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Verfahren zum Vermehren des das Reproduktions- und Atemwegs-Syndrom verursachenden Schweinevirus und dessen Verwendung als Impfstoff. - Dokument DE69426228T2
 
PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69426228T2 01.03.2001
EP-Veröffentlichungsnummer 0683816
Titel Verfahren zum Vermehren des das Reproduktions- und Atemwegs-Syndrom verursachenden Schweinevirus und dessen Verwendung als Impfstoff.
Anmelder Bayer Corp., Pittsburgh, Pa., US;
Iowa State University Research Foundation, Inc., Ames, Ia., US
Erfinder SANDERSON, Thomas, Skokie, US;
MCGINLEY, J., Michael, Lenexa, US;
ZIMMERMAN, J., Jeffrey, Ames, US;
HILL, T., Howard, Cambridge, US;
MEETZ, C., Michael, Nevada, US;
PIRTLE, C., Eugene, Ames, US;
SWENSON, L., Sabrina, Madrid, US;
SHIBLEY, P., George, Leawood, US
Vertreter Krieg, R., Dipl.-Biol. Dr.rer.nat., Pat.-Anw., 51377 Leverkusen
DE-Aktenzeichen 69426228
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 26.01.1994
EP-Aktenzeichen 949078950
WO-Anmeldetag 26.01.1994
PCT-Aktenzeichen US9400951
WO-Veröffentlichungsnummer 9418311
WO-Veröffentlichungsdatum 18.08.1994
EP-Offenlegungsdatum 29.11.1995
EP date of grant 02.11.2000
Veröffentlichungstag im Patentblatt 01.03.2001
IPC-Hauptklasse C12N 7/00
IPC-Nebenklasse A61K 39/12   

Beschreibung[de]
GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Schwein (Porcine) - Reproduktions- und Respirationssyndrom-Virus-(PRRSV)-Isolat. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen Impfstoff für Reproduktions- und Atemwegskrankheiten bei Schweinen sowie Verfahren zu dessen Herstellung.

KURZE BESCHREIBUNG DES STANDES DER TECHNIK

Das Schwein-Reproduktiv- und Atemwegssyndrom taucht schnell und zunehmend als ein wirtschaftlich verheerendes Krankheitsproblem für US-amerikanische und europäische Schweineerzeuger auf. Das Syndrom wurde zuerst in den US in 1987 beschrieben, mit ähnlichen Beschreibungen gebietsweise in Europa und Kanada zwei bis drei Jahre später. Das Krankheitssyndrom ist mit vielen verschiedenen Namen bezeichnet worden, einschließlich Geheimnis-Schweinekrankheit, Abortus-Blau, blau-ohrige Schweinekrankheit, Schweineepidemie, Abortions- und Atemwegssyndrom (PEARS) und Schweineunfruchtbarkeits- und Atemwegesyndrom (SIRS). Im folgenden wird der Name Schwein (Porcine)-Reproduktiv- und Respirator-Syndrom (PRRS) verwendet.

Das etiologische Agens, das zur Reproduzierung des Krankheitssyndroms befähigt ist, ist als ein kleines umhülltes kugelförmiges RNA-Virus, mit einem Durchschnitts-Virion- Durchmesser von 62 nm und einem Kern von 25 bis 30 nm, umgeben von einer Umhüllung, identifiziert worden. Dieses Virus ist versuchsweise als Mitglied des Genus Arterivirus innerhalb der Togaviridae-Familie eingruppiert worden. Das Schwein- Reproduktions- und Atemwegesyndrom-Virus-(PRRSV)-Isolat, das hier beschrieben wird, passt in diese Versuchsklassifikation, und es hat sich erwiesen, dass es das Krankheitssyndrom reproduziert.

Das mit PRRSV in Zusammenhang stehende Krankheitssyndrom ist durch akutes und chronisches Reproduktioonsversagen bei ausgewachsenen weiblichen Schweinen und starken bis milden Atmungskrankheiten bei jungen Schweinen gekennzeichnet. Das Reproduktionsversagen ist durch Spätphasen-Abgänge gekennzeichnet und führt zu erhöhtem Auftreten mumifizierter, still geborener und schwach geborener Schweine bei deutlich verringerten Überlebenschancen. Chronische Probleme unter verzögerter Rückkehr zu Östrus (Brünstigkeit) bei infizierten Säuen sind ebenfalls beschrieben worden. Atemwege- Erkrankungsfolgeerscheinungen reichen von deutlichem Fieber und Zwerchfellpneumonitis bis zu milden oberen Atemwegestörungsanzeichen (d. h. Niesen, Husten und nasale oder okulare Ausscheidungen) bei jungen Schweinen. Neuere (1990) serologische und Herden-Historie-Untersuchungen zeigen, dass mindestens 50% der US-Schweineherden PRRSV ausgesetzt waren oder Reproduktionsversagen und Atemwegeerkrankungen erfahren haben, welche ein Indiz für eine PRRSV-Infektion sind.

Christianson et al beschreiben im American Journal of Veterinary Research, Vol. 53(4), April 1992, ein spezifisches PRRS-Virus-Isolat (ATCC VR-2332), das sich allerdings von dem Virus-Isolat gemäß der vorliegenden Erfindung antigen unterscheidet.

Wegen des erst in jüngerer Zeit erfolgten Auftretens dieses Krankheitssyndroms sind Untersuchungen bezüglich Pathogenese, Epidemiologie und Beherrschung der Krankheit eingeschränkt gewesen. Wie zu vergegenwärtigen ist, würde eine wirksame Vermehrung und Herstellung der PRRSV umfassenden Antigene die Entwicklung eines PRRSV-Impfstoffes als Hilfsmaßnahme zur Vorbeugung und Bekämpfung des Schwein-Reproduktiv- und Respirator-Syndroms erleichtern.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß dem vorstehend Gesagten, betrifft die vorliegende Erfindung ein Virus-Isolat, das als ISU-P, ATCC VR 2402, bezeichnet ist und sich zur Herstellung von Antigenen zur Diagnose des Schwein-Reproduktiv- und Resiprator-Syndroms und zur Induktion einer schützenden Immunreaktion vor bzw. gegen das Schwein (Porcine)-Reproduktiv- und Respirator-Syndrom- Virus (PRRSV) eignet. Auch werden durch die Erfindung die Verfahren zur Herstellung und Anwendung der Antigene umfasst.

In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist das PRRSV-Isolat mit einem Verfahren erhältlich, wobei man das PRRSV isoliert, indem eine Co-Kultivierung von 10% Gewicht/Volumen (G/V) Lungenhomogenaten aus mit Virus infizierten Schweinen mit primären Schwein-Alveolarmakrophagen oder kontinuierlichen Zelllinien-Kulturen bei 35ºC durchgeführt wird.

Die vorliegende Erfindung umfasst ferner die Fortpflanzung und Vermehrung des Virus zu hohen Titern in bestimmten Zelllinien wie einer Afrikanischen Grünaffen-Nieren-Kontinuum-Zelllinie.

Ebenfalls sind durch die Erfindung Verfahren zur Herstellung und Anwendung von Lebend-Virus oder Getötet-Virus-Antigenen (konventionell oder rekombinant) und der daraus sich ergebenden Impfstoffe durch Zusammenbringen einer immunologisch wirksamen Menge des Virus mit Verdünnungsmittel bzw. Adjuvans (Hilfslösung) umfasst.

Es ist herausgefunden worden, dass eine direkte experimentelle Immunisierung von Säuen mit Lebend-Virus oder der Kontakt mit Säuen, die mit dem Lebend-Virus immunisiert waren, das Reproduktioonsversagen nach erfolgter intranasaler Herausforderung mit virulentem PRRSV verhinderte.

Es ist auch herausgefunden worden, dass inaktivierte, Hilfslösung enthaltende PRRSV-Impfstoffe Schweine vor einer PRRSV-Infektion nach der entsprechenden Herausforderung schützten, wie dies durch das Fehlen einer Virus-Replikation bei geimpften Gruppen, verglichen mit nicht-geimpften Vergleichsschweinen gemessen wurde.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

wie oben dargelegt, ist die vorliegende Erfindung auf die Isolierung bzw. Gewinnung des PRRSV-Virus-Isolats ISU-P zum Erhalt viraler Antigene zur Verwendung in Impfstoffen und diagnostischen Assay-Verfahren gerichtet. Das ISU-P-Isolat wurde aus dem Lungengewebe schwach geborener Schweine erhalten. Beispielsweise wurde ein 10% G/V Gewebehomogenat aus Lunge, Milz und Lymphknoten in mit Antibiotika ergänzten Minimal-Essentialmedien (MEM+A) zur Minimierung des Kontaminations-Potenzials hergestellt. Das Rohhomogenat wurde durch Zentrifugation bei 4ºC 15 min lang bei 1500 · g geklärt. Geklärter Überstand wurde auf 1 : 5 in MEM+A verdünnt, und es wurde 1,0 ml an einer 48 h alten konfluenten Monoschicht von MA 104 Zellen oder primären Alveolarmakrophagen in Fläschchen von 25 cm³ adsorbiert. Im Anschluß an eine Adsorptionsdauer von 2 h bei 35ºC wurden Monoschichten zweimal mit MEM+A gewaschen, und es wurden 5,0 ml MEM+A zugegeben, das mit 5,0% γ-bestrahltem fötalen Kälberserum ergänzt war. Virus-Isolierfläschchen wurden bei 25ºC in einer 5% CO&sub2;-Atmosphäre inkubiert und täglich bezüglich Auftreten und Evidenz eines zytopatischen Effekts (CPE) beobachtet. Der PRRSV ISU-P-Zytopathie-Effekt begann mit der Kreisbildung kleiner Herde von 5 bis 10 Zellen und schritt fort, als viele Zellen pyknotisch wurden und sich im Laufe von 4 bis 7 Tagen nach Infektion vom Substrat ablösten.

Das ISU-P-Isolat wurde als ein PRRSV-Isolat durch Fluoreszenz- Antikörper-Färbung mit PRRSV-gruppenspezifischem monoklonalen Antikörper bestätigt, der in der Öffentlichkeit als SDOW17 bezeichnet wird. Außerdem wurden mit negativ gefärbtem Virus infizierte Zellen mit Transmissionselektronenmikroskopie bezüglich des Vorliegens von Viruspartikeln untersucht. Die betrachteten Viruspartikel waren kugelförmig und umhüllt und wiesen einen Durchschnitts-Virion-Durchmesser von 65 nm und einen Kerndurchmesser von 27 nm auf. Gewebekulturvirus, das in dieser Weise charakterisiert war, wurde herangezogen, um Spätphasen-Abortus und Reproduktionsversagen bei trächtigen Säuen experimentell zu reproduzieren (Tabelle 1). Tabelle 1 zeigt, dass trächtige Jungsäue, die entweder ISU-P-infizierten Lungenhomogenaten (PRRS-hm) oder ISU-P ausgesetzt waren, das in einer Zellkultur (PRRS-tc) gewachsen war, typische Krankheitsanzeichen von Schwein-Reproduktiv- und Respirator- Syndrom (PRRS) zeigen und ergeben. In den PRRS-hm-Gruppen wurden keine Normalschweine geworfen. In den PRRS-tc-Gruppen wurden lediglich 4 von 33 Schweinen normal geworfen. Im Vergleich dazu, waren 29 von 30 (96,7%) der nicht-ausgesetzten Schweine normal beim Wurf. Die Tatsache, dass ISU-P, sogar nach Reinigung in Gewebekultur, die Krankheit von PRRS zu reproduzieren vermag, bestätigt, dass dieses Isolat korrekt als Mitglied des Genus Arterivirus innerhalb der Togaviridae- Familie klassifiziert ist. Bei diesem Isolat hat es sich auch erwiesen, dass es eine milde Zwerchfellpneumonie bei experimentell infizierten Schweinen erzeugt.

Es ist ein Merkmal der Erfindung, dass PRRSV gemäß der Erfindung in bestimmten Gewebekulturzellen gezüchtet werden kann, die das Virus wirksam auf ein genügend hohes Niveau replizieren, um die antigene Masse bereitzustellen, die zur Einbringung in Impfstoffe benötigt wird, welche Schweine und/oder trächtige Jungsäue oder Säue vor einer bzw. gegen eine PRRS-Herausforderung zu schützen vermögen. Beispielsweise kann das PRRSV in einer als MA 104 bezeichneten Gewebekulturzelle durch bzw. mit Whittaker BioProducts gezüchtet werden. Virus-Fortpflanzungsversuche, unter Anwendung identischer Züchtungsbedingungen, mit aus drei verschiedenen Quellen erhaltenen MA 104-Zellen zeigen, dass ein hoher Variabilitätsgrad unter MA 104-Zellen bezüglich der Befähigung zur Begünstigung und Unterstützung einer PRRSV- Replikation auf einen hohen Titer besteht. Eine MA 104- Zellkultur, bezeichnet als MA 104(M), von Miles Inc., Agriculture Division, Animal Health Products Group, welche in den hier beschriebenen Untersuchungen angewandt wurde, unterstützte und begünstigte beständig die PRRSV-Replikation auf hohe Titerwerte. Ferner begünstigt und unterstützt ein Zelllinienklon, erzeugt von Miles Inc., Agriculture Division, Animal Health Products Group, welcher aus MA 104(M) abgeleitet ist und als 9009B bezeichnet wird, die Replikation von PRRSV auf Titerwerte, die höher sind als die Elternzelllinie. Daher ist die bevorzugte Gewebekulturzelle für Züchtung und Wachstum von ISU-P 9009B. Im folgenden wird die Zellkulturfortpflanzung des PRRSV ISU-P noch etwas vollständiger dargelegt.

Gewebekulturzellen [MA 104(M) und 9009B] wurden in Dulbecco's modifizierten Minimal-Essentialmedien mit hoher Glucose (DMEM/HG), ergänzt mit 5% fötalem Kälberserum und gepuffert mit 1,3 g/l Natriumbicarbonat, gezüchtet und gehalten. Zell- Durchläufe wurden mit hinreichenden Zell-Zählungen durchgeführt, um eine 80 bis 100% konfluente Monoschicht in 48 h zu erreichen. PRRSV ISU-P Virus-Vorratslösungen wurden in DMEM/HG + 5% fötalem Kälberserum, gepuffert auf pH = 6,8 mit PIPES, verdünnt. Virus wurde auf die Zell-Platte bei niedriger Multiplizität der Infektion (MOl) inokuliert und bei 36ºC inkubiert. Infizierte Kulturen wurden täglich bezüglich des CPE 4 bis 7 Tage lang beobachtet. Infizierte Kulturen wurden geerntet, als ein CPE von 90 bis 100% evident war. Maximale Virus-Antigenmasse wurde nach 1-70ºC Gefrier-Auftau-Zyklus erhalten. Die Durchschnitts-Virus-Titerwerte, die sich aus der Fortpflanzung in MA 104(M)-Zellen ergaben, betrugen 103,0 bis 1045 Fluoreszenz-Antikörper-Infektionsdosis50/ml FAID&sub5;&sub0;/ml. Die Virus-Titerwerte, die durch Fortpflanzung im 9009B-Zellklon erreicht wurden, betrugen 105,5 bis 106,5 FAID&sub5;&sub0;/ml. Titerwerte dieser Größenordnung ermöglichen es, eine hinreichende antigene Masse in handelsmaßstäbliche PRRSV-Impfstoff- Formulierungen von mehr als 50 l an Volumen einzubringen.

Wie der Durchschnittsfachmann erkennt, sind, sobald das PRRSV auf hohe Gehaltsmengen antigener Masse fortgepflanzt werden kann, auch die Derivate (Abkömmlinge) dieses Virus, einschließlich von Untereinheiten davon, welche gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls wirksam sind, mit im Stand der Technik bekannten Verfahrensmaßnahmen wie einer Extraktion aus dem Virus erhältlich. Ausserdem können die Schutzantigene am molekularen Niveau identifiziert und mit rekombinanter Technologie reproduziert und exprimiert werden.

Virale Flüssigkeiten wurden zur Impfstoff-Formulierung mit zwei Verfahren inaktiviert. Die ausgewählten Inaktivierungsmittel waren Formalin und binäres Ethylenimin (BEI). Die Inaktivierung wurde mit Standardverfahren durchgeführt, die nun vollständiger beschrieben werden. Eine Formalin-Inaktivierung wurde durch Vermischen viraler Flüssigkeiten mit 37%igen Formaldehyd-Vorratslösungen auf eine Formalin-Endkonzentration von 0,05% durchgeführt. Die Formalin-Virus-Mischung wurde bei Raumtemperatur (ca. 25ºC) unter konstanter Vermischung 24 h lang gehalten. Proben wurden zu den Zeitpunkten 0, 8, 12 und 24 h gezogen und bezüglich Lebend-Virus in 9009B-Zellen analysiert. Gemäß Zytopatieeffekt und Fluoreszenzfärbung mit gruppenspezifischem monoklonalen Antikörper wurde Lebend-PRRSV lediglich zum Zeitpunkt = 0 h nachgewiesen.

Die Inaktivierung mit BEI wurde durch Zusammenbringen einer Vorratslösung von 0,1 M BEI (20,5 g/l 2-Bromethylamin x HBr in O,175 N NaOH) mit viralen Flüssigkeiten auf eine Endkonzentration von 1,0 mM BEI durchgeführt. Die Inaktivierung wurde fortgesetzt, indem die BEI-Virus-Mischung bei Raumtemperatur 24 h lang konstant vermischt wurde. Die Virus-Inaktivierung wurde durch Zugabe von 1,0 M Natriumthiosulfat auf eine Endkonzentration von 0,1 mM unter zweistündiger Vermischung angehalten. Es wurden Proben zu den Zeitpunkten = 0, 2, 4, 8, 12, 24 und 48 h gezogen und bezüglich Lebend-Virus analysiert, wie oben beschrieben. Lebend-PRRSV wurde lediglich zu den Zeitpunkten = 0, 2 und 4 h nachgewiesen.

Zur Herstellung eines modifizierten lebenden oder verdünnten Impfstoffes der Erfindung wurde das PRRSV umgeändert, so dass es immer noch den Wirt in eingeschränkter Weise infizieren, aber keine Krankheitsanzeichen im Wirt mehr verursachen konnte. Normalerweise erfolgt eine derartige Umänderung des Virus, indem man es durch eine Nicht-Wirtszelle wie Afrikanische Grünaffen-Nierenzellen laufen lässt. Am Anfang kann das Virus nicht gut genug oder überhaupt nicht wachsen. Im letzteren Fall kann es notwendig sein, das Virus zu zwingen, sich dem Wachstum der Zellkultur anzupassen. Dies kann durch Zugabe des Virus zur Zellkultur bei hoher oder niedriger Multiplizität der Infektion (MOl) erfolgen.

Alternativ dazu, kann das Virus zusammen mit den Zellen zwangsweise oder blind laufen gelassen werden, bis genügend zytopathischer Effekt beobachtet und somit angezeigt wird, dass das Virus adaptiert wird. Sobald Adaption erfolgt, erhöht sich der Virustiter, wie dies zu beobachten ist, wenn das PRRSV-Isolat ISU-P aus der MA 104(M)-Zelllinie zur 9009B- Zelllinie abgeleitet wird. Tabelle 1 zeigt, dass das aus Gewebekultur geleitete PRRSV ISU-P (PRRS-tc) weniger virulent als das aus Lungenhomogenaten isolierte sein kann, was ein typisches Ergebnis einer Adaptierung ist. Die in Tabelle 2 angegebenen Daten zeigen an, dass mit dem Verfahren Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, die besonders wirkungsvoll zur Übertragung eines Schutzes gegen PRRS sind.

Das inaktivierte PRRSV ISU-P wurde mit Adjuvans (Hilfslösung) wie folgt versehen. Inaktivierte Flüssigkeiten wurden mit Adjuvanzien zusammengebracht, die aus der Gruppe ausgewählt waren, bestehend aus Freunds Komplett-Adjuvans (FCA), Freunds Inkomplett-Adjuvans (FIA), einem Carbopol-basierten Adjuvans und aus Diamond Scientific Adjuvans B (Adj B). Diese Adjuvanzien stellen die Haupttypen dar, die bei einer Impfstoffherstellung verwendet werden. Öl-basierte Adjuvanzien sind durch FCA, FIA und Adj B dargestellt. Wasser-basierte Adjuvanzien sind durch Carbopol dargestellt. Das inaktivierte PRRSV ISU-P kann gegebenenfalls ein geeignetes Konservierungsmittel enthalten.

Impfstoff-Zubereitungen mit FCA und FIA wurden durch Emulgieren des inaktivierten Virus, typischerweise in gleichen Volumina inaktivierter Virus-Flüssigkeit und Adjuvans, unter Anwendung einer 18-er Doppel-Auf-Zu-Vorrichtung und von zwei Spritzen hergestellt. Die Flüssigkeiten wurden wiederholt durch die Vorrichtung zwischen den Spritzen herausgedrückt, bis eine verdickte halb-feste Emulsion gebildet war. Die Emulsionen wurden direkt in Spritzen zur Verabreichung eingebracht.

Impfstoff-Zubereitungen mit Adj B wurden hergestellt, indem Vorrats-Adj B mit einem gleichen Volumen inaktivierter PRRSV- ISU-P-Viralflüssigkeit vermischt wurde. Adjuvans und Virus wurden durch einstündiges Rühren bei Raumtemperatur vermischt. Mit Adjuvans versehener Impfstoff wurde aseptisch in sterile Multidosis-Ampullen übertragen und bei 4ºC vor der Verabreichung aufbewahrt und gelagert.

Carbopol-basierte Impfstoff-Zubereitungen wurden hergestellt, indem Vorrats-Carbopol-Adjuvans mit inaktivierten viralen Flüssigkeiten auf eine Adjuvans-Endkonzentration von 10% V/V vermischt wurde. Adjuvans und Virus wurden unter vierstündigem Rühren bei Raumtemperatur vermischt. Mit Adjuvans versehender Impfstoff wurde aseptisch in sterile Multidosis-Ampullen übertragen und bei 4ºC vor der Verabreichung aufbewahrt und gelagert.

PRRSV ISU-P-Virus mit einem Vorinaktivierungstiter von so niedrig wie 105,0 FAID&sub5;&sub0;/ml wurde in den verschiedenen beschriebenen Impfstoff-Formulierungen bzw. -Zubereitungen verwendet.

Zum Nachweis, dass PRRSV-Isolat ISU-P gegen Schwein- Reproduktions- und Respirator-Syndrom schützte, wurden zwei Impfungs-Herausforderungs-Untersuchungen durchgeführt. In der ersten Untersuchung wurden vier Jungsäue mit Lebend-PRRSV ISU- P durch oronasales Aussetzen an Virus über entweder eine Direktroute oder Kontakt mit erkrankten Schweinen immunisiert. Zwei gleichaltrige Jungsäue wurden unimmunisiert (unausgesetzt) gelassen und getrennt untergebracht, um als Vergleiche zu dienen. Die Direkt-Aussetzungs-Impfgruppen (#57 und #58) erhielten intranasal 3,0 ml Virus-Inokulum. Sie serokonvertierten in 14 Tagen nach der Aussetzung bzw. Impfung, gemäß einem Indirekt-Fluoreszenz-Antikörper-Test. Die Kontakt-geimpften Jungsäue (#476 und #480) wurden auf oronasalem Weg immunisiert, nachdem sie in engen Kontakt mit erkrankten Schweinen gebracht worden waren. Diese Schweine serokonvertierten in 90 Tagen nach der Aussetzung bzw. Impfung. Die Serokonversion wird durch einen IFA-Titer von größer 1 : 20 angezeigt.

Nachdem die immunisierten Jungsäue serokonvertiert waren, wurde deren Östrus (Brünstigkeit) synchronisiert, und sie wurden dann der Zucht überlassen. Die Trächtigkeit wurde mit Ultraschall bestätigt. Am 90. Trächtigkeitstag erhielten geimpfte und zum Vergleich vorgesehene trächtige Jungsäue intranasal 3,0 ml PRRS-Herausforderungs-Virus mit einem Titer von 1 · 10&sup4; FAID&sub5;&sub0;.

Die Vergleichs-Jungsäue #52 und #477 zeigten und ergaben insofern frühe Anzeichen einer Erkrankung, als sie verringerten Appetit hatten und erhöhte Körpertemperaturen von ca. 40ºC (103-104ºF) zwei bis drei Tage nach der Herausforderung aufwiesen. Es wurden keine klinischen Krankheitsanzeichen bei den ISU-P-ausgesetzten (geimpften) Jungsäuen festgestellt. Diese Ergebnisse belegen einen Schutz vor dem bzw. gegen das klinische Atemwege-Krankheitssyndrom.

Alle Jungsäue wurden so lange gehalten, bis die Schweine entwöhnt waren (4 Wochen nach dem Ferkeln/Werfen). Tabelle 2 zeigt die Ferkel/Wurfergebnisse aus diesem Versuch.

Die Wurfergebnisse wurden bezüglich Trächtigkeitsdauer (die Trächtigkeit ist normalerweise bei PRRS-Infektion verkürzt), Stillgeburten oder toten Föten, schwachen Schweinen und Mumien ermittelt. Diese Schwierigkeiten beim Ferkeln/Werfen sind alle ein Indiz einer PRRS-Infektion bei trächtigen Jungsäuen oder Säuen. Ausserdem wurde die Anzahl von Normal-Schweinen ebenfalls festgestellt.

Keine der Vergleichs-Jungsäue warf Normal-Schweine (0 von 22 Schweinen waren normal). Sieben (7) von 22 Schweinen waren tot geboren, und 15 von 22 waren schwach geborene Schweine. Die Dauer der Trächtigkeit der Vergleichs-Jungsäue war um 2,5 Tage verkürzt, was typisch für PRRS bei trächtigen Schweinen ist. In der immunisierten Gruppe (n = 50) waren 40 Schweine oder 80% normal geboren. Sechs (6) von 50 Schweinen waren tot geboren, und 4 von 50 Föten erschienen mumifiziert beim Wurf. Es gab keine schwachen Schweine in der geimpften Gruppe. Es ist klar, dass Jungsäue, die vorab Lebend-PRRSV ISU-P ausgesetzt waren bzw. damit geimpft wurden, und welche dann der Zucht überlassen und herausgefordert waren, gegen diese Herausforderung geschützt sind, wie dies auch das Fehlen direkter klinischer Krankheitsanzeichen bei den Jungsäuen und durch den Schutz der Föten, die sie tragen, belegt wird.

Wie ersichtlich, eignet sich, da die IFA-Testreagenzien, die zur Bestimmung des Serostatus der Jungsäue in dieser Untersuchung herangezogen wurden, aus PRRSV ISU-P abgeleitet wurden und eine direkte Korrelation zwischen dem Serostatus der Jungsäue und dem Schutz vor PRRS besteht, das PRRSV ISU-P- Isolat in Diagnosetests wie Indirekt-Fluoreszenz- Antikörpertests, wie hier belegt, zu ELISAs, Serumneutralisationsassays, Direkt-Fluoreszenz- Antikörperassays und zu weiteren Diagnoseassayverfahren des Standes der Technik. Daher wird auch ein Diagnoseassay, der aus Antigen abgeleitet ist, das aus PRRSV ISU-P erhältlich ist, gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt und angewandt.

In der zweiten Impfungs/Herausforderungs-Untersuchung wurden junge Schweine (4 bis 6 Wochen alt) mit verschiedenen inaktivierten, mit Adjuvans versehenen PRRSV ISU-P-Impfstoffen geimpft. Ein Impfstoff-Antigen-Vorrat wurde durch Inaktivierung des PRRSV ISU-P mit BEI hergestellt, wie vorher beschrieben, und entweder mit Carbopol, FCA/FIA oder mit Adj B als Adjuvans (Hilfslösung) versehen. Ein zweiter Impfstoff- Antigen-Vorrat wurde durch Inaktivierung des PRRSV ISU-P mit Formalin hergestellt, wie vorher beschrieben, und mit den gleichen drei Adjuvanzien als Hilfslösung versehen. Drei Schein-Impfungen wurden erzeugt, um sicherzustellen, dass die Adjuvanzien und Zellen keine falsche immunologische Reaktion stimulieren konnten. Der Schein-Impfstoff wurde hergestellt, indem uninfizierte Gewebekulturzellen mit Adjuvans versehen wurden. Zwei Schweine wurden mit jedem Impfstoff geimpft. Die Impfstoffe wurden subkutan an den Tagen 0, 21, 42 und 64 verabreicht. 7 Tage nach der letzten Impfung wurden die Schweine intranasal mit 103,5 FAIDsa virulentem Lebend-PRRSV herausgefordert. Alle Schweine wurden täglich nach der Herausforderungsbehandlung bezüglich klinischer Krankheitsanzeichen beobachtet. Außerdem wurden Blutproben entnommen und bezüglich der Gewinnung von Virus in Gewebekultur verarbeitet. Lebend-Virus, das im Blutstrom nach der Herausforderungsbehandlung vorgefunden wird, bedeutet und zeigt, dass eine Viremie aufgetreten ist.

Serumneutralisationstiter wurden am Beginn der Untersuchung, am Tag der Herausforderungsbehandlung und 19 Tage nach der Herausforderung bewertet. Es sollte angemerkt sein, dass der Serumneutralisationstest weniger empfindlich als der IFA-Test ist, der in der vorherigen Untersuchung angewandt wurde. Deshalb kann man diese Titerergebnisse nicht mit den vorherigen Titerergebnissen vergleichen.

In Tabelle 3 sind die Ergebnisse der Herausforderungsbehandlung aufgelistet. Keine klinischen Krankheitsanzeichen wurden in geimpften oder Vergleichsschweinen beobachtet. Ausserdem entwickelten weder geimpfte noch Vergleichsgruppen Serumneutralisationstiter während der Impfperiode. Dies zeigt an, dass es keine Aussetzung an bzw. Impfung mit Lebend-Virus während dieser Zeitperiode gab (die Vergleichsgruppen blieben negativ), und dies zeigt auch an, dass die Impfstoffe keine Humoralreaktion stimulierten, die hoch genug gewesen wäre, um mit einem Serumneutralisationstest gemessen zu werden. Die Tatsache, dass die Serumneutralisationstiterreaktion nach Herausforderung signifikant war, zeigt, dass alle Schweine wirksam mit dem Lebend-PRRS-Virus herausgefordert wurden. Eine Verifizierung dieser Herausforderungsimpfung liefert der Prozentsatz von Vergleichsschweinen, die Viremie zeigten und ergaben. Alle bis auf eines der Vergleichsschweine (87,5%) wurden infiziert. Die Immunreaktion bei geimpften Schweinen war so stark, dass sie dazu befähigt wurden, Viremie zu blockieren. Lediglich 1 von 12 der geimpften Schweine (8,3%) zeigten Viremie. Somit schützten die Impfstoffe bzw. Impfungen 91,7% der Schweine.

Ohne an eine besondere Theorie bezüglich der Erfindung gebunden zu sein, wird davon ausgegangen, dass eine Zangsführung des ursprünglichen PRRSV-Isolats durch einen speziell-adaptierten Klon aus MA 104(M)-Afrikanischen Grünaffen-Zellen (9009B) in erfolgreicher Weise eines oder mehrere Epitope des Virus zu verändern vermochte, was eine erhöhte Immunogenizität des Virus ergab, um dadurch die Herstellung von Impfstoff auf einem Gebiet zu ermöglichen, auf dem andere Wissenschaftler keinen Erfolg hatten. Tabelle 1

Reproduktion von Sptäphasenabtreibung und Reproduktionsversagen bei Säuen, ausgesetzt an PRRSV-Isolat ISU-P, verglichen mit nicht-ausgesetzten Vergleichsgruppen I. PRRS-Ausgesetzte Gruppe

a = Normal-Schweineträchtigkeitsdauer beträgt 114

b = PRRSV-positives gnotobiotisches Schweinelungenhomogenat- Inokulum

c = Gewebekultur-abgeleitetes PRRSV, 103,0 Fluoreszenz- Antikörper-Infektionsdosis 50 pro ml (FAID&sub5;&sub0;/ml)

d = Gewebekultur-abgeleitetes PRRSV, 104,0 FAID&sub5;&sub0;/ml

e = Gewebekultur-abgeleitetes PRRSV, 105,0 FAID&sub5;&sub0;/ml

II. Nicht-ausgesetzte Vergleichsgruppe
Tabelle 2 Ferkel/Wurfergebnisse von ISU-P-immunisierten und nicht­immunisierten Jungsäuen

+ bedeutet einen IFA-Titer von > 20

- bedeutet einen IFA-Titer von < 20

V bedeutet geimpft

C bedeutet Vergleich

Tabelle 3 PRRSV-inaktivierte Impf-Versuchsreihen-Zusammenfassung

a = SN-Reaktion am 19. Tag der Nach-Herausforderung, Beendigung des Versuchs

b = Virus-Isolierung aus Plasma zu jeder Zeit am 19. Tag der Nach-Herausforderungs-Testdauer,

Virus-Isolierung, nachgewiesen mit CPE in 9009B-Zellen und bestätigt durch deren FA-Färbung mit PRRSV-gruppenspezifischem monoklonalen Antikörper SDOW17


Anspruch[de]

1. Schwein (Porcine)-Reproduktiv- und Respirator-Syndrom- Virus (PRRSV)-Isolat, bezeichnet als ISU-P und hinterlegt unter Zugangs-Nr. ATCC VR 2402.

2. Verfahren zu Vermehrung und Wachstum des PRRSV-Isolats gemäß Anspruch 1 in einer Gewebekultur, die gegenüber Infektion empfindlich ist, um das Virus in einer Menge zu replizieren, die hinreicht, Tiere gegen PRRS zu schützen oder zur Diagnose von PRRS oder zur Identifizierung der Molekularstruktur von PRRSV zur Entwicklung rekombinanter Produkte verwendet zu werden, wobei man das Virus auf die Gewebekultur inokuliert und das replizierte Virus erntet.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin die Gewebekultur eine Zelllinie umfasst.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, worin die Gewebekultur eine Afrikanische Grünaffen-Nierenzelllinie ist.

5. Gewebekultur, enthaltend das PRRSV-Isolat gemäß Anspruch 1.

6. Gewebekultur gemäß Anspruch 5 in handelsüblichem Maßstab von > 25 l mit einem Fluoreszenz-Antikörper-Infektions-Dosis von. 50 pro ml FAID50-Titer von > 10510 ml.

7. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes, der wirksam zum Schutz von Schweinen vor bzw. gegen PRRS ist, wobei man das PRRSV-Isolat gemäß Anspruch 1 bereitstellt, das Virus aus einer Gewebekultur freisetzt und antigene Masse durch Verdünnen, Konzentrieren oder Extrahieren zubereitet, um eine immunologisch wirksame Menge der antigenen Masse für eine modifiziert lebende (verdünnte), inaktive, Untereinheits- oder rekombinante Formulierung herzustellen.

8. Impfstoff, umfassend das PRRSV-Isolat gemäß Anspruch 1.

9. Impfstoff, erhältlich durch das Verfahren gemäß Anspruch 7, worin das PRRSV modifiziert lebend (verdünnt) ist und in einer flüssigen, gefrorenen oder trockenen Form vorliegt.

10. Impfstoff gemäß Anspruch 8 oder 9, worin das PRRSV inaktiviert ist, und worin ein Adjuvans und gegebenenfalls ein geeignetes Konservierungsmittel enthalten sind.

11. Impfstoff gemäß Anspruch 10, worin das Adjuvans entweder Öl- oder Wasser-basiert ist.

12. Impfstoff gemäß Anspruch 11, worin das Adjuvans aus Freunds Komplett-Adjuvans und Freunds Inkomplett-Adjuvans ausgewählt ist.

13. Impfstoff gemäß Anspruch 10, worin das Inaktivierungsmittel binäres Ethylenimin, β-Propiolacton oder Formalin ist.

14. Impfstoff gemäß Anspruch 9, worin die Gewebekultur eine Afrikanische Grünaffen-Nierenzelllinie ist.







IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
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