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Dokumentenidentifikation DE69328770T2 26.10.2000
EP-Veröffentlichungsnummer 0627008
Titel VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON MELANINPIGMENTE DURCH BIOKONVERSION
Anmelder L'Oréal S.A., Paris, FR
Erfinder JUNINO, Alex, F-93180 Livry-Gargan, FR;
HILAIRE, Pascal, F-37100 Tours, FR;
MARTIN, Richard, F-37210 Rochecorbon, FR
Vertreter Beetz und Kollegen, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69328770
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, NL, PT, SE
Sprache des Dokument FR
EP-Anmeldetag 19.11.1993
EP-Aktenzeichen 949008577
WO-Anmeldetag 19.11.1993
PCT-Aktenzeichen FR9301138
WO-Veröffentlichungsnummer 9412653
WO-Veröffentlichungsdatum 09.06.1994
EP-Offenlegungsdatum 07.12.1994
EP date of grant 31.05.2000
Veröffentlichungstag im Patentblatt 26.10.2000
IPC-Hauptklasse C12P 17/00
IPC-Nebenklasse C09B 69/10   A61K 7/00   A61K 7/13   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Melaninpigmenten durch Biokonversion und die so erhaltenen Pigmente.

Bekanntermaßen können farbige Pigmente auf dem Gebiet der Kosmetik verwendet werden; es handelt sich im wesentlichen um anorganische Pigmente, um Pigmente aus synthetischen Direktfarbstoffen und, im Falle von schwarzen Pigmenten, um reinen Kohlenstoff.

In der Druckschrift EP 0 467 767 sind Produkte auf der Basis von lamellaren Partikeln beschrieben, die ein Melaninpigment enthalten.

Es ist insbesondere bekannt, durch Oxidation von 5-Hydroxyindol gelbbraune Farbstoffe herzustellen. Es ist im übrigen insbesondere aus der Druckschrift EP 0 441 689 bekannt, Melaninpigmente auf enzymatischem Weg durch oxidative Polymerisation von 5,6-Dihydroxyindolderivaten, beispielsweise 5,6- Dimethoxyindol oder 5,6-Methylendioxyindol, herzustellen. Die Anmelderin hat festgestellt, daß Melaninpigmente durch Biokonversion von einfachen Substraten, insbesondere unter Einsatz von Pflanzenzellen, die in vitro auf herkömmliche Weise kultiviert werden, schnell erhalten werden können.

In den bis heute vorgeschlagenen Verfahren werden herkömmliche Precursoren für die Biosynthese von Melaninen eingesetzt, die sich als kostenintensiv erwiesen haben.

Im Gegensatz hierzu handelt es sich erfindungsgemäß um geläufige Precursoren und biologische Verbindungen, die einfach zu verwenden und kostengünstig sind. In dem Mechanismus der enzymatischen Biokonversion gemäß der Erfindung werden keine Polyphenoloxydasen eingesetzt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Melaninpigmenten durch enzymatische Biokonversion, wobei ein Precursor von Melanin als Substrat und Pflanzenzellen eingesetzt werden.

Erfindungsgemäß werden folgende Schritte durchgeführt:

a) Pflanzenzellen von Mohn (Papaver somniferum), die vorab kultiviert wurden, werden aus ihrem Kulturmedium entfernt und in einer Konzentration im Bereich von 10 bis 100 g/l in einem frischen Kulturmedium subkultiviert,

b) die Zellen werden in der Latenzzeit oder am Ende der Latenzzeit zumindest teilweise zerkleinert,

c) die zumindest zum Teil zerkleinerten Zellen werden in einem Medium für die Biokonversion mit einem als Substrat dienenden Melaninprecursor, der unter Indol, Indolin, Dihydroxyphenylalanin, Tyramin und Tyrosin ausgewählt ist, in Kontakt gebracht, und

d) das ausgefallene Melaninpigment wird gewonnen.

In einem ersten Schritt werden undifferenzierte Zellen von Mohn in einem herkömmlichen Kulturmedium in vitro kultiviert. Nach einer ausreichenden Wachstumszeit werden die Zellen beispielsweise durch Filtrieren aus ihrem Kulturmedium entfernt. Die Dauer der Wachstumszeit der Zellen ist für das Verfahren ohne Bedeutung und hängt insbesondere von der gewünschten Menge der Zellen ab.

Als herkömmliches Kulturmedium kann das Heller-Medium verwendet werden. Das Medium kann gegebenenfalls auch Vitamine und/oder Hormone enthalten.

Unter undifferenzierten Zellen von Mohn werden Zellkulturen verstanden, die von Teilen einer ganzen Pflanze stammen und die dekontaminiert und auf feste Kulturmedien gegeben wurden, die so ausgewählt sind, daß sich die Zellen vermehren, ohne organisierte Gewebeformen zu bilden. Die Zellen werden dann in flüssige Medien überführt, wo ihr Wachstum durch einfache Zellvermehrung erfolgt. Diese Kulturen sind mit Bakterienkulturen vergleichbar.

In einem zweiten Schritt werden die erhaltenen Zellen bei einer Konzentration des frischen Zellmaterials im Bereich von 10 bis 100 g/l in einem herkömmlichen Kulturmedium subkultiviert. Als Medium für die Subkultivierung wird ein frisches Kulturmedium verwendet. Für die Subkultivierung kann ebenfalls ein Heller-Medium verwendet werden, das gegebenenfalls Vitamine und/oder Hormone enthält. Die Zellen verbleiben in diesem Me dium während einer Zeitdauer, die höchstens der Latenzzeit entspricht.

Die Latenzzeit ist die Zeitspanne, die erforderlich ist, damit sich eine frisch passagierte Zelle dem Medium anpaßt; während dieser Zeitspanne bleibt die Zellkonzentration konstant, bevor sie dann ansteigt. Durch regelmäßige Entnahmen kann festgestellt werden, ob die Zellkonzentration im wesentlichen mit der Anfangskonzentration identisch ist - die Zellen sind in der Latenzzeit; nach dem Ende der Latenzzeit steigt die Konzentration signifikant an; die Zellen sind nun in der Wachstumsphase. In Abhängigkeit von dem verwendeten Stamm kann die Latenzzeit im Bereich von 6 Stunden bis 7 Tagen liegen.

Die Zellen werden bevorzugt bei einer Konzentration des frischen Zellmaterials im Bereich von 20 bis 50 g/l subkultiviert.

In einem dritten Schritt werden die Zellen in der Latenzzeit oder am Ende der Latenzzeit vorzugsweise zerkleinert, um eine zerkleinerte Zellmasse herzustellen.

Das Zerkleinern der Zellen kann in dem Kulturmedium durchgeführt werden, vorzugsweise werden die Zellen jedoch zuvor abgetrennt, beispielsweise durch Filtrieren. Es können herkömmliche Vorrichtungen verwendet werden, um die zerkleinerte Zellmasse herzustellen, beispielsweise eine Vorrichtung zum Zerkleinern Potter oder Ultra Turrax. Das Zerkleinern erfolgt vorzugsweise bei einer niedrigen Temperatur, insbesondere bei einer Temperatur im Bereich von 10 bis 15ºC.

Zur Durchführung der Biokonversion wird die zerkleinerte Zellmasse in einem vierten Schritt mit dem als Substrat dienenden Melaninprecursor, der unter Indol, Indolin, Dihydroxyphenylalanin (DOPA), Tyramin und Tyrosin ausgewählt ist, in Kontakt gebracht. Dies erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 10 bis 70ºC.

Das Medium für die Biokonversion kann aus der zerkleinerten Zellmasse bestehen. Die zerkleinerte Zellmasse kann auch in entmineralisiertes Wasser oder in eine Pufferlösung gegeben werden. In diesem Fall liegt der pH-Wert vorzugsweise im Bereich von 3 bis 9.

Die Reaktion läuft ab, indem das Substrat mit der zerkleinerten Zellmasse in Kontakt gebracht wird, wobei die Zellmasse vorzugsweise in einer Pufferlösung mit dem Substrat in Kontakt gebracht wird; die Konzentration des Substrats kann in Abhängigkeit von seiner Löslichkeit in dem wäßrigen Medium in weiten Bereichen variieren.

Die Reaktion wird vorzugsweise unter Rühren ablaufen gelassen. Die Konzentration des Substrats liegt im allgemeinen im Bereich von 10 mg bis 2 g pro Liter Pufferlösung, die 20 bis 200 g frisches Zellmaterial enthält. Die Konzentration des Substrats kann erhöht werden, indem es in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie beispielsweise Ethanol, gelöst wird. Bei dem Schritt der Biokonversion ist die Reaktionszeit variabel; sie hängt insbesondere von dem Substrat, der Temperatur der Reaktion und dem pH-Wert des Mediums ab.

Ein schwarzer Niederschlag erscheint im allgemeinen nach 30 Minuten bis 24 Stunden. Das ausgefallenen Pigment kann durch Dekantieren, Filtrieren oder Zentrifugieren oder beliebige weitere geeignete Maßnahmen zum Abtrennen gewonnen werden. Man kann das Filtrat gewinnen und den Arbeitsgang von neuem beginnen, indem das Substrat unter den oben beschriebenen Bedingungen zu dem Filtrat gegeben wird. Vorzugsweise wird mit einem Sieb filtriert, dessen Maschenweite unter 5 um liegt, um die Pigmente von Proteinrückständen zu befreien.

Die Analyse des Pigments mit EPR (Paramagnetische Elektronenspin-Resonanz-Spektroskopie), die mit einem Spektrometer ER 200 D BRUCKER bei 9,52 GHz, einer Frequenz der Feldmodulation von 100 kHz und einer Mikrowellenleistung von 1,9 mw durchgeführt wurde, zeigt ein Absorptionsmaximum in der Nähe von 3470 Gauss, das für Melanine charakteristisch ist.

Das erhaltene Melaninpigment kann anschließend mit Ethanol und dann mit Wasser gewaschen werden, um den Melaninprecursor zu entfernen.

Die erhaltenen, gegebenenfalls gewaschenen und getrockneten Pigmente sind auf dem Gebiet der Kosmetik zur Herstellung von Produkten zum Schminken, Sonnenschutzmitteln oder auch Zusammensetzungen zum Färben der Haare einsetzbar.

Für diese Anwendungen können sie auch in ein kosmetisch akzeptables Medium auf der Basis von Wasser und/oder einem Gemisch von Wasser und einem organischen Lösemittel oder einem oder mehreren Lösemitteln eingebracht werden, das gegebenenfalls ferner in der Kosmetik übliche Zusatzstoffe enthält, beispielsweise grenzflächenaktive Stoffe, Verdickungsmittel und Konservierungsmittel.

Nach einer Ausführungsform der Erfindung kann das Melaninpigment auf einem anorganischen Füllstoff abgeschieden werden, der aus inerten Partikeln besteht, wobei die Partikel eine für derartige Träger übliche Korngröße aufweisen, beispielsweise eine Korngröße unter 20 um und vorzugsweise 10 um.

Das Pigment kann in bekannter Weise auf anorganischen Partikeln in lamellarer oder nicht lamellarer Form und lamellaren oder nicht lamellaren organischen Partikeln, die farbig oder nicht farbig sind, abgeschieden und/oder adsorbiert werden. Diese Partikel weisen eine mittlere Korngröße von 0,01 bis 200 um auf.

Man erhält so farbige Pulver, die in der Kosmetik verwendet werden können.

Das farbige Pulver kann hergestellt werden, indem die anorganischen oder organischen Partikel in der Lösung des Melaninprecursors und der zerkleinerten Zellmasse, in der die Biokonversion stattfindet, dispergiert werden. Das Pulver, das das Pigment enthält, wird nach der Reaktionszeit, die für die Bildung der Melaninpigmente erforderlich ist, beispielsweise durch Filtrieren abgetrennt, worauf es mit Wasser gewaschen und getrocknet wird.

Die Pulver können auch durch Adsorption des erfindungsgemäß hergestellten Melaninpigments auf und/oder in den oben definierten anorganischen oder organischen Partikeln hergestellt werden.

Gemäß dieser Ausführungsform kann das zuvor gebildete Melaninpigment in einem Medium dispergiert werden, das die Partikel enthält und in dem die Partikel unlöslich sind; nach Adsorption des Pigments werden die pigmenthaltigen Partikel getrocknet.

Von den anorganischen Füllstoffen können die Partikel von Calciumcarbonat, Siliciumoxid oder Titanoxid verwendet werden, die die oben definierte Korngröße aufweisen.

Von den organischen Füllstoffen werden vorzugsweise Partikel von Polymeren, die von Keratin abgeleitet sind und die gegebenenfalls modifiziert sind, Partikel von Polymeren, die von Chitin abgeleitet sind und die gegebenenfalls deacetyliert sind, Partikel von Seidenfibroin, Partikel von synthetischen Polymeren, die unter vernetztem Polymethylmethacrylat und vernetztem Poly-β-alanin ausgewählt sind, Mikrohohlkugeln von Vinylidenchlorid-Acrylnitril-Copolymeren oder auch poröse Mikrokugeln von Polyamid-12, Polyamid-6 oder Copolyamid-6/12 sowie Siliconpulver verwendet, die aus Gummis, Harzen und Elastomeren von Organopolysiloxan bestehen.

Diese Partikel weisen vorzugsweise eine Korngröße über 0,1 um auf.

Bei den lamellaren Partikeln handelt es sich um anorganische oder organische Partikel, die in Form von Blättchen vorliegen, die gegebenenfalls geschichtet sind. Diese Blättchen sind dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Dicke aufweisen, die geringer als die größte Abmessung ist. Das Verhältnis zwischen der größten Abmessung und der Dicke liegt vorzugsweise im Bereich von 2 bis 100. Die größte Abmessung liegt im allgemeinen unter 100 um.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, ohne sie einzuschränken.

Beispiele für die Herstellung eines Melaninpigments aus Indol

Es werden verschiedene Stämme verwendet, die von undifferenzierten Mohnkulturen stammen, wobei die Stämme ausgehend von Kallus auf Agar-Agar in ein flüssiges Medium überführt wurden; es wurden die folgenden Schritte durchgeführt:


Anspruch[de]

1. Schritt

Die undifferenzierten Mohnzellen werden in vitro bei 26ºC in den nachfolgend definierten Medien kultiviert:

Medium 1:

Medium 2:

Medium 3:

Unter Morel-Vitaminen wird ein Gemisch verstanden, das pro 100 ml enthält:

Von acht getesteten Stämmen wurden vier Stämme in Medium 1, drei Stämme in Medium 2 und 1 Stamm in Medium 3 kultiviert. Nach einer Wachstumszeit, bei der die Zellkonzentration 400 g/l Medium erreichen kann, werden die Zellen durch Filtrieren (50 um) gewonnen.

2. Schritt

Die im ersten Schritt erhaltenen Zellen werden in einer Menge von 50 g/l in einem identischen Kulturmedium bei 4ºC subkultiviert. Nach einer Latenzzeit, die im Bereich von 1 bis 2 Tagen liegt, werden die Zellen filtriert.

3. Schritt

Die Zellen werden bei 4ºC in einer Potter-Vorrichtung zerkleinert. Die zerkleinerte Zellmasse wird mit einem Puffermedium, das einen pH-Wert von 6, 5 bis 7 aufweist, aufgenommen, wobei der Mengenanteil etwa 1 g Zellen pro 100 ml Pufferlösung entspricht.

4. Schritt

Es werden bei Umgebungstemperatur 50 mg Indol pro Liter der im dritten Schritt hergestellten Lösung unter Rühren zugegeben. Während der ersten 15 Minuten tritt eine rosa Färbung auf, die malvenfarben und schließlich nach 2 Stunden schwarz wird. Die Suspension wird an einem Sieb filtriert, dessen Maschenweite unter 5 um liegt. Dann wird der Niederschlag mit Wasser gewaschen und anschließend getrocknet.

Aus den acht getesteten Stämmen wurden nach der Kultur in den drei beschriebenen Medien Pigmente erhalten, wohingegen die drei Kulturmedien mit dem gleichen Precursor vor oder nach der Kultur der Zellen keine Reaktion zeigen.

EPR-Analse der erhaltenen Pigmente:

Das EPR-Spektrum zeigt ein Absorptionsmaximum bei 3470 Gauss.

Anwendungsbeispiele

Beispiel A: Mascara Creme

Beispiel B: Haargel







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