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Dokumentenidentifikation DE69704011T2 07.06.2001
EP-Veröffentlichungsnummer 0835930
Titel Europäische Vakzinstämme des Fortplanzungs-Atmungs-Syndromsvirus des Sweins (PRRSV)
Anmelder Akzo Nobel N.V., Arnheim/Arnhem, NL
Erfinder van Woensel, Petrus A.M., 5831 NL Boxmeer, NL;
Demaret, Jean G.J., 5831 CH Boxmeer, NL
Vertreter WUESTHOFF & WUESTHOFF Patent- und Rechtsanwälte, 81541 München
DE-Aktenzeichen 69704011
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 07.10.1997
EP-Aktenzeichen 972031116
EP-Offenlegungsdatum 15.04.1998
EP date of grant 31.01.2001
Veröffentlichungstag im Patentblatt 07.06.2001
IPC-Hauptklasse C12N 7/00
IPC-Nebenklasse A61K 39/12   A61K 39/295   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft einen lebenden attenuierten Stamm eines europäischen Serotyps des Virus des porcinen Reproduktiven und Respiratorischen Syndroms (PRRSV); Verfahren zur Herstellung eines solchen Stamms, darauf basierende Impfstoffe und Verfahren zur Herstellung solcher Impfstoffe.

1987 wurde eine bis dahin unbekannte Krankheit bei Schweinen in Nordamerika nachgewiesen, von wo sie sich später über Kanada ausbreitete (Hill, H.; in: Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, 6. Oktober 1990, Denver, Colorado, Livestock Conservation Institute, Madison Wi, USA; Keffaber et äl., Am. Assoc. Swine Pract. Newsletter 1 : 1-9 (1989)). Die Krankheit, die durch die Tatsache charakterisiert ist, dass sie sowohl einen Abort als auch eine respiratorische Erkrankung hervorruft, wurde zunächst als Mysteriöse Schweinekrankheit (MSD) bezeichnet. Heutzutage ist die Krankheit in Amerika und Kanada als Schweineinfertilitäts- und respiratorisches Syndrom bekannt (SIRS).

Seit 1990 wurde diese Erkrankung auch in Europa festgestellt, wo sie zunächst Ausbrüche in Deutschland, gefolgt von Ausbrüchen in Belgien und den Niederlanden verursachte, und diese Krankheit breitet sich nun in Europa aus. In Europa ist diese Krankheit gemeinhin als porcines Reproduktives Respiratorisches Syndrom (PRRSV) und als porcines epidemisches Abort- und Respirationssyndrom (PEARS) bekannt.

Gegenwärtig wird diese Krankheit weltweit als PRRS bezeichnet.

Die Pathologie ist nicht auf Abort und eine respiratorische Erkrankung beschränkt. Andere Symptome, die mit der Krankheit einhergehen, sind: Nahrungsverweigerung, Anorexie, blaue Verfärbung der Extremitäten, insbesondere der Ohren.

Die pathogenen Wirkungen der Krankheit sowohl bezüglich Abort als auch der respiratorischen Erkrankung sind ausführlich in dem umfassenden Bericht von Christianson et al. (Swine Health and Production 2 : 10-28 (1994)) beschrieben.

Als verursachendes Agenz ist nun ein kleines umhülltes RNA- Virus bekannt, das zu den Arteriviridae gehört.

Beobachtungen von Wensvoort et al., (J. Vet. Diagn. Invest. 4 : 134-138 (1992) und von Murtaugh at al., (Arch. Virol. 140: 1451-1460 (1995) machten eindeutig klar, dass zwei völlig verschiedene (Sero)Typen des Virus existieren: der amerikanische und der europäische Serotyp.

Der europäische Typ dieses Virus wurde von Wensvoort et al. (The Vet. Quarterly; 13 : 121-130 (1991)) beschrieben. Ein Stamm dieses europäischen Typs, als das "Lelystad Virus" (LV) bezeichnet, wurde beim Institut Pasteur, Paris, Frankreich unter der Nummer I-1102 in Verbindung mit der PCT WO 92/21375 beim Zentralen Veterinärinstitut Lelystad, Niederlande hinterlegt.

Ein anderer europäischer Stamm wurde in der EPA NR. 91 202 646.5 beschrieben und wurde bei der Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) des Institut Pasteur in Paris, Frankreich unter der Nummer I-1140 hinterlegt.

Dieser europäische Stamm wurde kürzlich von Conzelmann et al. (Virology 193 : 329-339 (1993)) beschrieben.

Der amerikanische Virustyp wurde von Benfield et al. (J. Vet. Diagn. Invest. 4 : 127-133 (1992)) beschrieben. Ein Stamm des amerikanischen Typs wurde bei der ATCC unter der Nummer VR- 2332 hinterlegt und wird in der PCT WO 93/03760 und der europäischen Patentanmeldung 0 529 584 genannt.

Ein attenuierter Stamm des amerikanischen Serotyps wurde in der europäischen Patentanmeldung 0 529 584 beschrieben. Dieser Stamm stammt direkt von dem hinterlegten amerikanischen VR-2332 Stamm.

Tiere, die mit diesem Stamm geimpft sind, werden daher keinen effizienten Schutz gegen eine Infektion mit einem Europäischen Serotyp erhalten.

Dies machte die Entwicklung eines lebenden attenuierten Stamms des europäischen Serotyps, der als Basis für einen Impfstoff gegen europäische Serotypen verwendet wird, notwendig.

In der europäischen Patentanmeldung Nr. EP 0 676 467 wurden zum ersten Mal lebende attenuierte Stämme des europäischen Serotyps offenbart. Beispiele von attenuierten Stämmen des europäischen Serotyps sind die Virusstämme PRRS C und PRRS D, die bei Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) des Institut Pasteur in Paris, Frankreich unter der Nummer I-1387 (Stamm D) und der Nummer I-1388 (Stamm C) hinterlegt wurden.

Diese Stämme sind als Basis für lebende attenuierte Impfstoffe gegen PRRSV sehr wirkungsvoll, besitzen jedoch immer noch eine gewisse Virulenz. Daher sind alternativ attenuierte PRRSV-Stämme und Verfahren zur Herstellung solcher Viren erwünscht.

Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung lebende attenuierte PRRSV-Virusstämme eines europäischen Serotyps, der das gewünschte Merkmal einer alternativ attenuierten Eigenschaft im Vergleich zu den existierenden attenuierten PRRS- Virusstämmen besitzt, zur Verfügung zu stellen.

Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zur Herstellung eines solchen lebenden attenuierten PRRSV-Impfstoffs zur Verfügung zu stellen.

Diese Gegenstände werden durch die vorliegende Erfindung erbracht, die lebende attenuierte PRRS-Virusstämme eines europäischen Serotyps zur Verfügung stellt, die das einzigartige Merkmal haben, dass sie für Makrophagen nicht infektiös sind. In den Beispielen wird gezeigt, dass solche Stämme in Schweinen abgeschwächter sind als ihre Elternstämme, die für Makrophagen immer noch infektiös sind.

Der Ausdruck "für Makrophagen nicht infektiös" muss wie folgt verstanden werden: eine Dosis von ≤ 10&sup4; für Gewebekulturen infektiöse Dosen (TCID)&sub5;&sub0; gemäß der vorliegenden Erfindung ergibt selbst nach 7 Tagen Infektion keinen sichtbaren CPE auf einer Makrophagenkultur. Ein typischer, für Makrophagen infektiöser Feldstamm würde mit infektiösen Partikeldosen von 1 TCID&sub5;&sub0; an eine volle CPE ergeben.

Viren des europäischen Serotyps sind dadurch gekennzeichnet, dass sie einen höheren Serumtiter in einem Immunperoxidase- Monotiterassay mit einer Auswahl an Antiseren gegen das europäische PRRSV-Virus LV (CDI-NL-2,91, wie beim Institut Pasteur unter I-1102 hinterlegt) ergeben, wenn sie mit einer Reaktion mit einer Auswahl an Antiseren gegen den amerikanischen Virus SIRSV (ATCC VR-2332) verglichen werden.

Es ist ein weiteres Merkmal der Erfindung, dass sie Verfahren zur Herstellung lebender attenuierter PRRSV-Stämme gemäß der Erfindung zur Verfügung stellt. Gegenwärtig werden alle europäischen PRRSV-Stämme aus Makrophagen infizierter Tiere erhalten, und dann, wenn möglich, auf MA 104-Zellen oder Klonen davon für eine Vermehrung gehalten. Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf eine Adaptation von auf MA 104 gewachsenem PRRS-Virus auf nicht MA 104-Zellen. Diese nicht-MA 104-Zellen können zum Beispiel Zellen mit einer begrenzten Lebenszeit oder etablierte unsterbliche Zelllinien sein. Im allgemeinen werden die nicht MA 104 Zellen Säugetierzellen sein. Säugetierzellen, die nicht MA 104 -Zellen sind, sind zum Beispiel Zelilinien für allgemeine Zwecke, wie BHK-Zelllinien, CRFK-Zelliinien und Madin Darby Kälbernierenzelllinien oder zum Beispiel porcine Zellen, wie Schweinehodenzellen oder Schweinnierenzellen oder sie können nicht-MA 104 Primatenzellen, wie beispielsweise Vero-Zellen sein.

Das Adaptieren von PRRSV an andere als ihre natürlichen Wirtszellen umfaßt Standardverfahren, die wie folgt durchgeführt werden können: ein spezifisches PRRS-Virusisolat wird auf einer Kultur wachsen gelassen, die porcine oder andere suszeptible Zellen nicht-porcinen Ursprungs enthält, auf denen sich die Viren vermehren können, wie beispielsweise MA 104-Zellen. Nach dem Wachstum werden die PRRSV durch Sammeln der Zeilflüssigkeiten und/oder gefolgt von einer Passage der Zellkulturflüssigkeiten und/oder Zellen auf einen anderen Zelltyp zur Adaptation geerntet.

Stämme, die zuerst an eine nicht-MA 104 Zelllinie adaptiert wurden, können an eine weitere nicht-MA 104 Zeillinie für eine weitere Attenuierung adaptiert werden. Falls erwünscht, kann dieser Adaptationsprozess noch auf weiteren nicht-MA 104-Zellen wiederholt werden. Adaptation an Wachstum bei verschiedenen Temperaturen kann ebenfalls Teil des Adaptationsprozesses sein.

Nach der Passage auf nicht-MA 104-Zellen, kann der nicht- Makrophagen-infektiöse Charakter nach einer kleinen Anzahl von Passagen erhalten werden. Eine Anzahl von 5 Passagen, gewöhnlich die Anzahl der Passagen, die notwendig ist, um ein "Master"-Saatvirus zu erhalten, ist häufig ausreichend, ein nicht-Makrophagen-infektiöses Virus gemäß der Erfindung zu erhalten.

In einer bevorzugten Form verwendet das Verfahren nicht-MA 104 Primatenzellen als Adaptationszellen. Es ist klar, dass nach der Adaptation an nicht-MA 104 Primatenzellen jede weitere Adaptation auf jeder anderen geeigneten Zelle durchgeführt werden kann.

In einer bevorzugteren Ausführungsform verwendet das Verfahren Vero-Zellen als nicht-MA 104-Primatenzellen für die Adaptation.

Untersuchen auf nicht-Makrophagen-infektiösen Charakter der so erhaltenen lebenden attenuierten Stämme kann einfach durchgeführt werden, indem die Abwesenheit von Wachstum auf den so erhaltenen Stämmen in vitro auf Makrophagen getestet wird.

Standardtechniken, sowohl für die Herstellung von Makrophagenkulturen und Vermehrung von Makrophagen-infektiösem Virus ist im Stand der Technik bekannt und wurde zum Beispiel in der WO 93/07898 beschrieben. Ein einfaches Testsystem, basierend auf Makrophagen, die unter Standardbedingungen isoliert und wachsen gelassen werden, reichen als ein Testsystem aus, um lebende attenuierte PRRSV-Stämme gemäß der Erfindung von anderen lebenden attenuierten PRRS-Viren zu unterscheiden, die ihren Makrophagen-infektiösen Charakter noch beibehalten haben. Ein mögliches Testsystem ist in Beispiel 2 beschrieben.

Der attenuierte Charakter der PRRSV-Stämme gemäß der vorliegenden Erfindung kann ausgehend von 2 Stämmen dargestellt werden: I-1140, ein pathogener, 1991 in den Niederlanden isolierter PRRSV-Stamm und I-1387, ein gering pathogener PRRSV- Feldstamm (beide Stämme sind bei der Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) des Institut Pasteur in Paris, Frankreich ihrer jeweiligen Nummer hinterlegt). Diese Elternstämme sind für Makrophagen infektiös. Aus einem dieser Elternstämme wurden attenuierte, nicht-Makrophagen-infektiöse Stämme gemäß der Erfindung, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Der Makrophagen-infektiöse Charakter wurde wie in Beispiel 2 beschrieben bestimmt.

Die folgenden Stämme standen für Tests zur Verfügung:

1. I-1140 88. Passage auf MA 104-Zellen

2. I-1140 61. Passage auf Vero-Zellen

3. I-1387 20. Passage auf MA 104-Zellen

4. I-1387 49. Passage auf Vero-Zellen

Das folgende zeigt die Testresultate der Untersuchung bezüglich Infektionscharakteristika dieser Stämme:

Tabelle 1. Vergleich der Stämme gemäß der Erfindung und hohe Passagenzahlen der Elternstämme

Ebenfalls sehr geeignet als Elternstämme für eine Attenuierung gemäß der vorliegenden Erfindung sind PRRS-Viren, die bereits bezüglich eines anderen Aspekts (d. h. nicht bezüglich auf Makrophageninfektiosität) attenuiert sind. Solche Viren sind in der EP 0 676 467, wie oben bemerkt, beschrieben. Diese Virusstämme gehören zu einem europäischen Serotyp und reagieren mit dem monoklonalen Antikörper A27, der von dem Hybridom A27 produziert wird und bei der Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) des Institut Pasteur in Paris, Frankreich unter der Nummer I-1401 hinterlegt ist, sie reagieren jedoch nicht mit dem monoklonalen Antikörper A35, hinterlegt bei der Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) des Institut Pasteur in Paris, Frankreich unter der Nummer I 1402. Wenn solche Viren für Makrophagen gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung nichtinfektiös gemacht werden, sind sie noch sicherer, denn ihre attenuierte Eigenschaft hängt von zwei oder mehreren verschiedenen Aspekten ab, von denen einer die nicht- Makrophagen-infektiöse Eigenschaft ist. Daher hat das lebende attenuierte PRRSV gemäß der Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die zusätzlichen Eigenschaften mit dem monoklonalen Antikörper A27, wie von dem Hybridom A27 hergestellt, das bei der Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) des Institut Pasteur in Paris, Frankreich hinterlegt ist, zu reagieren, jedoch nicht mit dem monoklonalen Antikörper A35, der beim Institut Pasteur in Paris, Frankreich unter der Nummer I 1402 hinterlegt ist.

Da der nicht-Makrophagen-infektiöse Stamm gemäß der vorliegenden Erfindung, der von dem I-1387-Stamm stammt, nach seiner Passage über Vero-Zellen so sehr attenuiert ist, ist dieser lebende attenuierte Stamm außerordentlich sicher, wenn er Tieren verabreicht wird (siehe Beispiel 2 und weitere). Daher stammt der lebende attenuierte PRRSV in einer bevorzugteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung von dem Stamm, der von AKZO Nobel NV bei der Collection Nationale de Culture de Microorganismes de Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 unter der Hinterlegungsnummer I-1758 hinterlegt wurde. Diesem Stamm wurde die Identifizierungsreferenz "PRRSV-Stamm DV" gegeben und wird in der vorliegenden Beschreibung als Stamm DV bezeichnet.

Die lebenden attenuierten Viren der vorliegenden Erfindung sind, als ein Ergebnis ihrer Unfähigkeit Makrophagen zu infizieren, aus den folgenden Gründen eine sehr geeignete Grundlage für Impfstoffe:

Diese Stämme sind für Makrophagen nicht infektiös. Der Makrophage ist die primäre Zielzelle des Wildtyp-PRRSV und eine der Schlüsselzellen des Immunsystems. Sie haben dennoch ihre Fähigkeit behalten, das Immunsystem anzuschalten. Im Gegensatz zu Impfstoffen, die auf bekannten lebenden attenuierten Stämmen des europäischen Serotyps wie in der europäischen Patentanmeldung Nr. EP 0 676 467 beschrieben, basieren, schalten daher die Impfstoffe, die lebende attenuierte Viren gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, das Immunsystem an, ohne es zur gleichen Zeit zu beeinträchtigen. Impfstoffe, die auf den Stämmen der vorliegenden Erfindung basieren, ermöglichen daher eine andere Sicherheit als Impfstoff, die auf bekannten attenuierten Stämmen basieren.

In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung deshalb Impfstoffe zum Schutz von Schweinen gegen PRRSV-Infektion zur Verfügung, die auf lebenden nicht- Makrophagen-infektiösen attenuierten PRRS-Stämmen, wie oben beschrieben, beruhen.

Aufgrund der Sicherheit der nicht-Makrophagen-infektiösen Viren können Impfstoffe, die auf diesen Viren basieren, typischerweise 10³-10¹&sup0; lebende Viruspartikel enthalten.

Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung können einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen. Ein möglicher Träger ist eine physiologische Salzlösung. Ein anderer pharmazeutisch annehmbarer Trägerstoff ist zum Beispiel die Gewebekulturflüssigkeit, die verwendet wird, um das Zellwachstum zu stoppen und in die das Virus aus den infizierten Zellen abgegeben wird.

Ein Adjuvans und falls erwünscht ein oder mehrere Emulgatoren wie beispielsweise Tween® und Span® können ebenfalls in den lebenden attenuierten Impfstoff gemäß der Erfindung aufgenommen werden.

Geeignete Adjuvanzien sind zum Beispiel Vitamin E-Acetat- Lösungsvermittler, Aluminiumhydroxid, -phosphat oder -oxid, (Mineral)Ölemulsionen wie Bayol® und Marco152® und Seifen. Der Einbau von Antigenen in Iscoms ist ebenfalls eine Möglichkeit für ein Adjuvans.

Der Impfstoff gemäß der Erfindung wird vorzugsweise in gefriergetrockneter Form hergestellt. Es ist von Vorteil einen Stabilisator zu den lebenden attenuierten Viren zu geben, insbesondere wenn eine trockene Zusammensetzung der Viren durch Lyophilisierung hergestellt wird. Geeignete Stabilisatoren sind zum Beispiel SPGA (Bovamik et al., J. Bacteriology 59, 509, 1950); Kohlenhydrate (beispielsweise Sorbit, Mannit, Trehalose, Stärke, Saccharose, Dextran oder Glukose), Proteine (beispielsweise Albumin oder Casein) oder Abbauprodukte davon und Puffer (beispielsweise Alkalimetallphosphate). Falls erwünscht, können eine oder mehrere Verbindungen mit Adjuvanzaktivität, wie oben beschrieben, hinzugefügt werden.

Ein Impfstoff gemäß der Erfindung kann durch intramuskuläre oder subkutane Injektion oder via intranasaler, intratrachealer, oraler, kutaner, perkutaner/intradermaler oder intramuskulöser Gabe verabreicht werden. Ein sehr einfacher Weg ist die intradermale oder intramuskuläre Verabreichung. Daher umfaßt der Impfstoff der vorliegenden Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform einen Trägerstoff, der für eine intramuskuläre oder intradermale Verabreichung geeignet ist. Eine physiologische Salzlösung ist z. B. ein einfacher und geeigneter Trägerstoff für eine intramuskuläre oder intradermale Anwendung.

Der Impfstoff gemäß der Erfindung kann Schweinen in Abhängigkeit der Impfgeschichte der Mutterschweine im Alter von 1, 3, oder 10 Wochen verabreicht werden, Mutterschweinen vor der Paarung und/oder 6 Wochen vor dem Werfen (Booster-Impfung) oder bei Ebern halbjährlich (Boosterimpfungen).

In einer bevorzugten Form umfaßt der Impfstoff de vorliegenden Erfindung neben dem lebenden attenuierten PRRS-Virus einen weiteren nicht verwandten (d. h. nicht PRRSV-)attenuierten oder inaktivierten Krankheitserreger oder antigenes Material von einem anderen Krankheitserreger. Solch ein Pathogen kann zum Beispiel ein Bakterium oder ein Parasit sein, kann aber auch viralen Ursprungs sein. Gewöhnlich wird der nicht verwandte Krankheitserreger oder antigenes Material davon ein porciner Krankheitserreger sein.

Ein Impfstoff gemäß der Erfindung, der auch solche zusätzlichen attenuierten oder inaktivierten Krankheitserreger oder antigenes Material von einem anderen Krankheitserreger umfaßt, hat den Vorteil, dass er zur gleichen Zeit gegen verschiedene Infektionen schützt.

Antigenes Material wird als Material verstanden, das fähig ist, eine Immunantwort auszulösen. Beispiele von antigenem Material sind Proteine, Polysaccharide und Lipopolysaccharide.

In einer bevorzugteren Form wird der Krankheitserreger ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pseudorabies Virus, porcines Influenzavirus, porcines Parvovirus, Übertragbares Gastroenteritisvirus, Rotavirus, Escherichia coli, Erysipelo rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hypopneumoniae und Actinobacillus pleuropneumoniae.

Ein Impfstoff gemäß der Erfindung kann von jedem lebenden attenuierten PRRS-Virusisolat eines europäischen Serotyps gemäß der vorliegenden Erfindung stammen.

Der hinterlegte PRRSV-Stamm DV, unter Anwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt, besitzt alle Eigenschaften, die einen sehr geeigneten Impfstamm ausmachen. Daher stammt der Impfstoff in einer bevorzugten Ausführungsform von dem PRRSV-Stamm DV, der beim Institut Pasteur unter der Zugangsnummer I-1758 hinterlegt ist.

In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung eines lebenden attenuierten Impfstoffs zur Bekämpfung von PRRS zur Verfügung.

Ein einfacher Weg einen Impfstoff basierend auf einem lebenden PRRSV gemäß der Erfindung zu erhalten, umfaßt Mischen einer geeigneten Menge Virus gemäß der Erfindung mit einem pharmazeutisch geeigneten Trägerstoff.

Zusätzlich können andere Materialien, wie beispielsweise die oben genannten Adjuvanzien, Emulgatoren und Stabilisatoren zugegeben werden, die die Wirkung und Stabilität des Impfstoffs verbessern.

Beispiel 1: Adaptationsexperimente.

Adaptation des PRRSV-Isolats I-1140 an Vero-Zellen:

1-1140, ein pathogener PRRSV-Stamm, der 1991 in den Niederlanden isoliert wurde (wie oben bemerkt und bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) des Institut Pasteur in Paris, Frankreich unter dieser Nummer hinterlegt wurde), wurde zuerst in porcinen Lungenmakrophagen kultiviert und dann wie folgt auf MA 104-Zellen wachsen gelassen:

Halb-konfluente Monolayer MA 104-Zellen (70 cm²) wurden mit dem PRRSV-Stamm bei 80%-iger Konfluenz mit einem MOI von 1 inokuliert. Die Inokulation wurde durchgeführt, indem zuerst das Gewebekulturmedium entfernt wurde, dann wurde 1 ml PRRS- Virus zugegeben und mindestens 2 Stunden bei 37ºC auf dem Monolayer belassen. Nach dieser Zeitspanne wurde neues Gewebekulturmedium zugegeben und die Zellen weiter bei 37ºC in befeuchtetem CO&sub2; (5% CO&sub2;) inkubiert. Wenn CPE beobachtet wurde, wurde der Überstand gesammelt und die Zellen dreimal gefriergetrocknet, 10 Minuten bei 2000 UpM zentrifugiert und der Überstand gesammelt. Beide Überstände wurden vereint und verwendet, um frische Monolayer der gleichen Zellen zu inokulieren. Dieser Prozess wurde dann wiederholt, bis das Virus völlig an die Zelhinie adaptiert war und Titer vergleichbar mit Makrophagenkulturen auf dieser Zelhinie erhalten werden konnten. Während dieses Prozesses wurde die Identität des Virus durch Immunfluoreszenzassay (IFA) sowohl mit PRRSVspezifischem polyklonalen Serum als auch mit PRRSVspezifischen monoklonalen Antikörpern bestimmt.

Die 5. Passage von I-1140 auf MA 104-Zellen wurde verwendet, um CVl (Grüne Afrikanische Affennieren)zellen nach dem folgenden Verfahren zu infizieren:

CV1-Zellen wurden unter standardisierten Zellwachstumsbedingungen wachsen gelassen.

Bei 70 bis 80% Konfluenz wurde das Medium von dem CVl- Monolayer entfernt. Der Überstand, der bei einem maximalen CPE von einem infizierten Monolayer MA 104-Zellen erhalten wurde, wurde zuerst durch einen 0,2 jim-Filter gefiltert und dann auf den CV1-Monolayer gegeben. Nach einem Tag Inkubation bei 37ºC und 5% CO&sub2; wurde das Medium durch ein neues Gewebekulturmedium ersetzt. Die Zellen wurden weitere 7 Tage bei 37ºC und 5% CO&sub2; inkubiert. Während dieser Zeitspanne wurden die Zellen täglich mikroskopisch untersucht. Nach 7 Tagen wurden die Zellen 3x gefroren und aufgetaut, die Überstände durch Zentrifugation geerntet und durch einen 0,2 um-Filter gefiltert. Das gefilterte Material wurde dann verwendet, um einen neuen Monolayer CV1-Zellen wie oben beschrieben zu inkubieren. Dieses Verfahren wurde 3 Runden durchgeführt, nach der dritten Runde wurden die geernteten und gefilterten Überstände auf Anwesenheit von PRRSV untersucht, indem die Überstände auf MA 104-Zellen inkubiert wurden. Die Anwesenheit von PRRSV wurde durch Anwesenheit einer PRRSVspezifischen Fluoreszenz unter Verwendung PRRSVspezifischer monoklonaler Antikörper I-1401 gezeigt. (Monoklonaler Antikörper I-1401 wurde bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) des Institut Pasteur in Paris, Frankreich unter dieser Nummer hinterlegt).

Ein PRRSV-Titer von 6, 6 TID&sub5;&sub0;/ml wurde in den Überständen der CVl-Zellen festgestellt.

Passage 13 des I-1140 auf CV1-Zellen wurde mittels dem oben beschriebenen Verfahren auf Vero-Zellen gebracht. Dieses Mal wurde nach 3 Runden blinden Passagierens PRRSV im Überstand der Vero-Zellen nachgewiesen. Das Virus wurde weiter an Vero- Zellen mittels 61 Passagen adaptiert.

Zum Vergleich wurde die 88. Passage des Elternstamms I-1140 auf MA 104-Zellen, die daher nicht auf nicht-MA 104-Zellen adaptiert war, in Tabelle 1 als Kontrolle verwendet, in der die Makrophageninfektiosität der verschiedenen Stämme verglichen wurde.

Adaptation des PRRSV-Isolats I-1387 auf Vero-Zellen Isolat I-1387 wurde zuerst auf porcinen Lungenmakrophagen kultiviert. Die 5. Passage des I-1387 wurde dann auf MA 104- Zellen mittels dem oben beschriebenen Verfahren gegeben. Passage 38 von I-1387 auf MA 104-Zellen wurde verwendet, um Vero-Zellen gemäß dem oben angegebenen Verfahren zu infizieren.

PRRSV wurde im Überstand der Vero-Zellen nachgewiesen. Dieses Isolat wurde weiter an Vero-Zellen mittels Durchführung von 49 Passagen auf diesen Zellen adaptiert.

Dieser Stamm wurde in den Sicherheitsexperimenten und Impfchallengeexperimenten, die in den Beispielen 2 und 3 beschrieben sind, verwendet.

Zum Vergleich wurde die 20. Passage des Elternstamms I-1387, die auf MA 104-Zellen und daher nicht auf nicht-MA 104-Zellen adaptiert, als Kontrolle in Tabelle 1 verwendet, in der die Makrophageninfektiosität der verschiedenen Stämme verglichen wurde.

Beispiel 2: Testsystem für Makrophageninfektiosität.

In diesem Test wurden die vier Virusstämme, die in Tabelle 1 (siehe supra) genannt wurden, wie folgt auf Makrophageninfektiosität untersucht:

Schweinealvelolarmakrophagen wurden wie folgt erhalten: SPF- Schweine wurden geschlachtet, ihre Lungen entfernt und mit 3000 ml PBS gewaschen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und in MEM-Medium (GIBCO) + 10% FCS zu einer Konzentration von 0,3 · 10&sup6; Zellen/ml resuspendiert. Schließlich wurden die Zellen auf Mikrokulturplatten mit 96 Vertiefungen mit 225 ul Zellsuspension/Vertiefung ausgesät und die Platten wurden 4 Tage in einem CO&sub2;-Inkubator inkubiert.

Gerade vor der Titrierung wurden die Mikrotiterplatten geleert und mit frischem Medium aufgefüllt. 25 ul-Proben, 10&sup4; MA-infektiöse Viruspartikel des zu testenden Viruspartikels enthaltend, wurden in die Vertiefungen gebracht und 10-fach- Verdünnungen wurden hergestellt. Schließlich wurden die Platten in einem CO&sub2;-Inkubator 7 Tage inkubiert.

Es konnte kein Wachstum der Makrophagen wie durch CPE gemessen für die Stämme, die auf nicht-MA104-Zellen adaptiert waren, festgestellt werden, wohingegen die nicht-adaptierten Kontrollstämme wie erwartet für Makrophagen infektiös waren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 (siehe supra) gezeigt.

Beispiel 3: Attenuierungstests.

Um zu testen, ob die Adaptation des Virus an diese Zellen eine positive Attenuierung der Virulenz induzierte, wurden alle Virusstämme in trächtigen Schweinen mittels dem folgenden Verfahren getestet:

Mutterschweine, die bezüglich des PRRS-Virus und PRRSVspezifischer Antikörper negativ waren, wurden mit einem oben genannten PRRSV-Stämme ungefähr 90 Tage nach Beginn der Trächtigkeit infiziert. Um die Virulenz eines gegebenen Stamms zu messen, wurde die Anzahl der Ferkelaborte und die Anzahl der Ferkel, die innerhalb einer Woche starben, bestimmt.

Tabelle 2. Attenuierungsergebnisse.

Von der oben angegebenen Tabelle 2 kann geschlossen werden, das die PRRSV-Stämme, die ihre Makrophageninfektiosität verloren haben, vorteilhafte attenuierte Eigenschaften zeigen.

Für I-1140 wurden signifikant weniger tote Ferkel nach der Infektion der Mutterschweine mit dem nicht-Makrophageninfektiösen Stamm festgestellt. In Anbetracht der Tatsache, dass im Vergleich zu dem Elternstamm I-1140 eine dreihundertfache Menge der Dosis der an Vero adaptierten I-1140 verabreicht wurde, konnte eine substantielle Reduzierung der Virulenz erzielt werden.

Eine gleiche Wirkung wird in dem Experiment beobachtet, in dem I-1387 den Mutterschweinen verabreicht wurde. Eine Dosis von 107,5 TCID&sub5;&sub0; verursachte immer noch eine signifikante Zahl toter Ferkel. Mit dem nicht-Makrophagen-infektiösen Stamm wurde jedoch eine bemerkenswerte Reduzierung der Virulenz beobachtet; obwohl eine extrem hohe Dosis verabreicht wurde (10-facher Anstieg bezüglich der Dosis von 107,5 TCID&sub5;&sub0;), wurde eine signifikant niedrigere Zahl toter Ferkel festgestellt.

Beispiel 4: Sicherheitsexperimente. I) Sicherheit des Stamms DV in 5-6 Wochen alten Ferkeln. Einzeldosis und hohe Dosis.

Drei Experimente schlossen die Impfung von Zieltieren ein: junge Ferkel. Der Aufbau des Experiments ist in Tabelle 3 zusammengefasst.

Für den Sicherheitstest wurden die Tiere auf mögliche klinische Anzeichen untersucht, die auf die Impfung zurückzuführen sind.

* i.m.: intramuskulär i.d.: intradermal

Tabelle 3. Ergebnisse:

In diesen Experimenten wurden nach der Impfung keine klinischen Zeichen bemerkt.

Schlussfolgerung.

Die erfindungsgemässen Stämme sind für die Zieltiere absolut sicher: junge Ferkel.

II) Sicherheit für schwangere Mutterschweine

Das schwangere Mutterschwein wird als das empfindlichste Tier für Sicherheitsuntersuchungen angesehen, weil eine Infektion mit dem PRRS-Virus nach ungefähr 90 Schwangerschaftstagen zu einem hohen Prozentsatz an Aborten und Totgeburten (30-100%) und zu einem hohen Prozentsatz an Toten in der ersten Woche nach der Geburt, nachdem die Ferkel lebend geboren wurden, führt.

In diesem Sicherheitstest wurde jedes Mutterschwein bei 94 Schwangerschaftstagen sowohl intramuskulär als auch intradermal mit einer massiven Dosis von 108,3 TCID&sub5;&sub0; pro Injektionsstelle geimpft.

Die Untersuchungen schlossen die folgenden Punkte ein:

- Lokale und systemische Reaktionen der Mutterschweine

- Antikörpermenge in den Mutterschweinen bei der Entbindung, um die "Aufnahme" des Impfstoffs zu zeigen

- Reproduktives Verhalten der Schweine

- Virus-Rückisolierungen aus Serumproben von Ferkeln am Tag der Geburt

Ergebnisse:

Die in einem Immunfluoreszenzassay gemessene Antikörpermenge betrug > 8(log&sub2;) in allen Mutterschweinen, was zeigte, dass das Virus aufgenommen wurde. Nach der Impfung wurden keine systemischen Reaktionen während eines Zeitraums von 5 Tagen beobachtet, in denen die Temperatur überwacht wurde sowie während 14 Tagen klinischer Beobachtung. Nur bei einem Mutterschwein wurde 7 Tage post i.m.-Impfung eine geringe lokale Reaktion beobachtet. Während einer Woche nach intradermaler- Verabreichung wurde eine lokale Hautreaktion gesehen: Rötung, Hitze, palpatierbare Flecken und einige Läsionen. Diese lokalen Hautreaktionen verschwanden schnell und waren in der zweiten Woche nicht länger sichtbar.

Die Ergebnisse dieser wiederholbaren Behandlung sind in Tabelle 4 zusammengefasst:

Tabelle 4.

* Die zwei Ferkel von Mutterschwein 4608, die mit dem Mutterschwein 465 plaziert wurden, überlebten.

Die Anzahl der Ferkel, die überlebten, wird mindestens als eine normale Durchschnittszahl (> = 10,8 gemäß Handboek voor de Varkenshouderij ISBN 90-800999-3-7) betrachtet. Sie steht voll im Einklang mit dem reproduktiven Verhalten, das zuvor bei diesen Schweinen festgestellt wurde.

Schlussfolgerung.

Obwohl in extrem hohen Dosen zu einem optimalen Zeitpunkt der Schwangerschaft einen Abort zu induzieren, verabreicht, konnten bei diesem Experiment keine klinischen Zeichen einer PRRSV-Infektion festgestellt werden.

Beispiel 5: Impf-Challenge-Experimente

In zwei Impf-Challenge-Experimenten wurden die schützenden Eigenschaften der Impfung mit PRRSV-Virus gemäß der vorliegenden Erfindung untersucht.

In beiden Experimenten wurden Gruppen aus 10 PRRSV- Antikörperfreien Ferkeln im Alter von 5-6 Wochen mit dem Impfstamm DV PRRS-Virus mit Titern zwischen 1033,5 bis 106,9 TCID&sub5;&sub0; (siehe auch Tabelle 2; Gruppen 131 und 135) geimpft. In diesen Experimenten wurden auch Sicherheits- und Ausbreitungsaspekte untersucht.

Vier Wochen nach der Impfung wurden diese Ferkel intranasal mit 10&sup5; TCID&sub5;&sub0; eines heterologen Wildtypvirus "gechallenged". Nach der Impfung und Challenge wurde die serologische Reaktion sowohl in den geimpften Tieren als auch in den Überwachungstieren, die in direkten Kontakt mit den Geimpften plaziert wurden und den Kontrollen, die im gleichen Gebäude, jedoch physisch getrennt plaziert wurden, aufgezeichnet (unterschiedlicher Stift).

Das Hauptkriterium, um die schützenden Eigenschaften des Impfstoffs zu beurteilen, war die Menge des rückisolierten Virus des Challenge-Stamms aus Serum, das zu verschiedenen Zeiten nach dem Challenge erhalten wurde.

Die Rückisolierung wurde mittels zweier verschiedener Parameter bestimmt: die Periode während der das Challenge-Virus rückisoliert werden konnte und der Titer des Virus im Moment der Rückisolierung wurden bestimmt.

Ergebnisse Serologische Antwort

Der Antikörpertiter, wie in IFA in log&sub2;-Einheiten nach der Impfung und Challenge gemessen, sind in Tabelle 5 für die Impflinge, Überwachungstiere und Kontrollen dargestellt.

Tabelle 5.

¹ i.m. = intramuskulär i.d. = intradermal

² Tag 28 nach der Impfung = Tag 0 nach dem Challenge

³ nicht-spezifische Mengen

Die höchsten Antikörpertiter wurden im Experiment 131 festgestellt. Dieses Experiment zeigte, dass eine klare Antikörperantwort bereits zwei Wochen nach der Impfung nachweisbar ist. In beiden Experimenten waren die Titer der geimpften Tiere viel höher als in den Kontrollen, ebenso nach dem Challenge. Dies war insbesondere im Experiment 131 der Fall. Die serologisch Antwort, die in Experiment 135 nach intramuskulärer und intradermaler Verabreichung gemessen wurde, war vergleichbar. Möglicherweise wurden die niedrigsten beobachteten Titer und die langsamste Booster-Reaktion in der Gruppe gesehen, die mit einer Dosis von 103,5 TCID&sub5;&sub0; geimpft wurde, aber auch mit dieser niedrigsten getesteten Dosis wurden signifikante Titer erhalten. Überwachungsgruppen: 2 von 4 Tieren zeigten eine Serumkonversion in Experiment 131 und 1 von 12 in Experiment 135. In beiden Experimenten wurde in den Kontrollen, die in dem gleichen Bereich wie die Impflinge, jedoch physisch getrennt gehalten wurden, keine Serumkonversion beobachtet.

Reisolierungs(Challenge)-Virus

Durchschnittliche PRRSV-Titer (log&sub1;&sub0;), die im Serum gefunden wurden (für jede Gruppe wurde der Durchschnitt gebildet) sind in Tabelle 6 für die Impflinge, Überwachungstiere und Kontrollen dargestellt.

Tabelle 6.

i.m. = intramuskulär i.m. = intradermal

In dem Experiment 131 wurde aus den geimpften Tieren kein Challenge-Virus rückisoliert. In dem Experiment 135 wurde in allen Gruppen eine signifikante Reduktion der Rückisolierungsrate und Dauer der Rückisolierung im Vergleich mit den ungeimpften Kontrollen festgestellt. Die Wirkungen bezüglich der Reduktion in den Gruppen, die intramuskulär mit einer Dosis von 103,5 TCID&sub5;&sub0; geimpft wurden, war leicht niedriger als in den anderen Gruppen.

Nur zwei von 4 Überwachungstieren im Experiment 131 zeigte eine Serumkonversion nach der Impfung, in Experiment 135 nur 1 aus 12 Tieren. In einem anderen Überwachungstier der gleichen Gruppe (i. m. 104,5) wurde PRRS-Virus zur Zeit des Challenge isoliert, das wahrscheinlich das Impfvirus war.

Schlussfolgerung:

Eine klare Antikörperantwort ist bereits zwei Wochen nach der Impfung nachweisbar und steigt auf hohe Titer.

Die serologische Antwort nach intramuskulärer oder intradermaler Verabreichung ist vergleichbar. Selbst mit einer Dosis von 103,5 TCID&sub5;&sub0; wurden signifikante Titer erhalten.

In allen Gruppen wurde im Vergleich zu den ungeimpften Kontrollen keine Rückisolierung oder eine signifikant reduzierte Rückisolierungsrate und Rückisolierungsdauer festgestellt. Das Virus breitet sich auf die direkten Kontrollen nur in einer geringen Rate aus. Mit dieser Ausbreitungsrate wird das Virus innerhalb weniger Replikationsrunden ausgelöscht sein, was weiterhin den attenuierten Charakter der erfindungsgemässen Stämme zeigt.


Anspruch[de]

1. Lebender attenuierter Schweinevirus des Reproduktiven und Respiratorischen Syndroms (PRRSV) eines europäischen Serotyps, dadurch gekennzeichnet, dass er für Makrophagen nicht infektiös ist.

2. Lebender attenuierter PRRSV nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er mit dem monoklonalen Antikörper A27 reagiert, der von dem Hybridom A27 gebildet wird, dass bei der Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) des Instituts Pasteur in Paris, Frankreich unter der Nummer I 1401 hinterlegt ist, jedoch nicht mit dem monoklonalen Antikörper A35 reagiert, der von dem Hybridom A35 gebildet wird, das beim Institut Pasteur in Paris, Frankreich unter der Nummer I 1402 hinterlegt ist.

3. Lebender attenuierter PRRSV nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass er von dem Stamm, der beim Institut Pasteur unter der Zugangsnummer I-1758 hinterlegt ist, stammt.

4. Verfahren zur Herstellung von lebendem attenuiertem PRRSV nach den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die Adaptation eines auf MA104 gewachsenen PRRSV eines europäischen Serotyps auf Säugetierzellen umfasst, die nicht MA104 sind.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass Primatenzellen, die nicht MA104 sind als nicht-MA104 Säugetierzellen verwendet werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass Vero-Zellen als nicht-MA104 Primatenzellen verwendet werden.

7. Impfstoff zum Schutz von Schweinen gegen eine PRRSV- Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass er lebenden attenuierten PRRSV nach den Ansprüchen 1-3 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.

8. Impfstoff nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass er einen oder mehrere attenuierte oder inaktivierte Pathogene oder antigenes Material davon umfasst, die nicht PRRSV sind.

9. Impfstoff nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten Pathogene, die nicht PRRSV sind, ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Pseudorabiesvirus, Schweine-influenzavirus, Schweineparvovirus, Übertragbares Gastroenteritisvirus, Rotavirus, Escherichia coli, Erysipelo rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae und Acidobacillus pleuropneumoniae.

10. Impfstoff nach den Ansprüchen 7-9, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Träger umfasst, der für eine intradermale oder intramuskuläre Verabreichung geeignet ist.

11. Impfstoff nach den Ansprüchen 7-10, dadurch gekennzeichnet, dass er in gefriergetrockneter Form vorliegt.

12. Verfahren zur Herstellung eines lebenden attenuierten Impfstoffes zur Bekämpfung von PRRSV, dadurch gekennzeichnet, dass er das Mischen eines lebenden attenuierten PRRSV nach Ansprüchen 1-3 mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass zum Mischen der lebende attenuierte PRRSV verwendet wird, der beim Institut Pasteur unter der Zugangsnummer I-1758 hinterlegt ist.







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