit 10 mg/mL wurde gegen 0,1 M Natriumphosphat-Pufferlösung, die 0,1M NaCl, 1 mN MgCl&sub2;, und 0,1 mM ZnCl&sub2; enthält, pH 7,0, diafiltriert. Das Volumen wurde mit dem Dialysepuffer auf 1 mL gebracht und die Enzymlösung wurde in ein Glasfläschchen umgefüllt. Zu der Enzymlösung wurden 200 uL DMF hinzugefügt, die 0,8 mg Succinimidyl (Tricaproamidocyclohexylmethyl)-N-Maleimid (STCM)-Linker enthalten, ein mit 30 Atomen verlängertes heterobifunktionelles Linkerreagenz mit Succinimidester und Maleimid-endständigen Gruppen, der wie in der europäischen Patentantragspublikation Nr. 0314127 beschrieben, hergestellt wurde und hier durch die Referenz enthalten ist. Die entstehende Reaktionsmischung wurde auf einem Rührer 30 Minuten bei Raumtemperatur leicht gerührt und das derivatisierte Enzym wurde durch Chromatographie auf einer 1 · 45 cm Säule Sephadex G-25 gereinigt. Die Säule wurde in Gleichgewicht gebracht und mit 0,1 M Natriumphosphat Pufferlösung, die 0,1 M NaCl, 1 mM MgCl&sub2; und 0,1 mM ZnCl&sub2; enthält, pH 7,0, eluiert. Fraktionen von jeweils etwa 1 mL wurden während der Elution gesammelt und die Absorption wurde bei 280 nm ermittelt. Die Spitzenwertfraktionen wurden zusammengefaßt und die Konzentration des Enzyms in dem Pool wurde aus seiner Absorbtion bei 280 nm unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten (E1cm1%) von 10, berechnet.

c) Konjugation von derivatisiertem Enzym mit im Fc-Bereich thioliertem Antikörper

Die derivatisierte alkalische Phosphatase aus obigem Schritt (b) wurde mit dem aktivierten Antikörper aus obigem Schritt (a), in einem molaren Verhältnis von 2 : 1 (Enzym zu Antikörper), kombiniert. Die Mischung wurde über Nacht auf einem Rührer bei 2-8ºC leicht gerührt, was zu einer ca 90%igen Konjugation des Ausgangsenzyms und Antikörpers führte, wie durch HPLC und SDS-PAGE Auswertungen gezeigt.

Die noch unreagierten Thiolgruppen auf dem Antikörper wurden durch Behandlung mit N-Ethylmaleimid (NEM; Sigma Chemical Co.) über einen Zeitraum von 1 Stunde bei Raumtemperatur abgetrennt. Anteile einer 5 mN Lösung wurden dem Konjugat hinzugefügt, so daß die Endkonzentration von NEM in dem Konjugat etwa 0,3 mM war.

d) Leistung des Fc-Konjugates

Die Leistung des Fc-Konjugates, das wie oben beschrieben hergestellt wurde, wurde durch einen Sandwich Mikropartikelfangenzymimmunoassay (MEIA) für karcinoembryonales Antigen [CEA] ausgewertet(King, et al., In Immunodiagnosis of Cancer, Bei der Immunodiagnose von Krebs, 2. Ausgabe, in press) unter Verwendung des Abbott IMx® Systems (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, U. S. A.; (Fiore, et al., Clin. Chem., Band 34, Seiten 1726-1732, 1988). Gemäß der Anordnung dieses Assays wurden Latexmikropartikeln, die kovalent mit dem Fangantikörper (anti-CEA) verknüpft sind, zunächst mit einer Probe, die bekannte oder unbekannte Mengen des Analyten (CEA) enthält, und dann mit alkalischen Phosphatase-markiertem Antikörperkonjugat (anti-CEA/alkalisches Phosphatasekonjugat) inkubiert. Nicht adsorbierte Materialien wurden bei jedem Schritt durch Kapillarwirkung und Pufferwäschen entfernt. Nach der Entfernung des ungebundenen Konjugates, wurde Enzymsubstrat (4- Methylumbelliferylphosphat) hinzugefügt und das Ausmaß der Fluoreszenzzunahme gemessen.

Die Daten in Fig. 1 und Tabelle 1 vergleichen die Leistung des Fc-ortsspezifischen Konjugates der vorliegenden Erfindung mit jenem eines anti-CEA/alkalische Phosphatasekonjugates, das durch Kombination des Iminothiolan-aktivierten Enzyms mit STCM Linker-aktiviertem Antikörper (STCM-Konjugat) hergestellt wurde, wie es in der europäischen Patentantragspublikations Nr. 0314127 beschrieben wird. Die Ergebnisse zeigen klar eine 400%ige Verbesserung der Assayempfindlichkeit mit dem Fc- ortsspezifischen Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung, gegenüber dem STCM-Konjugat.

Tabelle 1 Vergleich von anti-CEA/alkalische Phosphatase Fc-ortsspezifischen Konjugaten mit Konjugaten, die unter Verwendung von Iminothiolan/STCM verlängertem Linker (STCM-Konjugat) im IMx CEA Assay, hergestellt wurden

Die beiden Konjugate, die oben beschrieben sind, wurden ebenfalls jeder über 3 Tage bei 45ºC identisch belastet, um ihre Stabilität auszuwerten. Die Daten, die in Tabelle 2 gezeigt sind, zeigen daß die thermische Stabilität des Fc- ortsspezifischen Konjugates der vorliegenden Erfindung mit jener des STCM-Konjugates, das zuvor beschrieben wurde, vergleichbar war, und daß selbst nach Hitzebelastung das Fc-ortsspezifische Konjugat der vorliegenden Erfindung ein mehr als 3-fach höheres Signal lieferte als das STCM-Konjugat.

Tabelle 2 Vergleich von anti-CEA/alkalische Phosphatase Fc-ortsspezifischem Konjugat mit STCM-Konjugat nach Hitzebelastung (3 Tage bei 45ºC)

Beispiel 2 Fc-ortsspezifische Thiolierung von anti-Krebs Antigen (CA) 19-9 Immunglobulin und seine Verknüpfung an intestinaler alkalischer Phosphatase vom Kalb.

Ein anti-CA 19-9 IgG und intestinale alkalische Phosphatase vom Kalb wurden im wesentlichen jeweils, wie in den Schritten (a) und (b) von Beispiel 1 beschrieben, aktiviert und dann konjugiert, indem sie in einem molaren Verhältnis von 1,5 : 1 (Enzym zu Antikörper) kombiniert wurden. Die noch unreagierten Thiol-Gruppen wurden mit N-Ethylmaleimid, wie es in Beispiel 1 beschrieben wurde, abgetrennt.

Die Leistung des Fc-ortsspezifischen Konjugates wurde unter Verwendung eines Sandwich artigen MEIA-Formates, das das Abbott IMx System verwendete, analysiert und mit der Leistung des STCM-Konjugates, das wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt wurde, verglichen. Die Ergebnisse, die in Fig. 2 und Tabelle 3 gezeigt werden, zeigen eine etwa 8-fach höhere Empfindlichkeit für das Fc-ortsspezifische Konjugat als das STCM-Konjugat.

Tabelle 3 Vergleich von anti-CA 19-9/alkalischer Phosphatase Fc-ortsspezifischem Konjugat mit STCM-Konjugaten

Beispiel 3 Fc-ortsspezifische Thiolierung von anti-Harnwegsinfektion- (UTI)-Immunglobulin und seine Verknüpfung an intestinaler alkalischer Phosphatase vom Kalb.

Hasen- und Schafs- anti-UTI-Immunglobuline und intestinale alkalische Phosphatase vom Kalb wurden im wesentlichen wie jeweils in den Schritten (a) und (b) beschrieben, aktiviert und konjugiert, indem die derivatisierten Materialien bei einem molaren Verhältnis von 2 : 1 (Enzym zu Antikörper) kombiniert wurden und über Nacht bei 2-8ºC durch ein leichtes Schütteln auf einem Rührer inkubiert wurden. Nach der Inkubation über Nacht wurden überbleibende Thiolgruppen in den Konjugaten mit 5 mN N-Ethylmaleimid, wie in Beispiel 1 beschrieben, abgetrennt

Die Leistung solcher Fc-Konjugate wurde mit der Abbott Test-PackTM Immunoassayvorrichtung ausgewertet [Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA; W. E. Brown III, Clin. Chem., Band 33, Seite 1567, (1987)] unter Verwendung von E. Coli- Extrakten als Testorganismen, und mit jenen eines Periodatkonjugates verglichen, das gemäß dem Verfahren von Nakane und Kawaoi hergestellt wurde (P. K. Nakane und Akira Kawaoi, J. Histochem. and Cytochem Band 22, Seiten 1084-1091, 1974). Die Fc-ortsspezifischen Konjugate erwiesen sich als etwa 4-fach aktiver als die Periodatkonjugate.

Beispiel 4 Fc-ortsspezifische Thiolierung von anti-Biotin-Immunglobulin und seine Kopplung an intestinale alkalische Phosphatase vom Kalb.

Hasen-anti-Biotin-Immunglobuline und intestinale alkalische Phosphatase vom Kalb wurden im wesentlichen wie in den Schritten (a) und (b) von Beispiel 1 beschrieben, aktiviert, und dann, durch Kombination der derivatisierten Materialien in einem molaren Verhältnis von 1 : 1, konjugiert. Die entstehende Mischung wurde über Nacht bei 2-8ºC auf einem Rührer leicht gerührt. Am folgenden Morgen wurden die unreagierten Thiole in dem resultierenden Konjugat mit einer 5 mN Lagerlösung von NEM, wie in Beispiel 1 beschrieben, abgetrennt.

Das Fc-ortsspezifische Konjugat zeigte, bei der Auswertung durch eine DNA Untersuchung mit humanen Papillomvirus (HPV)-Assay, eine 20-fache Zunahme der Empfindlichkeit verglichen mit dem STCM-Konjugat, das wie in Beispiel 1 oben beschrieben, hergestellt wurde (siehe Fig. 3 und Tabelle 4). Tabelle 4

Vergleich von anti-Biotin/alkalische Phosphatase Fc-ortsspezifischem Konjugat mit STCM-Konjugat durch HPV-DNA Untersuchungsassay

Beispiel 5 Fc-ortsspezifische Thiolierung von anti-Krebsantigen (CA 125) Immunglobulin und seine Kopplung an intestinale alkalische Phosphatase vom Kalb.

Monoklonale anti-CA 125 Immunglobuline und alkalische Phosphatase wurden im wesentlichen, wie in den Schritten (a) und (b) von Beispiel 1 beschrieben, aktiviert und dann konjugiert, indem die derivatisierten Materialien in den jeweiligen molaren Verhältnissen von 1 : 1 und 2 : 1 (Enzym zu Antikörper), kombiniert wurden. Die entstehenden Mischungen wurden über Nacht bei 2-8ºC auf einem Rührer leicht gerührt. Die entstehenden Konjugate wurden dann den Endgruppenabtrennverfahren aus Beispiel 1 durch Zusatz von 5 mM NEM, unterworfen.

Die Leistung dieser Konjugate wurde durch ein Sandwich- Typ MEIA Format, unter Verwendung des Abbott IMx Systems, ausgewertet, und es wurde herausgefunden, daß sie vergleichbar war mit jener von Konjugaten die hergestellt wurden in dem der DTT-reduzierte Antikörper mit dem Enzym derivatisiert mit dem STCM verlängerten Linker, wie beschrieben in der europäischen Patentantragspublikations Nr. 0314127, kombiniert wurde.

Beispiel 6 Fc-ortsspezifische Thiolierung von antimenschlichen IgM Immunglobulin und seine Kopplung an intestinale alkalische Phosphatase vom Kalb.

Ziegen-anti-menschliche-IgM-Immunglobuline und intestinale alkalische Phosphatase vom Kalb wurden im wesentlichen, wie in den Schritten (a) und (b) im Beispiel 1 beschrieben, aktiviert, und wurden dann konjugiert, durch Kombination der derivatisierten Materialien in jeweiligen molaren Verhältnissen von 1 : 1 und 2 : 1 (Enzym zu Antikörper), und durch leichtes Rühren über Nacht der Mischungen bei 2-8ºC auf einem Rührer. Die entstehenden Konjugate wurden dann dem Endgruppenabtrennverfahren aus Beispiel 1, durch den Zusatz von 5 mN NEM, unterworfen.

Die Leistung der Fc-ortsspezifischen Konjugate, durch einen Sandwich-Typ MEIA ausgewertet, bei Verwendung des Abbott IMx Systems, erwies sich als vergleichbar zu jener von den Konjugaten die unter Verwendung von Iminothiolan und STCM verlängertem Linker hergestellt wurden, wie im obigen Beispiel 1 beschrieben.

Beispiel 7 Fc-ortsspezifische Thiolierung von anti-menschlichem IgE Immunglobulinen und ihre Verknüpfung an intestinale alkalische Phosphatase vom Kalb.

Ziegen-anti-menschliches-IgE-Immunglobuline und alkalische Phosphatase wurden im wesentlichen, wie in den Schritten (a) und (b) aus Beispiel 1 beschrieben, aktiviert und dann konjugiert, indem die derivatisierten Materialien im jeweiligen molaren Verhältnis von 1 : 1 kombiniert wurden. Die Antikörper/Enzymmischung wurde über Nacht bei 2-8ºC auf einem Rührer leicht gerührt und das entstehende Konjugat wurde dem Endgruppenabtrennverfahren aus Beispiel 1, durch den Zusatz von 5 mM NEM, unterworfen.

Die Leistung des Fc-Konjugates wurde durch einen Sandwich-Typ Immunoassay folgendermaßen ausgewertet. Eine Auswahl an Allergenen, die auf einem Stück Nitrocellulosepapier immobilisiert wurde, wurde mit menschlichen IgE Molekülen, die für zahlreiche Allergene spezifisch sind, behandelt. Das Nitrocellulosepapier wurde mit Phosphatpuffersalzlösung gewaschen, mit den Fc-ortsspezifischen Konjugaten bei verschiedenen Verdünnungen im Bereich von 1 : 1000 bis 1 : 16000 behandelt, was zu unterschiedlichen Farbreaktionen mit alkalischer Phosphatase führte. Die Ergebnisse, die in Fig. 4 gezeigt sind, zeigen, daß das Fc-ortsspezifische Konjugat etwa 3-mal empfindlicher ist als die Konjugate, die gemäß dem oben beschriebenen Periodatverfahren von Nakane und Kawaoi hergestellt wurden.

Beispiel 8 Ortsspezifische Thiolierung von anti-Hypophysenfaserprotein (anti-PTP) und seine Verknüpfung an intestinale alkalische Phosphatase vom Kalb.

Anti-PTP Immunglobuline und alkalische Phosphatase wurden im wesentlichen, wie in den Schritten (a) und (b) von Beispiel 1 beschrieben, aktiviert und dann in einem molaren Verhältnis von 1 : 1 und 2 : 1 (Enzym zu Antikörper) konjugiert. Die Antikörper/Enzymmischung wurde über Nacht bei 2-8ºC auf einem Rührer leicht gerührt und das entstehende Konjugat wurde dem Endgruppenabtrennverfahren aus Beispiel 1, durch den Zusatz von 5 mM NEM, unterzogen.

Die Leistung des Fc-ortsspezifischen Konjugates wurde durch einen Sandwich-Typ MEIA-Format, unter Verwendung des Abbott IMx Systems, ausgewertet und verglichen mit jener des Periodatkonjugates, das gemäß dem oben erwähnten Verfahren von Nakane und Kawaoi hergestellt wurde. Die Ergebnisse, die in Fig. 5 und Tabelle 5 gezeigt sind, zeigen klar eine 10-fache Verbesserung des Signal/Geräusch-Verhältnisses (S/N) des Fc- ortsspezifischen Konjugates verglichen mit dem Periodatkonjugat.

Tabelle 5 Vergleich von anti-Bauchspeicheldrüsenfaserprotein/alkalisches Phosphatase Fc mit Periodatkonjugat durch IMx PTP Assay PTP = hypophiser??

[Die Werte in Klammern zeigen die Signal/Geräusch-Verhältnisse]

Beispiel 9 Einbau von verlängerten Analoga des oxidierten Glutathion in Fc- Bereiche von Antikörpern und Glutathion Reduktase katalysierte Erzeugung von Thiolen

Antikörper werden mit Natriumperiodat bei pH 8 und 2-8ºC, wie in Beispiel 1 beschrieben, oxidiert und dann, nach Entfernung der überschüssigen Reagenzien, einer reduktiven Alkylierung, durch ein Überschuss an oxidierten Glutathion (ca. 100 mN) und Natriumcyanoborhydrid (15 mN), unterzogen. Nach der Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur, wird der Überschuß an Reagenzien durch Gelfiltration durch eine Sephadex G-25-Säule, wie in Beispiel 1 beschrieben, entfernt.

Der abschließende Schritt in der Aktivierung des Antikörpers wird enzymatisch durchgeführt. Zu dem derivatisierten Antikörper mit verlängerten Analoga von oxidierten Glutathion, das kovalent an den Fc-Bereich angeheftet ist, werden ein paar Mikrogramm des Enzyms, Glutathionreduktase und ein Überschuß von NADPH (etwa 1 mM), hinzugefügt, und die Reaktion wird, bis zur Bildung einer angemessenen Menge an Thiolen (2-6 Mol/Mol Antikörper), durchgeführt.

Nach der Erzeugung der Thiole wird der Antikörper mit alkalischer Phosphatase, die aus STCM verlängertem Linker derivatisiert wurde, kombiniert und die resultierende Mischung wird über Nacht bei 2-8º, C wie in Beispiel 1 beschrieben, leicht gerührt. Abschließend wird das Konjugat mit NEM, wie in Beispiel 1 beschrieben, abgetrennt und dialysiert um überschüssige Reagenzien zu entfernen.

Beispiel 10 Einbau von Hydrazidolipoamid und verlängerten Analoga von Hydrazidolipoamid in den Fc-Bereich von Antikörpern und Lipoamiddehydrogenase katalysierte Erzeugung von Thiolen

Antikörper werden mit Natriumperiodat bei pH 8 und 2-8ºC, wie beschrieben in Beispiel 1, oxidiert und dann, nach Entfernung von überschüssigem Periodat, behandelt mit einem Überschuß an Hydrazidolipoamid oder verlängerten Analoga von Hydrazidolipoamid (10-50 mM). Nach einer Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur, wird der Überschuß an Reagenzien durch Gelfiltration über eine Sephadex G-25-Säule, wie in Beispiel 1 beschrieben, entfernt.

Der abschließende Schritt in der Aktivierung des Antikörpers wird enzymatisch durchgeführt. Zu dem derivatisierten Antikörper mit dem Lipoamidanteil der kovalent an dem Fc-Bereich gebunden ist, werden ein paar Mikrogramm Lipoamiddehydrogenase und ein Überschuß an NADPH (etwa 1 mN) hinzugefügt und die Reaktion wird, bis zur Bildung einer ausreichenden Menge an Thiolen (2-6Mol Thiol/Mol Antikörper), durchgeführt.

Nach der Erzeugung der Thiole, wird der Antikörper mit alkalischer Phosphatase, die aus STCM verlängertem Linker derivatisiert wurde, kombiniert, und die entstande Mischung wird über Nacht bei 2-8ºC, wie in Beispiel 1 beschrieben, leicht gerührt. Schließlich wird das Konjugat vor der Verwendung mit NEM, wie in Beispiel 1 beschrieben, abgetrennt und dialysiert, um überschüssige Reagenzien zu entfernen.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Herstellung eines derivatisierten Immunglobulins, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

(a) ortsspezifische Oxidierung des glykosylierten Abschnittes des Fc-Bereiches eines Immunglobulins mit einem Oxidans, um mindestens zwei Hydroxylgruppen in dem Abschnitt des Immunglobulins in eine Aldehydgruppe zu überführen; und

(b) Umsetzung des oxidierten Immunglobulins aus Schritt (a) mit einer Disulfidverbindung, wobei mindestens eine der Aldehydgruppen reduktiv aminiert wird, um eine Disulfidgruppe in den Fc-Bereich des Immunglobulins einzuführen; wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß es folgenden Schritt umfaßt:

(c) das selektive Reduzieren der Disulfidbindungen der Disulfidgruppe des umgesetzten Immunglobulins aus Schritt (b) mit einer Menge eines Reduktans, die ausreichend ist, um mindestens eine der Disulfidgruppen des Immunglobulins in zwei Sulfhydrylgruppen umzuwandeln, aber unzureichend ist, um die Disulfidgruppen in dem durch die Komplementarität definierten Bereich und in dem Scharnierbereich des Immunglobulins zu reduzieren, wodurch die Disulfidbindungen in dem durch die Komplementarität definierten Bereich und in dem Scharnierbereich im wesentlichen unbeeinflußt bleiben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Disulfidverbindung in Schritt (b) folgende Formel hat:

X-R&sub1;-S-S-R&sub1;-X

wobei

X eine Aminoalkylgruppe oder eine Semihydrazongruppe ist;

R&sub1; eine Gruppe ist, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome enthält;

und R&sub1; und X zusammen mit den Disulfidatomen zwischen ihnen einen makrozyklischen, heterozyklischen Ring bilden oder eine Interimmunglobulindisulfid enthaltende Kette bilden können, um mindestens eine Aldehydgruppe pro Immunglobulin in eine Gruppe zu überführen, die eine Disulfidgruppe gemäß der folgenden Formel enthält:

- X-R&sub1;-S-S-

wobei:

R&sub1; und X wie oben definiert sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Oxidans in Schritt (a) ein chemisches Oxidans ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei X aus der Gruppe gewählt ist, die aus CH&sub2;-NH&sub2;,

, einem Fragment von Glutathion, einem Fragment von reduziertem Hydrazidolipoamid, alkylkettenmodifiziertem, verlängertem Glutathion, und alkylkettenmodifiziertem, verlängertem Hydrazidolipoamid besteht.

5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das chemische Oxidans aus der Gruppe gewählt ist, die aus Alkalimetallperiodat, Jod und Brom besteht.

6. Verfahren aus Anspruch 3, worin das chemische Oxidans Natriumperiodat ist.

7. Das Verfahren aus Anspruch 1, wobei das Oxidans in Schritt (a) ein enzymatisches Oxidans ist.

8. Das Verfahren aus Anspruch 7, wobei das enzymatische Oxidans Neuraminidase und Galaktoseoxidase umfaßt, und wobei der Oxidationsschritt das sequenzielle In-Kontakt-Bringen des Immunglobulins mit Neuraminidase und Galaktoseoxidase umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Disulfidverbindung in Schritt (b) aus der Gruppe gewählt ist, die aus Cystamin, oxidiertem Glutathion, oxidierter Hydrazidoliponsäure, alkylkettenmodifiziertem verlängertem oxidiertem Glutathion und alkylkettenmodifizierter verlängerter oxidierter hydrazidolipoischer Säure besteht.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reduktans in Schritt (c) ein chemisches Reduktans ist, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus Mercaptoethanol, Dithiothreitol, Natriumborhydrid und Natriumdithionit besteht.

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reduktans in Schritt (c) ein enzymatisches Reduktans ist, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus Glutathionreduktase und Lipoamiddehydrogenase besteht.

12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Sulfhydryl- Gruppen-enthaltende Immunglobulin aus Schritt (c) mit einer nachweisbaren Gruppe in Kontakt gebracht wird, die eine Maleimidgruppe enthält, die mit der Sulfhydrylgruppe reagiert, um das Immunglobulin an den nachweisbaren Anteil zu verknüpfen, um ein Konjugat zu erzeugen.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die nachweisbare Gruppe aus der Gruppe gewählt ist, die aus Enzymen, Chromophoren, fluoreszenten Molekülen, chemilumineszenten Molekülen, phosphoreszenten Molekülen, farbigen Partikeln und lumineszenten Molekülen besteht.

14. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die nachweisbare Gruppe ein Enzym ist.

15. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Maleimidgruppe an die nachweisbare Gruppe über eine Linkergruppe angebunden ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Maleimidgruppe ein Teil einer heterobifunktionellen Gruppe ist, die das Immunglobulin an die nachweisbare Gruppe koppelt.

17. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reduktans von etwa 1 mM bis etwa 5 mM Dithiothreitol umfaßt.

18. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Reduktans etwa 2 mM Dithiotreitol umfaßt.







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