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Dokumentenidentifikation DE69800383T2 16.08.2001
EP-Veröffentlichungsnummer 0870508
Titel Influenza Vaccine
Anmelder Duphar International Research B.V., Weesp, NL
Erfinder Van Scharrenburg, Gustaaf J. M., 1380 AC Weesp, NL;
Brands, Rudi, 1380 AC Weesp, NL
Vertreter Lederer, Keller & Riederer, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69800383
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 02.04.1998
EP-Aktenzeichen 982010563
EP-Offenlegungsdatum 14.10.1998
EP date of grant 08.11.2000
Veröffentlichungstag der Übersetzung europäischer Ansprüche 19.08.1999
Veröffentlichungstag im Patentblatt 16.08.2001
IPC-Hauptklasse A61K 39/145

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft Influenza-Oberflächenantigen-Impfstoffe, die durch Herstellung aus Influenzaviren erhältlich sind, die in einer Tierzellkultur vermehrt wurden, und ein Verfahren zur Herstellung von Oberflächenantigen-Proteinen von Influenzaviren, die in einer Tierzellkultur vermehrt wurden.

Der Körper des Influenzavirus hat eine Größe von etwa 125 nm und besteht aus einem Kern von Ribonucleinsäure (RNA) verbunden mit dem Nucleoprotein, der umgeben ist von einer Virushülle mit einer Lipid-Bilayer-Struktur. Die innere Schicht der Virushülle ist hauptsächlich aus Matrixproteinen aufgebaut und die äußere Hülle enthält den größten Anteil des vom Wirt stammenden Lipidmaterials.

Die so genannten "Oberflächenproteine" Neuraminidase (NA) und Hämagglutinin (HA) erscheinen als Stifte (Spikes) auf der Oberfläche des Virenkörpers.

Die meisten der im Handel erhältlichen inaktivierten Influenzaimpfstoffe sind so genannte "Spaltimpfstoffe oder Spaltvakzine" oder "Untereinheit-Impfstoffe".

"Spaltvakzine" werden hergestellt durch Behandlung des gesamten Influenzavirus mit solubilisierenden Konzentrationen von Detergenzien und durch nachfolgende Entfernung des Detergenz und der Hauptmasse des Virenlipidmaterials.

"Untereinheit-Impfstoffe" gegen Influenza enthalten anders als "Spaltvakzine" nicht alle Virenproteine. Stattdessen sind die "Untereinheit-Impfstoffe" mit Oberflächenproteinen angereichert, die für die Erzeugung der gewünschten Virusneutralisierenden (und damit schützenden) Antikörper bei der Impfung verantwortlich sind.

Die meisten der im Handel erhältlichen Influenzaimpfstoffe stammen von Influenzaviren, die auf embryonisierten Hühnereiern gezüchtet wurden. Es ist jedoch weithin anerkannt, dass die auf Eier bezogene Herstellung von Influenzavirus für Impfzwecke mehrere Nachteile hat:

1. Ein solcher Herstellungsprozess ist ziemlich empfindlich aufgrund der variierenden (mikro)biologischen Qualität der Eier.

2. Dem Verfahren fehlt aufgrund logistischer Probleme vollständig die Flexibilität, wenn plötzlich die Nachfrage ansteigt, d. h. im Fall einer ernsten Epidemie oder Pandemie, da große Mengen an geeigneten Eiern nicht verfügbar sind.

3. So hergestellte Impfstoffe sind für Personen mit einer bekannten Überempfindlichkeit gegenüber Hühner- und/oder Eiproteinen kontraindiziert.

Eine Lösung für diese Probleme kann in der Herstellung von Influenzavirus in einer Gewebekultur liegen. Es wird daher angenommen, dass ein solches Herstellungsverfahren viele Vorteile hat:

1. Gewebekultur-Zelllinien sind in wohl definierten Zellbanksystemen verfügbar, die frei von (mikro)biologischen Verunreinigungen sind, wodurch die Konsistenz von Charge zu Charge stark verbessert ist und ein Produkt höherer Qualität erhalten wird.

2. Die Chancen, genügend Impfstoff im Fall einer drohenden ernsten Epidemie oder Pandemie verfügbar zu haben, steigen.

3. Das erhaltene Influenzavirusmaterial ist besser geeignet für alternative Verabreichungswege (oral, nasal, inhaliert).

4. Vom Standpunkt der WHO aus lässt die Technologie es zu, die jährliche Empfehlung für die Zusammensetzung des Impfstoffs (von Mitte Februar bis Mitte März) zu verschieben, was das Abstimmen des Impfstoffs mit den zirkulierenden Stämmen verbessert.

Nichtsdestotrotz bleibt ein wichtiges Problem im Zusammenhang mit der Gewebekultur von Influenzavirus, da genetisches Material aus kontinuierlichen Zelllinien in dem Impfstoff zurückbleiben kann.

Ein solches Problem stellt ein Risiko dar, das, wenn es nicht überwunden wird, die Zulassungsämter dazu bringen kann, Anträge für die Marktzulassung für solche Influenzaimpfstoffe aus Sicherheitsgründen zu verweigern. Z. B. fordert die U. S. Food and Drug Administration, dass biotechnologische Produkte für menschliche Verwendung nicht mehr als 100 pg Wirtszell- DNA pro Dosis enthalten.

Daher liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Influenzavirus-Oberflächenantigen für Impfzwecke, das sicher ist und keine unakzeptablen Mengen an schädlichem genetischen Material enthält und die von den Regulierungsbehörden aufgestellten Erfordernisse erfüllt. Es wird jedoch als wünschenswert angesehen und ist überraschenderweise auch möglich, Influenzaimpfstoffe mit einem Wirtszell-DNA-Gehalt von beträchtlich weniger als 100 pg pro Dosis herzustellen.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit einen Influenza- Oberflächenantigen-Impfstoff, der aus Influenzaviren erhältlich ist, die in einer Tierzellkultur mit der unten beschriebenen Methode vermehrt wurden und einen Wirtszell-DNA-Gehalt von ≤ 25 pg pro Dosis haben.

Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung von Oberflächenantigenproteinen, die zur Herstellung von solchem Influenzaimpfstoff mit geringem DNA-Gehalt aus Influenzaviren, die in einer Tierzellkultur gezüchtet wurden, geeignet sind, das die folgenden Stufen umfasst, dass man:

a) die Flüssigkeit, die das ganze Virus enthält und die aus der Zellkultur erhalten wurde, mit einem DNA-verdauenden Enzym behandelt und

b) ein kationisches Detergenz zugibt

und anschließend die Oberflächenantigenproteine isoliert. Das erfindungsgemäße Verfahren kann während der Herstellung von Impfstoffen angewendet werden, die verschiedene Influenzavirenstämme enthalten, z. B. Viren, die typisch sind für Humaninfluenza, Schweineinfluenza, Pferdeinfluenza und Affeninfluenza.

Die erfindungsgemäße Tierzellkultur kann entweder primäre Zellen enthalten, z. B. Hühnerembryofibroblasten (CEF) oder eine kontinuierliche Zelllinie, z. B. Madin-Darby-Hundenierenzellen (MDCK), Eierstockzellen vom Chinesischen Hamster (CHO) und Verozellen.

Die Behandlung der ganze Viren enthaltenden Flüssigkeit mit einem DNA-verdauenden Enzym kann direkt im Fermenter durchgeführt werden, gegebenenfalls bereits während dem Zellkultur- und Virenvermehrungsverfahren.

Geeignete Beispiele für DNA-verdauende Enzyme sind DNase (z. B. klassifiziert als EC 3.1.21 und EC 3.1.22) und Nucleasen (z. B. klassifiziert als EC 3.1.30 und 3.1.31).

Geeignete kationische Detergenzien der vorliegenden Erfindung bestehen hauptsächlich aus einer Verbindung der allgemeinen Formel

worin

R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; gleich oder verschieden sind und jeweils Alkyl- oder Arylreste bedeuten, oder

R&sub1; und R&sub2; zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 5- oder 6-gliedrigen gesättigten heterocyclischen Ring bilden, und

R&sub3; einen Alkyl- oder Arylrest bedeutet oder

R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Ring bedeuten, der am Stickstoffatom ungesättigt ist,

R&sub4; einen Alkyl- oder Arylrest bedeutet und

X ein Anion bedeutet.

Beispiele für solche kationischen Detergenzien sind Cetyltrimethylammoniumsalze, wie Cetyltrimethylammoniumbromid (C. T. A. B.) und Myristyltrimethylammoniumsalz. Geeignete Detergenzien sind auch Lipofectin, Lipofectamin, DOTMA.

Gegebenenfalls können diese kationischen Detergenzien mit einem nichtionischen Detergenz, z. B. Tween, ergänzt sein.

Die Isolierung der Oberflächenantigenproteine nach der Behandlung mit Detergenz kann z. B. die Stufen umfassen, dass man:

1. die RNP-Teilchen (Körper) von den Oberflächenantigenproteinen abtrennt, z. B. mit Zentrifugation oder Ultrafiltration und

2. das Detergenz von den Oberflächenantigenproteinen entfernt, z. B. durch hydrophobe Wechselwirkung des Detergenz mit einem geeigneten Harz (z. B. Amberlite XAD-4) und/oder durch Ultra(dia)filtration.

Überraschenderweise liefert das erfindungsgemäße Verfahren ein Produkt, dessen Gehalt an von Tierzellen stammender DNA extrem gering ist. DNA-Konzentrationen von nur 25 pg/Dosis und in vielen Fällen sogar nur 10 pg/Dosis sind leicht erhältlich.

Die Oberflächenantigenproteine können aufgearbeitet werden, um den Influenzaimpfstoff herzustellen, z. B. durch Zugabe von Puffer (z. B. PBS) und/oder Vermischen mit Antigenen von anderen Influenzavirus-Serotypen.

Gegebenenfalls ist die Konzentrierung des Oberflächenantigens für die weitere Herstellung des Impfstoffs erforderlich.

Beispiel 1 A. Virusvermehrung

1. Influenzavirus der Antigenart B/Yamagata wird in Madin- Darby-Hundenieren (MDCK)-Zellen (ATCC CCL34) in einem Fermenter vermehrt durch 2-tägiges Inkubieren des Impfvirus mit den Zellen bei 35ºC.

2. Als Nächstes wird der pH der Fermenterflüssigkeit auf 8,0 erhöht durch Zugabe von verdünntem Natriumhydroxid und Benzonnuclease wird auf eine Endkonzentration von 1000 Einheiten (1 ug) pro Liter zugegeben.

3. Die Inkubation wird bei 35ºC 4 Stunden lang fortgeführt.

B. Isolierung des Virus

1. Die Flüssigkeit wird durch einen Tiefenfilter mit einer Nennporengröße von 0,5 um filtriert, um Zellbruchstücke zu entfernen.

2. Anschließend wird der Influenzavirus eingeengt und mit Ultrafiltration gereinigt unter Verwendung einer Membran mit einer Molekulargewichtsausschlussgrenze von 300 000.

3. Saccharose wird zu dem Konzentrat auf eine Endkonzentration von 30% (G/V) zugegeben, wonach Formaldehyd auf eine Endkonzentration von 0,015% (G/V) zugegeben wird. Diese Mischung wird bei 2 bis 8ºC 72 Stunden lang gerührt.

4. Als Nächstes wird das Viruskonzentrat fünffach mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt und auf eine Affinitätssäule geladen, die Amicon-Cellufine-Sulfat enthält. Nach Entfernung der Verunreinigungen, indem mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen wird, wird das Virus mit einer Lösung von 1,5 M Natriumchlorid in phosphatgepufferter Kochsalzlösung eluiert. Das Eluat wird eingeengt und durch Ultrafiltration entsalzt unter Verwendung einer Membran mit einem Molekulargewichtsausschluss von 300 000.

C. Isolierung der Untereinheit

1. Das nichtionische Detergenz Tween-80 wird auf eine Endkonzentration von 300 ug/ml zugegeben und Cetyltrimethylammoniumbromid wird auf eine Endkonzentration von 750 ug/ml zugegeben. Diese Mischung wird bei 4ºC 3 Stunden lang gerührt, wonach das RNP-Teilchen von den Oberflächenantigenproteinen durch Zentrifugation getrennt wird.

2. Der Überstand wird mit Amberlite XAD-4 über Nacht bei 2 bis 8ºC gerührt, um die Detergenzien zu entfernen. Amberlite wird durch Filtration entfernt und das Filtrat wird anschließend einer Sterilfiltration unterzogen, indem es durch ein 0,22-um-Filter geleitet wird.

Während des obigen Verfahrens wurde der Gehalt an Wirtszell- DNA der Proben mit einem validierten Test analysiert auf Basis der Slot-Blot-Hybridisierung unter Verwendung einer mit 32P-markierten Hunde-DNA-Sonde.

Die Ergebnisse des DNA-Assays, der nach verschiedenen Stufen durchgeführt wurde, sind in der folgenden Tabelle angegeben (in dieser Tabelle ist der DNA-Gehalt pro IW-Dosis ausgedrückt in Picogramm pro 50 ug HA).

Tabelle

Beispiel 2

Die Vermehrung, Reinigung, Inaktivierung und Spaltung des Virus werden durchgeführt wie in Beispiel 1.

Die Behandlung der Fermenterflüssigkeit mit Benzonnuclease während der letzten Stunden der Virusvermehrung (Stufen A2 und A3), die Verwendung des pH des Vermehrungsmediums (Stufe A1) lieferten ähnliche Ergebnisse im Hinblick auf die DNA- Entfernung.

DNase I ist, obwohl sie in höheren Konzentrationen erforderlich ist, genauso wirksam bei der Entfernung der Wirtszell- DNA (während der Stufen A1 bis A3). Ähnliche Ergebnisse können bei Verwendung anderer Endonucleasen erhalten werden.

Beispiel 3

Das Verfahren wird durchgeführt wie in Beispiel 1 oder 2, außer dass die Entfernung der Zellbruchstücke (Stufe B1) durch Zentrifugation bewirkt wird.

Beispiel 4

Das Verfahren wird durchgeführt, wie in Beispiel 1, 2 oder 3, außer dass das Virus aus der Fermenterflüssigkeit eingeengt und gereinigt wird (Stufe B2) durch Zentrifugieren in einer kontinuierlichen Durchflusszonalzentrifuge, z. B. Electro- Nucleonics (Modell RK) unter Verwendung eines Saccharosegradienten, z. B. in phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

Beispiel 5

Das Verfahren wird durchgeführt, wie in Beispiel 1 bis 4, außer dass die Zugabe von Cetyltrimethylammoniumbromidlösung in Stufe C1 ersetzt wird durch Zugabe einer Lösung von Cetylpyridiniumbromid, Myristyltrimethylammoniumbromid, Benzethoniumchlorid, Methylbenzethoniumchlorid, Decaitiethoniumchlorid oder Stearyldimethylbenzylaitimoniumbromid. Ähnliche Ergebnisse im Hinblick auf die Entfernung der Wirtszell-DNA werden erhalten.

Beispiel 6

Das Verfahren wird durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben, außer dass die Zugabe der Saccharose nach einer Affinitätssäulenchromatographie durchgeführt wird und 120 Stunden lang Forrualdehyd zugegeben wird auf 0,05% (G/V).

Beispiel 7

Die Methoden der Beispiele 1, 2, 3, 4 und 6 wurden auch erfolgreich angewendet zur Herstellung von Impfstoffen mit geringem DNA-Gehalt aus Influenzaviren der Stämme B/Harbin, B/Panama, A/Texas (HIN1), A/Taiwan (HIN1), A/Johannesburg (H3N2) und A/Wuhan(H3N2).


Anspruch[de]

1. Influenza-Oberflächenantigen-Impstoff aus Influenzaviren die in Tierzellkulturen vermehrt wurden, erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 3, mit einem Gehalt an Wirtszell-DNA gleich oder weniger als 25 pg pro Dosis.

2. Infuenza-Oberflächenantigen-Impfstoff gemäß Anspruch 1 mit einem Gehalt an Wirtszell-DNA von weniger als 10 pg pro Dosis.

3. Verfahren zur Herstellung von Oberflächenantigen-Proteinen aus Infuenzaviren, die in Tierzellkulturen vermehrt wurde, das folgende Schritte umfaßt:

a. Behandlung der Flüssigkeit, die das ganze Virus enthält und aus der Zellkultur erhalten wurde, mit einem DNAverdauenden Enzym, und

b. Zugabe eines kationischen Detergens, gefolgt von der Isolierung der Oberflächenantigen-Proteine.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Behandlung mit dem DNAverdauenden Enzym während der Vermehrung des Infuenzavirus in der Zellkultur stattfindet.

5. Verfahren nach Anspruch 3, worin das kationische Detergens überwiegend besteht aus einer Verbindung der allgemeinen Formel

worin

R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; gleich oder verschieden sind und jedes Alkyl oder Aryl bedeutet, R&sub1; und R&sub2;, zusammen mit dem Stickstoffatom, an das diese gebunden sind, einen 5- oder 6- gliedringen gesättigten heterocyclischen Ring bilden, und R&sub3; Alkyl oder Aryl bedeutet, oder

R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; zusammen mit dem Stickstoffatom an das diese gebunden sind, einen 5- oder 6- gliedrigen heterocyclischen Ring bedeuten, der am Stickstoffatom ungesättigt ist,

R&sub4; Alkyl oder Aryl bedeutet und

X ein Anion bedeutet.

6. Verfahren nach Anspruch 3, worin das kationische Detergens überwiegend Cetyltrimethylammoniumbromid enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 3, worin das kationische Detergens durch ein nichtionisches Detergens ergänzt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Infuenzaviren in einer Tierzellinie vermehrt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Influenzaviren in MDCK-Zellen vermehrt werden.







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