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Dokumentenidentifikation DE69520829T2 09.08.2001
EP-Veröffentlichungsnummer 0759088
Titel Herstellung von L - Ascorbinsäure in Mikroorganismen
Anmelder DCV, Inc., Wilmington, Del., US
Erfinder HUSS, John, Ronald, Manitowoc, US;
RUNNING, A., Jeffrey, Manitowoc, US;
SKATRUD, J., Thomas, Manitowoc, US
Vertreter Dreiss, Fuhlendorf, Steimle & Becker, 70188 Stuttgart
DE-Aktenzeichen 69520829
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 10.02.1995
EP-Aktenzeichen 959102005
WO-Anmeldetag 10.02.1995
PCT-Aktenzeichen US9501574
WO-Veröffentlichungsnummer 9521933
WO-Veröffentlichungsdatum 17.08.1995
EP-Offenlegungsdatum 26.02.1997
EP date of grant 02.05.2001
Veröffentlichungstag im Patentblatt 09.08.2001
IPC-Hauptklasse C12P 17/04

Beschreibung[de]
GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft die Herstellung von L-Ascorbinsäure (Vitamin C) durch Mikroalgen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure durch Mikroalgen bei geringem pH (2,5-6,0).

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

L-Ascorbinsäure (Vitamin C) ist ein wasserlösliches Vitamin, das in der Pflanzen- und Tierwelt weit verbreitet ist. L-Ascorbinsäure (L-AA) kann aus pflanzlichen Quellen, wie z. B. Paprika, Gladiolenblätter, Hagebutte, Persimone und Zitrusfrüchten extrahiert oder aus L- Xylose, L-Galactose oder D-Glucose synthetisiert werden. F. A. Loewus, L-Ascorbic Acid: Metabolism, Biosynthesis, Function in The Biochemistry of Plants, Vol. 3, Academic Press, New York, 1980, Seiten 77-99 zeigt einen Überblick über die Biosynthese und Quellen der L- Ascorbinsäure.

Obwohl die meisten Tierarten L-Ascorbinsäure synthetisieren können, sind Menschen und andere Primaten, Guinea-Schweine, fruchtfressende Fledermäuse, manche Vögel und Fische, wie z. B. Coho-Lachs, Regenbogenforelle und Karpfen hierzu nicht in der Lage. Bei diesen Tieren ist eine Zufuhr von L-Ascorbinsäure über die Nahrung notwendig um Skorbut zu vermeiden. Bei Fischen verursacht ein Mangel an L-Ascorbinsäure auch Skoliose, Lordose, verminderte Gewichtszunahme, Anfälligkeit für bakterielle Infektionen, dunkle Hautfärbung, Flossenschwund und eine verminderte Bildung der Knochenknorpel.

L-Ascorbinsäure ist eine Mengenchemikalie, die ökonomische und effiziente Herstellungsverfahren erforderlich macht. Verschiedene Algen produzieren L-Ascorbinsäure. [Siehe z. B. Aaronson, Arch. Microbiol., 112, 57-59 (1977) und Renstrom, Plant Bei. Leiters, 28, 299-305 (1982/1983)]. Da die Verwertung der Kohlenstoffquelle schlecht ist und die Säure in geringer Konzentration produziert wird, ist die Herstellung von L-Ascorbinsäure durch Mikroalgen kein brauchbares Produktionsverfahren für die großtechnische Herstellung gewesen.

Skatrud, US-Patent Nr. 5,001,059 beschreibt ein Verfahren, das Mikroalgen der Spezies Chlorella pyrenoidosa verwendet um L-Ascorbinsäure mit hoher Ausbeute zu bilden. Weil die Konzentration an L-Ascorbinsäure und die Verwertung der Kohlenstoffquelle signifikant verbessert wurden, wurde durch dieses Verfahren eine signifikante Verbesserung in der Herstellung von L-Ascorbinsäure durch Mikroalgen erzielt. Jedoch wird bei dem relativ hohen pH (6,5-7), der zur kontinuierlichen Herstellung der L-Ascorbinsäure notwendig ist, die extrazelluläre Säure durch die für den Zellmetabolismus und die Produktion der L- Ascorbinsäure erforderliche Luft prompt oxidiert. Deshalb besteht ein Bedarf an einem effizienten Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure bei geringem pH (weniger als 6,5) durch Mikroalgen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure. Das Verfahren umfaßt das Kultivieren eines Organismus, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Organismen der Gattung Prototheca und Organismen der Spezies Chlorella protothecoides, mit einer Fermentation bei einem pH von weniger als ungefähr 6,0. Ferner beinhaltet das Verfahren die Gewinnung der L-Ascorbinsäure aus dem Fermentationsmedium. Eine alternative Ausführungsform umfaßt ein Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure durch Kultivieren eines der oben genannten Organismen in einem Fermentationsmedium mit einer verfügbaren Sauerstoffquelle, bei welchem das Fermentationsmedium extrazelluläre L- Ascorbinsäure enthält und L-Ascorbinsäure aus dem Fermentationsmedium gewonnen wird. Bevorzugte Organismen sind Organismen der Gattung Prototheca, besonders bevorzugte Organismen sind Organismen der Spezies Prototheca moriformis und Prototheca zopfii. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist besonders vorteilhaft, weil es zur Herstellung von signifikanten Konzentrationen extrazellulärer L-Ascorbinsäure führt, was die Gewinnung der L-Ascorbinsäure einfacher macht, als wenn anstelle dessen die meiste L-Ascorbinsäure innerhalb der Zellen abgeschieden würde. Das vorliegende Verfahren kann in Gegenwart einer verfügbaren Sauerstoffquelle durchgeführt werden, weil bei den pH-Bedingungen des vorliegenden Verfahrens der Abbau der produzierten extrazellulären L-Ascorbinsäure nicht signifikant ist.

Die Gewinnung der extrazellulären L-Ascorbinsäure kann durch eine Reihe von Verfahren, einschließlich Ionenaustausch, Chromatographie, Extraktion, Membranseparation, Umkehrosmose, Destillation, chemische Derivatisierungsverfahren und Kristallisation erreicht werden. Das Verfahren kann zusätzlich die Gewinnung der intrazellulären L- Ascorbinsäure beinhalten. In einer Ausführungsform werden die Zellen aus der Fermentationsbrühe entfernt und extrazelluläre L-Ascorbinsäure aus der zellfreien Fermentationsbrühe und separat aus den abgetrennten Zellen gewonnen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ergibt sich aus einer Fermentationskultur, die L-Ascorbinsäure produzierende Mikroalgen und ein Fermentationsmedium enthält. Bei dieser Ausführungsform enthält das Fermentationsmedium extrazelluläre L-Ascorbinsäure und hat eine Sauerstoffquelle zur Verfügung. In bevorzugten Ausführungen der Fermentationskultur können die Mikroalgen aus der Gruppe, bestehend aus Organismen der Gattung Prototheca und Organismen der Spezies Chlorella protothecoides, gewählt werden. Ferner haben bevorzugte Ausführungen der Fermentationskulturs einen pH von weniger als ungefähr 6, stärker bevorzugt weniger als ungefähr 5,5, und noch stärker bevorzugt weniger als ungefähr 5,0.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Mikroorganismen. Die Mikroorganismen zur Produktion von L-Ascorbinsäure bei niedrigem pH sind Mikroalgen der Gattung Prototheca, insbesondere der Spezies Prototheca zopfii und Prototheca moriformis und Mikroalgen der Spezies Chorella protothecoides. Das Verfahren wurde demonstriert mit: Prototheca zopfii Stamm BTR 1254, Prototheca moriformis Stamm BTR 1385 (ATCC 75669), Chlorella protothecoides BTR 902 (ATCC 75667). Prototheca zopfii Stamm UTEX 1438 ist zur Produktion von L-Ascorbinsäure bei hohem pH fähig und sollte sie auch bei niedrigem pH produzieren.

Prototheca zopfii Stamm UTEX 1438 wurde von der Algenkultursammlung, Department für Botanik, Universität von Texas, Austin, 78713-7640, USA bezogen. Die Kulturen sind für die Öffentlichkeit zu einer nominellen Gebühr von zurzeit jeweils 25, 00 $ erhältlich. Prototheca zopfii Stamm BTR 1254, Prototheca moriformis Stamm BTR 1385 und Chlorella protothecoides Stamm BTR 902 wurden in der Natur gesammelt. Prototheca moriformis BTR 1385 (ATCC 75669) und Chlorella protothecoides BTR 902 (ATCC 75667) wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive Rockville, MD 20852, USA am 9. Februar 1994 hinterlegt.

Medium. Das Kulturmedium enthält die Kohlenstoffquelle, eine Vielzahl von Salzen und im allgemeinen Spurenmetalle. Die Kohlenstoffquelle kann jede Kohlenstoffquelle sein, die zur Fermentation von Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Insbesondere kann die Kohlenstoffquelle aus Ethanol, Glycerol und Glucose gewählt werden und ist vorzugsweise Glucose. Die Glucosequelle kann Glucose oder irgendein Kohlenhydrat sein, das in situ in Glucose umgewandelt werden kann, z. B. Melasse, Maissirup usw.

Um das Zellwachstum optimal zu fördern, jedoch nicht zu hemmen oder übermäßig zu begrenzen, sollte im Fermenter eine nichthemmende/nichtbegrenzende Menge der Glucosequelle verwendet werden. Obwohl die optimale Konzentration der Glucosequelle abhängig vom Organismus variieren kann, wird sie durch einen Versuch einfach bestimmt. Rechtzeitige Zugaben, welche die Glucosequelle im Bereich von 5-30 g/L halten, reichen normalerweise aus, um das Zellwachstum zu fördern, wobei eine Glucosehemmung vermieden wird.

In wünschenswerter Weise liegen mit der Glucosequelle weitere Zusätze anfänglich vor und können dem Medium kontinuierlich zugegeben werden um ihre Konzentrationen aufrecht zu erhalten. Diese umfassen Alkalimetallphosphate, wie z. B. Natrium- und Kaliumphosphat, insbesondere als dibasisches Natriumphosphat und monobasisches Kaliumphosphat. Die Gesamtmenge des dibasischen Natriumphosphats beträgt typischerweise ungefähr 1-2 g/L, vorzugsweise ungefähr 1-1,5 g/L, und noch stärker bevorzugt ungefähr 1,3 g/L. Die anfänglich im Fermenter vorliegende Menge an dibasischem Natriumphosphat beträgt rypischerweise ungefähr 35-50%, noch typischer ungefähr 40-45% der gesamten Menge an zugegebenem dibasischen Natriumphosphat. Die Gesamtmenge an monobasischen Kaliumphosphat beträgt üblicherweise ungefähr 1,5-3 g/L, noch üblicher ungefähr 2-2,5 g/L. Die anfänglich vorliegende Menge beträgt ungefähr 40-50%, noch üblicher ungefähr 45- 50% der gesamten Menge.

Ein biologisch akzeptabler Chelator, wie z. B. Trinatriumcitrat, wird vorteilhaft in einer Gesamtmenge von ungefähr 0,8-1,2 g/L, üblicherweise ungefähr 1,0 g/L zugegeben. Eine biologisch akzeptable Mineralsäure wird hinzu gegeben um die Spurenmetalle in Lösung zu halten und das Ammoniak, das gewöhnlich als Stickstoffquelle verwendet wird, zu neutralisieren. Üblicherweise wird konzentrierte Schwefelsäure mit ungefähr 1-2 mL/L, typisch ungefähr 1,2-1,5 mL/L verwendet.

Magnesium wird mit ungefähr 1-0, 2 g/L, vorzugsweise ungefähr 0,1-0, 15 g/L als physiologisch akzeptables Salz, z. B. als Sulfat, hinzu gegeben. Da Eisen und Kupfer den Abbau der extrazellulären L-Ascorbinsäure beschleunigen und deshalb ihre Anhäufung im Medium hemmen, ist die Verwendung dieser Metalle in ihrer Menge begrenzt. Eisen (+2) liegt anfänglich mit ungefähr 2-5 mg/L, vorzugsweise ungefähr 3-4 mg/L vor und ist nicht in einer der darauffolgenden Zugaben enthalten. Kupfer liegt in relativ geringen Mengen von im allgemeinen 1-50 g/g Glucose vor. Eine Spurenmetallösung (Tabelle 3) wird in einer Gesamtmenge von ungefähr 10-15 mL/L, typisch ungefähr 12-14 mL/L hinzu gegeben. Bezogen auf Glucose liegt die Spurenmetallösung 0, 1 bis 0,2 mL/g vor. Aus praktischen Gründen wird die in Tabelle 1 angegebene Lösung während der Fermentation zugegeben. (Lösungsherstellung ist in Tabelle 5 beschrieben). Obgleich eine Anzahl von Salzen als mono- oder dibasisch angegeben wurde, ist dies nur aus Zweckmäßigkeitsgründen geschehen und nicht aus Notwendigkeit. Da diese Verbindungen Puffer sind, variiert das Ausmaß der Protonierung mit dem pH des Mediums. Um das Einschleppen von fremden Mikroorganismen zu vermeiden wird steril zugegeben.

Tabelle 1 Formel des Mediums

Komponente Konzentration (relativ zu Glucose)

Glucose 1,0

Trinatriumcitrat, Dihydrat 0,0125

Magesiumsulfat, wasserfrei 0,0082

monobasisches Natriumphosphat 0,0116

monobasisches Kaliumphosphat 0,0238

dibasisches Natriumphosphat 0,0121

Schwefelsäure 98% (w/w) 0,0329

Spurenmetallmischung (Tabelle 3) 0,1675 mL/g

Fermentation. Vor dem Animpfen wird das Nährmedium auf die gewünschte Temperatur von typisch 30-40ºC, vorzugsweise ungefähr 35ºC, gebracht. Das Medium wird mit einer aktiv wachsenden Kultur des gewünschten Mikroorganismus in einer solchen Menge angeimpft, die ausreicht nach einer vernünftigen Wachstumsperiode eine hohe Zelldichte zu produzieren. Typische anfängliche Zelldichten betragen 0,1-0,5 g/L, noch typischer 0,15-0,4 g/L basierend auf dem Trockengewicht der Zellen. Die Zellen läßt man auf eine Zelldichte von wenigstens ungefähr 5 g/L, vorzugsweise ungefähr 10-80 g/L, und noch stärker bevorzugt 40-60 g/L wachsen. Dies erfordert typischerweise 10-40 Stunden, noch typischer 15-25 Stunden.

Anfänglich werden ungefähr 15-30%, typisch ungefähr 20-25% der gesamten Glucosequelle hinzu gegeben. Wenn die Glucosekonzentration fallt, wird sie nach Bedarf ergänzt, indem ungefähr 20%-Aliqote der konzentrierten Glucose-Salze-Lösung (Tabelle 1) hinzu gegeben werden, während die Gesamtglucosekonzentration unterhalb von 30 g/L gehalten wird. Herkömmliche Techniken, wie z. B. der Glucoseoxidase-Enzymtest oder die Hochdruckflüssigchromatographie, können verwendet werden, um die Glucosekonzentration im Überstand, d. h. der zellfreien Komponente des Mediums, zu überwachen. Eine kleine Menge an Antischaummittel kann während der Fermentation hinzu gegeben werden.

Ammoniak wird sowohl als Stickstoffquelle wie auch zur Kontrolle des pH hinzu gegeben. Folglich hängt die Stickstoffmenge im Medium von dessen Azidität und Pufferkapazität ab. Ammoniak wird üblicherweise durch Zuleiten eines Ammoniakgasstroms zum Luftstrom oder einer anderen Sauerstoffquelle, die in den Fermenter eingebracht wird, zugeführt.

Der pH des Mediums kann innerhalb der gewünschten Grenzen, zum Beispiel durch Zugabe von Ammoniak oder einer anorganischen Base, nach Bedarf kontrolliert werden. Der pH wird vorzugsweise unterhalb eines Wertes gehalten, bei dem ein signifikanter Abbau der extrazellulären L-Ascörbinsäure durch Oxidation erfolgt. In diesem Zusammenhang bezieht sich ein signifikanter Abbau auf mehr als ungefähr 20% der produzierten L-Ascorbinsäure, insbesondere auf mehr als ungefähr 10% der produzierten L-Ascorbinsäure und noch stärker auf ungefähr 5% der produzierten L-Ascorbinsäure. Der pH des Mediums wird unterhalb von ungefähr 6,0, stärker bevorzugt unterhalb von ungefähr 5,5 und am meisten bevorzugt unterhalb von ungefähr 5,0 gehalten. Indem der pH des Fermentationsmediums innerhalb der oben angegebenen Parameter gehalten wird, werden signifikante Vorteile hinsichtlich der Produktion der L-Ascorbinsäure erreicht. Bei niedrigeren pH-Werten wird der Abbau der extrazellulären L-Ascorbinsäure vermindert. So können höhere Produktivitäten in Bezug auf die L-Ascorbinsäure erzielt werden. Den Fachleuten ist klar, daß extrazelluläre L- Ascorbinsäure signifikant leichter zu gewinnen ist als intrazelluläre L-Ascorbinsäure. Zudem kann die extrazelluläre Produktion von L-Ascorbinsäure die Entwicklung von Verfahren mit höherer Produktivität ermöglichen, weil kommerzielle Verfahren entwickelt werden können ohne dass ultrahohe intrazelluläre L-Ascorbinsäurekonzentrationen, welche eine Rückkopplungshemmung der metabolischen Produktion von L-Ascorbinsäure verursachen können, notwendig sind.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird während des anfänglichen Zellwachstums der pH auf ungefähr 3,0-6,0, vorzugsweise ungefähr 3,5-5,0, stärker bevorzugt ungefähr 3,5-4,5 eingestellt. Wenn die Zelldichte größer als ungefähr 10 g/L ist, was im allgemeinen nach ungefähr 10-25 Stunden der Fall ist, wird der pH auf 2,5-5,0, vorzugsweise 2,5-4,0 vermindert. Dies kann praktischerweise durch zeitweiliges Stoppen der Zugabe von Ammoniak erreicht werden. Der pH der Brühe fallt wegen der von den Zellen produzierten Säure ab. Wenn die Brühe den erwünschten pH erreicht, wird die Zugabe von Ammoniak wieder aufgenommen.

Wie oben dargelegt, ermöglicht das erfindungsgemäße Fermentationsverfahren mit einem Beibehalten des pH-Wertes innerhalb der oben angegebenen Parameter, daß die extrazelluläre Ascorbinsäure im Fermentationsmedium vorliegen kann, ohne durch Oxidation abgebaut zu werden. Überdies ist es möglich, daß sich die L-Ascorbinsäure im Fermentationsmedium anhäuft und hohe Konzentrationen an extrazellulärer Ascorbinsäure ohne einen signifikanten Abbau von Ascorbinsäure durch Oxidation erreicht werden. Während das Fermentationsverfahren das Vorliegen von Sauerstoff erfordert, wie genauer weiter unten beschrieben wird, ist es möglich, das Fermentationsverfahren der vorliegende Erfindung, welches hohe Mengen an extrazellulärer Ascorbinsäure produziert, sogar in Gegenwart einer verfügbaren Sauerstoffquelle erfolgreich durchzuführen. Es soll festgehalten werden, daß die verfügbare Sauerstoffquelle nicht auf Luft oder Sauerstoffgas beschränkt ist, sondern auch andere Chemikalien, die in der Fermentationsumgebung zu Sauerstoff umgewandelt werden, umfaßt.

Während der Fermentation muß ausreichend Sauerstoff zum Medium hinzu gegeben werden, um das anfängliche Zellwachstum aufrecht zu halten und den Metabolismus und die Bildung von L-Ascorbinsäure aufrechtzuerhalten. Der Sauerstoff wird praktischerweise durch Bewegung und Belüftung des Mediums geliefert.

Herkömmliche Verfahren, wie z. B. Rühren oder Schütteln, können verwendet werden, um das Medium zu bewegen und zu belüften. Vorzugsweise beträgt die Sauerstoffkonzentration im Medium 20-100% des Sättigungswertes (d. h. Löslichkeit von Sauerstoff bei atmosphärischem Druck und ungefähr 30-40ºC), obgleich auch geringere Konzentrationen auftreten können, wenn die Fermentation nicht nachteilig beeinflußt wird. Die Sauerstoffkonzentration des Mediums kann durch herkömmliche Methoden, wie z. B. einer Sauerstoffsondenelektrode überwacht werden. Andere Sauerstoffquellen, wie z. B. unverdünntes Sauerstoffgas und mit Inertgas, nicht Stickstoff, verdünntes Sauerstoffgas können verwendet werden.

Die Fermentation wird solange fortgeführt, bis die Bildung von L-Ascorbinsäure, wie durch die Anhäufung von extrazellulärer L-Ascorbinsäure evident wird, im wesentlichen aufhört. Die gesamte Fermentationszeit beträgt typischerweise 24-120 Stunden.

Typischerweise liegt das meiste der in dem vorliegenden Verfahren produzierten L- Ascorbinsäure extrazellulär vor. Die Zellen können aus der Brühe durch herkömmliche Methoden, wie z. B. Filtration oder Zentrifugation, entfernt werden, wobei L-Ascorbinsäure aus dem zellenfreien Überstand durch herkömmliche Methoden, wie z. B. Ionenaustausch, Chromatographie, Extraktion, Kristallisation, Membranseparation, Umkehrosmose, Destillation, chemische Derivatisierungsverfahren usw. gewonnen werden kann. Der Ausdruck "chemische Derivatisierungsverfahren" bezieht sich auf Verfahren, in denen die produzierte L-Ascorbinsäure mit anderen Chemikalien reagiert, die leichter zu gewinnen und/oder stabiler sind. Z. B. offenbart Cayle, US-Patent Nr. 4,595,659 die Isolierung von L- Ascorbinsäure aus einem wäßrigen Fermentationsmedium durch herkömmliche Ionenaustausch-Harzabsordon und Elution, gefolgt von Bleichung, Verdampfung und Kristallisation. Die Isolierung der strukturell ähnlichen Iso-Ascorbinsäure aus der Fermentationsbrühe durch ein kontinuierliches Multi-Bett-Extraktionssystem eines Anion- Austauschharzes wird von K. Shimizu, Agr. Biol. Chem. 31, 346-353 (1967) beschrieben.

Die Gewinnung von L-Ascorbinsäure durch Verfahren der vorliegenden Erfindung kann kontinuierliche, semi-kontinuierliche oder Batch-Verfahren umfassen. In kontinuierlichen und semi-kontinuierlichen Verfahren sind die Konzentrationen an extrazellulärer L-Ascorbinsäure nicht so groß wie in Batch-Produktionsverfahren, weil die extrazelluläre L-Ascorbinsäure während der Fermentation aus dem Fermentationsgefaß entfernt wird. Tatsächlich können kontinuierliche oder semi-kontinuierliche Verfahren durchgeführt werden, in denen die extrazelluläre Konzentration an L-Ascorbinsäure sehr gering bleibt oder nahe einem nicht mehr meßbaren Wert liegt.

Wie oben dargestellt, produziert das Verfahren der vorliegenden Erfindung signifikante Mengen an extrazellulärer L-Ascorbinsäure. Das Verfahren produziert L-Ascorbinsäure in der Weise, daß wenigstens ungefähr 2% der gesamten L-Ascorbinsäure extrazellulär, stärker bevorzugt wenigstens ungefähr 10% der gesamten L-Ascorbinsäure extrazellulär, und am meisten bevorzugt wenigstens ungefähr 20% der gesamten L-Ascorbinsäure extrazellulär vorliegt. Durch Verwendung der vorliegenden Erfindung kann eine extrazelluläre L- Ascorbinsäureproduktion mit einer Konzentration erreicht werden, die größer als ungefähr l mg/l, stärker bevorzugt größer als ungefähr 10 mg/l und noch stärker bevorzugt größer als ungefähr 20 mg/l ist.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt eine Fermentationskultur, die L-Ascorbinsäure produzierende Mikroalgen der Gattung Prototheca oder der Spezies Chlorella protothecoide, sowie ein Fermentationsmedium mit einem pH zwischen 2,5 und 6,0 umfaßt. In dieser Ausführungsform enthält das Fermentationsmedium extrazelluläre L- Ascorbinsäure und eine verfügbare Sauerstoffquelle. Die L-Ascorbinsäure produzierenden Algen können die gleichen wie bereits oben beschrieben sein. In ähnlicher Weise kann die Zusammensetzung des Fermentationsmediums, welches die extrazelluläre L-Ascorbinsäure enthält, so sein wie oben umfangreich beschrieben wurde.

INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT

Das Verfahren erzeugt L-Ascorbinsäure durch Fermentation in einer Fermentationsbrühe mit niedrigem pH (2,5-6,0). Bei diesem pH wird die L-Ascorbinsäure durch die Luft nicht sofort oxidiert. Folglich ist es nicht notwendig, daß die produzierte L-Ascorbinsäure intrazellulär vorliegt. Die L-Ascorbinsäure, die sich in der Brühe anhäuft, wird nicht durch den in der Brühe vorliegenden Sauerstoff prompt oxidiert. L-Ascorbinsäure (VitaminC) wird als Nahrungsergänzungsmittel verwendet um Skorbut zu verhindern. L-Ascorbinsäure und einige ihrer Derivate, wie z. B. Ascorbylpalmitat, sind alsAntioxidantien in Nahrungsmitteln verwendet worden.

Beispiel 1

Dieses Beispiel zeigt, dass Prototheca in der Lage ist, L-Ascorbinsäure (L-AA) bei hohem pH zu produzieren. Das meiste der produzierten L-Ascorbinsäure war intrazellulär.

Herstellung des Mediums. Eine Lösung von 0, 27 g monobasischen Kaliumphosphat und 0,23 g dibasischen Natriumphosphat in 600 mL desilliertem Wasser wurde in einem 1 L- Glasfermenter hitzesterilisiert, wobei dieser mit Mitteln zum Bewegen des Mediums und zum Zuführen von Nährkomponenten, einer Sauerstoffquelle und weiteren unten beschriebenen Agenzien zum Medium ausgestattet ist. Nachdem das Medium abgekühlt war wurden 5 mL einer Lösung von 1,9 g/L Eisensulfatheptahydrat durch ein 0,2 Mikrometer-Sterilfilter hinzu gegeben.

Glucose-Salze-Konzentrat. Die in der Tabelle 2 aufgelisteten Komponenten wurden sterilisiert und nach dem Kühlen auf ein Endvolumen von 600 mL kombiniert.

TABELLE 2 Glucose-Salze-Konzentrat

Menge Verbindung/Komponente

Gruppe 1

56 g Glucose, Nahrungsmittelgüte, Monohydrat

(wasserfreie Basis) in 80 mL Wasser

Gruppe 2

0,7 g Trinatriumcitratdihydrat

0,46 g Magnesiumsulfat, wasserfrei

0,7 mL Schwefelsäure in 10 mL Wasser

Gruppe 3

0,65 g monobasisches Natriumphosphat

1,3 g monobasisches Kaliumphosphat

0,68 g dibasisches Natriumphosphat in 10 mL Wasser

Gruppe 4

9,4 mL Spurenmetalllösung (siehe Tabelle 3)

TABELLE 3 Spurenmetalllösung

Komponente Konzentrationa (mg/L)

Calciumchlorid, Dihydrat 3102

Mangan(II)-sulfat, Monohydrat 400

Kupfer(II)-sulfat, Monohydrat 16

Kobalt(II)-chlorid, Pentahydrat 40

Borsäure 160

Zink(II)-sulfat, Heptahydrat 400

Natriummolybdat, Dihydrat 19

Vanadylsulfat, Dihydrat 20

Nickel(II)-nitrat, Hexahydrat 8

Natriumselenit 18

a Konzentration von Metall

Spurenmetalllösung. Die in Tabelle 3 aufgelisteten Zutaten und 20 mL konzentrierte Salzsäure wurden mit destilliertem Wasser auf 1 L aufgefüllt.

Nährmedium. 20 mL des Glucose-Salze-Konzentrats wurden zu dem Phosphatmedium im Fermenter hinzugegeben.

Zellwachstum und L-Ascorbinsäureproduktion. Das Nährmedium wurde erwärmt und auf 35ºC gehalten, die Bewegung wurde mit 300 U/min begonnen, Luft wurde in das Medium mit 0,1 L/min eingeleitet, der pH wurde mit Ammoniak, das dem Luftstrom hinzu gefügt wurde, auf 6,9 eingestellt. Das Medium wurde mit einer aktiv wachsenden Kultur angeimpft um eine anfängliche Zelldichte von ungefähr 0,3 g/L Trockengewicht zu erhalten.

Die Zellen ließ man auf Dichten von ungefähr 20-50 g/L (Trockenbasis) wachsen. Der pH wurde durch die Zugabe von gasförmigen Ammoniak auf 6,5-7,0 eingestellt. Um einen Überschuß an gelöstem Sauerstoff zwischen 20% und 90% Luftsättigung während des Verlaufes der Fermentation aufrechtzuerhalten, wurde die Bewegung mit 450 U/min begonnen und auf 800 U/min erhöht. Die Belüftung wurde mit 0,2 L/min begonnen und auf 0,6 L/min erhöht. Die Glucoseverfügbarkeit im Überstand wurde entweder durch den Glucoseoxidase-Enzymtest oder durch Hochdruckflüssigchromatographie überwacht. Wenn die Glucosekonzentration fiel, wurde sie durch Zugabe von ungefähr 20%-Aliquoten der Glucose-Salze-Konzentratlösung ergänzt, während die gesamte Glucosekonzentration unter 30 g/L gehalten wurde. Wenn das gesamte Glucose-Salze-Konzentrat zugegeben worden war und anschließend vollständig ausgeschöpft wurde, wurde in der Kulturbrühe L-Ascorbinsäure bestimmt.

Die zur Bestimmung der L-Ascorbinsäure (L-AA) benutzte Methode wurde von Grün und Loewus, Analytical Biochemistry (1983) 130 : 191-198 beschrieben. Die Methode besteht aus einem Ionenaustauschverfahren unter Verwendung einer 7,8 · 300 mm Analyse-Säule für organische Säuren, HPX-87 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Die Bedingungen sind: mobile Phase, 0,013 M Salpetersäure; Flußrate 0,8 mL/min. Druck 1500 psig (1,04 · 10&sup8; Dyn/cm²); Detektion, Extinktion bei 245 nm. Dieses System unterscheidet zwischen den L- und D-Isomeren der Ascorbinsäure.

Für die Trockengewichtsbestimmungen der Zelldichte wurden Proben der gesamten Brühe aus den Kulturen entfernt, 5 mL wurden bei 4000 · g 5 Minuten lang zentrifugiert, das Pellet wurde einmal mit destilliertem Wasser gewaschen und dann in eine geteerte Aluminiumwägeschale eingewaschen. Die Zellen wurden 8-24 Std. lang bei 60ºC und eine zusätzliche Stunde bei 105ºC getrocknet. Das Zellgewicht wurde durch die Differenz berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben.

TABELLE 4

a Werte sind das Mittel aus vier Fermentationen

Beispiel 2

Dieses Beispiel veranschaulicht die Produktion von L-Ascorbinsäure durch Prototheca zopfii bei niedrigem pH (3,5-5,0). Eine signifikante Menge an L-Ascorbinsäure wurde im extrazellulären Medium sogar mit meßbar gelöstem Sauerstoff in der Brühe hergestellt. Wenn nicht anders angegeben, wurde dem Verfahren von Beispiel 1 gefolgt. Die Fermentation lief in einem 14 L-Fermenter, der in der gleichen Weise wie der 1 L-Fermenter konfiguriert und kontrolliert wurde. Das verwendete Konzentrat ist in Tabelle 5 angegeben.

TABELLE 5

Glucose-Salze-Konzentrat

Menge Verbindung/Komponente

Gruppe 1

800 g Glucose, Nahrungsmittelgüte, Monohydrat

(wasserfreie Basis) in 2,1 L Wasser

Gruppe 2

15 g Trinatriumcitratdihydrat

6,6 g Magesiumsulfat, wasserfrei

10 mL Schwefelsäure in 250 mL Wasser

Gruppe 3

22 g monobasisches Natriumphosphat

22 g dibasisches Natriumphosphat in 250 mL Wasser

Gruppe 4

134 mL Spurenmetalllosung (siehe Tabelle 3)

Mediumherstellung. Eine Lösung von 3,9 g monobasischem Kaliumphosphat und 3,3 g dibasisches Natriumphosphat in 7,2 L destilliertem Wasser wurde in einem 14 L- Glasfermenter hitzesterilisiert. Nachdem das Medium abgekühlt war, wurden 27 mL einer 6,0 g/L Eisensulfatheptahydrat-Lösung durch ein 0,2 Mikrometer-Sterilfilter hinzu gegeben.

Zellwachstum und L-Ascorbinsäureproduktion. Zusätzlich zu den in Tabelle 6 aufgelisteten Zutaten enthielt das Medium 2 mg/L Thiaminhydrochlorid, das aseptisch hinzu gegeben wurde, nachdem der Fermenter hitzesterilisiert und gekühlt wurde. Die Temperatur betrug 30ºC. Das Medium wurde mit einer aktiv wachsenden Kultur von Prototheca zopfii, Stamm BTR 1254 angeimpft, was zu einer anfänglichen Zelldichte von ungefähr 0,3 g/L Trockengewicht führte.

Die Zellen wuchsen auf eine Zelldichte von 56 g/L Trockengewicht (Wachstumsrate, 0,20 h&supmin;¹). Der pH wurde durch Zugabe von gasförmigen Ammoniak auf ungefähr 3,5-5,0 gehalten. Die Bewegung wurde bei 100 U/min begonnen und auf 800 U/min erhöht. Die Belüftung wurde bei 2,0 L/min begonnen und auf 6,0 L/min Luft erhöht. Die Bedingungen und analytischen Ergebnisse sind in Tabelle 6 angegeben. TABELLE 6

Gesamtüberstand

a Glucose-Salze-Konzentrat

b 1050 mL des Glucose-Salze-Konzentrats während der nächsten 3 Stunden hinzu gegeben

Beispiel 3

Dieses Beispiel veranschaulicht die Produktion von L-Ascorbinsäure durch Prototheca moriformis bei niedrigem pH (4,0-5,0). Eine signifikante Menge der L-Ascorbinsäure wurde in dem extrazelluläre Medium sogar mit meßbar gelöstem Sauerstoff in der Brühe produziert. Wenn nicht anders angegeben wurde dem Verfahren von Beispiel 2 gefolgt.

Zellwachstum und L-Ascorbinsäureproduktion. Zusätzlich zu den in Tabelle 1 aufgelisteten Zutaten enthielt das Medium 2 mg/L Thiaminhydrochlorid, das aseptisch hinzu gegeben wurde, nachdem der Fermenter hitzesterilisiert und gekühlt wurde. Die Temperatur betrug 30ºC.

Das Medium wurde mit einer aktiv wachsenden Kultur von Prototheca moriformis ATCC 75669 angeimpft, was zu einer anfänglichen Zelldichte von ungefähr 0,3 g/L Trockengewicht führte. Die Zellen wuchsen auf eine Zelldichte von 42 g/L Trockengewicht (Wachstumsrate, 0,23 h&supmin;¹). Während der ersten 22 Std. wurde der pH durch Zugabe von gasförmigen wasserfreien Ammoniak auf ungefähr 5,0 gehalten. Dann wurde die Zugabe von Ammoniak gestoppt. Wenn der pH auf 4,0 fiel, wurde die Zugabe von Ammoniak wieder aufgenommen. Für den Rest der Fermentation wurde er auf 4,0 gehalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 angegeben. TABELLE 7

Gesamtüberstand

a Glucose-Salze-Konzentrat

b plus 1115 mL während der nächsten 6 Std.

Beispiel 4

Dieses Beispiel veranschaulicht die Produktion von L-Ascorbinsäure durch Chlorella protothecoides bei niedrigem pH (3,5-5,0). Eine signifikante Menge der L-Ascorbinsäure wurde in dem extrazelluläre Medium sogar mit meßbar gelöstem Sauerstoff in der Brühe produziert. Wenn nicht anders angegeben wurde dem Verfahren von Beispiel 3 gefolgt.

Zellwachstum und L-Ascorbinsäureproduktion. Das Medium wurde mit einer aktiv wachsenden Kultur von Chlorella protothecoides ATCC 75667 angeimpft, was zu einer anfänglichen Zelldichte von ungefähr 0,3 g/L Trockengewicht führte. Die Zellen wuchsen auf eine Zelldichte von 37 g/L Trockengewicht (Wachstumsrate, 0,16 h&supmin;¹). Während der ersten 18 Std. wurde der pH durch Zugabe von gasförmigen wasserfreien Ammoniak auf ungefähr 5,0 gehalten. Dann wurde die Zugabe von Ammoniak gestoppt. Wenn der pH auf 3,5 fiel, wurde die Zugabe von Ammoniak wieder aufgenommen. Für den Rest der Fermentation wurde er auf 3,5 gehalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 angegeben. TABELLE 8

Gesamtüberstand

a Glucose-Salze-Konzentrat

b 1800 mL Glucose-Salze-Konzentrat während der nächsten 3 Std. hinzu gegeben


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure, wobei das Verfahren umfaßt:

(a) Kultivieren eines Organismus, der gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Organismen der Gattung Prototheca und Organismen der Spezies Chlorella protothecoides, in einem Fermentationsmedium mit einem pH von weniger als 6,0 in Gegenwart einer verfügbaren Sauerstoffquelle; und

(b) Gewinnen von L-Ascorbinsäure aus dem genannten Fermentationsmedium.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem der genannte Organismus ein Organismus der Gattung Prototheca ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem der genannte Organismus aus der Gruppe, bestehend aus Prototheca moriformis und Prototheca zopfii, gewählt ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das genannte Verfahren durchgeführt wird bis wenigstens ungefähr 10% der produzierten L-Ascorbinsäure extrazellulär vorliegt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das genannte Verfahren durchgeführt wird bis wenigstens ungefähr 20% der produzierten L-Ascorbinsäure extrazellulär vorliegt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem sich extrazelluläre L-Ascorbinsäure in dem genannten Fermentationsmedium anhäuft.

7. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem der genannte Gewinnschritt die Gewinnung der L-Ascorbinsäure aus dem extrazellulären Fermentationsmedium umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei welchem der genannte Schritt des Gewinnens von L-Ascorbinsäure aus dem extrazellulären Fermentationsmedium durch ein Verfahren erfolgt, das aus der Gruppe, bestehend aus Ionenaustausch, Chromatographie, Extraktion, Membranseparation, Umkehrosmose, Destillation, chemische Derivatisierungsprozesse und Kristallisation, gewählt ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7, bei welchem der genannte Gewinnschritt ferner den Schritt des Gewinnens intrazellulärer L-Ascorbinsäure umfaßt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das genannte Fermentationsmedium einen pH von weniger als ungefähr 5, 5 hat.

11. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das genannte Fermentationsmedium einen pH von weniger als ungefähr 5,0 hat

12. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die Zelldichte des genannten Organismus weniger als ungefähr 5 g/L beträgt.

13. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem kein signifikanter Abbau von L-Ascorbinsäure erfolgt.

14. Fermentationskultur, die einen Organismus gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Organismen der Gattung Prototheca und Organismen des Spezies Chlorella protothecoides, und ein Fermentationsmedium mit einem pH zwischen 2, 5 und 6, 0 umfaßt und extrazelluläre L-Ascorbinsäure aufweist, wobei die genannte Fermentationskultur durch ein Verfahren erzeugt wird, das ein Kultivieren des genannten Organismus in dem genannten Fermentationsmedium in einer verfügbaren Sauerstoffquelle bis die genannte extrazelluläre L-Ascorbinsäure durch den genannten Organismus erzeugt wird, umfaßt.

15. Fermentationskultur nach Anspruch 14, bei welcher das genannte Fermentationsmedium wenigstens ungefähr 1 mg/L der extrazellulären L-Ascorbinsäure aufweist.

16. Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure, wobei das Verfahren umfaßt:

(a) Kultivieren eines Organismus, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Organismen der Gattung Prototheca und Organismen der Spezies Chlorella protothecoides, in einem Fermentationsmedium mit einem pH von weniger als 6,0 in Gegenwart einer verfügbaren Sauerstoffquelle, wobei das genannte Verfahren durchgeführt wird, bis das genannte Fermentationsmedium eine Konzentration der extrazellulären L-Ascorbinsäure von größer als ungefähr 1 mg/L hat; und

(b) Gewinnen von extrazellulärer L-Ascorbinsäure aus dem genannten Fermentationsmedium.

17. Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure, wobei das Verfahren umfaßt:

(a) Kultivieren eines Organismus, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Organismen der Gattung Prototheca und Organismen der Spezies Chlorella protothecoides, in einem Fermentationsmedium mit einem pH von weniger als ungefähr 6,0 in Gegenwart einer verfügbaren Sauerstoffquelle; und

(b) Gewinnen von L-Ascorbinsäure aus dem genannten Fermentationsmedium.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das genannte Verfahren durchgeführt bis wenigstens 2% der L-Ascorbinsäure in dem genannten Fermentationsmedium extrazellulär vorliegt.

19. Verfahren nach Anspruch 17, bei welchem die Zelldichte des genannten Organismus weniger als ungefähr 5 g/L beträgt.

20. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das genannte Verfahren durchgeführt wird bis wenigstens 2% der L-Ascorbinsäure in dem genannten Fermentationsmedium extrazellulär vorliegt.







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