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Dokumentenidentifikation DE10019864A1 15.02.2001
Titel Nukleinsäure-Sequenzen aus Candida Hefen, die Cytochrom b5-Polypeptide kodieren
Anmelder Max-Delbrück-Centrum für molekulare Medizin, 13125 Berlin, DE
Erfinder Schunck, Wolf-Hagen, Dr., 13125 Berlin, DE;
Chernogolov, Alexei, Dr., Minsk, BY
Vertreter Baumbach, F., Dr.rer.nat. Pat.-Ing., Pat.-Ass., 13125 Berlin
DE-Anmeldedatum 18.04.2000
DE-Aktenzeichen 10019864
Offenlegungstag 15.02.2001
Veröffentlichungstag im Patentblatt 15.02.2001
IPC-Hauptklasse C07K 14/39
IPC-Nebenklasse C07K 16/00   C07H 21/04   C12N 15/81   C12N 15/31   C12N 15/11   C12N 1/19   C12N 5/00   C12P 7/40   C12P 7/44   
Zusammenfassung Die Erfindung betrifft Nukleinsäure-Sequenzen aus Candida Hefen vorzugsweise aus Candida maltosa, die Cytochrom b5-Polypeptide kodieren sowie die entsprechenden Cytochrom b5-Polypeptide und ihre Verwendung zur Erhöhung der Aktivität von Cytochrom P450 Systemen, insbesondere zur Stimulierung der Aktivität Alkan- und Fettsäure-hydroxylierender Cytochrom P450 Systeme bei der Produktion langkettiger Dicarbonsäuren (L C10).

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft Nukleinsäure-Sequenzen aus Candida Hefen vorzugsweise aus Candida maltosa, die Cytochrom b5-Polypeptide kodieren sowie die entsprechenden Cytochrom b5-Polypeptide und ihre Verwendung zur Erhöhung der Aktivität von Cytochrom P450 Systemen, insbesondere zur Stimulierung der Aktivität Alkan- und Fettsäurehydroxylierender Cytochrom P450 Systeme bei der Produktion langkettiger Dicarbonsäuren (≥ C10)

Cytochrome b5 sind Hämoproteine, die an verschiedenen Elektronentransfer-Prozessen in eukaryontischen Zellen beteiligt sind [Übersichten bei: Oshino, N., Pharmac. Ther. A. 2, (1978) 477-515 und Vergeres and Waskell Biochemie 77 (1995) 604-620]. Die Übertragung von Elektronen auf Cytochrom b5 erfolgt durch NADH- bzw. auch NADPH-abhängige Reduktasen. Das reduzierte Cytochrom b5 kann dann das aufgenommene Elektron auf verschiedene andere Proteine übertragen. Zu diesen Elektronenakzeptoren gehören Cytochrome P450, Fettsäure-Desaturasen, Methämoglobin und Methionin-Synthase.

Nach ihrer intrazellulären Lokalisierung können drei verschiedene Cytochrom b5 Formen unterschieden werden:

  • a) eine membrangebundene Form, die im Endoplasmatischen Retikulum lokalisiert ist (mikrosomale Form) und dort mit Fettsäure-Desaturasen und Cytochromen P450 wechselwirkt
  • b) eine weitere membrangebundene Form, die aber spezifisch in der äußeren Mitochondrienmembran lokalisiert ist und
  • c) eine lösliche Form des Cytochrom b5, wie sie in Erythrocyten (Reduktion von Methämoglobin) und nach neueren Untersuchungen auch in Leberzellen (reduktive Aktivierung der Methionin-Synthase [Chen and Banerjee, J. Biol. Chem. 273 (1998) 26248-26255] vorkommt.

Die membranständigen Formen des Cytochrom b5 bestehen aus einer cytoplasmatischen Domäne (Länge ca. 90 bis 100 Aminosäurereste), einem membranspannenden Segment (ca. 20 überwiegend hydrophobe Aminosäurereste) und einem C-terminalen Teil (ca. 10 hydrophile Aminosäurereste), der nach neueren Untersuchungen luminal orientiert ist [Vergeres et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 3414-3422]. Die cytoplasmatische Domäne enthält die prosthetische Hämgruppe und ist direkt an der Elektronentransfer-Funktion des Cytochrom b5 beteiligt. Die dreidimensionale Struktur der cytoplasmatischen Domäne des mikrosomalen Cytochrom b5 vom Rind ist bekannt [Argos and Mathews J. Biol. Chem. 250 (1975) 747-751]. Danach fungieren zwei Histidinreste als axiale Liganden des Hämeisens. Cytochrome b5 gehören zur Klasse der "tail-anchored" Proteine. Das membranspannende Segment und der sich C-terminal anschließende luminale Teil enthalten alle Determinanten für seine intrazelluläre Lokalisierung. Unterschiede im Vorliegen einzelner geladener Aminosäuren im luminalen Teil bestimmen darüber, ob die jeweilige Cytochrom b5 Form im Endoplasmatischen Retikulum oder in der äußeren Mitochondrienmembran lokalisiert wird [Kuroda et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 31097-31102]. Bei den Cytochrom b5 Proteinen des Endoplasmatischen Retikulums ist darüberhinaus bekannt, daß die Länge des membranspannenden Segments entscheidend für ihre permanente Lokalisierung (Retention) in diesem Zellkompartiment ist [Pedrazzini et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 4207-4212]. Bei der löslichen Form in Erythrozyten handelt es sich um ein C-terminal verkürztes Cytochrom b5, welches dementsprechend über keinen Membrananker verfügt [VanDerMark and Steggles, Biochem. Biophys. Res. Commun. 240 (1997) 80-83].

Die ersten vollständigen Aminosäuresequenzen mikrosomaler Cytochrom b5 Proteine wurden vor etwa 10 Jahren aufgeklärt (vom Menschen und vom Huhn, [Ozols, J. Biochim. Biophys. Acta 997 (1989) 121-130]. Inzwischen sind die cDNAs bzw. Gene für Cytochrome b5 aus mindestens 20 unterschiedlichen Organismen kloniert worden. Die entsprechenden DNA- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen sind in verschiedenen Datenbanken über Internet zugänglich. Eine spezielle Zusammenstellung als Zugang zu den publizierten Cytochrom b5 Sequenzen und den entsprechenden Literaturstellen findet sich unter: http://www.icgeb.trieste.it/p450/cytb5.html. Die Sequenz eines menschlichen Cytochrom b5 ist in WO-A-98/36071 beschrieben. Die Sequenz eines Cytochrom b5 aus alkanverwertenden Hefen war bisher unbekannt.

Cytochrome b5 spielen eine komplexe Rolle bei der Regulation der enzymatischen Aktivität von mikrosomalen Cytochrom P450 Systemen [Perret and Pompon, Biochemistry 37 (1998) 11412-11424 und darin zitierte Literatur]. Je nach untersuchter Cytochrom P450 Form, dem gewählten Substrat und den Reaktionsbedingungen, kann Cytochrom b5 eine Hemmung bzw. beträchtliche Stimulierung der P450-katalysierten Substratumsetzungen bewirken. Die stimulierende Wirkung beruht im allgemeinen auf einer Verbesserung der Kopplung von Elektronentransfer und Substrathydroxylierung im Reaktionszyklus der Cytochrom P450 Systeme. Dabei kann Cytochrom b5 sowohl als Redox-Partner fungieren (Übertragung des zweiten Elektrons im Reaktionszyklus) als auch Konformationsveränderungen am Cytochrom P450 bewirken, die zu einer Erhöhung der Substrataffinität führen. Die Bindungsstellen von Cytochrom b5 und NADPH-P450 Reduktase am Cytochrom P450 sind wahrscheinlich nicht identisch aber möglicherweise partiell überlappend [Bridges et al. J. Biol. Chem. 273 (1998) 17036-17049]. Einige Autoren beschreiben, daß bereits Apo-Cytochrom b5 die Aktivität von einzelnen Cytochrom P450 Systemen stimulieren kann [Yamazaki et al. J. Biol. Chem. 271 (1996) 27438-27444]. Die tatsächlichen Effekte von Cytochrom b5 auf ein konkretes Cytochrom P450 System sind bisher nicht voraussagbar.

Die Anwendung des menschlichen Cytochrom b5 zur Stimulierung der Aktivität menschlicher Cytochrom P450 Systeme nach heterologer Expression in S. cerevisiae ist aus einer Reihe von Publikationen [Übersicht bei Pompon et al., Toxicol. Lett. 82/83 (1995) 815-822] und aus WO-A 97/10344 und US 5,635,369 bekannt. Die Frage, ob zur Stimulierung der Aktivität ausgewählter Cytochrom P450 Systeme auch Cytochrome b5 aus anderen Organismen eingesetzt werden können, ist bisher nicht systematisch untersucht. Aufgrund der zum Teil geringen Sequenzhomologien erscheint dies jedoch eher als unwahrscheinlich.

Die Fähigkeit von Cytochrom P450 Systemen zur regio- und z. T. auch stereospezifischen Hydroxylierung verschiedenster chemischer Verbindungen ist von erheblichem biotechnologischen Interesse. Ein Anwendungsgebiet ist beispielsweise die Produktion von langkettigen Dicarbonsäuren mit Hilfe Alkan- und Fettsäurehydroxylierender Cytochrom P450 Systeme. Hierzu patentierte Verfahren beinhalten bisher zwar bereits eine Überexpression der unmittelbaren Komponenten dieser Cytochrom P450 Systeme (P450 und NADPH-P450 Reduktase) in alkanverwertenden Hefen (Candida tropicalis, WO-A 91/14781) bzw. in Saccharomyces cerevisiae (DE 195 07 546 A1). Zum Einsatz von Cytochrom b5 in derartigen Verfahren liegen aber weder publizierte Ergebnisse noch Patente vor.

Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, Nukleinsäuresequenzen zu finden, die die Produktion von Cytochrom b5-Polypeptiden ermöglichen, welche die Aktivität von Alkan- und Fettsäure-hydroxylierenden P450-Enzymen stimulieren und damit die Rate und Effizienz der Produktion von Dicarbonsäuren erhöhen.

Die Aufgabe konnte durch Nukleinsäure-Sequenzen aus Candida Hefen, vorzugsweise aus Candida maltosa, die Cytochrom b5-Polypeptide kodieren, sowie deren Fragmente, Varianten und Mutationen gelöst werden.

Erfindungsgemäß wurde C. maltosa Cytochrom b5 gereinigt, seine vollständige cDNA wurde kloniert und die Bildung eines funktionsfähigen Cytochrom b5 durch heterologe Expression der klonierten cDNA nachgewiesen.

Überraschend konnte ein spezifischer Vorteil des Cytochrom b5 aus C. maltosa mit seiner erfindungsgemäßen Sequenz erreicht werden, da es zur Stimulierung der Aktivität von Cytochrom P450 Systemen aus dem gleichen Organismus bzw. aus verwandten alkanverwertenden Hefen eingesetzt werden kann.

Gegenstand der Erfindung sind somit Nukleinsäure-Sequenzen aus alkanverwertenden Candida Hefen, die ein Cytochrom b5-Polypeptid kodieren sowie ihre Fragmente, Varianten und Mutationen, insbesondere die entsprechende cDNA.

Vorzugsweise handelt es sich um die Nukleinsäure-Sequenzen mit der SEQ ID No. 1 und SEQ ID No. 2 oder deren Varianten.

Des weiteren betrifft die Erfindung Cytochrom b5-Polypeptide, die von den Nukleinsäure- Sequenzen kodiert werden, vorzugsweise ein Cytochrom b5-Polypeptid der SEQ ID No. 3 sowie Varianten davon, die Deletionen oder Modifikationen aufweisen und Cytochrom b5- Aktivitäten aufweisen.

Außerdem betrifft die Erfindung Plasmide und Vektoren, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure-Sequenz enthalten sowie Wirtszellen, die einen Vektor aufweisen und Antikörper, die spezifisch an die Polypeptide binden.

Erfindungsgemäß werden die Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptide zur Stimulierung der Aktivität von Cytochrom P50-Enzymen bei der biotechnologischen Herstellung von Fettsäuren und Dicarbonsäuren durch Oxidation von langkettigen n-Alkanen (≥ C10) verwendet.

Mit der Erfindung wird u. a. bei der Oxidation von Dodekan unter Verwendung von P450 Cml aus Candida maltosa eine mehr als 4fache Stimulierung erreicht, bei der Oxidation von Laurinsäure unter Verwendung von P450 Cm2 aus Candida maltosa eine mehr als 7fache Stimulierung.

Anschließend wird die Erfindung an Beispielen näher erläutert, auf die sie jedoch nicht beschränkt sein soll.

Ausführungsbeispiele 1. Klonierung und heterologe Expression der vollständigen codierenden Region für das Cytochrom b5 der alkanverwertenden Hefe Candida maltosa

Wie nachfolgend im Einzelnen beschrieben wurde das mikrosomale Cytochrom b5 der alkanverwertenden Hefe C. maltosa gereinigt, tryptisch gespalten und hinsichtlich seiner Aminosäuresequenz partiell charakterisiert. Die Sequenz eines der tryptischen Peptide bildete die Grundlage für die Ableitung von degenerierten Oligonucleotiden zur Amplifikation von Teilsequenzen der Cytochrom b5 cDNA mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Ausgehend von den erhaltenen Sequenzen erfolgte dann die Amplifikation und Klonierung der vollständigen codierenden Region. Das aus den DNA-Sequenzen abgeleitete Protein besteht aus 126 Aminosäuren, beinhaltet die Teilsequenzen wie sie für das aus C. maltosa gereinigte Cytochrom b5 ermittelt wurden und weist eine Homologie von etwa 30% zu Cytochromen b5 aus anderen Organismen auf. Als weiterer Beweis für die Identität der klonierten cDNA wurde gezeigt, daß die heterologe Expression in S. cerevisiae zur Bildung eines spektral intakten, mikrosomalen Cytochrom b5 führt.

1.1. Reinigung des Cytochrom b5 Proteins

Der Hefestamm C. maltosa ATCC 28140 wurde in einem 5 l Bioreaktor auf Hexadekan als Kohlenstoffquelle kultiviert. Die Medienzusammensetzung und die allgemeinen Wachstumsbedingungen waren wie bei Huth et al., J. Basic Microbiol. 30 (1990) 481-488, beschrieben. Die Hefezellen wurden kurz vor Eintritt in die stationäre Wachstumsphase geerntet. Der mechanische Zellaufschluß und die Gewinnung der mikrosomalen Membranfraktion erfolgten wie früher beschrieben [Riege et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 98 (1981) 527-534]. Der mikrosomale Cytochrom b5 Gehalt lag bei ca. 0.5 nmol/mg Protein. Die Reinigung des Cytochrom b5 erfolgte in Anlehnung an Methoden wie sie für Cytochrome b5 aus anderen Organismen publiziert wurden [Guzov et al. J. Biol. Chem. 271 (1996) 26637-26645; Strittmatter et al., Meth. Enzymol. 52 (1978) 97-101].

Im Ergebnis wurde ein Cytochrom b5 Präparat mit einer Reinheit von ca. 60% erhalten (das Verhältnis der Absorptionen bei 412 und 280 nm lag bei ca. 1.4). Das gereinigte Cytochrom b5 zeichnet sich durch folgende spektrale Eigenschaften aus: Absorptionsmaxima bei 412 (Sortebande), 525 und 527 nm im oxidierten Zustand; Verschiebung des Soretmaximums auf 424 nm nach Reduktion mit Dithionit.

1.2. Bestimmung von partiellen Aminosäuresequenzen für das gereinigte Cytochrom b5

Das unter 1.1. erhaltene Präparat wurde in einem 15%-igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die erhaltenen Hauptbanden mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 17.5 und 20 kDa wurden dann auf eine Polyvinylidendifluorid-Membran geblottet (Pro Blott, Applied Biosystems, USA) und in situ mit Trypsin gespalten [Methode nach: Fernandez et al. Anal. Biochem. 218 (1994) 112-117]. Die tryptischen Peptide wurden eluiert und über eine Reverse-phase-HPLC an einer Mikrosäule (RPC C2/C18 SC; 100 × 2.1 mm) aufgetrennt (Smart system, Pharmacia, Sweden). Ausgewählte Fraktionen wurden dann auf Polybrenhaltige Glasfaser-Filter aufgetragen und sequenziert (Gasphasen-Sequenator, Procise, Applied Biosystems).

Im Ergebnis wurden folgende Peptidsequenzen erhalten:

T27 (abgeleitet von der 20 kDa-Bande): LYIGNLK

T53 (abgeleitet von der 20 kDa-Bande): VYDITSYIDEHPGGE

T54 (abgeleitet von der 17.5 kDa-Bande): VYDITSYIDE

Die Peptide T53 und T54 stimmen in der Sequenz von 10 Aminosäuren überein. Dieses Ergebnis zeigt an, daß es sich bei der 17.5 kDa-Bande wahrscheinlich um ein proteolytisches Fragment der 20 kDa-Bande handelt.

1.3. PCR-Amplifikation der Cytochrom b5 cDNA

Als Template für die PCR-Amplifikation von Cytochrom b5 cDNA-Fragmenten diente zunächst der Plasmidpool aus einer bereits früher hergestellten C. maltosa EH15 cDNA-Bank [Schunck et al., Biochem Biophys. Res. Commun. 181 (1989) 843-850]. Die in dieser Bank enthaltenen cDNAs sind in den Hind II-Ort des Plasmids pUC 119 inseriert. Cytochrom b5-spezifische Primer wurden aus der Sequenz des Peptids T53 abgeleitet und in Kombination mit Plasmid-abgeleiteten Primern für die PCR eingesetzt. Folgende Primer wurden für die nachstehenden Experimente erfolgreich verwendet:

T53-1-4: 5'- GAT/C ATT/C ACT/C AGT/C TAT/C ATT/C GAT/C GAA C -3'

T53-2-2: 5'- ATT/C GAT GAA CAT/C CCA/T GGT/A GG -3'

pUC 119-2CR: 5'- ACG GCC AGT GAA TTC GAG -3'

Die Kombination von T53-1-4 mit pUC119-2CR führte zur Amplifikation eines etwa 380 bp großen DNA-Fragments. Die dazu durchgeführte PCR (Ready-To-Go PCR Kit, Amersham Pharmacia Biotech) verlief über 35 Zyklen bestehend aus den Schritten: 95°C, 45 sec / 53°C, 45 sec/72°C, 45 sec (+ 1 sec pro Zyklus). Zur Erhöhung der Spezifität wurde das erhaltene DNA-Fragment einer zweiten PCR mit der Primerkombination T53-2-2 (3' versetzt gegenüber T53-1-4)/pUC119-2CR unterworfen (25 Zyklen, gleiches Temperaturregime). Das so amplifizierte Fragment wurde sequenziert.

Für die anschließende Amplifikation des fehlenden 5'-Bereichs der Cytochrom b5 cDNA wurde folgendes Primerpaar eingesetzt:

T53-4CR: 5'- GTT TTA TTT CTA AGG GTT TTG GAG -3'

pUC1 19-1: 5'- ACA GCT ATG ACC ATG ATT ACG -3'

T53-4CR würde aus der Sequenz des zuerst amplifizierten Fragments abgeleitet und setzt am 3'-Ende der vermuteten Cytochrom b5 cDNA an. Die PCR verlief über 30 Zyklen bestehend aus den Schritten: 95°C, 45 sec/55°C, 45 sec/72°C, 45 sec. Das erhaltene Produkt mit einer Länge von ca. 400 bp wurde sequenziert. Die Sequenz zeigte eine offenen Leserahmen für ein Polypeptid mit 126 Aminosäuren.

Im letzten Schritt erfolgte die Gewinnung der vollständigen Cytochrom b5 cDNA mit Hilfe des folgenden Primerpaars:

T53-7Sal: 5'- GAA GTCGAC GTC ATG TCT GAT ACT ACA -3'

T53-8BamCR: 5'- CGC GGATCC ATT ATG TTT TAT TTC TAA G -3'

Diese Primer setzen am 5'- bzw. 3'-Ende der Sequenz des oben beschriebenen 400 bp Fragments an. Die unterstrichenen Sequenzbereiche sind hinzugefügte Restriktionsorte für Sal I bzw. Bam HI zur anschließenden Umklonierung in den Hefe-Expressionsvektor YEp51 (siehe Punkt 1.5).

Als Template diente die Poly(A)RNA aus Zellen des C. maltosa Stammes ATCC 28140 nach Wachstum auf Hexadekan. Die Isolierung der RNA erfolgte nach mechanischem Zellaufschluß mit Hilfe des Oligotex Direct mRNA Mini Kits (QIAGEN). Für die Umschreibung in einzelsträngige cDNA und die anschließende Amplifikation der Cytochrom b5 cDNA wurde der Ready To Go RT-PCR Kit von Amersham Pharmacia Biotech verwendet. Zur reversen Transkription (30 min. 42°C) wurden 100 ng Poly(A)RNA und ein Oligo(dT) Primer eingesetzt. Nach einer Inaktivierung für 5 min bei 95°C erfolgte bei 65°C die Zugabe der Cytochrom b5-spezifischen Primer (T53-75a1 und T53-8Bam). Die anschließende PCR-Amplifikation verlief über 35 Zyklen bestehend aus den Schritten: 95°C, 45 sec/53°C, 45 sec/72°C, 45 sec (+ 1 sec pro Zyklus).

Für die nachfolgende Klonierung des erhaltenen RT-PCR Produkts wurde der TOPO T-A Cloning Kit der Firma INVITROGEN verwendet. Entsprechend den Instruktionen des Herstellers erfolgte eine Ligation des RT-PCR Produkts in das Plasmid pCR 2.1™ und eine anschließende Transformation in E. coli TOP10.

1.4. Charakterisierung der Cytochrom b5 cDNA Sequenz

Zur Sequenzierung wurden insgesamt 21 Klone zufällig ausgewählt, die Plasmide mit einem RT-PCR Insert trugen. Alle sequenzierten Inserts enthielten einen offenen Leserahmen von 378 bp. Signifikante Unterschiede in den analysierten Sequenzen traten an zwei Positionen (147 und 156 gerechnet vom Start-ATG) auf: T(147)-C(156) bei 8 Klonen im Gegensatz zu C(147)-T(156) bei den übrigen. Dieses Ergebnis deutet auf das Vorliegen von zwei allelen Varianten des Cytochrom b5 Gens in C. maltosa hin. Die unterschiedlichen Basen an den Positionen 147 und 156 haben jedoch keinen Einfluß auf die Aminosäuresequenz des kodierten Proteins.

Die klonierten cDNAs (SEQ ID No. 1 und 2) kodieren für ein Polypeptid (SEQ ID No. 3) mit einer Länge von 126 Aminosäuren (Abb. 1). Die für das gereinigte Cytochrom b5 aus C. maltosa ermittelten Peptidsequenzen (vgl. Punkt 2) stimmen exakt mit den Regionen 31 bis 45 (T53 Peptid) bzw. 76 bis 82 (T27 Peptid) in der abgeleiteten Aminosäuresequenz überein (Abb. 1).

Die ermittelte Aminosäuresequenz des C. maltosa Cytochrom b5 zeigt eine mäßige aber signifikante Homologie zu der von Cytochromen b5 aus anderen Organismen. Die Sequenzidentitäten betragen beispielsweise 33% beim Vergleich mit dem menschlichen Protein und überraschenderweise auch nicht mehr als 37% beim Vergleich mit dem bisher einzigen bekannten Cytochrom b5 aus einer anderen Hefeart (S. cerevisiae). Die entsprechenden Alignments sind in Abb. 2 dargestellt.

1.5. Heterologe Expression des Candida maltosa Cytochrom b5 in Saccharomyces cerevisiae

Die Cytochrom b5 cDNA wurde aus einem der sequenzierten Klone SEQ ID No. 2 durch Restriktionsspaltung mit Sal I und Bam HI isoliert und in den Hefeexpressionsvektor YEp51 [Broach et al., In: Experimental Manipulation of Gene Expression, M. Inoye, ed. Academic Press, N. Y, 1983, pp. 83-117] umkloniert. Das so konstruierte Plasmid enthielt die Cytochrom b5 cDNA unter Kontrolle des Galaktose-induzierbaren GAL 10-Promotors. und wurde dann zur Transformation des S. cerevisiae Stammes GRF18 (α, his 3-11, his 3-15, leu 2-3, leu 2-112, can') eingesetzt. Die Kultivierung der Transformanden (GRF18/YEp51-b5) in einem Raffinose-haltigen Medium und die Induktion der Expression der Cytochrom b5 cDNA durch Zugabe von Galaktose erfolgte analog zu früheren Arbeiten zur Expression von Cytochromen P450 in diesem Wirts/Vektor-System [Menzel et al., Arch. Biochem. Biophys. 330 (1996) 97-109]. Als Kontrolle dienten parallel durchgeführte Kulturen des gleichen Hefestammes nach Transformation mit dem Ausgangsplasmid (GRF18/YEp51).

Die Zellen wurden 24 h nach Zugabe der Galaktose geerntet und mechanisch mit Glaskugeln aufgeschlossen (in 100 mM Tris/HCl-Puffer pH 7.7 mit 5 mM EDTA und einem Protease- Inhibitor-Cocktail, Boehringer-Mannheim). Die anschließende differentielle Zentrifugation beinhaltete folgende Schritte: 15 min. 3000 g; 15 min. 10 000 g; 90 min. 100 000 g. Das 100 000 g Sediment (Mikrosomen) wurde in dem oben angegebenen Tris-Puffer resuspendiert.

Der Cytochrom b5 Gehalt wurde in den einzelnen Zellfraktionen spektral bestimmt: Dazu wurden die Differenzspektren zwischen der Dithionit-reduzierten und der mit H2O2 (Endkonzentration: 0.003%)-oxidierten Probe aufgenommen. Zur Berechnung diente der für Cytochrom b5 Proteine übliche Extinktionskoeffizient von 185 mM-1xcm-1 für die Differenz der Absorptionen bei 424 und 409 nm [Estabrook and Werringloer, Meth. Enzymol. 52 (1978) 212-221].

Die erhaltenen Ergebnisse (Abb. 3) belegen, daß die unter Kontrolle des GAL 10-Promotors exprimierte cDNA tatsächlich für ein mikrosomales Cytochrom b5 kodiert. Aus den Differenzspektren der Homogenate kann eine Expressionshöhe von ca. 300 bis 400 nmol Cytochrom b5 pro 1 Kultur abgeschätzt werden. Die aus dem Stamm GRF18/YEp51-b5 isolierten Mikrosomen hatten einen Cytochrom b5 Gehalt von ca. 0.5 nmol/mg Protein. Der Gehalt an wirtseigenem Cytochrom b5 war unter den gewählten Versuchsbedingungen wesentlich geringer und lag an der Nachweisgrenze wie die Differenzspektren mit den entsprechenden Zellfraktionen des Kontrollstammes GRF18/YEp51 zeigen (Abb. 3).

1.6. Reinigung des heterolog exprimierten Candida maltosa Cytochrome b5

Das heterolog exprimierte mikrosomale Cytochrom b5 (vgl. 1.5.) wurde mit Hilfe von Detergentien solubilisiert und durch Chromatographie an DEAE-Sepharose, Hydroxyapatit und DEAE-Toyoperl gereinigt. Das gereinigte Protein zeigte ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 20 kDa. Bei der Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz wurden folgende zwei Sequenzen ermittelt:

Met-Ser-Asp-Thr-Thr-Thr-Thr-Val-Tyr-Asp-Tyr-Glu-Glu-Ile-Ser- . . .

Ser-Asp-Thr-Thr-Thr-Thr-Val-Tyr-Asp-Tyr-Glu-Glu-Ile-Ser-Lys- . . .

Diese unterscheiden sich lediglich durch die An- bzw. Abwesenheit des Start-Methionins, und stimmen exakt mit der aus der cDNA-Sequenz abgeleiteten Aminosäuresequenz des C. maltosa Cytochrom b5 überein. Dieses Ergebnis bestätigt eindeutig die Identität des heterolog exprimierten Proteins.

2. Stimulierung der Aktivität von Alkan- und Fettsäure-oxidierenden Cytochrom P450 Enzymen durch das C. maltosa Cytochrom b5

Wie nachfolgend im Einzelnen beschrieben wurde der Einfluß des C. maltosa Cytochrom b5 auf die Aktivität von zwei C. maltosa Cytochrom P450 Formen untersucht. Diese werden als P450 Cm1 und P450 Cm2 bezeichnet (Schunck et al., Eur. J. Cell Biol. 55 (1991) 336-345). Sie bilden bei Rekonstitution mit der ebenfalls aus C. maltosa klonierten NADPH-P450 Reduktase enzymatisch aktive Monooxygenase-Systeme, welche die Oxidation verschiedener n-Alkane und Fettsäuren katalysieren (Scheller, U., Zimmer, T., Kärgel, E. and Schunck, W.- H. Arch: Biochem. Biophys. 328 (1996) 245-254). Sowohl P450 Cm1 als auch P450 Cm2 können nicht nur die primäre terminale Hydroxylierung von Alkanen und Fettsäuren katalysieren, sondern auch alle weiteren Oxidationsschritte bis zur Bildung der entsprechenden Dicarbonsäuren (Scheuer, U., Zimmer, T., Becher, D., Schauer, F., Schunck, W.-H., J. Biol. Chem. 273 (1998) 32528-32534).

Um Enzymsysteme bestehend aus P450 Cm1 bzw. P450 Cm2 und NADPH-P450 Reduktase zu rekonstituieren und den Einfluß von Cytochrom b5 zu testen, wurden diese drei Komponenten in S. cerevisiae coexprimiert. Das dazu entwickelte System ist unter 2.1. erläutert. Als Kontrollen dienten S. cerevisiae Zellen, in denen P450 und Reduktase ohne Cytochrom b5 exprimiert wurden. Anschließend erfolgte eine Bestimmung der resultierenden Enzymaktivitäten auf der Ebene der isolierten Mikrosomen und intakten Hefezellen (2.2.). Als Substrat wurde jeweils ein Vertreter der Klasse der n-Alkane (Dodekan) und der Fettsäuren (Laurinsäure) eingesetzt. Die erhaltenen Ergebnisse (Tab. 1-3) zeigen eindeutig, daß Cytochrom b5 einen starken stimulierenden Effekt auf die Aktivität der untersuchten Alkan- und Fettsäure-oxidierenden P450 Formen ausübt.

2.1. Konstruktion von S. cerevisiae Stämmen zur Coexpression von C. maltosa Cytochrom b5 mit Cytochrom P450 und NADPH-Cytochrom P450 Reduktase

Als erster Schritt wurde durch integrative Transformation ein S. cerevisiae Stamm konstruiert, der in seinem Genom eine Kassette für die Expression des C. maltosa Cytochrom b5 trägt. Wie in Abb. 4 dargestellt, bestand die integrative Expressionskassette aus folgenden Elementen: flankierenden Teilsequenzen des TRP1-Gens für die Integration ins Hefe-Genom, einem URA3-Markergen sowie dem GAL 10-Promotor, der Cytochrom b5 cDNA und dem ADH1-Terminator.

Zur Gewinnung und Klonierung dieser einzelnen Elemente wurde wie folgt vorgegangen:

Die Teilsequenzen des TRP1-Gens wurden durch PCR aus genomischer DNA amplifiziert. Als Primerpaare dienten:

TRP-A1: 5'-TCTAGCCATGGTGACTATTGAGCACG-3' /

TRP-A3CR: 5'-ACAGGTACCGATATCAATGCCGTAATC-3'

und

TRP-B4: 5'-TATTGCGGCCGCTTAGATTAAATGG-3'/

TRP-B2CR: 5'-CTAGGAATTCGGCACACAGTGG-3'

Die amplifizierten Fragmente entsprechen den Regionen 49-390 bzw. 670-1425 innerhalb der Sequenz TRP1 Gens (zugrundeliegende Sequenz: V01341, Gene Bank). Diese Fragmente wurden in das bereits beschriebene Plasmid "pBM21-Ex2" (Zimmer, T., Kaminski, K., Scheuer, U., Vogel, F., and Schunck, W.-H. DNA and Cell Biology 14 (1995) 619-628) unter Verwendung der Restriktionsorte PmaCI/EcoRV (TRP-A) bzw. NotI/EcoRI (TRP-B) eingeführt (resultierendes Plasmid: "Ex2-TRAB").

Das URA3-Markergen wurde durch Restriktion mit Pvu I/Nru I aus dem Plasmid pSEY304 (Bankaitis, V. A., Johnson, L. M., and Emr, S. D. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83 (1986) 9075-9079) isoliert und in den Eco RV-Ort des Plasmids Ex2-TRAB einkloniert (resultierendes Plasmid: Ex2-TRAB/URA).

Die Cytochrom b5 cDNA wurde aus dem Plasmid pCR 2.1™ (vgl. 1.3.) durch Restriktion mit Sal I und Bam HI isoliert und in das mit den gleichen Restriktasen geöffnete Plasmid Ex2-TRAB/URA umkloniert (resultierendes Plasmid: pEx2/Cmb5, siehe Abb. 4). Die verwendete Cytochrom b5 cDNA entspricht der SEQ ID No: 2.

Die so konstruierte integrative Expressionskassette wurde dann aus dem Plasmid pEx2/Cmb5 durch Restriktion mit Pma CI und Nhe I isoliert und in den S. cerevisiae Stamm YS 18 (isogen zu GRF18 aber ura3; Sengstag and Hinnen, Gene 67 (1988) 223-228) transformiert. Dabei wurden sowohl Transformanten erhalten, bei denen die Expressionskassette durch homologe Rekombination in das TRP1-Gen der Wirtzelle eingebaut wurde (TRP-, URA+, im weiteren als YSCmb5C1 bezeichnet), als auch solche, die aus einem zufälligen Einbau an einem anderen, nicht näher charakterisierten Ort des Hefe-Genoms resultierten (TRP+, URA+, im weiteren als YSCmb5C10 bezeichnet).

Die so konstruierten und für die weiteren Versuche ausgewählten Stämme YSCmb5CI und YSCmb5C10 tragen jeweils eine stabil in das Hefegenom integrierte Expressionskassette, die eine Galaktose-induzierbare Expression des C. maltosa Cytochrom b5 gestattet. Dabei zeichnet sich der Stamm YSCmb5C10 durch eine etwa 2.5-fach höhere Cytochrom b5 Expression im Vergleich zu YSCmb5C1 aus.

Ausgehend von YSCmb5C1 und YSCmb5C10 wurden dann Hefe-Stämme erzeugt, die eine gleichzeitige Expression von Cytochrom P450, NADPH-P450 Reduktase und Cytochrom b5 ermöglichen. Dazu erfolgte eine Transformation der YSCmb5-Stämme mit den autonom replizierenden Plasmiden YEp51Cm1-R bzw. YEp51Cm2-R. Diese Plasmide wurden bereits früher beschrieben: Zimmer, T., Kaminski, K., Scheuer, U., Vogel, F., and Schunck, W.-H. (DNA and Cell Biology 14 (1995) 619-628 und DE 195 07 546 A1). Sie tragen zwei Expressionskassetten, die jeweils unter Kontrolle des GAL10 Promotors zur Expression der gewünschten P450-Komponente (P450 Cm1 bzw. P450 Cm2 aus C. maltosa) und der NADPH-P450 Reduktase aus C. maltosa genutzt werden.

Letztlich wurden für die Untersuchung des stimulierenden Effekts von Cytochrom b5 auf die Aktivität Alkan- und Fettsäure-oxidierender P450 Enzyme folgende S. cerevisiae-Stämme erhalten:

YSCmb5C1/Cm1R und YSCmb5vC10/Cm1R - zur Coexpression von Cytochrom b5, P450 Cm1 und NADPH-P450 Reduktase;

YSCmb5C1/Cm2R und YSCmb5C10/Cm2R - zur Coexpression von Cytochrom b5, P450 Cm2 und NADPH-P450 Reduktase;

YS18/Cm1R - Kontrollstamm zur Expression von P450 Cm1 und NADPH-P450 Reduktase ohne Cytochrom b5

YS18/Cm2R - Kontrollstamm zur Expression von P450 Cm2 und NADPH-P450 Reduktase ohne Cytochrom b5

2.2. Einfluß von Cytochrom b5 auf die P450-katalysierte Oxidation von Dodekan und Laurinsäure

Für diese Untersuchungen wurden die oben genannten S. cerevisiae Stämme (vgl. 2.1.) wie unter 1.5. beschrieben kultiviert und die Expression der jeweiligen Komponenten (P450, Reduktase und Cytochrom b5) durch Zugabe von Galaktose induziert. Die Zellen wurden 24 h nach Galaktose-Zugabe geerntet, mechanisch aufgeschlossen und die Gewinnung der Mikrosomen erfolgte durch differentielle Zentrifugation (siehe 1.5).

Die Reaktionsansätze (1 ml) enthielten in 100 mM K-K-Phosphatpufer pH 7.25, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, ca. 0.2 mg mikrosomales Protein, 100 nmol NADPH, ein NADPHregenerierendes System bestehend aus 3.1 µMol Glucose-6-Phosphat und 1 U Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase sowie als Substrat entweder [1-14C] Dodekan (1000 nMol, 1 × 106 dpm) oder [1-14C] Laurinsäure (250 nMol, 5 × 105 dpm). Die Reaktionen wurden durch Zugabe von NADPH gestartet, bei einigen Experimenten wurde gleichzeitig NADH (500 nmol) zugesetzt. Die Inkubation erfolgte 30 min bei 30°C. Die weitere Aufarbeitung (Chloroform/Methanol-Extraktion und Dünnschicht-Chromatographie) sowie die Quantifizierung der Reaktionsprodukte mit einem TLC-Radio-Scanner erfolgte wie früher beschrieben (Scheller, U., Zimmer, T., Kärgel, E. and Schunck, W.-H. Arch. Biochem. Biophys. 328 (1996) 245-254).

Die Ergebnisse sind in Tab. 1 und Tab. 2 zusammengefaßt. Sie zeigen, daß Cytochrome b5 einen starken stimulierenden Effekt auf die Aktivität der untersuchten P450 Enzyme hat.

Beispielsweise wurde die Geschwindigkeit der NADPH-abhängigen, P450 Cm2 katalysierten Oxidation von Laurinsäure durch die Anwesenheit von Cytochrom b5 etwa 4-fach gesteigert (siehe Tab. 1). Bei Einsatz eines Gemisches von NADPH und NADH erfolgte eine weitere Erhöhung, so daß durch Cytochrom b5 eine insgesamt mehr als 7-fache Stimulierung erreicht wurde. Der synergistische Effekt von NADPH und NADH trat nur in Anwesenheit von Cytochrom b5 auf (siehe Tab. 1). Die Aktivität von P450 Cm1, das im Gegensatz zum P450 Cm2 bevorzugt n-Alkane oxidiert, wurde ebenfalls deutlich durch Cytochrom b5 stimuliert. Das coexprimierte Cytochrom b5 bewirkte eine mehr als 4-fache Steigerung der P450 Cm1 katalysierten Oxidation von Dodekan (Tab. 2). Zusätzlich wurde gezeigt, daß eine Stimulierung der P450-Aktivität auch durch Zusatz von gereinigtem Cytochrom b5 zu Mikrosomen erreicht werden kann, die nur P450 und NADPH-P450 Reduktase enthielten (Tab. 2). Unter den gewählten Reaktionsbedingungen waren 1-Dodekanol und 12- Hydroxylaurinsäure die Hauptprodukte der P450-abhängigen Dodekan bzw. Laurinsäure- Oxidationen. Eine signifikante Weiteroxidation bis zur entsprechenden Dikarbonsäure trat vor allem bei hohen Enzymaktivitäten auf (vgl. Tab. 1).

In einer weiteren Versuchsreihe wurde die Fähigkeit intakter Hefezellen zur Oxidation von Laurinsäure untersucht. Dazu wurden je 2 ml Aliquote Galaktose-induzierter Kulturen der oben genannten Hefestämme eingesetzt. Diese wurden mit [1-14C] Laurinsäure (500 nMol, 1 × 106 dpm; gelöst in 10 µl Ethanol) versetzt und unter Schütteln für 30 min bei 30°C inkubiert. Die Extraktion und Quantifizierung der Reaktionsprodukte erfolgte wie oben für die mikrosomalen Ansätze beschrieben.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tab. 3 zusammengefaßt. Sie zeigen, daß bereits auf der Ebene der intakten Zellen ein stimulierender Effekt des Cytochrom b5 klar nachweisbar ist. Dieser war im Fall von P450 Cm2 besonders stark ausgeprägt. So wies der Stamm mit der höchsten Cytochrom b5 Coexpression (YSCmb5C10/Cm2R) eine etwa 4-fach höhere Aktivität auf, als der entsprechende Stamm, der nur P450 Cm2 und die NADPH-P450 Reduktase exprimiert (YS18/Cm2R). Dabei wurde nicht nur eine verstärkte Bildung der 12- Hydroxylaurinsäure sondern auch der Dodekandisäure beobachtet (Tab. 3). Dieses Ergebnis zeigt, daß Cytochrom b5 sowohl die primäre Hydroxylierungsreaktion, als auch die nachfolgenden Oxidationsschritte bis zur entsprechenden Dikarbonsäure stimuliert. Tabelle 1 Effekt des coexprimierten Candida maltosa Cytochrom b5 (Cmb5, SEQ ID No.2) auf die Laurinsäure-oxidierende Aktivität der mikrosomalen Cytochrom P450 Enzyme P450 Cm1 und P450 Cm2



Tabelle 2 Effekt von coexprimiertem bzw. gereinigtem Candida maltosa Cytochrom b5 (Cmb5, SEQ ID No.2) auf die Dodekan-oxidierende Aktivität der mikrosomalen Cytochrom P450 Enzyme P450 Cm1 und P450 Cm2



Tabelle 3 Effekt des coexprimierten Candida maltosa Cytochrom b5 (Cmb5, SEQ ID No. 2) auf die Laurinsäure-oxidierende Aktivität der Cytochrom P450 Enzyme P450 Cm1 und P450 Cm2 in intakten Saccharomyces cerevisiae Zellen



Legende zu den Abbildungen:

Abb. 1: Nucleinsäuresequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz für das Cytochrom b5 der alkanverwertenden Hefe Candida maltosa.

Abb. 2: Vergleich der Aminosäuresequenz des Cytochrom b5 aus Candida maltosa mit der bekannter Cytochrom b5 Proteine. (A)- Alignment mit der Sequenz des Cytochrom b5 aus Saccharomyces cerevisiae (Swiss Prot Accession number: P40312); (B)- Alignment mit der Sequenz des menschlichen Cytochrom b5 (mikrosomale Form, Swiss Prot Accession number: P00167).

Abb. 3: Heterologe Expression der Candida maltosa Cytochrom b5 cDNA in Saccharomyces cerevisiae. Dargestellt sind die Differenzspektren (reduzierte gegen oxidierte Probe) zum Nachweis von Cytochrom b5 in verschiedenen Zellfraktionen: A: Homogenat; B: 10 000 g Überstand; C: 100 000 g Überstand; D: 100 000 g Sediment (Mikrosomen). #1- Zellfraktionen des Stammes GRF18/YEp51-b5 (Expression des C. maltosa Cytochrom b5); #2- Zellfraktionen des Kontrollstammes GRF18/YEp51; #0- Grundlinie zu #1.

Abb. 4: Karte des Plasmids pEx2/Cmb5. Dieses Plasmid enthält die konstuierte Expressionskassette zur heterologen Expression des Cytrochrom b5 aus Candida maltosa in Saccharomyces cerevisiae.


Anspruch[de]
  1. 1. Nukleinsäure-Sequenzen aus alkanverwertenden Candida Hefen, die ein Cytochrom b5- Polypeptid kodieren sowie ihre Fragmente, Varianten und Mutationen.
  2. 2. Nukleinsäure-Sequenzen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Candida maltosa stammen.
  3. 3. Nukleinsäure-Sequenzen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie vollständig komplementär sind.
  4. 4. Nukleinsäure-Sequenzen nach Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet durch die SEQ ID No. 1 oder deren Varianten.
  5. 5. Nukleinsäure-Sequenzen nach Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet durch die SEQ ID No. 2 oder deren Varianten.
  6. 6. Cytochrom b5-Polypeptide, die von den Nukleinsäure-Sequenzen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 kodiert werden.
  7. 7. Cytochrom b5-Polypeptide gekennzeichnet durch die SEQ ID No. 3, Varianten davon, die Deletionen oder Modifikationen aufweisen und Cytochrom b5-Aktivitäten aufweisen.
  8. 8. Plasmide, die eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 enthalten.
  9. 9. Vektoren, die Nukleinsäure-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 enthalten.
  10. 10. Wirtszellen, die einen Vektor gemäß Anspruch 9 enthalten.
  11. 11. Antikörper, die spezifisch an die Polypeptide gemäß Anspruch 7 binden.
  12. 12. Verwendung der Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptide gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Stimulierung der Aktivität von Cytochrom P450-Enzymen.
  13. 13. Verwendung der Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptide gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 in Verfahren zur Oxidation von langkettigen Alkylverbindungen (≥ C10).
  14. 14. Verwendung der Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptide gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 in Verfahren zur Herstellung von langkettigen Dicarbonsäuren durch Oxidation von n-Alkanen (≥ C10) und Fettsäuren (≥ C10).






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