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Verfahren zur Sichtbarmachung von Substanzflecken auf Schichtchromatogrammen - Dokument DE3905954C2
 
PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE3905954C2 01.02.2001
Titel Verfahren zur Sichtbarmachung von Substanzflecken auf Schichtchromatogrammen
Anmelder LTS Lohmann Therapie-Systeme AG, 56626 Andernach, DE
Erfinder Müller, Walter, Dipl.-Chem., Dr., 5450 Neuwied, DE
Vertreter Flaccus, R., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat., Pat.-Anw., 50389 Wesseling
DE-Anmeldedatum 25.02.1989
DE-Aktenzeichen 3905954
Offenlegungstag 30.08.1990
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 01.02.2001
Veröffentlichungstag im Patentblatt 01.02.2001
IPC-Hauptklasse G01N 30/90
IPC-Nebenklasse B32B 7/02   B32B 27/06   B01D 15/08   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sichtbarmachung von Substanzflecken auf Schichtchromatogrammen.

Die Schichtchromatographie ist eine weitverbreitete Methode zur analytischen und präparativen Auftrennung von komplexen Stoffgemischen.

Unter Schichtchromatographie im Sinne dieser Erfindung werden dabei alle chromatographische Methoden verstanden, bei denen die stationäre Phase eine im wesentlichen zweidimensionale Geometrie aufweist.

Bei der Schichtchromatographie handelt es sich um ein physikalisch-chemisches Trennverfahren, bei dem sich eine meist aus einem feinkörnigen Material bestehende Trennschicht (stationäre Phase) auf einem flächenförmigen Träger befindet. Dieser Träger ist üblicherweise eine Glasplatte oder eine aus Aluminium oder Polyamid bestehende Folie.

Das zu trennende Stoffgemisch wird in gelöster Form punkt- oder streifenförmig an dem einen Ende der Platte, der sogenannten Startseite aufgetragen und die Platte anschließend üblicherweise in einer speziellen dichtschließenden Kammer mit der Startseite in ein geeignetes Fließmittel (mobile Phase) gestellt. Dieses Fließmittel breitet sich durch Kapillarkräfte ausgehend von der Startseite in Richtung der anderen Plattenseite aus. Die aufgetragenen Stoffkomponenten werden dabei für eine für jeden Stoff unter den jeweiligen Bedingungen charakteristische Strecke mitgenommen. Je geringer die Affinität des Stoffes zu der stationären Phase ist, umso größer ist die Strecke auf der Platte, die er von der mobilen Phase mitgenommen wird.

Nach diesem sogenannten Entwicklungsvorgang wird die Platte getrocknet und die Flecke der einzelnen Stoffkomponenten markiert. Dies ist einfach, wenn die Stoff komponenten eine Eigenfarbe besitzen. Da dies jedoch nur sehr selten der Fall ist, muß man durch spezielle Methoden dafür sorgen, daß die Substanzflecke in eine irgendwie gefärbte oder fluoreszierende Form überführt werden oder sich durch eine andere Art und Weise von der sonstigen Oberfläche der stationären Phase abheben.

Weitverbreitet ist die Methode der stationären Phase einen sogenannten Fluoreszenzindikator zuzusetzen. Diese Fluoreszenz wird unter Bestrahlung mit UV-Licht geeigneter Wellenlänge sichtbar. Wenn die Substanz die Eigenschaft hat, diese Fluoreszenz zu löschen, sind die Substanzflecke als dunkle Flächen vor hellem Hintergrund zu sehen.

Da jedoch bei weitem nicht alle Substanzen die Fluoreszenz des Indikators zu löschen vermögen, spielt die Überführung von Substanzflecken in gefärbte oder fluoreszierende Verbindungen eine mindestens ebenso große Rolle. Dazu wird die Chromatographieplatte nach erfolgter Entwicklung mit dem Reagenz besprüht oder in eine Lösung des Reagenzes getaucht.

Vor allem die Sprühmethode ist problematisch, da oftmals mit giftigen oder ätzenden Substanzen gearbeitet werden muß und eine Kontamination des Operateurs bzw. der Laboreinrichtung nicht ganz vermieden werden kann. Ein weiterer Nachteil ist, daß es nur schwer möglich ist, die ganze Platte gleichmäßig mit dem Reagenz zu besprühen und so die quantitative Auswertung der Chromatogramme beeinträchtigt wird. Die Tauchmethode hat den Nachteil, daß mit relativ großen Mengen an Reagenzlösung gearbeitet werden muß und nach mehrmaligem Gebrauch die Gefahr besteht, daß die Lösung an Reagenz verarmt.

Erwähnt sei auch die US 44 21 719, die Farbindikatoren zur Feststellung toxischer Substanzen zum Gegenstand hat. Die blattförmigen Farbindikatoren bestehen aus einer den Indikator tragenden Schicht aus porösem Material mit hoher Oberfläche, welche auf eine Trägerfolie aufgebracht ist, und werden unter anderem zur Bestimmung der Gebrauchsdauer von toxische Stoffe zurückhaltenden Atemschutzgeräten oder als Dünnschichtchromatogrammplatten für die Chromatographie toxischer Substanzen verwendet. Eine Verwendung dieser blattförmigen Farbindikatoren zum Auflegen auf entwickelte Dünnschichtchromatogramme zur Sichtbarmachung von Substanzflecken auf Schichtchromatogrammen wird jedoch nicht angegeben.

Aufgabe dieser Erfindung ist es, Eine Möglichkeit zu schaffen, Substanzflecke auf entwickelten Chromatographieplatten sichtbar zu machen, die nicht mit den Nachteilen oben geschilderter Methode behaftet ist, die also ohne das Versprühen von giftigen oder ätzenden Substanzen mit einer vergleichsweise geringen Menge an Reagenz auskommt und die es gleichwohl ermöglicht, die gesamte Fläche der stationären Phase gleichmäßig mit Reagenz in Berührung zu bringen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß überraschenderweise durch ein Verfahren gelöst, nach dem eine einschichtige Folie, die ein oder mehrere Reagenzien zur Sichtbarmachung der Substanzflecke enthält, oder ein Laminat aus einer reagenzfreien Trägerfolie, auf die mindestens eine das Reagenz oder die Reagenzien enthaltende Folienschicht aufgebracht ist, mit der Reagenzschicht auf das Schichtchromatogramm gelegt und gegebenenfalls unter Anwendung von Druck und/oder Wärme der Verbund zwischen der Folie bzw. dem Laminat hergestellt wird. Per Diffusion kann nun das Reagenz aus der Folie in die stationäre Phase wandern und dort die charakteristische Farbreaktion bewirken. Möglich ist auch der umgekehrte Fall, daß nämlich die sichtbar zumachenden Substanzen per Diffusion in die Vorrichtung gelangen und die Farbreaktion dort stattfindet. Sicherlich wird man auch Fälle finden, in denen beide Reaktionen parallel ablaufen.

Zur Fixierung der Reagenzschicht an der Oberfläche der stationären Phase der Chromatographieplatte besteht die Reagenzschicht entweder aus einem Haftkleber oder einem Heißschmelzkleber, oder sie ist plastisch bzw. thermoplastisch.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Folie mehrschichtig und stellt ein Laminat aus einer Trägerfolie und mindestens einer weiteren Folienschicht dar. In diesem Fall ist die Trägerfolie reagenzfrei; die Reagenzien sind in der oder den weiteren mit der Trägerfolie verbundenen Schichten enthalten.

Die Folie ist flexibel und bevorzugt auch dehnbar und natürlich müssen zumindest die nach Anwendung auf der Chromatographieplatte verbleibenden Teile der Vorrichtung transparent sein.

Als Materialien für die reagenzhaltigen Folien bzw. Folienschichten kommen alle mit den Reagenzien verträgliche folienbildende Polymere, Haftkleberformulierungen, Heißschmelzmassen, Thermoplaste und Elastomere in Betracht.

Beispielhaft seien genannt Formulierungen auf der Basis von Kautschuk, Polyisobutylen, Polyethylen, Polypropylen, Polyacrylsäurederivaten, Polyurethanen, Polyvinylacetaten und deren teilverseiften Derivaten, Polyvinylalkoholen, Polysiloxanen, Polyamiden, Blockpolymeren aus Styrol und einer anderen aliphatischen Olefinkomponente und Copolymeren des Ethylens, Vinylacetats und Acrylsäurederivaten.

Zum Schutz der reagenzhaltigen Schicht kann diese, insbesonders zur problemlosen Lagerung der Folie mit einer Schutzfolie abgedeckt werden, die natürlich vor Benutzung entfernt werden muß. Für den Fall, daß die Folie nach ihrer Herstellung in Form einer Rolle aufgewickelt und gelagert wird, kann die nichtklebende Oberseite der Trägerfolie selbst die Funktion einer Schutzfolie übernehmen.

Ist die Folienschicht, die bei Gebrauch unmittelbar Kontakt mit der Oberfläche des Schichtchromatogramms hat, selbstklebend, muß diese Schutzfolie natürlich ablösbar gemacht werden, wie z. B. durch eine Silikonbehandlung. Andere ablösbare Schutzschichten sind z. B. aus Polytetrafluorethylen, behandeltem Papier, Cellophan u. ä.

Die Trägerfolie und die Schutzfolie können aus flexiblem oder nicht flexiblem Material bestehen und ein- oder mehrschichtig aufgebaut sein. Substanzen, die zu ihrer Herstellung verwendet werden können, sind polymere Substanzen, wie z. B., Polyethylen, Polypropylen, Polyvinylchlorid, Polyester, Polyacrylsäurederivate und Polyamid. Als weitere Materialien können auch Metallfolien, wie z. B. Aluminiumfolie, allein oder mit einem polymeren Substrat beschichtet, angewendet werden.

Das oder die Reagenzien können in einer einzigen Schicht enthalten sein, möglich ist jedoch auch, daß der reagenzhaltige Teil der Folie auch mehrschichtig aufgebaut ist und in den einzelnen Schichten verschiedenartige Reagenzien enthalten sind. Dies ist dann zweckmäßig, wenn Kompatibilitätsprobleme zwischen den einzelnen Reagenzien bestehen oder sie nacheinander zur Wirkung kommen müssen. Sollte das letztere notwendig sein, so können auch zwei Folien nacheinander verwendet werden. Dazu muß natürlich, falls vorhanden, die Trägerfolie des zuerst aufgebrachten Laminates entfernt werden, falls dieses nicht transparent und für die Reagenzien der zweiten Folie oder des zweiten Laminates durchlässig ist. Nur in diesem Fall ist es auch sinnvoll die Trägerfolie des zuerst aufgebrachten Laminates zu entfernen, wenn die dann freiliegende Folienschicht selbstklebend ist.

Die Reagenzien selbst können in verschiedener Form in die Folien eingearbeitet sein. So können sie z. B. molekulardispers gelöst, kristallin oder mikroverkapselt vorliegen. Bei mehreren Reagenzien nebeneinander können diese auch in unterschiedlicher Form eingearbeitet sein.

Die einschichtige Folie oder das Laminat wird mit der Oberfläche der stationären Phase des Schichtchromatogramms ggf. unter Anwendung von Druck und Wärme in Kontakt gebracht wird.

Druck und Wärme begünstigen - auch wenn die Folie oder das Laminat selbstklebend ausgerüstet ist - den engen Kontakt zur stationären Phase und die Wärme führt in den meisten Fällen zu einer beschleunigten Farbreaktion.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Fig. 1 bis 3 sowie der Beispiele erläutert:

Fig. 1 stellt die einfachste Ausführungsform der Erfindung eine einschichtige, reagenzhaltige Folie dar

Fig. 2 stellt eine bevorzugte mehrschichtige Folie dar

Fig. 3 zeigt eine bevorzugte zweischichtige, aus Träger und klebender reagenzhaltiger Schicht aufgebaute Folie gemäß der Erfindung.

In Fig. 1 enthält die thermoplastische Folie (11) die zur Sichtbarmachung der Substanzflecke notwendigen Reagenzien (12) in gleichförmiger Verteilung. Die Folie wird bei Gebrauch auf die entwickelte und getrocknete Chromatographieplatte, z. B. eine Dünnschichtplatte, gelegt und der Verbund Dünnschichtplatte/Folie erhitzt. Die Dünnschichtplatte selbst besteht aus der Trägerplatte oder Trägerfolie für die stationäre Phase (14) und der stationären Phase (15) selbst. Durch Schmelzen bzw. Erweichen verbindet sich die Folie mit der stationären Phase (15) und die in ihr enthaltenen Reagenzien gelangen per Diffusion zu den Substanzflecken der stationären Phase. Wie schon zuvor erwähnt, können jedoch auch die sichtbar zu machenden Substanzen in die Folie diffundieren und so auch die Farbe in der Folie gebildet werden.

Die in Fig. 2 gezeigte bevorzugte Ausführungsform besteht aus einer Trägerfolie (21), der eigentlichen Reagenzfolie (22), die bevorzugt entweder plastisch, thermoplastisch oder schmelzbar ist und einer zusätzlichen Schutzfolie (23), die vor Gebrauch entfernt wird.

Wurde eine silikonisierte Trägerfolie verwendet, so wird sie nach Gebrauch entfernt und braucht deshalb nicht notwendigerweise transparent zu sein.

In einer besonders bevorzugten Ausführung ist die reagenzhaltige und mit der stationären Phase der Chromatographieplatte in Kontakt kommende Schicht eine Heißschmelzmasse, da dann der Kontakt zur stationären Phase und den sich in ihr befindlichen sichtbarzumachenden Substanzen besonders intensiv ist. Die stationäre Phase wird dann gewissermaßen von der Reagenzschicht durchdrungen.

In Fig. 3 übernimmt die Oberseite der Trägerfolie selbst die Funktion einer Schutzfolie.

Beispiel 1

Nichtselbstklebendes Laminat zur Sichtbarmachung von Aminosäuren und Aminozucker

107 g Ethylen/Vinylacetat-Copolymer (20% in Dichlormethan) (Evatane 33.400, Fa. ATOCHEM)

17,2 g Paraffin (Fp. 51-53°C) (25% in Hexan)

1 g Ninhydrin oder Isatin (gelöst in möglichst wenig Methylethylketon)

werden zusammengegeben, homogenisiert und als 100 µm dicker Film auf eine silikonisierte 100 µ Polyesterfolie aufgetragen und 15 Minuten bei 50°C getrocknet. Zur Aufbewahrung wird die Reagenzschicht mit einer weiteren Polyesterfolie als Schutzfolie abgedeckt, die möglichst stärker silikonisiert ist als die Trägerfolie.

Die Vorrichtung wird wie in Beispiel 1 beschrieben angewendet, nachdem die DC-Platte entwickelt und getrocknet ist.

Die Farben der Substanzflecke werden bei ca. 80°C nach 10-20 Sekunden sichtbar.

Beispiel 2

Selbstklebendes Laminat zur Sichtbarmachung von Aminosäuren und Aminozucker

33 g Polyisobutylen (Viskosität 10^ 9 Pa.s, 20°C) (z. B. Oppanol B100, Fa. BASF) 20% in Benzin

66 g Polyisobutylen (Viskosität 25 Pa.s, 20°C) (z. B. Oppanol B3, Fa. BASF) 20% in Benzin

0,25 g Ninhydrin in 10 ml Dichlormethan

werden zusammengegeben, homogenisiert, als 100 µ dicker Film auf eine 100 µ dicke silikonisierte Polyesterfolie ausgestrichen und 15 Minuten bei 50°C getrocknet.

Danach wird eine 10 µ dicke transparente Polyesterfolie aufkaschiert. Zum Gebrauch wird von einem passenden Stück die 100 µ silikonisierte Polyesterfolie abgezogen und die Reagenzschicht auf die entwickelte und getrocknete DC-Platte aufgeklebt. Nach kurzem Erwärmen werden die Substanzflecke in ihren charakteristischen Farben sichtbar.

Beispiel 3

Laminat zum Nachweis von basischen Substanzen

107 g Ethylen/Vinylacetat-Copolymer (Evatane 33.400, Fa. ATOCHEM)

43 g Paraffin (Fp.: 51-53°C)

0,2 g Methylrot

werden zusammengeschmolzen und mit dieser Masse eine silikonisierte 100 µm dicke Polyesterfolie 100 µ dick beschichtet. Zum Gebrauch werden passende Stücke auf die zu konservierende DC-Platte gelegt und bei ca. 100°C (auf Heizplatte oder Trockenschrank) aufgepresst. Nach dem Schmelzen (ca. 1 min auf einer Heizplatte) wird abgekühlt und die silikonisierte Polyesterfolie entfernt. Die Substanzflecke haben eine gelbe Farbe auf tiefrotem Hintergrund.

Beispiel 4

Laminat zur Sichtbarmachung von Schwermetallkationen

100 g Polyacrylatkleber (40%) z. B. DUROTAK 280-2516 Fa. National Starch

1,5 g Triethanolamin

1 g Thioacetamid

werden zusammengegeben, homogenisiert, als 100 µ dicker Film auf eine silikonisierte 100 µ Polyesterfolie aufgetragen und 15 min bei 50°C getrocknet. Danach wird der Film mit einer 10 µ dicken, nicht- silikonisierten und transparenten Polyesterfolie abgedeckt. Das weitere Vorgehen entspricht Beipiel 3.

Beispiel 5

Laminat zum Sichtbarmachen von zweiwertigen Kationen

100 g Polyacrylatkleber (40%) z. B. Durotak 280-2516, Fa. National Starch Polyacrylatpolymer mit basischen Gruppen, z. B. 20 g Eudragit E 100, (Fa. Röhm Pharma), 40% in Essigester

0,1 g Alizarin S

werden zusammengegeben, homogenisiert, als 100 µ dicker Film auf eine silikonisierte 100 µ Polyesterfolie aufgetragen und 15 min bei 50°C getrocknet. Danach wird der Film mit einer 10 µ dicken nicht- silikonisierten und transparenten Polyesterfolie abgedeckt. Das weitere Vorgehen entspricht Beispiel 3.


Anspruch[de]
  1. 1. Verfahren zur Sichtbarmachung von Substanzflecken auf Schichtchromatogrammen, dadurch gekennzeichnet, daß eine einschichtige Folie, die ein oder mehrere Reagenzien zur Sichtbarmachung der Substanzflecken enthält, oder ein Laminat aus einer reagenzfreien Trägerfolie, auf die mindestens eine das Reagenz oder die Reagenzien enthaltende Folienschicht aufgebracht ist, mit der Reagenzschicht auf das Schichtchromatogramm gelegt und gegebenenfalls unter Anwendung von Druck und/oder Wärme der Verbund zwischen der Folie bzw. dem Laminat und dem Schichtchromatogramm hergestellt wird.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die das Reagenz enthaltende Folienschicht selbstklebend ist.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die das Reagenz enthaltende Folienschicht eine Heißschmelzmasse enthält oder daraus besteht.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die das Reagenz enthaltende Folienschicht thermoplastisch ist.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerfolie aus einem Polymermaterial wie z. B. Polyethylen, Polypropylen, Polyamid, Polyvinylchlorid, Polyvinylacetat, Polyurethan, Polyvinylalkohol, Polyester, Polysiloxan, Polyacrylat, Polyisobutylen, Polystyrol oder Block- bzw. Copolymere aus den bisher genannten Polymeren zugrunde liegenden Monomeren oder aus Metall, vorzugsweise Aluminium, welches gegebenenfalls mit einem Polymer beschichtet ist, besteht.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Reagenz in mikroverkapselter Form Vorliegt.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß unterschiedliche Reagenzien in unterschiedlichen Schichten enthalten sind.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mit dem Schichtchromatogramm in Berührung kommende Seite der das Reagenz enthaltenden Folienschicht mit einer mindestens einschichtigen wieder entfernbaren Schutzfolie versehen ist.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerfolie entfernbar ist.






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