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Dokumentenidentifikation DE69610295T2 22.02.2001
EP-Veröffentlichungsnummer 0814834
Titel VON EINEM RETROVIRALEN REGULATIONSPROTEIN ABSTAMMENDE, DETOXIFIERTE IMMUNOGENE, DAGEGEN GERICHTETE ANTIKÖRPER, VERFAHREN ZUR DEREN HERSTELLUNG UND DIESE IMMUNOGENE ODER ANTIKÖRPER ENTHALTENDE, PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNGEN.
Anmelder Neovacs, Paris, FR
Erfinder ZAGURY, Jean-François, F-75003 Paris, FR;
BIZZINI, Bernard, F-46100 Figeac, FR;
ZAGURY, Daniel, F-75007 Paris, FR
Vertreter Hagemann, Braun & Held, 81679 München
DE-Aktenzeichen 69610295
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument FR
EP-Anmeldetag 07.03.1996
EP-Aktenzeichen 969067958
WO-Anmeldetag 07.03.1996
PCT-Aktenzeichen FR9600357
WO-Veröffentlichungsnummer 9627389
WO-Veröffentlichungsdatum 12.09.1996
EP-Offenlegungsdatum 07.01.1998
EP date of grant 13.09.2000
Veröffentlichungstag im Patentblatt 22.02.2001
IPC-Hauptklasse A61K 39/21
IPC-Nebenklasse C07K 16/10   A61K 39/42   A61K 47/48   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit neuen retroviralen Immunogenen, die retrovirale Regulationsproteine einsetzen, deren essentielle biologische Eigenschaften zuvor derart inaktiviert wurden, dass ihre immunogenen Eigenschaften bewahrt oder vergrößert werden, einem Verfahren zu ihrer Herstellung und den sie enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen. Diese neuen "inaktivierten" Immunogene können eingesetzt werden, um beim Menschen eine aktive Immunisierung zu induzieren, die im Stande ist, den Störungseffekten vorzubeugen oder diese zu korrigieren, so dass die nativen Proteine, von denen sie herrühren, zur Produktion beitragen können.

Ebenso beschäftigt sich die vorliegende Erfindung mit neuen Antikörpern, erhalten durch Verwendung dieser "inaktivierten" Immunogene, den Verfahren zu ihrer Herstellung und den sie enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen im Hinblick auf eine passive Immunisierung.

Das Tat-Molekül ist ein Regulationsprotein von HIV, das man nicht im viralen Teilchen findet, das aber durch das 1-HIV-Genom codiert wird. Im Inneren der infizierten Zellen spielt dieses durch provirale DNA codierte Protein eine Rolle als Transaktivator von viralen oder zellulären Genen. Dieses genetische Regulationsprotein kann sich indessen auch im äußeren Teil der Zellen im extrazellulären Blutkreislauf befinden, abgeschieden innerhalb der Überreste von abgestorbenen Zellen, im nativen oder fragmentären Zustand, oder durch Sekretionsprozesse. Seine Gegenwart im Blutkreislauf erklärt die Anwesenheit detektierbarer Anti-Tat-Antikörper bei bestimmten seropositiven Subjekten. Diese extrazelluläre Umgebung von Tat ermöglicht ihnen das terminale Segment C, der Träger der RGD-Reste, die durch die zelluläre Oberfläche der Integrine und die Basenregion des Moleküls (Reste 45 bis 70) wiedererkannt werden, wie die bakteriellen Toxine zu wirken, nämlich auf nicht infizierte Zellen verschiedener Gewebe einzuwirken.

So wirkt das Tat-Zirkulationsprotein wie ein echtes virales Toxin, kann auf Endothelialzellen schädliche Wirkungen ausüben und kann in Assoziation mit dem Wachstumsfaktor BFGF zur Neoangiongenese des die Aids-Krankheit charakterisierisierenden Kaposi- Sarkoms beitragen. Das Tat-Zirkulationsprotein kann auch die Immunsuppression verschlimmern, die sich bei Aids allmählich einstellt, entweder durch direkte immunsuppressive Wirkung auf die T-Zellen, oder indem es die α-Interferon-Produktion durch die antigen auftretenden Zellen, bezeichnet als APC (Makrophagen oder dentritische Zellen), stört.

Das erworbene Immunschwäche-Syndrom (Aids) wird klinisch definiert durch opportunistische Erkrankungen aufgrund einer Immunsuppression oder durch das Kaposi- Sarkom. Die erworbene Immunsuppression, die allmählich im Laufe einer HIV- Infektion auftritt, äußert sich biologisch durch den Verlust der immunologischen Reaktivität der T-Zellen (Cytostase und Verringerung der IL2-Produktion) nach der Stimulation in erster Linie durch Gedächtnisantigene, dann durch Alloantigene und schließlich durch Mitogene (PHA). Diese Immunsuppression ist mit der Überproduktion der α- und γ-Interferone verbunden.

Die cytopathogenen Mechanismen, die die Immunsuppression induzieren, sind komplex und greifen in verschiedene Faktoren viralen Ursprungs ein, indem sie entweder direkt auf die Immunitätszellen, T-Lymphozyten und APC oder indirekt über das Netz der Cytokine wirken. Somit kann das Umhüllungsprotein gp120, das vom 1-HIV-Teilchen getragen wird und dessen extrazelluläre Gegenwart durch die virale Ladung im Serum gemessen wird, direkt die Anergie der T-Zellen vom Phenotyp CD4 induzieren. Die Regulationsproteine von HIV, insbesondere das Tat in seiner extrazellulären Konfiguration des viralen Zirkulationstoxins, scheinen ebenfalls eine direkte Immunsuppression der T- Zellen oder andere pathogene Effekte zu induzieren, beispielsweise mit der Folge, dass in vitro die aktivierten T-Zellen durch ein Gedächtnisantigen oder Anti-CD3-Antikörper in Gegenwart des Tat-Moleküls nicht mehr proliferieren. Außerdem scheint das Tat- Zirkulationsprotein die Überproduktion durch die APC von α-Interferon, cytostatischem und apoptogenem Cytokin, das in der Lage ist, die bei der Aids-Erkrankung beobachtete Immunsuppression und Apoptose zu verstärken, zu erleichtern. Tatsächlich scheint die α-Interferon-Sekretion durch die Makrophagen in Gegenwart von Tat durch eine Retroregulation (feedback), die im Normalzustand diese α-Interferon-Produktion (refraktäre Periode) kontrolliert, nicht mehr aufzuhören.

Das Kaposi-Sarkom äußert sich klinisch durch das Auftreten von vaskulären Knötchen, die eine von Endothelialzellen ausgebildete Neoangiogenese darstellen. Diese durch entzündliche Prozesse aktivierten Zellen verursachen die Produktion von Cytokinen (γ- Interferon, 1-IL und 6-IL), erzeugen BFGF (Basic Fibroblastic Growth Factor) und vermehren sich. Die Proliferation der in vitro aktivierten Endothelialzellen wird durch die Gegenwart im Milieu des Tat-Proteins verstärkt. Die Anti-Tat-Antikörper blockieren in vitro die proliferativen Effekte des Tat-Proteins. Die Wirkung von Tat auf die Endothelialzellen, die auf ihrer Oberfläche Adhesin aus der Familie der Integrine tragen, erklärt sich durch die Gegenwart der RGD-Sequenz, die durch diese Moleküle wiedererkannt wird.

Die Neoangiogenese, die in vivo das Kaposi-Sarkom umfaßt, würde daher das Tat- Regulationsprotein in seiner extrazellulären Konfiguration begünstigen, das dank seines C-terminalen Fragments, das die RGD-Sequenz enthält, durch die Integrine der Endothelialzellen wiedererkannt werden könnte. Zudem kann das Tat auch durch seine an K- und R-Resten reiche Basenregion wirken und ist folglich in der Lage, sich an Heparinsulfat aus der extrazellulären Matrix, das den Wachstumsfaktor BFGF konzentriert, zu binden. Somit wird die durch die Wachstumsfaktoren induzierte Proliferation der Endothelialzellen durch die Gegenwart von Tat erhöht und die Neoangiogenese hervorgeru fen. Dieser Effekt auf das Wachstum der Endothelialzellen wird in vitro durch die Wirkung des Anti-Tat-Antikörpers verringert.

Es scheint daher wünschenswert, die schädigende Aktivität der Regulationsproteine der Retroviren, insbesondere des in den extrazellulären Milieus zirkulierenden Tat, (Blut, Lymphe, Bindegewebsmilieus ...) zu blockieren, die wirkliche virale Toxine darstellen.

Hinsichtlich der HIV-Viren hat man bis heute Impfungsversuche mit Strukturproteinen oder Fragmenten von Strukturproteinen dieser Viren durchgeführt, aber niemals mit Regulationsproteinen oder Fragmenten von Regulationsproteinen dieser Viren.

Nun hat man erstaunlicherweise gefunden, dass genau wie bei bakteriellen Toxinen (Tetanus, Diphterie oder Botulinus), deren toxische Aktivität durch spezifische Antikörper neutralisiert wird, die schädigenden Effekte der viralen Regulationsproteine und insbesondere von Tat, einem echten Toxin von HIV, in seiner extrazellulären Konfiguration - die sich auf die Immunsuppression der T-Zellen durch Störung der Produktion von α- Interferon durch die APC oder durch Neoangiogenese, die das Kaposi-Sarkom umfaßt, auswirken - in Gegenwart spezifischer Anti-Tat-Antikörper beseitigt werden, wie nachfolgend im experimentellen Teil zu sehen ist.

Dieses trifft gleichermaßen auf die anderen Regulationsproteine von Viren, wie 1-HIV, 2-HIV und 1-HTLV oder 2-HTLV zu. Es wäre daher wünschenswert, für den Mensch verabreichbare Immunogene bereitzustellen, die in der Lage sind, derartige Antikörper zu produzieren, und außerdem, sowohl zu heilenden als auch vorbeugenden Zwecken, solche Antikörper bereitzustellen. Tatsächlich können die als Immunogene eingesetzten Verbindungen aus dem Stand der Technik für den Menschen toxisch sein (siehe z. B. WO-A-91 18 454), insbesondere jene, die die basischen Regionen tragen. Es handelt sich um nichtmodifizierte Fragmente von "nativem" Tat, Nef oder Ref, im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung, die auf der Inaktivierung dieser Proteine oder Fragmente von Proteinen basiert.

Die WO-A-93 22 349 beschreibt natürliche IgM-Antikörper von niedriger Affinität, die normalerweise im Serum eines nicht mit 1-HIV infizierten Individuums vorhanden sind, und die die Epitope auf den Protaminen SP80 und Tat wiedererkennen und regt an, sie ausgehend von den seronegativen Seren der Subjekte oder dem Überstand geklonter B CD5+-Zellen zu reinigen, um sie in Therapie einzusetzen.

Das Journal of Virology, 1990, 64: 962-5 beschreibt monoklonale Antikörper, produziert von gegen das Tat-Protein mit Adjuvans von Freund immunisierten Mäusen. Bestimmte dieser monoklonalen Antikörper können die Transaktivierungswirkung des Tat-Proteins auf LTR, einen 1-HIV-Promotor, inhibieren.

Das Journal of Cell Biology, 1990, 111: 1275-81 und die WO-A-91/15224 beschreiben die Fixierung von Tat-Protein auf monozytären, lymphozytären oder muskulären Zellen, dank des RGD-Rests in der Sequenz. Die Tat-Rezeptoren auf den Zellen können Integrine sein. Die PCT-Anmeldung schlägt die Verwendung von für die Bindungsstellen von Tat-Integrin-spezifischen Peptiden oder Antikörpern vor, um die RGD-Integrin- Wechselwirkung zu blockieren und den extrazellulären Effekt von Tat zu begrenzen.

Im Gegensatz zu obigem Artikel und Patent gibt die WO-A-92 14 755 einen Tat-Bereich an, der an die Integrine bindet und der nicht von der RGD-Sequenz abhängt und schlägt vor, bei der Therapie Inhibitoren der Tat-Integrin-Bindung einzusetzen, die entweder von Integrinen oder Tat abstammende Peptidfragmente oder Antikörper sind und die gegen die Tat-Integrin-Bindungsstellen gerichtet sind.

In Cell, 1988, 55: 1189-93 ist die Penetration von extrazellulärem Tat-Protein in die Zellen beschrieben, um die Transkription des I-HIV-Promoters zu transaktivieren (CAT Assay). Es wird außerdem der Verlust dieser Transaktivatorwirkung der Transkription beschrieben, wenn man ein durch Carboxymethylierung behandeltes Tat-Molekül einsetzt.

Das Journal of Virology, 1994, 68: 3343-53, beschreibt die Produktion durch Synthese von nativem Tat-Protein oder Fragmenten mit ihren Transaktivatoreigenschaften auf LTR von 1-HIV, indem man als Marker das Gen von β-Galactosidase einsetzt. Die durch Addition von Acetamidomethylgruppierungen modifizierten Formen von Tat wurden ebenfalls in diesem Transaktivatorsystem getestet.

Aus diesem Grund bezieht sich das vorliegende Schutzrecht auf pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend eine dem Menschen verabreichbare detoxifizierte immunogene Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass die immunogene Verbindung von einem Regulationsprotein eines 1-HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2-HTLV-Virus oder einem seiner Peptidfragmente durch chemische Behandlung oder durch Kopplung mit einem Trägerprotein, aktiviert durch eine Vorbehandlung mit einem Aldehyd, abgeleitet ist, was die Wiedererkennung durch Antikörper, die gegen das native Regulationsprotein gerichtet sind, und die Aufrechterhaltung von ausreichenden immunogenen Eigenschaften ermöglicht, um Antikörper zu erzeugen, die das native Protein neutralisieren oder blockieren, während mindestens 50% der toxischen biologischen Eigenschaften des nativen Proteins verlorengehen.

Das vorliegende Schutzrecht bezieht sich auch auf die immunogenen Verbindungen, wie sie oben definiert sind, zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren für den menschlichen oder tierischen Körper, d. h. die Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus den immunogenen Verbindungen, wie sie oben definiert sind, aufgebaut sind.

Mit Ausnahme des von Frankel et al. in Cell, Band 55, 1189-1193, 1988 beschriebenen carboxymethylierten Tat sind die immunogenen Verbindungen, wie sie oben definiert sind, neu.

Daher bezieht sich das vorliegende Schutzrecht ebenfalls auf einen immunogene, einem Menschen verabreichbare detoxifizierte Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass sie von einem Regulationsprotein eines 1-HIV-, 2-HIV, 1-HTLV- oder 2-HTLV-Virus oder einem seiner Peptidfragmente durch chemische Behandlung oder Kopplung mit einem Trägerprotein, aktiviert durch eine Vorbehandlung mit einem Aldehyd, abgeleitet ist, was die Wiedererkennung durch Antikörper, die gegen das native Regulationsprotein gerichtet sind und die Aufrechterhaltung von ausreichenden immunogenen Eigenschaften ermöglicht, um Antikörper zu erzeugen, die das native Protein neutralisieren oder blockieren, während mindestens 50% der toxischen biologischen Eigenschaften des nativen Proteins verlorengehen, ausgenommen das carboxymethylierte Tat.

Das vorliegende Schutzrecht bezieht sich insbesondere auf immunogene, einem Menschen verabreichbare detoxifizierte Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass sie von einem Regulationsprotein eines 1-HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2-HTLV-Virus durch chemische Behandlung mit einem Kopplungsmittel, wie einem Aldehyd oder einem Trägerprotein, aktiviert durch eine Vorbehandlung mit einem Aldehyd, bevorzugt Formaldehyd oder Glutaraldehyd, abgeleitet sind, was die Wiedererkennung durch Antikörper, die gegen das Regulationsprotein gerichtet sind und die Aufrechterhaltung ausreichender immunogener Eigenschaften ermöglicht, um Antikörper zu erzeugen, die das native Protein neutralisieren oder blockieren, während mindestens 50%, besonders bevorzugt mindestens 80%, insbesondere mehr als 95%, der toxischen biologischen Eigenschaften des nativen Proteins verlorengehen.

Diese Verbindungen werden in Analogie zu bakteriellen Toxoiden, wie das Tetanus- Toxoid, nachfolgend als "Toxoide" bezeichnet.

Tatsächlich sind sie, wie die klassischen bakteriellen Toxoide ohne eigene Toxizität, aber sind währenddessen in der Lage durch Verabreichung an ein Subjekt eine Immunisierung hervorzurufen.

Die unten genannte chemische Behandlung kann durch eine physikalische Behandlung, wie z. B. eine Bestrahlung und insbesondere eine UV-Bestrahlung, vervollständigt werden, mit dem Ziel, die verbliebene Toxizität der erfindungsgemäßen immunogenen Verbindungen zu verringern.

Die obigen Toxoide können z. B. ausgehend von einem Peptid mit einer Sequenz, die mit der Peptidsequenz eines Regulationsproteins, wie Tat, identisch oder dieser ähnlich ist, hergestellt werden, und sie können z. B. durch herkömmliche Peptid-Synthese auf Harz oder durch Gentechnik erhalten werden. All diese Verfähren sind im Stand der Technik wohlbekannt.

Um zu überprüfen, ob das erfindungsgemäß modifizierte Regulationsprotein oder sein erfindungsgemäß modifiziertes Fragment durch die gegen das native Regulationsprotein gerichteten Antikörper gut erkannt wird, kann man z. B. immunologisch nach Elisa die Gegenwart von spezifischen Antikörpern überprüfen, die Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen, wie nachfolgend im experimentellen Teil zu sehen.

Um zu bestimmen, ob die immunogenen Eigenschaften des Regulationsproteins ausreichend erhalten bleiben, um Antikörper zu erzeugen, die das native Protein neutralisieren, kann man beispielsweise Säugetiere (Hasen, Ratten, Mäuse) mit einer erfindungsgemäßen immunogenen Verbindung immunisieren und überprüfen, ob die erzeugten Antikörper die toxische Aktivität des Regulationsproteins neutralisieren, wie man es für das Tat im experimentellen Teil sieht.

Um zu bestimmen, ob das modifizierte Regulationsprotein mindestens 50% seiner toxischen biologischen Eigenschaften verloren hat, kann man z. B. den Effekt des Regulationsproteins, wie des inaktivierten Tat, auf die Immunsuppression der T-Zellen oder auf die α-Interferon-Produktion durch die aktivierten mononukleierten Zelten im peripheren Blut oder auch auf die durch das Regulationsprotein induzierte Neoangiogenese untersuchen.

Die Inaktivierung des Tat-Regulationsproteins wird beispielsweise durch den "Tat Rescue Assay" unter Verwendung eines nicht-infektiösen, Tat defizitären HIV- Mutanten, auf einer zellulären 1-HLM-Linie, dessen Replikation vom exogenen Zusatz von nativem Tat abhängt, kultiviert.

Die immunogene Verbindung kann abgeleitet sein von irgendeinem der Regulationsproteine der 1-HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2-HTLV-Viren, und insbesondere von Vif, Rev, Nef und Tat der 1-HIV- und 2-HIV-Viren. Man nimmt besonders Rev, Nef und Tat, insbesondere Rev und Tat, bevorzugt Letzteres.

Man kann auch das Tax-Protein von 1-HTLV oder 2-HTLV anführen.

Ebenfalls kann man insbesondere die externen Regionen an den basischen Regionen von Tat und Rev angeben, d. h. außerhalb der Regionen 49 bis 57 von Tat und 35 bis 50 von Rev, oder überlappend mit diesen Regionen über höchstens 4 Aminosäuren, bevorzugt höchstens 2 Aminosäuren, insbesondere des Peptids HQVSLSKQPTSQPRGD.

Unter "abgeleitet" oder "abzuleiten" von einem Regulationsprotein eines 1-HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2-HTLV-Virus versteht man, dass die immunogene Verbindung insgesamt oder aus einem Fragment des Regulationsproteins aufgebaut sein kann, und eine oder mehrere Modifikationen in den Aminosäuren dieses Proteins oder Fragments, wie Deletionen, Substitutionen, Additionen oder Funktionalisierungen, wie Amino säureacylierungen, in dem Umfang trägt, dass diese Modifikationen im oben präzisierten Rahmen bleiben (Fehlen von Toxizität, immunologische Charakteristika). Beispielsweise modifiziert im allgemeinen der Ersatz eines Leucin-Restes durch einen Isoleucin-Rest derartige Eigenschaften nicht. Die Modifikationen sollten allgemein weniger als 30% der Aminosäuren betreffen, bevorzugt weniger als 20% und insbesondere weniger als 10% auf den Homologiesegmenten am Regulationsprotein, mindestens 8 Aminosäuren, insbesondere mindestens 12 Aminosäuren. Ein Fragment kann z. B. 8 bis 60 Aminosäuren tragen, bevorzugt 12 bis 40 Aminosäuren und insbesondere 25 bis 40 Aminosäuren. Man kann beispielsweise die Reste 65 bis 80 am C-Terminus des Tat von 1-HIV nennen.

Unter den bevorzugten Bedingungen tragen die immunogenen Verbindungen der Erfindung mindestens 50% des gesamten Regulationsproteins, bevorzugt mindestens 70%, insbesondere mindestens 90%, und ganz besonders bevorzugt das gesamte oder fast das gesamte Protein.

Im allgemeinen kann man hinsichtlich der Modifikationen, der Homologie oder der Ähnlichkeit zwischen modifiziertem Immunogen und dem Protein oder einem Teil des nativen Proteins genauso wie den Dimensionen der immunogenen Verbindung und den Einzelheiten der Verwendung oder der Kopplung der erfindungsgemäßen immunogenen Verbindung an ein immunogenes Protein, wie das Tetanus-Toxoid, auf die WO-A- 86/06 414 oder die EP-A-0 220 273 oder auch die PCT/US 86/00831 verweisen, Äquivalente, deren Offenbarung hier durch Bezugnahme miteinbezogen wird.

Die erfindungsgemäßen immunogenen Verbindungen können wie folgt eingesetzt werden:

Man verabreicht einem Patienten eine erfindungsgemäße immunogene Verbindung, z. B. auf subkutanem oder intramuskulärem Weg, in einer ausreichenden Menge, um im therapeutischen Plan wirksam zu sein, an eine Person, die einer derartigen Behandlung bedarf.

Die verabreichte Dosis kann z. B. von 100 bis 1000 ug auf subkutanem Weg gehen, einmal pro Monat, während 3 Monaten, dann periodisch als Funktion des Gehalts der im Serum induzierten Antikörper, z. B. alle 2 bis 6 Monate.

Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann durch jeden herkömmlichen, beim Einsatz auf dem Gebiet der Impfstoffe üblichen Weg verabreicht werden, insbesondere auf subkutanem Weg, intramuskulärem Weg, intravenösem Weg oder oralem Weg. Die Verabreichung kann in einer Einzeldosis oder wiederholt einmal oder mehrmals nach einem bestimmten Zeitintervall erfolgen.

Daher bezieht sich das vorliegende Schutzrecht ebenfalls auf eine heilende oder vorbeugende, pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als aktiven Bestandteil eine immunogene Verbindung, wie sie oben definiert ist, umfaßt. Die immunogene Verbindung kann allein oder in Mischung mit einem pharmazeutischen akzeptablen Träger, wie einem Adjuvans, konditioniert werden.

Die Erfindung bezieht sich auch auf Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus den oben definierten immunogenen Verbindungen aufgebaut sind, nämlich den obigen immunogenen Verbindungen und ihre Verwendung in einem therapeutischen Behandlungsverfahren für den menschlichen oder tierischen Körper, genauso wie die Verwendung einer solchen immunogenen Verbindung für die Herstellung eines heilenden oder vorbeugenden Arzneimittels, bestimmt für die Behandlung oder die Vorbeugung schädigender Effekte der obigen Regulationsproteine und insbesondere des Tat. In der Tat haben die erfindungsgemäßen Verbindungen ihre toxischen Eigenschaften verloren und können daher dem Menschen verabreicht werden, wie nachfolgend im experimentellen Teil gezeigt.

Die Verabreichung der erfindungsgemäßen immunogenen Verbindungen entspricht einer aktiven Immuntherapie. Es kann ebenfalls von Interesse sein, eine passive Immunthera pie vorzunehmen, d. h., einem Patienten direkt die Antikörper zu geben, die er benötigt, um die schädigenden Effekte der Regulationsproteine der 1-HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2-HTLV-Viren zu neutralisieren.

Diese Anti-Regulationsprotein-Antikörper können auf klassische Weise erhalten werden und beispielsweise nach Immunisierung eines Säugers, Mensch oder Tier mit einer immunogenen Verbindung, wie sie oben definiert ist, durch Klonierung von Human-B- Lymphozyten, transformiert durch den Epstein-Barr-Virus, dann Wiedergewinnung der Antikörper, die erwartungsgemäß von den transformierten B-Lymphozyten sekretiert werden und schließlich genetische Rekombination, ausgehend von einer Phagen-Bibliothek.

Daher bezieht sich das vorliegende Schutzrecht auch auf Verfahren zur Herstellung von Anti-Regulationsprotein-Antikörpern eines 1-HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2-HTLV- Virus und insbesondere von Anti-Tat-Toxoidantikörpern, nämlich ein Herstellungsverfahren für obigen Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Säuger mit einer oben definierten immunogenen Verbindung immunisiert.

Das vorliegende Schutzrecht bezieht sich auch auf einen Anti-Regulationsprotein- Antikörper eines 1-HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2-HTLV-Virus und insbesondere polyklonale oder monoklonale Antikörper, erhalten ausgehend von immunisierten Menschen oder Säugern, indem man die oben beschriebenen Verfahren durchführt, mit Ausnahme eines Anti-Tat-Äntikörpers.

Diese spezifischen Antikörper können herrühren von:

1. entweder dem Subjekt selbst, induziert durch eine aktive Immunisierung (Impfung) mit einem biologisch inaktivierten aber immunogenen Regulationsprotein, insbesondere Tat. Eine solche immunogene Verbindung, beispielsweise im Falle von Tat, wird aufgrund der Analogie zu bakteriellen Toxoiden als Tat-Toxoid bezeichnet,

2. oder von einem fremden allo- oder xenogenen Organismus, einem Subjekt durch passive Immunisierung (Serotherapie) verabreicht. Die allogenen Antikörper (beim Menschen) können bei den freiwillig nicht infizierten Subjekten nach der aktiven Immunisierung (Impfung) mit einem immunogenen Protein oder seinen erfindungsgemäßen Derivaten, insbesondere dem Tat (erfindungsgemäßes Tat-Toxoid oder erfindungsgemäße Peptidfragmente von Tat), hervorgerufen werden. Diese passiv verabreichten Antikörper, seien sie allogen (menschlich) oder xenogen (tierisch), können komplette monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Fragmente F(ab')&sub2; oder F(ab) des Antikörpers sein.

Unter "Anti-Regulations-Antikörper" versteht man monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Fragmente F(ab')&sub2; oder F(ab) dieser Antikörper oder auch Anti- Regulationsprotein-Antikörper, erhalten durch Gentechnik, ausgehend von einer Phagen- Bibliothek.

Die allogenen Antikörper menschlichen Ursprungs sind:

- entweder polyklonal - diese können bei freiwillig mit einer erfindungsgemäßen immunogenen Verbindung immunisierten seronegativen Subjekten erhalten werden, insbesondere dem Tat-Toxoid oder Peptidfragmente von Tat;

- oder monoklonal, ausgehend von spezifischen Klonen der durch den EBV-Virus dieser immunisierten Individuen transformierten B-Zellen (spezifische B EBV- Linien).

Die xenogenen Antikörper stammen von mit einer erfindungsgemäßen immunogenen Verbindung hyperimmunisierten Tieren, insbesondere Tat oder seine Derivate (Tat- Toxoid, erfindungsgemäß detoxifizierte Peptidfragmente von Tat) und sind

- entweder polyklonal, herrührend von hyperimmunisierten Tieren,

- oder monoklonal, erhalten nach Hybridisierung gemäß der Technik von Kohler und Milstein von Milzzellen oder Adenozyten mit einer myelomatösen Linie, Typ x63, insbesondere x63AG3. In diesem Fall bevorzugt man Pferde- oder Kaninchen- Antikörper.

Das vorliegende Schutzrecht bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung von Anti-Regulationsprotein-Antikörpern eines 1-HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2-HTLV- Virus, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Säuger, Mensch oder Tier, mit einer oben definierten immunogenen Verbindung immunisiert.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Anti-Regulationsprotein-Antikörper eines 1-HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2-HTLV-Virus, dadurch gekennzeichnet, dass man B-Zellen einsetzt, herrührend von einem mit einer erfindungsgemäßen immunogenen Verbindung immunisierten Individuum, wobei die B-Zellen durch den EBV-Virus transformiert wurden, und Erzeugen der spezifischen Anti-Regulationsprotein-Antikörper eines 1-HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2-HTLV-Virus.

Die obigen EBV+-Zellen können derart kultiviert werden, dass sie die erwarteten Antikörper erzeugen. Diese Zellen stammen, wie man sehen wird, insbesondere von durch ein natives Regulationsprotein oder eine erfindungsgemäße immunogene Verbindung immunisierten Erkrankten.

Das vorliegende Schutzrecht bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen erfindungsgemäßen Antikörpern, die gegen ein inaktiviertes oder aktiviertes Regulationsprotein eines 1-HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2-HTLV-Virus gerichtet sind, dadurch gekennzeichnet, dass man das Säugerhybridom, insbesondere von Mäusen, herstellt, ausgehend von Splenozyten oder Adenozyten, insbesondere mit durch ein natives Regulationsprotein oder eine erfindungsgemäße immunogene Verbindung immunisierten Mäusen und Myelomzellen, bevorzugt der x63-Linie, nach den im Stand der Technik gut bekannten Verfahren (Kohler und Milstein).

Das vorliegende Schutzrecht bezieht sich ebenfalls auf ein Verfahren zum Erhalt von Anti-Regulationsprotein-Antikörpern eines 1-HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2-HTLV- Virus durch gentechnische Rekombination, dadurch gekennzeichnet, dass man als Immunogen eine oben definierte immunogene Verbindung einsetzt.

Das vorliegende Schutzrecht bezieht sich auch auf die Fragmente F(ab')&sub2; oder F(ab) dieser Antikörper. Diese können beispielsweise durch enzymatische Verdauung erhalten werden.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich gleichermaßen auf ein Verfahren zur passiven Immunisierung von mit dem HIV-Virus kontaminierten Subjekten unter Verwendung der spezifischen Anti-Regulationsprotein-Antikörper für die Vermehrung des HIV-Virus und insbesondere Anti-Tat, das die schädigenden Effekte dieses Proteins in seiner extrazellulären Konfiguration neutralisiert oder blockiert und wie angegeben hergestellt wird, oder die Fragmente F(ab')&sub2; oder F(ab) dieser Antikörper.

Das vorliegende Schutzrecht bezieht sich ebenfalls auf ein aktives Anti-HIV- oder Aids- Immunisierungsverfahren unter Verwendung einer oben beschriebenen immunogenen Verbindung, assoziiert an ein konstitutives Protein (oder Struktur-Protein) eines HIV- Virus, insbesondere das Umhüllungsglykoprotein gp 120 oder gp 160, oder ein modifi ziertes oder nicht modifiziertes Peptidfragment von diesen oder einen inaktivierten HIV- Virus oder einen von seiner genomischen RNA, z. B. durch alkalische Hydrolyse, depletierten HIV-Virus.

Die Erfindung bezieht sich auch auf ein aktives Anti-HIV oder Aids-Immunisierungsverfahren unter Verwendung einer oben beschriebenen immunogenen Verbindung, assoziiert an ein oder mehrere Immunogene auf Basis von inaktivierten Cytokinen und speziell α-Interferon, β-TGF oder TNF. In der Tat, wie man im nachfolgenden experimentellen Teil sieht, stellt eine Kombination der Effekte der erfindungsgemäßen Antikörper gegenüber den Regulationsproteinen und den Anti-α-Interferon-Antikörpern im Speziellen vollständig die durch HIV induzierte Immunsuppression wieder her.

Daher bezieht sich das vorliegende Schutzrecht ebenfalls auf eine Zusammensetzung, umfassend zwei immunogene Verbindungen, nämlich eine oben beschriebene immunogene Verbindung und eine immunogene Verbindung, die in der Lage ist, gegen ein Cytokin, wie α-Interferon oder α-TNF, Antikörper zu induzieren, wie beispielsweise in der WO-A-91 18 454 beschrieben, und ebenfalls auf eine Zusammensetzung, umfassend einen gegen ein Cytokin gerichteten Antikörper, insbesondere α-Interferon, und einen der obigen, gegen ein Regulationsprotein gerichteten Antikörper.

Das vorliegende Schutzrecht bezieht sich auch auf ein aktives Immunisierungsverfahren, dadurch gekennzeichnet, dass man als Immunogen eine oben definierte immunogene Verbindung einsetzt, assoziiert an ein mineralisches, ölhaltiges oder synthetisches Immunitätsadjuvans, oder auch eine immunogene Verbindung, wie sie oben definiert ist, gekoppelt oder assoziiert an ein Protein, das die Immunogenität erhöht.

Diese Immunisierungen können genauso heilend wie vorbeugend verwirklicht werden.

Als Immunogen für sämtliche obigen und nachfolgenden Verfahren setzt man bevorzugt ein Derivat des Tat-Proteins ein.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Hyperimmunisierung von Subjekten, die 1-HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2-HTLV-seronegativ oder - seropositiv sind, dadurch gekennzeichnet, dass man ein wie oben definiertes Immunogen für die Herstellung von hyperimmunen Humanseren, die insbesondere für die passive Serotherapie bestimmt sind, durch Verabreichung von gereinigten spezifischen Antikörpern oder ihren Fragmenten F(ab')&sub2; oder F(ab) einsetzt.

Die Erfindung bezieht sich zudem auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als aktiven heilenden oder vorbeugenden Bestandteil mindestens einen Anti- Regulationsprotein-Antikörper eines oben definierten Virus oder erhalten nach den obigen Verfahren.

Die Erfindung bezieht sich schließlich auf die Verwendung einer immunogenen Verbindung oder eines obigen Antikörpers für die Herstellung eines Arzneimittels, bestimmt zur Behandlung schädigender Effekte eines Regulationsproteins eines 1-HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2-HTLV-Virus.

Insgesamt bezieht sich die vorliegende Erfindung insbesondere auf die vorbeugende oder heilende Verwendung bei seropositiven oder mit ARC/Aids durch spezifische Antikörper befallenen Subjekten, um die schädliche Wirkung eines Regulationsproteins eines 1-HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2-HTLV-Virus und insbesondere des Zirkulations-Tat zu blockieren. Diese spezifischen Antikörper können stammen von: 1. dem Subjekt selbst, induziert durch eine aktive Immunisierung (Impfung) mit dem biologisch inaktivierten aber immunogenen Tat, bezeichnet als Tat-Toxoid, aufgrund der Analogie mit bakteriellen Toxoiden oder 2. einem fremden, allo- oder xenogen Organismus, dem Subjekt durch passive Immunisierung (Serotherapie) verabreicht. Die allogenen Antikörper (beim Menschen) können von freiwillig nicht infizierten Subjekten nach der aktiven Immunisierung (Impfung) mit einem Regulationsprotein, wie Tat oder seinen Derivaten (erfindungsgemäßen Tat-Toxoid oder erfindungsgemäße Tat-Peptidfragmente), stammen. Diese passiv verabreichten Antikörper, die allogen (menschlich) oder xenogen (tierisch) sind, können komplette monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Fragmente F(ab')&sub2; oder F(ab) des Antikörpers sein.

Unter Tat-Toxoid, wie oben angegeben, versteht man ein Tat-Peptid oder -Protein, behandelt mit einem chemischen Agens. Die Behandlung führt zum Verlust der biologisch toxischen Eigenschaften im Molekül des Zirkulations-Tat (Immunsuppression der T- Zellen, Induktion der α-Interferon-Produktion durch Interferon-Produktionszellen, Neoangiogenese der Endothelialzellen, Blockierung des antiviralen Effekts von Interferon auf die Makrophagen), aber die Eigenschaften, die für die Induzierung der Bildung von Antikörpern verantwortlich sind, bleiben erhalten, wenn sie in geeigneter Art und Weise geliefert und hergestellt, an einen "Träger" gekoppelt oder nicht, aggregiert oder nicht, in Gegenwart eines Adjuvans oder nicht vorliegen.

Man hat den Begriff des Tat-Toxoids auf die immunogenen Peptidfragmente des Tat ausgedehnt, d. h. eine Peptid-Sequenz des Tat, die für die Induktion der Bildung von Anti-Tat-Antikörpern geeignet ist, wenn sie auf geeignete Art und Weise geliefert, an einen Träger gekoppelt oder nicht und in Gegenwart eines Adjuvans oder nicht vorliegen. Die Erfindung bezieht sich auch auf die pharmazeutischen Zusammensetzungen.

a) Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als heilendes oder vorbeugendes Mittel ein virales Toxoid oder ein Fragment oder ein Analogon eines Regulationsproteins, insbesondere des erfindungsgemäßen Tat.

b) Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als heilendes oder vorbeugendes Mittel Anti-Tat-Antikörper, hergestellt ausgehend von gegen das erfindungsgemäße Protein oder seine Fragmente F(ab')&sub2; oder F(ab) immunisierte Organismen.

Zudem schlägt die Erfindung auch ein Kit vor, umfassend eine pharmazeutische Vaccinzusammensetzung, die außer dem aktiven Bestandteil (Tat-Toxoid oder seine Derivate oder Anti-Tat-Antikörper) ein Adjuvans und/oder ein anderes Immunogen mit antiretroviralen Eigenschaften umfassen kann.

Schließlich schlägt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung in herkömmlicher galenischer Form vor. Insbesondere ist der erfindungsgemäße aktive Bestandteil in ausreichenden Mengen vorhanden, um im Hinblick auf die Therapie mit einem Verdünnungsmittel oder einem verträglichen Träger vom pharmazeutischen Gesichtspunkt aus wirksam zu sein.

EXPERIMENT 1: Pathogene Effekte des Tat-Zirkulationsproteins:

Immunsuppression der T-Zellen in Gegenwart von Tat:

Die Wirkung von Tat auf aktivierte T-Lymphozyten des peripheren Bluts wurden untersucht. Mononukleierte Zellen (PMBC) und T-Lymphozyten (HLA 35 DR-), durch Immunmagnetismus isoliert, wurden durch Anti-CD&sub3;-Antikörper in Gegenwart oder bei Fehlen des Tat-Moleküls aktiviert. Nach 5 Tagen in Kultur wurde die zelluläre Proliferation durch Zugabe von H&sub3;-Thymidin gemessen. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass das Tat die Proliferation der T-Zellen HLA DR-inhibierte (85% Inhibition bei der Konzentration von 1,5 ug pro ml). Diese Inhibierung verschwand in Gegenwart des spezifischen Anti-Tat-Antikörpers (Intracel, U. K.).

EXPERIMENT 2: Pathogene Effekte des Tat-Zirkulationsproteins:

Inhibierungseffekt von Interferon auf die Makrophagen in Gegenwart von Tat:

Der Effekt von Tat auf die antivirale Wirkung des α-Interferons wurde durch einen herkömmlichen biologischen Test unter Verwendung des Grads der cytopathogenen Wirkung des VSV-Virus auf die MDBK-Zellen gemessen.

Effekt des Tat auf exogenes Interferon

Man ließ zunehmende Dosierungen von Tat schon bei schwachen Konzentrationen einer Dosiswirkungskurve folgend für Konzentrationen des Tat von 1 bis 20 ug/ml die antivirale Wirkung des exogenen Interferons inhibieren. In einem repräsentativen Beispiel wurde der Protektoreffekt des α-Interferons, der bis zu einer Verdünnung von 1/4800 (entsprechend 150 U. I.) auftrat, auf eine Verdünnung 1/300 bei Konzentrationen des Tat von 10 ug/ml reduziert. So ging bei einer Konzentration von 10 ug/ml Tat bei einer Verdünnung des exogenen Interferons von 4800 der Titer des VSV-Virus von 103.8 (Interferonproben ohne Tat) auf 105,5 (Interferonproben in Gegenwart von Tat) über. In diesen Beispielen wurde der Inhibitoreffekt des antiviralen α-Interferons durch das Tat-Molekül in Gegenwart spezifischer Anti-Tat-Antikörper (Intracel, U. K.) genauso wie durch die Pferde-Antikörper, die wir hergestellt haben (siehe nachfolgende Beispiele), unterdrückt.

EXPERIMENT 3: Beleg für die durch den 1-HIV des Tat-Proteins in seiner extrazellulären Konfiguration infizierte Subjekte

Gegenwart von Anti-Tat-Antikörpern im Serum von seropositiven Patienten:

a) Es wurde bei 50 seropositiven und 15 seronegativen Patienten eine Elisa-Studie der Anti-Tat-Antikörper im Serum unter Verwendung des nativen Tat-Moleküls als Antigen durchgeführt. Sämtliche Seren der seronegativen Patienten und 20 Seren der seropositiven zeigten mit einer optischen Dichte unterhalb des Schwellenwerts (cut off) (O. D. = 0,250) keine Gegenwart von Anti-Tat-Antikörpern. Von den mit HIV infizierten 30 Patientenseren, die den Schwellenwert überschritten, hatten 6 eine O. D. oberhalb von 0,500. Es konnte keine offensichtliche Korrelation zwischen der Gegenwart von Anti-Tat-Antikörpern einerseits und dem klinischen Zustand und der Zahl der CD4-Zellen pro mm³ Blut andererseits hergestellt werden.

b) Es wurde bei seropositiven Patienten in verschiedenen Entwicklungsstadien ihrer HIV-Infektion - asymptomatischen Patienten, Patienten, die klinische Erscheinungsbilder von Aids-Vorstadien (ARC) zeigten, und Patienten, bei denen Aids ausgebrochen war, eine Elisa-Studie von Anti-Tat-Antikörpern im Serum unter Verwendung verschiedener Tat-Peptide als Antigene durchgeführt. Die Resultate dieser Studien sind die folgenden:

1) Die Tat-Peptidsequenzen

MEPVDPRLEPWKHPG (Reste 1 bis 15 am N-Terminus) HQVSLSKQPTSQPRGD (Reste 65 bis 80 am C-Terminus) wurden durch die große Mehrheit der seropositiven Seren und keines der seronegativen Seren (Kontrollen) erkannt. Die Reaktionen waren stark positiv, aber es konnte in Bezug auf die Entwicklung der HIV-Infektion und die Zahl der CD4 der Patienten keine Korrelation aufgezeigt werden.

2) Die anderen untersuchten Sequenzen wurden nicht merklich durch die Seren erkannt, die von seropositiven oder Kontrollindividuen (siehe Tabelle 1) stammten. Einzig einige wenige Seren zeigten für jede Sequenz eine optische Dichte oberhalb des Schwellenwerts (der 2-fache Durchschnitt der Kontrollseren).

TABELLE 1

* Mit HIV infizierte Patienten befanden sich in unterschiedlichen Stadien, asymptomatische Patienten und von ACR befallene Patienten, von Aids befallene Patienten.

** Die Reaktion wurde als positiv angesehen (Schwellenwert), wenn die optische Dichte zweimal so hoch wie der Durchschnitt der seronegativen war.

3) Es ist interessant festzustellen, dass die reaktivste Sequenz (AA 65-80) diejenige ist, die die durch die Integrine erkannten RGD-Reste enthält.

BEISPIEL 1: Herstellung von immunogenem Tat-Protein (Tat-Toxoid) Inaktivierung des Tat-Proteins in Gegenwart von Formaldehyd

Zu einer Tat-Lösung (1 mg/ml) in Dinatriumphosphat, 70 mM, pH 8,0, wird Formaldehyd bis zu einer Endkonzentration von 33 mM zugegeben.

Die Mischung wird bei 37ºC während 1, 3, 5, 7 und 9 Tagen inkubiert. Am Ende jeder Inkubationsperiode wird eine Probe genommen, und die Reaktion mit dem Formaldehyd durch Zugabe von Glycin bis zu einer Endkonzentration von 100 mM abgebrochen.

Jede Entnahme wird für 1 Nacht bei 4ºC gegen das 100-fache Volumen PBS (Phosphatsalzpuffer) dialysiert.

BEISPIEL 2: Herstellung von immunogenem Tat-Protein (Tat-Toxoid) Inaktivierung des Tat-Proteins in Gegenwart von Glutaraldehyd

Zu einer Tat-Lösung (1 mg/ml) in Dinatriumphosphat, 70 mM, pH 8,2, gibt man Glutaraldehyd bis zu einer Endkonzentration entweder von 0,026 M oder 0,0026 M. Man läßt die Reaktion mit Glutaraldehyd während verschiedenen Zeitspannen, variierend von 1 Minute bis 3 Stunden, ablaufen. Nach Verstreichen der ausgewählten Reaktionszeit bei Laboratoriumstemperatur wird die Reaktion durch Zugabe von Glycin bis zu einer Endkonzentration von 100 mM abgebrochen. Die verschiedenen Entnahmen werden 16 Stunden bei 4ºC gegen das 100-fache Volumen PBS dialysiert.

BEISPIEL 3: Herstellung von immunogenem Tat-Protein (Tat-Toxoid) Inaktivierung und simultane Kopplung des Tat an Tetanus-Toxin

Zu einer Mischung von Tetanus-Toxin und Tat in einem molaren Verhältnis von 1 bis 15 in einem Phosphatpuffer mit 70 mM bis 100 mM (der pH-Wert variiert von 6,8 bis 8,2) gibt man Glutaraldehyd bis zu einer Endkonzentration zu (variierend von 0,0026 M bis 0,026 M) und läßt die Inaktivierung und Kopplungsreaktion für variable Zeitspannen (3 bis 15 Minuten) bei Laboratoriumstemperatur ablaufen. Die Reaktion wird durch Zugabe von Glycin bis zu einer Endkonzentration von 100 mM abgebrochen, und die verschiedenen Entnahmen werden 16 Stunden bei 4ºC gegen das 100-fache Volumen PBS dialysiert.

BEISPIEL 4: Antigene und immunogene Wirkung von Tat-Toxoiden Immunogenes Tat-Toxoid bei der Maus: Antikörper nach Elisa

Die immunogene Wirkung verschiedener Zubereitungen von inaktiviertem Tat, entweder durch Formaldehyd (Tat-Toxoid) oder durch Glutaraldehyd (Tat-Polan) oder durch Kopplung an Tetanus-Toxin (konjugiertes Tat-Tetanus-Toxin), d. h. die immunogenen Verbindungen der Beispiele 1 bis 3, wurden bei der Maus bestimmt.

Swiss-Mäuse von 18 bis 20 g wurden mit 2 subkutanen Injektionen des Immunogens der Beispiele 1, 2 und 3 in Gegenwart von komplettem Adjuvans von Freund immunisiert, wobei die zweite 3 Wochen nach der ersten mit 20 ug-Zubereitung in Emulsion und in Gegenwart des inkompletten Adjuvans von Freund durchgeführt wurde.

15 Tage nach der wiederholten Impfung wurden die Blutentnahmen auf intrakardialem Weg durchgeführt. Die Anti-Tat-Antikörper wurden in den Seren mit Elisa bestimmt. Die optische Dichte wurde bei 490 nm gemessen.

Die erhaltenen Ergebnisse, in Tabelle 2 zusammengefaßt, zeigen, dass sämtliche Tat- Zubereitungen in verschiedenem Grad immunogen sind, außer dem Tat-TT-Konjugat, das für eine kurze Zeitspanne (3 Minuten) mit Glutaraldehyd behandelt wurde, sich als toxisch erwies und die Mäuse in 24 Stunden tötete (TT zu schwach inaktiviert). Es hat sich gezeigt, dass die Seren der nicht-immunisierten Mäuse unterhalb von 0,200 (O. D.) auf natives Tat als Tat-Toxoid reagierten. Zudem zeigen diese Ergebnisse, dass natives Tat durch die Antikörper in gleicher Art und Weise wie das Toxoid erkannt werden, was ihr antigenes Äquivalent bestätigt und auch die Verwendung von Tat-Toxoid zur Immunisierung rechtfertigt.

TABELLE 2

BEISPIEL 5: Starke Toxizität

Die Toxizität der Tat-Toxoid- und Tat-Polan-Zubereitungen wurde durch subkutane Injektion bei Swiss-Mäusen von 18 bis 20 g bestimmt. Die Tat-Toxoid(7 Tage)- und Tat- Polan(15 min. 0,026 M)-Zubereitungen wurden als Dosierungen mit 100 ug pro Maus verabreicht. Die Tiere wurden über 7 Tage beobachtet.

Kein sichtbares Zeichen von Toxizität wurde beobachtet. Das Gewicht der Tiere nahm weiter zu. Eine makroskopische Untersuchung der Organe bei der Autopsie zeigte keinerlei Anomalien.

BEISPIEL 6: Anti-Tat-Antikörper

Anti-Tat-Antikörper wurden wie folgt hergestellt: man isolierte die IgG-Fraktion auf einer G-Proteinsäule, ausgehend von mit Tat-Polan immunisierten Mäuseseren. Die Fragmente F(ab')&sub2; wurden ebenfalls ausgehend von der isolierten IgG-Fraktion durch Pepsin-Verdauung hergestellt. Die immunologische Reaktivität dieser Fraktionen wurde mit Elisa verifiziert.

BEISPIEL 7: Biologische Inaktivierung von Tat-Toxoid

Die 1, 3, 5 und 9 Tage inaktivierten verschiedenen Tat-Toxoide von Beispiel 1 wurden in einem Aktivierungstest für die Expression des Reportergens, Chloramphenicol-Acetyl- Transferase (CAT), abhängig vom "Long Terminal Repeat" (LTR) des 1-HIV getestet.

Das Prinzip dieses Versuchs ist das folgende: die Zellen der Hela-Linie, enthaltend das CAT-Gen unter Kontrolle des LTR von HIV, wurden mit den nativem Tat oder den Toxoiden für 6 Stunden in Kontakt gebracht. Nach 24 Stunden in Kultur wurden die Zellen lysiert, und die Menge des hergestellten CAT durch einen Aktivitätstest auf CAT gemessen, der den Prozentsatz von an Chloramphenicol angelagertem Acetyl-CoA misst. Wenn das Tat-Molekül aktiv ist, gibt es einen großen Prozentsatz von acetyliertem Chloramphenicol, ansonsten ist der Prozentsatz gering. Die Kultur dieser adherierten Zellen ergibt sich im Standardmilieu RPMI, 10% FCS. Die zugegebene Tat- Konzentrativn für eine Dosis-Wirkung liegt bei 1 ug bis 10 ug pro ml Überstand.

Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen, dass das Tat-Toxoid nach 3 Tagen absolut inaktiviert ist, mit einer schwachen Restaktivität am ersten Tag.

Zubereitungen Acetylierung von Chloramphenicol (%)

Natives Tat 100

Tat-Toxoid (1 Tag) 18

Tat-Toxoid (3 Tage) 3

Tat-Toxoid (5 Tage) 2

Tat-Toxoid (9 Tage) 3

BEISPIEL 8: Das Fehlen pathogener Effekte des Tat-Toxoids a) Das Fehlen der Immunsuppression von T-Zellen in Gegenwart von Tat-Toxoid (im Gegensatz zu den Experimenten 1 und 2)

Der Effekt des Tat-Toxoids (5 Tage) auf aktivierte T-Lymphozyten des peripheren Bluts wurde untersucht. Die mononukleierten Zellen (PMBC) und die T- Lymphozyten (HLA 35 DR-), isoliert durch Immunmagnetismus, wurden durch die Anti-CD&sub3;-Antikörper in Gegenwart oder bei Fehlen der immunogenen Verbindungen von Beispiel 1 aktiviert. Nach 5 Tagen in Kultur wurde die zelluläre Proliferation durch Zugabe von H&sub3;-Thymidin gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass im Gegensatz zu nativem Tat das Tat-Toxoid die Proliferation der T-Zellen HLA DR- nicht inhibierte. So war bei einer Dosierung von 5 ug/ml in der Kultur in Gegenwart von Tat-Toxoid die Proliferation der Zellen identisch mit derjenigen der Kontrolle.

b) Fehlen der Inhibitorwirkung des α-Interferons auf die Makrophagen in Gegenwart von Tat-Toxoid:

Der Effekt von Tat-Toxoid auf die antivirale Wirkung von α-Interferon wurde durch einen herkömmlichen biologischen Test gemessen, unter Verwendung des Grads der cytopathogenen Wirkung des VSV-Virus auf die MDBK-Zellen.

Effekt des Tat-Toxoids auf exogenes Interferon

Im Gegensatz zu nativem Tat ermöglichen äquivalente Dosierungen des Tat-Toxoids von Beispiel 1 die Inhibierung der antiviralen Wirkung von exogenem Interferon nicht. In einem repräsentativen Experiment wurde der Protektoreffekt des α-Interferons, der bis zu einer Verdünnung von 1/4800 (entsprechend 150 U. I.) auftrat in Gegenwart von 50 ug Tat-Toxoid beibehalten, während er mit nativem Tat bis auf 1/300 verringert wurde. Bei der Verdünnung 4800 von exogenem Interferon wird der Titer des VSV auf dem Niveau der Kontrolle von 103.8 (Interferonproben mit Tat-Toxoid) beibehalten, während er im anderen Falle auf 103.8 (Interferonproben in Gegenwart von Tat) übergeht.

BEISPIEL 9: Protektorrolle der Anti-Tat-Toxoid-Antikörper gegenüber den Effekten des nativen Tat

Anti-Tat-Toxoid-Antikörper des Experiments 1 (Behandlung mit Formaldehyd für 3 Tage) wurden bei hyperimmunisierten Pferden hergestellt. Ausgehend von diesen Antikörpern wurden die Fragmente F(ab')&sub2; nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren hergestellt.

Die Antikörper, wie die Fragmente F(ab')&sub2;, inhibieren die verschiedenen biologischen Aktivitäten des nativen Tat in den verschiedenen Tests: Transaktivierung des LTR von HIV (CAT-Versuch) (siehe Beispiel 7), Immunsuppression (siehe Experiment 1), Inhibitoreffekt des exogenen α-Interferons in Kultur (siehe Experiment 2). Die Experimente 1, 2 und Beispiel 7 wurden mit nativem Tat und mit oder ohne Vorinkubierung dieses nativen Tat für 1 Stunde bei 37ºC mit den Antikörpern oder Fragmenten F(ab')&sub2; bei einer Dosierung von 40 ug Antikörper für 1 ug natives Tat wiederholt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Antikörper die Wirkung des nativen Tat inhibieren.

BEISPIEL 10: Systematische Verbesserung der zellulären Proliferation dank der Kombination Anti-Tat-Antikörper und Anti-α-Interferon- Antikörper: Zusammenwirken der Anti-Tat-Antikörper und des Anti-α-Interferons

Man hat beobachtet, dass PBLs (mononukleierte Zellen des peripheren Bluts) von Patienten ohne in vitro-Infizierung mit 1-HIV und 6 Tage-Kultivieren eine immunoexpressive Aktivität auslösten.

Wenn man solche 6 Tage-infizierte Zellen (oder nicht infizierte Zellen) zufügt, die im Verhältnis 1 : 5 mit durch das Staphylococcus Enterotoxin B-Protein (SEB) aktivierten, autologen Zellen bestrahlt, beobachtet man in der Tat nach 4 Tagen, dass die Proliferation der autologen Zellen im Vergleich zu den Kontrollen (nicht infizierten Zellen) um 80% vermindert wird.

Wenn man in diesem Modell zu der Kultur der in vitro infizierten Zellen α-Interferon- Antikörper zugibt, verlieren diese Zellen demnach bei 50% der Patienten ihre Suppressorwirkung. Bei 20% der Fälle verlieren die suppressiven Zellen 60% ihrer Suppressorwirkung und bei 30% wird dieser Suppressoreffekt signifikant aufrechterhalten.

Wenn man zu den Anti-α-Interferon-Antikörpern Anti-Tat-Antikörper zugibt (monoklonal, wie sie in Experiment 1 beschrieben sind, oder polyklonal vom Pferd nach Beispiel 9), verlieren in 100% der Fälle die in vitro infizierten Zellen ihre Suppressorwirkung.

Diese Experimente zeigen die zusammenhängende toxische Rolle von Tat und α- Interferon bei der Immunsuppression, hervorgerufen durch 1-HIV, und dass eine Assoziation von Anti-Interferon- und Anti-Tat-Antikörper eine normale Immunität wiederherstellt.

BEISPIEL 12: Herstellung des immunogenen Nef-Proteins (Nef-Toxoid) Inaktivierung des Nef-Proteins in Gegenwart von Formaldehyd

Zu einer Lösung von Nef-Protein (1 g/ml) in Dinatriumphosphat, 70 mM, pH 8,0, gibt man Formaldehyd bis zu einer Endkonzentration von 33 mM zu.

Die Mischung wird bei 37ºC während 1, 3, 5, 7 und 9 Tagen inkubiert. Am Ende jeder Inkubationsperiode wird eine Probe genommen, und die Reaktion mit Formaldehyd durch die Zugabe von Glycin bis zu einer Endkonzentration von 100 mM abgebrochen.

Jede Entnahme wird für 1 Nacht bei 4ºC gegen das 100-fache Volumen PBS (Phosphatsalzpuffer) dialysiert, und das Nef-Toxoid isoliert.

BEISPIEL 13: Herstellung des immunogenen Nef-Proteins (Nef-Polan) Inaktivierung des Nef-Proteins in Gegenwart von Glutaraldehyd

Zu einer Nef-Lösung (1 mg/ml) in Dinatriumphosphat, 70 mM, pH 8,2, gibt man Glutaraldehyd bis zu einer Endkonzentration entweder von 0,026 M oder von 0,0026 M zu. Man läßt die Reaktion mit Glutaraldehyd für verschiedene Zeitspannen, variierend von 1 min bis 3 h, ablaufen. Nach Verstreichen der ausgewählten Reaktionszeit bei Laboratoriumstemperatur wird die Reaktion durch Zugabe von Glycin bis zu einer Endkonzen tration von 100 mM abgebrochen. Die verschiedenen Entnahmen werden 16 Stunden bei 4ºC gegen das 100-fache Volumen von PBS dialysiert und das Nef-Polan wird isoliert.

BEISPIEL 14: Immunogene und antigene Wirkungen der Nef-Toxoide Immunogenes Nef-Toxoid bei der Maus: Antikörper nach Elisa

Die immunogene Wirkung verschiedener Zubereitungen von entweder mit Formaldehyd (Nef-Toxoid) oder mit Glutaraldehyd (Nef-Polan) inaktiviertem Nef, d. h. die immunogenen Verbindungen der Beispiele 12 und 13, wurden bei der Maus bestimmt.

Swiss-Mäuse von 18 bis 20 g wurden durch zwei subkutane Injektionen mit dem Immunogen der Beispiele 12 und 13 in Gegenwart des Adjuvans von Freund immunisiert. Die zweite wurde 3 Wochen nach der ersten mit 20 um einer Zubereitung in Emulsion in Gegenwart des inkompletten Adjuvans von Freund durchgeführt.

15 Tage nach der wiederholten Injektion wurden die Blutabnahmen auf intrakardialem Weg durchgeführt. Die Anti-Nef-Antikörper wurden in den Seren mit Elisa bestimmt. Die optische Dichte wurde bei 490 nm gemessen.

Der erhaltenen Ergebnisse, in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst, zeigen, dass sämtliche Nef-Zubereitungen in verschiedenem Grad immunogen sind. Es ist darauf hinzuweisen, dass die nicht-immunisierten Mausseren in diesen Elisa-Versuchen ein Reaktionsniveau unterhalb von 0,2 (in O. D.) ergaben.

Diese Ergebnisse zeigen, dass das native Nef-Protein durch die Antikörper in derselben Art und Weise wie das Toxoid erkannt wird, was ihre antigene Äquivalenz bestätigt und auch die Verwendung von Nef-Toxoid zur Immunisierung rechtfertigt.

SEQUENZLISTE

(i) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) DEPONENT:

(A) Name: NEOVACS

(B) Straße: 117, nie Vieille du Temple

(C) Stadt: Paris

(E) Land: Frankreich

(F) Postleitzahl : 75003

(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Neue Immunogene von neuen Antikörpern, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen

(iii) ZAHL DER SEQUENZEN: 1

(iv) FÜR DEN COMPUTER LESBARE FORM:

(A) Trägertyp: Floppy Disk

(B) Computer: IBM PC-kompatibel

(C) Auswertungssystem: PC-DOS/MS-DOS

(D) Software: Patentln Release # 1,0,

Version # 1,25

(EPA)

(2) INFORMATION FÜR DIE SEQUENZ ID NR. 1:

(i) CHARAKTERISTIKA DER SEQUENZ:

(A) Länge: 16 Aminosäuren

(B) Typ: Aminosäure

(C) Zahl der Stränge: einfach

(D) Konfiguration: linear

(ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid

(xi) DARSTELLUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 1:


Anspruch[de]

1. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine dem Menschen verabreichbare detoxifizierte immunogene Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass die immunogene Verbindung von einem Regulationsprotein eines 1-HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2- HTLV-Virus oder einem seiner Peptidfragmente durch chemische Behandlung oder durch Kopplung mit einem Trägerprotein, aktiviert durch eine Vorbehandlung mit einem Aldehyd, abgeleitet ist, was die Wiedererkennung durch Antikörper, die gegen das native Regulationsprotein gerichtet sind und die Aufrechterhaltung von ausreichenden immunogenen Eigenschaften ermöglicht, um Antikörper zu erzeugen, die das native Protein neutralisieren oder blockieren, während mindestens 50% der toxischen biologischen Eigenschaften des nativen Proteins verloren gehen.

2. Immunogene Verbindung, definiert nach Anspruch 1, zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren für den menschlichen oder tierischen Körper.

3. Immunogene Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie von einem der nachfolgenden Regulationsproteine abgeleitet ist: Nef, Tat, Vif oder Rev der 1- HIV- oder 2-HIV-Viren.

4. Immunogene Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Fragment des Proteins Tat ist oder davon abgeleitet ist.

5. Immunogene Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie von einem Protein Tax eines 1-HTLV- oder 2-HTLV-Virus abgeleitet ist.

6. Immunogene Verbindung nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie von einem Regulationsprotein eines 1-HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2-HTLV-Virus durch chemische Behandlung abgeleitet ist.

7. Immunogene Verbindung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Behandlung eine Behandlung mit einem Aldehyd darstellt.

8. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers für ein Antiregulationsprotein eines 1-HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2- HTLV-Virus, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Säugetier mit einer immunogenen Verbindung, definiert nach einem der Ansprüche 1 bis 7, immunisiert.

9. Verfahren zur Herstellung eines Antikörper für ein Antiregulationsprotein eines 1-HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2- HTLV-Virus, dadurch gekennzeichnet, dass man B-Lymphozyten kloniert, die von einem Subjekt stammen, das mit einer immunogenen Verbindung, definiert nach einem der Ansprüche 1 bis 7, immunisiert wurde, Transformieren mit dem Epstein-Barr-Virus, und dann Wiedergewinnen der Antikörper, die erwartungsgemäß von den transformierten B-Lymphozyten sekretiert werden.

10. Verfahren zur Herstellung eines Antiprotein-Tat- Antikörpers eines 1-HIV- oder 2-HIV-Virus nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man B-Lymphozyten kloniert, die von einem Subjekt stammen, das mit einer immunogenen Verbindung, definiert nach einem der Ansprüche 1 bis 7, immunisiert wurde, Transformieren mit dem Epstein-Barr-Virus, und dann Wiedergewinnen der Antikörper, die erwartungsgemäß von den transformierten B-Lymphozyten sekretiert werden.

11. Verfahren zur Herstellung eines Antiprotein-Tax- Antikörpers eines 1-HTLV- oder 2-HTLV-Virus nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man B-Lymphozyten kloniert, die von einem Subjekt stammen, das mit einer immunogenen Verbindung, definiert nach einem der Ansprüche 1 bis 7, immunisiert wurde, Transformieren mit dem Epstein-Barr-Virus, und dann Wiedergewinnen der Antikörper, die erwartungsgemäß von den transformierten B-Lymphozyten sekretiert werden.

12. Verfahren zur Herstellung eines Fragments F(ab')&sub2; oder F(ab) eines Antikörpers, hergestellt nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass man vorgeht wie nach einem der Ansprüche 8 bis 11 und außerdem den erhaltenen Antikörper einem enzymatischen Verdauen unterzieht.

13. Antikörper für ein Antiregulationsprotein eines 1- HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2-HTLV-Virus, erhalten durch Immunisieren eines Säugetiers mit einer immunogenen Verbindung, definiert nach einem der Ansprüche 1 bis 7, ausgenommen ein Anti-Tat-Antikörper.

14. Fragment F(ab')&sub2; oder F(ab) eines Antikörpers nach Anspruch 13.

15. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Antikörper, definiert nach einem der Ansprüche 13 und 14, umfaßt.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine immunogene Verbindung, definiert nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfaßt, die an ein Protein Gag, Pol oder Env eines 1-HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2-HTLV-Virus assoziiert ist.

17. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine immunogene Verbindung, definiert nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfaßt, die an ein Protein gp120/gp160, das nativ oder durch physikalische, chemische, genetische oder immunologische Behandlung inaktiviert ist, oder an eine Peptidiraktion dieses Proteins, modifiziert oder nicht, assoziiert ist.

18. Vakzinzusammensetzung, umfassend

- eine immunogene Verbindung, definiert nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und

- eine immunogene Verbindung, die ein Cytokin ist, das in einer von seiner nativen Form unterschiedlichen Form vorliegt und inaktiviert ist oder ein inaktives Analogon oder ein inaktives oder inaktiviertes Fragment des Cytokins.

19. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend:

- einen Antikörper für ein Regulationsprotein eines 1-HIV-, 2-HTV-, 1-HTLV- oder 2-HTLV-Virus, erhalten durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11,

- einen Antikörper für ein Anticytokin, wie einen α-Human-Anti-Interferon-Antikörper.

20. Vakzin, umfassend als Immunogen eine Verbindung, definiert nach einem der Ansprüche 1 bis 7, die an ein mineralisches, ölhaltiges oder synthetisches Immunitätsadjuvants oder ein Protein, das die Immunogenität erhöht, assoziiert ist.

21. Verwendung einer immunogenen Verbindung, definiert nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines heilenden oder vorbeugenden Arzneimittels, bestimmt für die Behandlung oder die Vorbeugung schädlicher Wirkungen von Regulationsproteinen der 1-HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2-HTLV-Viren.

22. Immunogene, einem Menschen verabreichbare, detoxifizierte Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass sie von einem Regulationsprotein eines 1-HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2-HTLV- Virus oder einem seiner Peptidfragmente durch chemische Behandlung oder Kopplung mit einem Trägerprotein, aktiviert durch eine Vorbehandlung mit einem Aldehyd, abgeleitet ist, was die Wiedererkennung durch Antikörper, die gegen das native Regulationsprotein gerichtet sind und die Aufrechterhaltung von ausreichenden immunogenen Eigenschaften ermöglicht, um Antikörper zu erzeugen, die das native Protein neutralisieren oder blockieren, während mindestens 50% der toxischen biologischen Eigenschaften des nativen Proteins verloren gehen, ausgenommen das carboxymethylierte Tat.

23. Immunogene Verbindung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass sie von einem der nachfolgenden Regula tionsproteine abgeleitet ist: Nef, Tat, Vif oder Rev der 1- HIV- oder 2-HIV-Viren.

24. Immunogene Verbindung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Fragment des Proteins Tat ist oder davon abgeleitet ist.

25. Immunogene Verbindung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass sie von einem Protein Tax eines 1-HTLV- oder 2-HTLV-Virus abgeleitet ist.

26. Immunogene Verbindung nach einem der Ansprüche 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass sie von einem Regulationsprotein eines 1-HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2-HTLV-Virus durch chemische Behandlung abgeleitet ist.

27. Immunogene Verbindung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Behandlung eine Behandlung mit einem Aldehyd darstellt.

28. Immunogene Verbindung nach Anspruch 22 mit der nachfolgenden Formel HQVSLSKQPTSQPRGD oder MEPVDPRLEPWKHPG oder entsprechend einem nativen Tat von 1-HIV oder 2-HIV nach Inaktivierung mit einem Aldehyd.

29. Verfahren zur Herstellung einer immunogenen Verbindung, definiert nach einem der Ansprüche 22 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Regulationsprotein eines 1-HIV-, 2-HIV-, 1-HTLV- oder 2-HTLV-Virus oder eines dessen Fragmente einer chemischen Behandlung unterzieht, selektioniert und dann die erwartete Verbindung reinigt.

30. Verfahren zur Herstellung einer immunogenen Verbindung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Behandlung eine Behandlung mit einem Aldehyd darstellt.

31. Verfahren nach Anspruch 29 oder 30, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Behandlung eine Behandlung mit einem Aldehyd, gefolgt von der Kopplung an ein Trägerprotein umfaßt.







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