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Dokumentenidentifikation DE69231246T2 01.03.2001
EP-Veröffentlichungsnummer 0580694
Titel HERSTELLUNG VON PHOSPHOPEPTIDEN AUSGEHEND VON KASEIN
Anmelder The University of Melbourne, Parkville, Victoria, AU;
The Victorian Dairy Industry Authority, Abbotsford, AU
Erfinder REYNOLDS, Eric Charles, 711 Elizabeth Street, Melbourne VIC 3000, AU
Vertreter Gille Hrabal Struck Neidlein Prop Roos, 40593 Düsseldorf
DE-Aktenzeichen 69231246
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, MC, NL, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 16.04.1992
EP-Aktenzeichen 929088631
WO-Anmeldetag 16.04.1992
PCT-Aktenzeichen AU9200175
WO-Veröffentlichungsnummer 9218526
WO-Veröffentlichungsdatum 29.10.1992
EP-Offenlegungsdatum 02.02.1994
EP date of grant 12.07.2000
Veröffentlichungstag im Patentblatt 01.03.2001
IPC-Hauptklasse C07K 1/14
IPC-Nebenklasse C07K 2/00   C12P 21/06   A23J 1/22   A23J 3/10   

Beschreibung[de]

Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Phosphopeptiden mit antikariogenen und anderen Eigenschaften aus Kasein.

In unserem australischen Patent Nr. 593365 haben wir dargestellt, dass vier von den vielen Phosphopeptiden, welche durch den tryptischen Abbau von Kasein freigesetzt werden, eine antikariogene (den Zahnabbau hemmende) Aktivität aufweisen. Diese Peptide besitzen alle die aktive Sequenz-Ser(P)- Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu- und entsprechen αs1 (59-79) SEQ. ID Nr. 2 (ii), β(2-25) SEQ. ID Nr. 3(T&sub2;), αs2 (46-70) SEQ. ID Nr. 4 (T&sub4;) und αs2 (2-21) SEQ. ID Nr. 7 (T&sub3;). Die für die Herstellung von antikariogenen Phosphopeptiden beschriebenen Verfahren sind die selektive Präzipitation und die Ionenaustausch-Chromatographie. Obwohl diese Verfahren sehr reine Zubereitungen von diesen Peptiden ergeben, sind sie in der Milchindustrie aufgrund ihrer Kosten und der notwendigen technischen Fertigkeiten nicht allgemein akzeptiert.

Die Membran-Ultrafiltration hat vor kurzem eine breite Akzeptanz in der Milchindustrie für die Milchbehandlung gefunden. In den US-Patenten 4 358 465, 4 361 587 und 4 495 176 beschreiben Brule et. al. ein Ultrafiltrationsverfahren zur Verwendung bei diesen Zubereitungen.

In AU-B 66783/81 und 51491/85 wird von Brule et al. ein Verfahren für die Extraktion von Phosphopeptiden für die Verwendung als Nahrungsergänzungen offenbart, bei dem ein Aggregat bildendes, bivalentes Kation in Kombination mit der Ultrafiltration verwendet wird, wobei sich eine Phosphopeptide von der Lösung abfiltriert werden, wobei den restlichen Phosphopeptiden und nichtphosphorylierten Peptiden erlaubt wird, während des Diafiltrationsverfahrens zu passieren. Dies stellt einen bedeutsamen Fortschritt in dem Stand der Technik dar, da es die Verwendung eines in der Industrie akzeptierten Extraktionsverfahrens beinhaltet, welches zu einer Zubereitung führt, die reich (> 90 Gew.-%) an den gewünschten Phosphopeptiden ist.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt die während des Filtrationsschrittes übernommene Molekulargewichts-Ausschlussgrenze im wesentlichen im Bereich zwischen 10.000 und 20.000.

Das lösliche monovalente Kationensalz von Kasein, wie Natriumkaseinat oder Kaliumkaseinat, kann in der Lösung in einer Konzentration vorliegen, die im wesentlichen im Bereich zwischen 0,1 und 50 Gew.-% liegt, wobei es vorzugsweise unter Verwendung eines proteolytischen Enzyms, wie Pankreatin, Trypsin, Papain oder Chymotrypsin, oder einer Mischung von proteolytischen Enzymen, wie Trypsin und Chymotrypsin, oder durch chemische Mittel, wie Cyanogenbromid, abgebaut wird. Das Verhältnis zwischen dem (den) Enzym(en) und dem Kasein kann in dem Bereich von etwa 1 : 1.000 und 1 : 10 (nach Gewicht) liegen, wobei dies so ausgewählt sein wird, dass ein vollständiger Abbau des Kaseins, wie oben definiert, ermöglicht wird. Der pH der Hydrolyse sollte vorzugsweise am Optimum für die Enzyme kontrolliert werden, um einen vollständigen Kaseinabbau zu gewährleisten. Die Temperatur sollte auch für einen vollständigen Abbau optimiert sein, wobei die eine Degradation induzierende Temperatur (Entamidierung, Dephosphorylierung und Peptidolyse) minimiert sein sollte. Die optimale Temperatur liegt zwischen 20ºC und 60ºC.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird nach dem Abbau HCl bei Raumtemperatur bis etwa pH 4,7 zugefügt und jedes Präzipitat (dies sollte minimal sein) wird entfernt. CaCl&sub2; wird dann zu dem Überstand bis zu einem Niveau von etwa 1,0 Gew./Vol.-% zugefügt, um eine Aggregation der Phosphopeptide in Gegenwart von 1,0 Gew./Vol.-% Calcium (II) zu erzielen. Dies erlaubt einen vollständigen Kaseinabbau. Die Temperatur sollte auch für einen vollständigen Abbau optimiert sein, wobei aber eine die Degradation induzierende Temperatur (Entamidierung, Dephosphorylierung und Peptidolyse) minimiert sein sollte. Die optimale Temperatur liegt zwischen etwa 20ºC und 60ºC.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird nach dem Abbau HCl bei Raumtemperatur bis zu etwa pH 4,7 zugesetzt und jedes Präzipitat (dies sollte minimal sein) wird entfernt. Dann wird CaCl&sub2; dem Überstand bis zu einem Niveau von etwa 1,0 Gew/Vol.-% zugefügt, um eine Aggregation der Phosphopeptide in Gegenwart von 1,0 Gew/Vol.-% zu erzielen. Die antikariogenen Phosphopeptide (d. h. die Sequenz-Ser(P)- Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu enthaltend) bilden Hexamere, die von den kleineren, nicht-antikariogenen Phosphopeptid-Aggregaten durch intensive Diafiltration durch ein Filter mit einer Molekulargewichts-Ausschlussgrenze von 10.000 mit einer CaCl&sub2;-Lösung, vorzugsweise 1,0 Gew./Vol.-%, getrennt werden. Die bevorzugte Molekulargewichts-Ausschlussgrenze des Membranfilters sollte nicht kleiner als 10.000 oder größer als etwa 20.000 sein. Die Zugabe einer CaCl&sub2;-Lösung oder eines anderen, geeigneten di-/trivalenten Metallions, wie Zink (II) oder Eisen (III), ist für die Diafiltration essentiell, um die Integrität der antikariogenen Phosphopeptid-Aggregate zu erhalten, was eine Trennung der antikariogenen von den nicht-antikariogenen Phosphopeptiden erlaubt.

Nachdem verschiedene Volumen von CaCl&sub2; mit 1,0 Gew./Vol.-% durch den Membranfilter passiert worden sind, um eine Reinheit von mehr als 90% der antikariogenen Phosphopeptiden zu erzielen, kann das Ultraretentat, welches die antikariogenen Phosphopeptide enthält, mit Wasser durch ein Filter mit einer Molekulargewichts-Ausschlussgrenze von 1.000 diafiltriert werden, um das Calcium, falls erwünscht, zu entfernen. Das Retentat wird dann konzentriert und sprühgetrocknet.

Die Calcium-, Zink- und Eisensalze der antikariogenen Phosphopeptid- Zubereitung (ACPP) können in ein Natriumsalz überführt werden, indem eine 10 Gew./Vol.-% Lösung von Calcium-ACPP mit HCL auf einen niedrigen pH, ca. pH 2,0, angesäuert wird. Nach intensiver Diafiltration durch ein Filter mit einer Molekulargewichts-Ausschlussgrenze von 1.000 wird das Retentat mit NaOH auf pH 7,0 neutralisiert und dann mit Wasser durch den gleichen Filter diafiltriert, um überschüssiges Natriumchlorid zu entfernen.

Das Calcium-ACPP kann durch Zugabe von CaCl&sub2; und Na&sub2;HPO&sub4;, wobei das endgültige Ca-P-Verhältnis 1,67 ist, in das Calciumphosphat-ACPP umgewandelt werden. Das Peptid αs1 (59-79) kann 21 Ca und 13 PO&sub4; binden. Das Filtrat des obigen Verfahrens ist geeignet für die Reinigung von anderen bioaktiven Kaseinpeptiden mittels Trenntechniken basierend auf Größe und Ladung, und kann auch als mikrobiologisches Wachstumsmedium sowie als Nahrungsergänzung nach Entbittern oder als ein Stickstoffdünger verwendet werden.

Eine gegenwärtig bevorzugte Ausführungsform der Erfindung wird im folgenden anhand eines Beispiels beschrieben werden.

Beispiel

Natriumkaseinat wurde durch Ansäuern von Milch mit 0,1 M HCL auf pH 4,7 und durch Neutralisierung des Präzipitates mit NaOH auf pH 7,0 hergestellt. Eine 10 Gew./Vol.-% Lösung von Natriumkaseinat wurde hergestellt und auf pH 8,0 eingestellt. Trypsin (Novo) wurde zu 0,2 Gew./Vol.-% zugesetzt. Die Hydrolyse wurde bis zur Vollendung bei 50ºC mit Einstellung des pH auf 8,0 durch konstante Zugabe von NaOH durchgeführt. Der pH der Lösung wurde dann auf pH 4,7 mit 5 M HCL eingestellt und das Präzipitat wurde bei Raumtemperatur durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand wurde durch ein 8 Micron-Filter mikrofiltriert und dann auf pH 7,0 mit NaOH eingestellt. CaCl&sub2; wurde bis zu einer Menge von 1,0 Gew./Vol.-% hinzugesetzt. Diese Lösung wurde dann durch ein Amicon YM10 (Molekulargewichts- Ausschlußgrenze 10.000) mit 3 bis 5 Volumina von 1,0 Gew./Vol.-% CaCl&sub2; diafiltriert. Das Retentat wurde dann mit einem Volumen von destilliertem/deiionisiertem Wasser durch ein Amicon YM1-Filter (Molekulargewichts-Ausschlußgrenze 1.000) gewaschen. Die individuellen Peptide dieser Zubereitung wurden dann mittels Ionenaustauscher-FPLC und Umkehr-HPLC, wie in dem oben erwähnten Patent beschrieben, getrennt und durch eine Aminosäure-Zusammensetzungsanalyse und Sequenzanalyse nach Umwandlung der Ser(P)-Reste zu S-Etylcystein identifiziert. Eine Analyse der Zubereitung ist in der Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1 Zusammensetzung einer antikariogenen Phosphopeptid-Zubereitung:

Peptid % Gew./Gew.

αs2 (1-21) (SEQ. ID Nr. 8) 0,8

β (1-25) (SEQ. ID Nr. 1) 22,3

αs2 (2-21) (SEQ. ID Nr. 7) (T&sub3;) 5,7

β (2-25) (SEQ. ID Nr. 3) (T&sub2;) 17,9

αs1 (59-79) (SEQ. ID Nr. 2) (T&sub1;) 21,4

Desamido 74α&sub1; (59-79) (SEQ. ID Nr. 5) 6,3

αs2 (46-70) (SEQ. ID Nr. 4) (T&sub4;) 6,8

Desamido 74,78 αs1 (59-79) (SEQ. ID Nr. 6) 6,4

αs1 (43-79) (SEQ. ID Nr. 9) 3,3

NAP* 9,1

*NAP = nicht-antikariogene Peptide

Diese Zubereitung enthält die vier antikariogenen Phosphopeptide, die in dem oben erwähnten Patent beschrieben sind [β (2-25), T&sub2;, αs1 (59-79), T&sub1;, αs2 (2-21), T&sub3; und αs2 (46-70), T&sub4;], solche verwandten Peptide, die durch Trypsin nicht vollständig hydrolysiert wurden [αs2 (1-21), β(1-25) und αs1 (43- 79)] sowie mit geringen Mengen zwei desaminierte Formen von αs1 (59-79), Desamido&sup7;&sup4; und Desamido74,78, die von einer Temperatur induzierten Desamidierung abstammen. Dies basiert in einem sogar größeren Umfange bei der kommerziellen Herstellung von Natriumkaseinat aufgrund der höheren Temperaturen und der extremen pH-Werte, wobei die Gegenwart der desaminierten Formen keinen Effekt auf die antikariogene Aktivität besitzt. Die antikariogenen Phosphopeptide betrugen 90,9 Gew.-% der hergestellten Peptide.

Falls reines αs1-Kasein anstelle von Kasein verwendet wird, wird αs1 (59-79) bei diesem Verfahren erzielt werden mit geringen Mengen der entamidierten Formen von diesem Peptid in Abhängigkeit von den Hydrolysebedingungen. Falls reines β-Kasein verwendet wird, werden unter Verwendung dieses Verfahrens nur β (1-25) und β (2-25) erzielt.

Wenn Rohenzyme verwendet werden (wie Pancreatin), kann eine leichte Abtragung (sowohl N- als auch C-terminal) der neun gelisteten Phosphopeptide auftreten. Solange diese Abtragung nur gering ist, tritt kein Aktivitätsverlust auf. Pancreatin produziert in der Tat eine Zubereitung mit einer etwas größeren spezifischen Aktivität auf Gewichtsbasis, wenn dies mit gereinigtem Trypsin verglichen wird.

Die Sequenzen der neun Peptide, welche die Peptide T&sub1; bis T&sub4; des oben erwähnten Patentes umfassen, und die anderen, oben erwähnten Peptide werden im Detail in dem folgenden Sequenzprotokoll aufgelistet.

Sequenzprotokoll (1) Allgemeine Angaben:

(i) Anmelder: Reynolds, Eric Charles

(ii) Bezeichnung der Erfindung: Herstellung von Phosphopeptiden aus Kasein

(iii) Zahl der Sequenzen: 9

(iv) Korrespondenzadresse:

(A) Adressat:

(B) Strasse:

(C) Stadt:

(D) Land:

(E) Staat:

(F) Postleitzahl:

(v) Maschinenlesbare Form:

(A) Träger: Floppy Disk

(B) Computer: IBM PC kompatibel

(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS

(D) Software: Word Perfect

(vi) Daten der gegenwärtigen Anmeldung:

(A) Anmeldenummer:

(B) Anmeldetag:

(C) Klassifizierung:

(vii) Daten der früheren Anmeldung:

(A) Anmeldenummer:

(B) Anmeldetag:

(C) Klassifizierung:

(viii) Vertreterangaben:

(A)

(B)

(C)

(ix) Telekommunikationsangaben:

(A)

(B)

(C)

(2) Angaben zu SEQ. ID Nr. 1:

(i) Sequenzeigenschaften:

(A) Länge: 25

(B) Art: Aminosäure

(C) Strang: einfach

(D) Topologie: linear

(ii) Molekülart: Protein

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 15

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 17

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 18

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 19

(C) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ. ID Nr. 1:

(2) Angaben zu SEQ. ID Nr. 2:

(i) Sequenzeigenschaften:

(A) Länge: 21

(B) Art: Aminosäure

(C) Strang: einfach

(D) Topologie: linear

(ii) Molekülart: Protein

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Pyroglutamat

(B) Lage: 1

(D) Sonstige Angaben: eine bestimmte Menge wird in dieser Form existieren

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 6

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 8

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 9

(C) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin (ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 10

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 17

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ. ID Nr. 2:

(2) Angaben zu SEQ. ID Nr. 3:

(i) Sequenzeigenschaften:

(A) Länge: 24

(B) Art: Aminosäure

(C) Strang: einfach

(D) Topologie: linear

(ii) Molekülart: Protein

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 14

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 16

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 17

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(C) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(C) Lage: 18

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ. ID Nr. 3:

(2) Angaben zu SEQ. ID Nr. 4:

(i) Sequenzeigenschaften:

(A) Länge: 25

(B) Art: Aminosäure

(C) Strang: einfach

(D) Topologie: linear

(ii) Molekülart: Protein

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 11

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 12

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 13

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(C) Lage: 16

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ. ID Nr. 4:

(2) Angaben zu SEQ. ID Nr. 5:

(i) Sequenzeigenschaften:

(A) Länge: 21

(B) Art: Aminosäure

(C) Strang: einfach

(D) Topologie: linear

(ii) Molekülart: Protein

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 6

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 8

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 9

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 10

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 17

(C) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ. ID Nr. 5:

(2) Angaben zu SEQ. ID Nr. 6:

(i) Sequenzeigenschaften:

(A) Länge: 21

(B) Art: Aminosäure

(C) Strang: einfach

(D) Topologie: linear

(ii) Molekülart: Protein

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 6

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 8

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 9

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 10

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 17

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ. ID Nr. 6:

(2) Angaben zu SEQ. ID Nr. 7:

(i) Sequenzeigenschaften:

(A) Länge: 20

(B) Art: Aminosäure

(C) Strang: einfach

(D) Topologie: linear

(ii) Molekülart: Protein

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 7

(D) Sonstige Angaben: post-transfational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 8

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 9

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 15

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ. ID Nr. 7:

(2) Angaben zu SEQ. ID Nr. 8:

(i) Sequenzeigenschaften:

(A) Länge: 21

(B) Art: Aminosäure

(C) Strang: einfach

(D) Topologie: linear

(ii) Molekülart: Protein

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 8

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 9

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 10

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 16

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(x) Sequenzbeschreibung: SEQ. ID Nr. 8:

(2) Angaben zu SEQ. ID Nr. 9:

(i) Sequenzeigenschaften:

(A) Länge: 37

(B) Art: Aminosäure

(C) Strang: einfach

(D) Topologie: linear

(ii) Molekülat Protein

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 4

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 6

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 22

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 24

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 25

(C) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 26

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(ix) Merkmal:

(A) Name/Schlüssel: Phosphoserin

(B) Lage: 33

(D) Sonstige Angaben: post-translational phosphoryliertes Serin

(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ. ID Nr. 9:


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Herstellung ausgewählter Phosphopeptide, umfassend die folgenden Schritte: vollständiges Abbauen eines löslichen monovalenten Kationensalzes von Kasein in Lösung, Einführen eines bi- oder trivalenten Metallions, um eine Aggregation von wenigstens den ausgewählten Phosphopeptiden in der genannten abgebauten Lösung herbeizuführen, und Diafiltrieren der Lösung, die das aggregierende Ion enthält, durch einen Filter mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze, die so gewählt wird, daß wenigstens die genannten aggregierten Phosphopeptide zurückgehalten werden, während der Großteil der restlichen Phosphopeptide in ein Filtrat geleitet wird, wobei die abgebaute Lösung mit Volumen einer Lösung aus dem bi- oder trivalenten Metallion unter Bedingungen diafiltriert wird, die wirksam sind, um eine Zusammensetzung zu erzeugen, die im wesentlichen aus antikariogenen Phosphopeptiden besteht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die während des Filtrationsschrittes übernommene Molekulargewichts- Ausschlußgrenze im wesentlichen im Bereich zwischen 10.000 und 20.000 liegt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das lösliche monovalente Kationensalz von Kasein in der Lösung in einer Konzentration vorliegt, die im wesentlichen im Bereich zwischen 0,1 und 50 Gew.-% liegt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem der Abbauschritt mit einem proteolytischen Enzym durchgeführt wird und das Verhältnis zwischen proteolytischem Enzym und löslichem monovalentem Kationensalz von Kasein in der Lösung im wesentlichen im Bereich zwischen 1 : 1000 und 1 : 10 (nach Gewicht) liegt und so gewählt wird, daß ein vollständiger Abbau des Kaseinsalzes möglich ist.

5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, bei dem pH-Wert und Temperatur der Lösung geregelt werden, um einen vollständigen Abbau des Kaseinsalzes zu ermöglichen.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Temperatur der Lösung im wesentlichen zwischen 20ºC und 60ºC liegt.

7. Verfahren zur Herstellung ausgewählter Phosphopeptide mit antikariogenen und anderen Aktivitäten, umfassend die folgenden Schritte: vollständiges Abbauen eines löslichen monovalenten Kationensalzes von Kasein in Lösung mit einem proteolytischen Enzym, Zugeben einer Mineralsäure in die Lösung, um den pH-Wert auf etwa 4,7 einzustellen, Entfernen von erzeugtem Präzipitat, Zugeben von CaCl&sub2; in einer Konzentration von etwa 1,0 Gew./Vol.-%, um eine Aggregation von wenigstens den ausgewählten Phosphopeptiden in der genannten abgebauten Lösung herbeizuführen, und Trennen der aggregierten Phosphopeptide von der Lösung durch Filtration, einschließlich Diafiltration mit der CaCl&sub2;- haltigen Lösung, durch einen Filter mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze, die im wesentlichen im Bereich zwischen 10.000 und 20.000 liegt, während der Großteil der restlichen Phosphopeptide und nichtphosphorylierten Peptide und Lösung in ein Filtrat geleitet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 7, bei dem das lösliche monovalente Kationensalz von Kasein ausgewählt wird aus Natrium-Kaseinat und Kalium-Kaseinat.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, bei dem das proteolytische Enzym ausgewählt wird aus Pankreatin, Trypsin, Papain, Chymotrypsin und Gemischen davon.







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