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Dokumentenidentifikation DE19962803A1 05.07.2001
Titel Verfahren und Vorrichtung zur maskenfreien Herstellung von Biopolymeren
Anmelder BASF AG, 67063 Ludwigshafen, DE
Erfinder Eipel, Heinz, 64625 Bensheim, DE;
Beier, Markus, Dr., 69120 Heidelberg, DE
Vertreter Patent- und Rechtsanwälte Bardehle, Pagenberg, Dost, Altenburg, Geissler, Isenbruck, 68165 Mannheim
DE-Anmeldedatum 23.12.1999
DE-Aktenzeichen 19962803
Offenlegungstag 05.07.2001
Veröffentlichungstag im Patentblatt 05.07.2001
IPC-Hauptklasse C07B 61/00
IPC-Nebenklasse C07H 21/00   C07H 1/00   B01J 19/12   
Zusammenfassung Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur lichtgesteuerten Synthese von Biopolymeren auf Oberflächen. Dabei werden Muster einzelner Sequenzen (20) durch die Abbildung einer Anordnung (1) elektrisch individuell ansteuerbarer Leuchtdioden (2) auf die Oberflächen erzeugt.

Beschreibung[de]

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur maskenfreien Herstellung von Biopolymeren, die beispielsweise auf einem Objektträger, durch eine Belichtungsabfolge synthetisiert werden.

Bislang sind zur lichtgesteuerten DNA-Chips-Synthese für jeden individuellen Chip Maskensätze erforderlich. Aus US 5,412,087 ist eine bereichsweise adressierbare Immobilisierung von Oligonukleotiden und anderer chemischer Polymere auf Oberflächen bekannt. Gemäß dieses Verfahrens wird vorgeschlagen, Substrate mit Oberflächen, die Komponenten mit Thiolgruppen enthalten sowie photoaktiv entfernbare, schützende Gruppen aufweisen, dazu benutzt werden können, Felder von immobilisierten Anti-Liganden zu erzeugen, wie beispielsweise Oligonukleotide oder andere Biopolymere. Die Felder dienen dazu, das Vorhandensein komplementärer Nukleinsäuren in einer Flüssigkeitsprobe zu detektieren. Die bereichsweise adressierbare Bestrahlung vordefinierter Regionen auf der Oberfläche gestattet die Immobilisierung von Oligonukleotiden und anderen Biopolymeren in den aktivierten Regionen der Oberfläche. Bestrahlungszyklen auf unterschiedliche Oberflächenbereiche der Oberfläche und Immobilisierung verschiedener Anti-Liganden erlauben die Formierung einer immobilisierten Matrix von Anti-Liganden an bestimmten Stellen auf der Oberfläche. Die Immobilisierungsmatrix der Anti-Liganden erlaubt ein gleichzeitiges Durchsuchen einer Flüssigkeitsprobe nach Liganden, die eine sehr hohe Affinität zu bestimmten Anti-Liganden in der Matrix aufweisen.

Bei dem hier vorgeschlagenen Verfahren wird die Oberfläche des Substratkörpers mit einer Lichtquelle, die eine Wellenlänge im Bereich zwischen 280 und 420 nm aussendet, durch eine Maske bestrahlt, wobei mit jeder individuellen Maske nur bestimmte vorwählbare Regionen zur Bestrahlung selektiert werden können.

US 5,744,305 bezieht sich auf feldförmig auf einen Träger aufgebrachte Materialien. Diese dienen einer Synthesestrategie zur Erzeugung chemisch divergierender Substrate. Es werden photoaktiv schützende Molekülgruppen dazu benutzt, um lichtgesteuert bereichsweise parallele ablaufende chemische Syntheseprozesse zu erzielen. Binäre Maskierungstechniken werden im Rahmen eines Ausführungsbeispiels eingesetzt. Bei dem offenbarten Verfahren werden mit einer maskierten Strahlungsquelle oder mittels eines Aktivators verschiedene chemische Komponenten parallel synthetisiert. Das Beleuchtungsmuster legt fest, welche Bereiche des Objektträgers für eine chemische Reaktion präpariert werden. Auch hier wird die Maskierungstechnik eingesetzt, um auf dem Objektträger jeweils zu belichtende verschiedene Bereiche zu selektieren.

US 5,143,854 bezieht sich auf ein Verfahren zur photolitographischen Synthese von Polypeptiden sowie ein Suchverfahren. Bei diesem Verfahren werden Polypeptidfelder auf einem Substrat synthetisiert, in dem photoaktive Gruppen auf die Oberfläche eines Substrats aufgebracht werden, die bestimmte Bereiche des Substrats zur Aktivierung der Regionen dem Licht aussetzen. Auf die solcher Art aktivierten Regionen wird ein Aminosäure-Monomer aufgebracht, mit einer photoaktiven Gruppe, wobei die Aktivierungs- und Anlagerungsschritte so oft wiederholt werden, bis Polypeptide der gewünschte Länge und Sequenz synthetisiert sind. Das resultierende Feld kann zur Auswahl derjenigen Peptide dienen, die einen Rezeptor zu binden vermögen.

In US 5,143,854 wird neben der bereits angesprochenen Maskierungsmethode vorgeschlagen, eine Diodenlichtquelle zur Belichtung einzusetzen und das zu belichtende Substrat entsprechend den zu belichtenden Teilbereichen zu belichten. Bei dieser Vorgehensweise ist ein aufwendiger mechanischer Steuerungsmechanismus notwendig, um das Substrat genauestens entsprechend der durch die Leuchtdiode zu belichtenden Bereiche auszurichten. Diese mechanische Ausrichtung muß für jedes neue zu belichtende Feld jedes Mal neu erfolgen.

Der Steuerungsmechanismus stellt zur Erzielung der genannten Stellpositionen sehr hohe Anforderungen an die Fertigungsgenauigkeit.

Neben der Maskierung der zu belichtenden Biopolymerbereiche auf dem Objektträger ist aus WO 99/42813 bekannt, DNA-Sequenzen oder Polypeptide oder ähnliches mittels einer Einrichtung mit jeweils ansteuerbaren Mikrospiegeln zu belichten, wobei die Mikrospiegel ein zusammenhängendes Feld bilden, welches aus elektronisch adressierbaren einzelnen Mikrospiegeln zusammengesetzt ist. Diesem ist eine gemeinsame Lichtquelle zugeordnet. Die auf dem Objektträger befindlichen Biopolymere werden in bestimmten Mustern aktiviert, wobei an die angesteuerten Bereiche die jeweils sequentiell angebotenen monomeren Bausteine angekoppelt werden. Dieser Vorgang wird fortgesetzt, bis alle Elemente eines zweidimensionalen Feldes auf dem Substrat mit dem jeweils gewünschten Monomer reagiert haben. Das Mikrospiegelfeld kann z. B. in Verbindung mit einem DNA-Synthetisierer so angesteuert werden, daß die Bildsequenz durch das Mikrospiegelfeld mit der auf dem Objektträger aufgebrachten Flüssigkeitsprobe abgestimmt ist.

Bei den dargestellten Maskierungsverfahren werden photoaktive monomere Bausteine bzw. photoaktive Oberflächen verwendet, um eine ortsgerichtete Synthese zu ermöglichen. Die Einwirkung von Licht dient dazu, die photoaktiven Gruppen der monomeren Bausteine bzw. Oberflächen zu entfernen, um dann an diesen Stellen der Lichteinwirkung eine Synthese oder einen Immobilisierungsschritt erfolgen zu lassen. Um das Licht ausschließlich an den jeweiligen Synthese- bzw. Immobilisierungsschritt benötigten Ort zu bringen, werden Masken eingesetzt bzw. Mikrospiegelfelder angesteuert.

Werden beispielsweise im Falle der lichtgesteuerten Oligonukleotidsynthese n- Nukleotide aus einem Ensemble von vier verschiedenen Basen in einer n-meren Sequenz verknüpft, werden 4 × n Masken benötigt. Soll eine lichtgesteuerte Synthese von Peptiden bei einer Sequenzlänge von n und einem Ensemble von 20 Aminosäuren erfolgen, werden 20 × n Masken benötigt. Ein solcher Maskensatz muß nicht nur bereits im Vorfeld bereitgestellt werden, sondern ist auch bei der Belichtung sehr genau zu justieren. Dies geht mit einem erheblichen technischen Aufwand einher, so daß das Maskierungsverfahren für kleine Serien nicht lohnenswert ist, dafür bei jeder neuen Synthese ein neuer Maskensatz bereitzustellen ist.

Die in US 5,143,854 offenbarte modulierbare Lichtquelle erlaubt die translatorische Verschiebbarkeit des Objektträgers mit entsprechendem mechanischem Aufwand. Nachteilig ist ferner der Umstand, daß die Belichtung nur sequenziell und nicht parallel erfolgen kann.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Synthese von Biopolymeren bereitzustellen, was Belichtung und Aktivierung einzelner Bereiche eines Biopolymere aufnehmenden Objektträgers vereinfacht und maskenfrei gestaltet.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 15 gelöst.

Die mit der erfindungsgemäß vorgeschlagenen Lösung einhergehenden Vorteile sind vielfältiger Natur. Mit sehr einfachen Mitteln lassen sich Arrays von Biopolymeren wie z. B. Oligonukleotide und Peptide beispielsweise synthetisieren. Ferner lassen sich Biopolymere lichtgesteuert immobiliseren, es werden keine Masken benötigt, deren Vorbereitung und Erstellung dienenden Arbeitsschritte können vollständig entfallen. Mit dem Fortfall der Masken können auch die damit zusammenhängenden Justageabläufe vollständig entfallen. Es werden weder komplizierte und teure mechanische Verschiebetische zur Ansteuerung der einzelnen Syntheseorte noch aufwendige Positionierungsapparaturen benötigt. Die Belichtungsschritte können allesamt parallel ablaufen, ferner lassen sich durch das Entfallen der Masken mittels des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens auch die Synthese von Individual- oder Kleinserien extrem wirtschaftlich durchführen.

In vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich Nukleotide und Peptide auf Oberflächen synthetisieren. Daneben lassen sich auch Biopolymere auf den Oberflächen jeweils immobilisieren. Unter Biopolymeren sind beispielsweise Nucleinsäuren, deren Analoga (z. B. PNA, LNA), Aminosäuren, Peptide, Proteine, Kohlenhydrate, sowie Kombinationen von diesen zu verstehen. Das Ein- und Ausschalten der Leuchtdioden des Leuchtdioden- Arrays aus 9, 16, 25 oder bis zu 100 oder noch mehr Leuchtdioden wird bevorzugt über eine Recheneinheit automatisch gesteuert. Die Recheneinheit enthält die jeweils gewünschten Strahlungsanordnungen in gespeicherter Form.

Über die Recheneinheit läßt sich auch die Belichtungsdauer eingeben, während der die einzelnen Leuchtdioden ausgewählte Bereiche eines Objektträgers bestrahlen. Vorzugsweise werden solche Leuchtdioden verwendet, die eine energiereiche Strahlung im UV-Bereich emittieren. Zur Verkürzung des Synthesevorgangs durch Abkürzung der Aktivierungs- bzw. Immobilisierungszeiten lassen sich Belichtungsvorgänge durch das mehrere Leuchtdioden enthaltende Leuchtdioden-Array gleichzeitig vornehmen. Eine sequenzielle Abfolge von Belichtungsvorgängen läßt sich daneben ebenfalls einrichten.

Die Gleichzeitigkeit der Ansteuerung mehrerer Leuchtdioden des Leuchtdioden- Arrays läßt sich beispielsweise durch die Ansteuerung der Leuchtdioden über die Parallelschnittstelle eines Rechners verwirklichen. Die parallele Vornahme von Belichtungszyklen unter Beachtung in der Recheneinheit abgelegter Sequenz individueller Belichtungszeiten verkürzt die Synthese von Biopolymeren erheblich. Das Substrat für die darauf zu synthetisierenden Biopolymere befindet sich in einer Speiseeinrichtung unterhalb eines lichtdurchlässigen Bereiches. Die Speiseeinrichtung kann beispielsweise als eine Durchflußkammer konfiguriert sein, in der sich die für die durchzuführende Synthese benötigten Chemikalien sequentiell anbieten lassen. In den ansteuernden Rechner werden zunächst die jeweiligen Sequenzen für die einzelnen Felder des zu synthetisierenden Arrays eingegeben. Mit einem entsprechenden Programm steuert der Rechner entsprechend dieser Vorgaben die einzelnen Leuchtdioden im Leuchtdioden- Array korreliert zu sequentiellen und zyklischen Zufuhr der einzelnen Monomere an.

Bevorzugt läuft die Belichtung räumlich getrennt von der chemischen Synthese ab, um jedwede äußeren störenden Einflüsse während der Belichtung auszuschließen.

Neben der Pro-Sequenz individuell zu synthetisierenden Biopolymeren kann in der Recheneinheit auch die sequentielle Abfolge von Immobilisierungsplätzen für frei wählbare Biopolymere abgespeichert werden.

Mittels der erfindungsgemäß vorgeschlagenen Vorrichtung kann durch Rechnergestütztes paralleles Ansteuern einzelner Leuchtdioden eine parallele lichtgesteuerte Synthese bzw. Immobilisierung von Biopolymeren erreicht werden, ohne dass Masken erforderlich sind. Bevorzugt sind die Leuchtdioden als Licht in UV-Wellenlängenbereich emittierende Leuchtdioden ausgelegt. Zur geometrischen Skalierung der Biopolymeren-Arrays kann beispielsweise eine optische Abbildung des Leuchtdioden-Arrays im gewünschten Maßstab erfolgen Hierfür werden entsprechend geeignete optische Vorrichtungen eingesetzt. Anhand der Zeichnung wird die Erfindung nachstehend näher erläutert:

Es zeigt:

Fig. 1 ein Feld von beispielsweise 4 × 4 individuell ansteuerbarer Leuchtdioden mit den elektrischen Ansteuerleitungen,

Fig. 2 ein Fluoreszenz-Bild eines Oligonukleotid-Arrays, synthetisiert unter Verwendung eines 4 × 4 Leuchtdioden-Arrays nach Hybridisierung,

Fig. 3 vier Oberflächenfluoreszenzbilder in vier unterschiedlichen Empfindlichkeitsstufen dargestellt zur Ermittlung einer ausreichenden Belichtungszeit mit einem 3 × 3 Leuchtdioden- Array,

Fig. 4 den Aufbau einer Sequenz auf einer Chipoberfläche mit Hilfe eines 2 × 2 Leuchtdioden-Arrays.

In Fig. 1 ist die Draufsicht auf ein Feld mit beispielsweise 4 × 4 individuell ansteuerbaren Leuchtdioden und die dazugehörige Ansteuerungselektronik beispielhaft dargestellt.

In schematischer Darstellung ist in Fig. 1 ein Leuchtdioden-Array 1 wiedergegeben, welches unterhalb eines Objektträgers 12 oder unterhalb einer Chipoberfläche 19 liegt. Bei der in Fig. 1 gezeichneten Anordnung handelt es sich um eine Leuchtdiodenanordnung 1, die 16 individuell elektrisch ansteuerbare Leuchtdioden 2 enthält; von den dargestellten Leuchtdioden 2 sind die Leuchtdioden A1, B3 und D4 näher dargestellt, die beispielsweise für eine von sechzehn DNA-Sequenzen anzusteuern sind.

Jede Ansteuerung einer Leuchtdiode 2 des Leuchtdioden-Array 1 erfolgt über separate Ansteuerleitungen 4, wobei die einzelnen Leuchtdioden 2 mit dem Versorgungsteil 8 verbunden sind. Ferner sind die einzelnen Leuchtdioden 2 des Leuchtdioden-Arrays 1 jeweils mit Widerständen 5 verbunden, von welchen sich weitere Leitungen zu Speicherzellen 6 bzw. 7 erstrecken. Die Speicherzellen 6 bzw. 7 ihrerseits werden über eine an einer Recheneinheit 22 vorgesehenen Parallelschnittstelle 10 aus angesteuert.

Im hier nur schematisch mit seiner Parallelschnittstelle 10 dargestellten Rechner 22 lassen sich in verschiedenen Dateien beispielsweise die DNA-Sequenzen 20 sowie die zur Entfernung der einzelnen photolabilen Schutzgruppen erforderlichen Belichtungszeiten oder auch die sequentielle Abfolge von Immobilisierungsplätzen abspeichern. Ferner können durch die Recheneinheit 22 diejenigen für die Synthese von Biopolymeren wie beispielsweise Oligonukleotiden oder Peptiden benötigten Chemikalien bereitgestellt werden, wobei diese je nach zu behandelnder Sequenz an genau vorgebbaren Belichtungsorten, nachdem dort die labilen Fotoschutzgruppen entfernt worden sind, reagieren. Durch die Korrelation der Sequenzen, mit dem Chemikalienzufluß und den zugehörigen Belichtungsorten kann durch die Verwendung des Parallelports 10 an der Recheneinheit 22 ein gleichzeitiges Belichten mehrerer Belichtungsorte erfolgen.

Die lichtgesteuerte Synthetisierung findet in einer Speiseeinrichtung beispielsweise statt, die beispielsweise als eine Durchflußzelle ausgebildet sein kann. Der Durchfluß der durch die Durchflußzelle strömenden zur Synthese notwendigen Chemikalien wird von einem DNA-Synthetisizer beispielsweise von der Recheneinheit 22, kontrolliert. In dieser liegen in Dateien beispielsweise die DNA-Sequenzen 20, in abgespeicherter digitaler Form vor.

Um innerhalb eines in einer Durchflußkammer stattfindenden Synthesezyklus zu definieren, an welcher Position welcher der vier Nukleotidbausteine - des Desoxydenosin, Desoxythymidin, Desoxyguanosin und Desoxycytidin - aufzukondensieren ist, müssen auf dem Substratträger zu vorgegebenen Zeiten, fotolabile Schutzgruppen entfernt werden. Die Entfernung der fotolabilen Schutzgruppen ist erforderlich, weil sich nur nach deren Entfernung eine Synthese und der Aufbau eines DNA-Oligomers erreichen läßt. Die Belichtung des Substratträgers an den Orten, an denen die fotolabilen Schutzgruppen entfernt werden sollen, erfolgt durch die Leuchtdiodenanordnung 1 gemäß Fig. 1. Die einzelnen Leuchtdioden 2 der Leuchtdiodenanordnung 1 sind vorzugsweise als einzeln elektrisch ansteuerbare Leuchtdioden 2 ausgebildet. Diese emittieren eine sehr energiereiche Strahlung, vorzugsweise im ultravioletten Bereich mit einer Wellenlänge von vorzugsweise 360 nm. Es können jedoch auch Leuchtdiodenanordnungen 1 Verwendung finden, in denen Einzelleuchtdioden 2 aufgenommen sind, die eine Strahlung anderer Wellenlänge imitieren, die verschieden vom UV-Bereich ist. Die optimale Wellenlänge der Leuchtdioden 2 ist auf die verwendete Photochemie abzustimmen.

Durch die Ansteuerung der einzelnen Leuchtdioden 2 der Leuchtdiodenanordnung 1 wird festgelegt, an welcher Stelle des Substratträgers Fotoschutzgruppen abgespalten werden, um die Anlagerung zu koppelnder Nukleotidbausteine zu ermöglichen. Dazu sind beispielhaft in Fig. 1 drei Leuchtdioden 2 herausgegriffen, die mit A1, B3 sowie D4 bezeichnet sind an den Stellen des Substratträgers der Speiseeinrichtung trifft vorzugsweise die emittierte energiereiche Strahlung der mit A1, B3 und D4 bezeichneten Leuchtdioden 2 auf und bewirkt an den so exakt festgelegten Orten die Entfernung der labilen Fotoschutzgruppen. Je nach auf dem Träger aufgebrachten Substrat, kann die Belichtungszeit unterschiedlich sein, auch abhängig von der zu erzeugenden Sequenz. Die unterschiedlichen Belichtungszeiten, die von den Leuchtdioden in Bezug auf deren Einschaltdauer einzuhalten sind, können ebenfalls in einer Datei der Recheneinheit 22 abgelegt werden und auf diese Weise in das vorgeschlagene Belichtungsverfahren eingebaut werden.

Durch die Ansteuerung der den Positionen A1, B3 und D4 entsprechenden Leuchtdioden 2 erfolgt nun an diesen Positionen auf dem Substratträger eine Entfernung der Schutzgruppen, so daß auch nur an diesen wohl definierten Orten innerhalb dieses Syntheseschrittes am Substratträger eine Kettenverlängerung erzielbar ist. Bei einem beispielsweise darauffolgenden Syntheseschritt kann eine Abspaltung der photolabilen Schutzgruppen am Substrat beispielsweise an den Stellen A4, B2 und D1 erfolgen, so daß nach Ablauf der zur Entfernung der Schutzgruppen benötigten Belichtungszeit, nur an diesen Orten am Substrat eine Kettenverlängerung bei Zurverfügungstellung eines durch die Durchflußkammer zu führenden monomeren Bausteines erfolgen kann.

Mittels der hier skizzierten Vorgehensweise wird die Leuchtdiodenanordnung 1 als ein Feld von Einzellichtquellen eingesetzt, ohne daß eine für jeden Substratträger oder jede Chipoberfläche 19 individueller Maskensatz erforderlich ist. Mittels der Rechner gestützten individuellen Ansteuerung einzelner Leuchtdioden in Bezug auf Einwirkungszeit der Belichtung, Vorwahl der Belichtungsorte, abhängig von dem Rechner 22 abgelegten Sequenzdatei, können vorteilhaft auch Kleinserien synthetisiert werden.

Die mittels der Recheneinheit 22 angesteuerten Leuchtdiodenanordnung 1 übernimmt sowohl die Funktion der Belichtung als auch die einer Maskierung des zu belichtenden Bereiches, wodurch die Notwendigkeit, Masken zu repositionieren, vollständig entfallen kann. Ungenauigkeiten bei der Maskenrepositionierung während der Synthetisierung nach dem Maskenverfahren haben in der Vergangenheit zu erheblichen Qualitätsmängeln an solcher Art synthetisierten Biopolymerbausteinen geführt.

Fig. 2 zeigt ein synthetisiertes Oligonukleotid-Array, synthetisiert unter Verwendung eines Arrays von 4 × 4 einzeln elektrisch ansteuerbaren Leuchtdioden 2. Neben der hier dargestellten Konfiguration eines Leuchtdioden- Arrays 1 kann dieses auch beliebig viele beispielsweise 25, 400 oder bis zu mehreren tausend einzelne Strahlungsquellen in Form von Leuchtdioden enthalten, wobei dahingestellt sein kann, ob diese quadratisch, rechteckig, ringförmig oder auch kreisförmig angeordnet werden können. Das in Fig. 2 abgebildete Array ist ein Fluoreszenzbild, das durch Hybridisierung mit einer Fluoreszenz maskierten Komplementärstrang-Sonde erhalten wurde.

Fig. 3 zeigt in Zusammenschau vier Oberflächenfluoreszenzbilder jeweils mit vier unterschiedlichen Empfindlichkeitsstufen aufgenommen. Zur Ermittlung einer ausreichenden Belichtungszeit wurde ein 3 × 3-Leuchtdioden-Array 1 verwendet. Die vier Bilder zeigen dasselbe Array, aufgenommen in vier unterschiedlichen Empfindlichkeitsstufen des detektierenden Scanners.

Während in den mit geringen Empfindlichkeiten 15, 16 aufgenommenen Oberflächenfluoreszenzbildern 14, 3.1 und 3.2 keine Signale enthalten sind, sind diese bei den in Fig. 3.3 und 3.4 dargestellten Oberflächenfluoreszenzabbildungen mit höheren Empfindlichkeitsstufen 17 bzw. 18 deutlich erkennbar. Die Intensität der Signale verhält sich proportional zur Effizienz der Abspaltung der labilen Fotoschutzgruppen an der jeweiligen Position auf dem Substratträger 12 bei vorgebbarer Bestrahlungsdauer. Die Bestrahlung erfolgte mit 1, 3, 5, 7, 10, 13, 15, 20 und 30 Minuten Dauer. Sichtbar wurde die erfolgreiche Entfernung der Fotoschutzgruppe aufgrund der Bestrahlung durch eine kovalente Anbindung eines Cy 5- Phosphorarmidites nach erfolgter Bestrahlung.

In den Fig. 4.1 und 4.2 ist der Aufbau einer Sequenz auf einer Oberfläche 19 mit einer 4 Einzelleuchtdioden 2 enthaltenden Leuchtdiodenanordnung 1 sichtbar gemacht.

Auf den Oberflächenfluoreszenzbildern 14, die mit unterschiedlichen Empfindlichkeitsstufen 16, 18 aufgenommen sind, wurden an den vier heller wiedergegebenen Positionen 19 die Sequenz d(CGCTGGAC) mittels lichtgesteuerter DNA-Chipsynthese aufgebaut. Dazu wurde ein vier Einzelleuchtdioden 2 enthaltendes Leuchtdioden-Array 1 verwendet, die Strahlung im ultravioletten Wellenlängenbereich aussenden. Die in Fig. 4.1 und 4.2 dargestellten Abbildungen wurden mit verschiedenen Empfindlichkeitsstufen des Scanners aufgenommen. Es erfolgte eine DNA-Chipsynthese mit 2 × 2 UV- Leuchtdiodenanordnung 1 der Sequenz CGCTGGAC, die mit fluoreszenzmarkierten GTCCAGCG hybridisiert wurde bei einer Belichtungszeit von 10 Minuten.

Die abgebildeten Fig. 4.1 und 4.2 wurden nach Hybridisierung mit der komplementären 5'-Cy-5 markierten Sonde nach dem Scannen in einer Fluoreszenzabbildungseinheit erhalten. Bezugszeichenliste 1 Leuchtdioden-Array

2 Einzelleuchtdiode

3 Feldgrenze

4 Ansteuerleitung

5 Widerstand

6 Speicherzelle

7 Speicherzelle

8 Versorgungsspannungsteil

9 Erdung

10 Parallelschnittstelle PC

11 Schnittstellenleitung 1 bis 25

12 Objektträger

13 Seitenkante

14 Oberflächenfluoreszenzbild

15 Empfindlichkeitsstufe niedrig

16 Empfindlichkeitsstufe höher

17 Empfindlichkeitsstufe hoch

18 Empfindlichkeitsstufe sehr hoch

19 Chipoberfläche

20 Sequenz d (CGCTGGAC)

21 Sequenzposition

22 Recheneinheit

A1 Leuchtdiodenposition

B3 Leuchtdiodenposition

D4 Leuchtdiodenposition


Anspruch[de]
  1. 1. Verfahren zur lichtgesteuerten Synthese von Biopolymeren auf Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, daß Selektion und Aktivieren von Bereichen auf einem festen Träger durch die Abbildung einer Anordnung (1) elektrisch ansteuerbarer Leuchtdioden (2) herbeigeführt werden.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Biopolymere Oligonukleotide sind.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Biopolymere Peptide sind.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Biopolymere auf Objektträgern (12, 19) immobilisiert werden.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Leuchtdioden (2) entsprechend einer in einem Rechner (22) abgelegten Datei von Sequenzen (20) einzeln angesteuert werden.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Leuchtdioden (2) energiereiche Strahlung im UV-Bereich emittieren.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Belichtung mehrerer Bereiche durch die Leuchtdioden (2) gleichzeitig erfolgt.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Belichtung sequenziell erfolgt.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ansteuerung der Leuchtdioden (2) des Leuchtdioden-Arrays (1) durch die Parallelschnittstelle (10, 11) einer Recheneinheit (22) erfolgt.
  10. 10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich das Substrat für die darauf zu synthetisierenden Biopolymere in einer Speiseeinrichtung unter einem lichtdurchlässigen Bereich befindet.
  11. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die für die Synthese benötigten Chemikalien sequenziell angeboten werden und die Belichtung in der Speiseeinrichtung erfolgt.
  12. 12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Belichtung räumlich getrennt von der chemischen Synthese abläuft.
  13. 13. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Belichtungsdauer der Sequenzen (20) am Rechner (22) vorwählbar ist.
  14. 14. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzielle Abfolge der Immobilisierungsplätze im Rechner (22) in einer Datei abgelegt ist.
  15. 15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur geometrischen Skalierung des Leuchtdioden-Arrays (1) auf das Biopolymeren-Array geeignete optische Abbildungsverfahren verwendet werden.
  16. 16. Vorrichtung zur lichtgesteuerten Biopolymersynthese auf Objektträgern (12, 19) mit einer Belichtungsquelle, dadurch gekennzeichnet, daß einem Objektträger (12, 19) eine Belichtungsanordnung (1) zugeordnet ist, die aus elektrisch ansteuerbaren Leuchtdioden (2) besteht.
  17. 17. Vorrichtung gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Leuchtdioden (2) energiereiche UV-Strahlung emittieren.






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