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Dokumentenidentifikation DE69426725T2 06.09.2001
EP-Veröffentlichungsnummer 0725825
Titel PEPTIDE, DIE NEUTRALISIERENDE ANTIKÖRPER GEGEN GENETISCH DIVERGIERENDE HIV-1 STÄMME, INDUZIEREN
Anmelder Polimun Scientific immunbiologische Forschungsgesellschaft mbH, Wien, AT
Erfinder KATINGER, Hermann, A-1190 Wien, AT;
MUSTER, Thomas, A-1180 Wien, AT
Vertreter Becker, Kurig, Straus, 80336 München
DE-Aktenzeichen 69426725
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, IE, IT, LI, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 12.09.1994
EP-Aktenzeichen 949276026
WO-Anmeldetag 12.09.1994
PCT-Aktenzeichen EP9403039
WO-Veröffentlichungsnummer 9507354
WO-Veröffentlichungsdatum 16.03.1995
EP-Offenlegungsdatum 14.08.1996
EP date of grant 21.02.2001
Veröffentlichungstag im Patentblatt 06.09.2001
IPC-Hauptklasse C12N 15/48
IPC-Nebenklasse C07K 14/16   A61K 39/21   A61K 39/395   C07K 16/10   

Beschreibung[de]

[0001] Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Peptide, die neutralisierende Antikörper gegen verschiedene Stämme und klinische Isölate von HIV-1 induzieren, sowie auf die damit induzierten Antikörper und auch auf die Herstellung von Peptid- Träger-Kombinationen, die diese Peptide dem Immunsystem wirksam darbieten. Genauer bezieht sich diese Erfindung auf die Entwicklung eines Impfstoffes gegen HIV-1.

[0002] Das Syndrom der erworbenen Immunschwäche (AIDS) ist das Spätstadium der klinischen Manifestation einer langfristigen persistenten Infektion mit dem humanen Immunschwächevirus des Typs 1 (HIV-1). Während der persistenten Infektion gegen das Virus und die virusinfizierten Zellen gerichtete Immunreaktionen versagen gewöhnlich darin, eine Behebung der Infektion zu vermitteln. Impfstoffe vermögen Immunantworten zu induzieren, die das Auftreten einer persistenten Infektion oder sogar das Fortschreiten zu AIDS verhüten können. Die meisten Impfstoffstrategien gegen HIV-1 richten sich auf dessen oberflächliches Glykoprotein gp160, das aus gp 120 und gp41 besteht und für die Bindung des Virus an den Zellrezeptor CD4 sowie die Auslösung der nachfolgenden Fusionsaktivität verantwortlich ist.

[0003] In Zusammenhang mit gp160 sind jedoch verschiedene Erscheinungen beobachtet worden, die gegen die Verwendung des ganzen gp160 oder gp120 als ein Immunogen sprechen. Invitro-Experimente zeigen, dass Synergismus zwischen gp 120 und gp 120-spezifischen Antikörpern die Aktivierung menschlicher T-Zellen blockiert (Mittler et att Science (1989) 245: 1380). Ausserdem sind eine Anzahl antigener Domänen auf gp 160 dafür bekannt, Antikörper zu induzieren, die eine HIV- 1-Infektion verstärken (Jiang et al., J. Exp. Med. (1991) 174 : 1557).

[0004] Die Verwendung synthetischer Peptide als Immunogene bietet eine Anzahl von Vorteilen. Die von synthetischen Peptiden induzierten Antikörper haben eine vorbestimmte Spezifität, und im Falle von Viren können sie so ausgewählt werden, dass sie Strukturen auf der Oberfläche von Virionen darstellen. Die synthetischen Polypeptide sind auch insofern von Interesse, als sie Antikörperreaktionen induzieren können, die unter normalen Bedingungen nicht erkennbar sind. Zum Beispiel ist es möglich, neutralisierende Antikörper zu induzieren, die eine breitere Reaktivität als von Vollproteinen induzierte Antikörper haben (Green et al., Cell (1982) 28: 477).

[0005] Ausserdem ist gezeigt worden, dass ein Peptid, das einen Teil der V3- Schleife des gp120 aus HIV-1-Isolat HIV-1 1113 enthielt, Antikörper induziert, die Schimpansen gegen virale Herausforderung mit demselben HIV-1-Jsolat schützten (Emini et al., Nature (1992) 355: 728).

[0006] Da synthetische Peptide selbst eine schwache Immunogenität aufweisen, müssen sie an Moleküle gekoppelt werden, die eine Adjuvantienwirkung haben, zum Beispiel Tetanustoxoid oder Napfschnecken-Hämocyanin (Bittle et al., Nature (1982) 298: 30). Eine weitere Möglichkeit besteht darin, kleine Peptide als Fusionsproteine mit Glutathion-S-transferase von Schistosoma japonicum zu klonen (Fikrig et al., Science (1990) 250: 553).

[0007] Weiterhin können Viren wie das Vaccinia-, Polio- oder Influenza-Virus als Vektoren für Immunogene verwendet werden. Kaninchen, die mit Sequenzen des Hepatitis-B-Oberflächenantigens (HBsAg) enthaltenden rekombinanten Vacciniaviren, Herpes simplex-Viren-Glykoprotein D und Influenzavirus-Hämagglutinin geimpft wurden, produzierten Antikörper gegen alle drei dieser fremden Antigene (Perkus et al., Science (1985) 229: 981). Weiterhin induzierte ein chimärer Polio- Virus, der ein Epitop aus HN-1-gp41 ausprägte, erfolgreich neutralisierende Antikörper gegen HIV-1 in Kaninchen (Evans et al., Nature (1989) 339: 385).

[00081 Seit kurzem ist es auch möglich, das Genom des Influenzavirus durch Invitro-Mutagenese zu verändern (Enami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 3802). Mit dieser Technik war es möglich, ein stabiles abgeschwächtes Influenza-A- Virus zu konstruieren (Muster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88: 5177).

[0009] Ein Vorteil des Influenzavirus ist in diesem Zusammenhang die Verfügbarkeit vieler Varianten, so dass eine wiederholte Impfung möglich werden kann. Des weiteren induziert das Influenzavirus starke sekretorische und zelluläre Immunreaktionen, die für ein Anti-HIV-1-Impfverfahren von Vorteil sein können.

[0010] Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, Peptidsequenzen zu schaffen, die im Zusammenhang mit dem vollen gp160 nur minimal immunogen sind, und die dazu verwendet werden können, Antikörper zu induzieren, die eine neutralisierende Aktivität gegenüber verschiedenen Stämmen und/oder klinischen Isolaten von HIV-1 aufweisen und/oder die durch HIV-1 in Säugern hervorgerufene Zelifusion inhibieren.

[0011] Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, Strategien zu schaffen, um sekretorische Antikörper zu induzieren, die von Schleimhautoberflächen ausgeschieden werden und sich gegen das HIV-1-Virus und virusinfizierte Zellen wenden. Es wurde erfindungsgemäss vorausgesetzt, dass die Induktion von Anti-HIV-1-IgA-Antikörpern in Schleimhautgeweben eine starke Waffe speziell in der Vorbeugung und Verhütung der HIV-1-Infektion in potentiell gefährdeten Individuen schaffen wird, da viele Virus-Infektionen, darunter HIV-1, über Schleimhautoberflächen des Atem-, Magen-, Dann- und Genitaltrakts übertragen werden.

[0012] Die Ziele werden durch Herstellung kleiner Peptide mit sieben oder acht Aminosäuren erreicht, die entweder durch chemische Synthese oder durch mikrobiologische Verfahren erhalten werden, wobei die Peptide bevorzugt von Nucleinsäuresequenzen abgeleitet sind, die für Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser ( = ELDKWAS in der Ein-Buchstaben-Notation), Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser (LELDKWAS), Glu Leu Asn Lys Trp Ala Ser (ELNKWAS), Leu Glu Leu Asn Lys Trp Ala Ser (LELNKWAS), Glu Leu Asp Asn Trp Ala Ser (ELDNWAS) oder Leu Glu Leu Asp Asn Trp Ala Ser (LELDNWAS) kodieren.

[0013] Zumindest eine und bevorzugt alle der sechs obigen Aminosäuresequenzen (hiernach als die "benannten sechs ASS" bezeichnet) können dann dem Immunsystem wirkungsvoll dargeboten werden, um die Bildung und Freisetzung von Antkörpern zu induzieren, die eine neutralisierende Aktivität gegenüber HIV-1-Stämmen aufweisen und/oder die durch diese Viren verursachte Zelfusion inhibieren können.

[0014] Es ist ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung, einen vielversprechenden Anti-HIV-1-Impfstoff zu schaffen, das auf einer Formulierung beruht, die zumindest eines und bevorzugt ein Gemisch aller sechs der obigen Peptide umfasst. Besondere Merkmale und vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung werden unten beschrieben.

[0015] In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Aminosäuresequenz Glu Leu Asp Lys Trp Ala (ELDKWA), die die Epitopsequenz des monoklonalen menschlichen Antikörpers 2F5 definiert (aus der Hybridom-Zelllinie 2F5 erhalten, PHLS-Hinterlegung Nr. 90091704; hinterlegt am 17. 9. 1990), mit einem Ser oder sowohl einem Leu und einem Ser verbunden (die der ELDKWA-Sequenz auf gp41, die das 2F5-Epitop definiert, benachbart ist), wodurch die Peptidsequenzen Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser (ELDKWAS) bzw. Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser (LELDKWAS) hergestellt werden, und in ein Trägermolekül eingesetzt, und zwar an der Antigenerkennungsstelle B des Influenzavirus HA.

[0016] Das modifizierte "chimäre" HA-Fusionsprotein, das die fremde Aminosäuresequenz ELDKWAS oder LELDKWAS trägt, induziert sehr wirksam Antikörper, die gegen die dargebotene ELDKWAS- bzw. LELDKWAS-Sequenz gerichtet sind, wenn sie vorzugsweise in injizierter Form auf das Immunsystem von Säugern und insbesondere Menschen angesetzt werden. Die mit diesem Verfahren erhaltenen Antikörper weisen neutralisierende Aktivität gegenüber verschiedenen Stämmen und/oder klinischen Isolaten von HIV-1 auf.

[0017] Es hat sich jedoch erwiesen, dass durch die bekannte Polymorphie des HIV- 1-Virus Mutationen sogar innerhalb der hochkonservierten (L)ELDKWAS-Aminosäuresequenz von gp41, die den Aminosäuren 661-668 (LELDKWAS) oder 662-668 (ELDKWAS) des HIV-1-Isolats BH10 entsprechen, auftreten können. Die Nucleotid- und Aminosäurenummerierung, die überall in dieser Beschreibung verwendet wird, entspricht der des gp160 von HIV-1-Isolat BH10, wie sie in der Datenbank von Los Alamos verwendet wird (Myers et al., Data Base Human Retrovirus and Aids). Die Mutationen betrafen insbesondere die Aminosäuren Asp (D) und/oder Lys (K) in der Mitte der benannten Sequenz, wodurch die Empfänglichkeit des Virus, durch Antikörper, die das 2F5-Epitop tragen, neutralisiert zu werden, vermindert wird. Diese unerwünschte Art eines viralen Ausweichmechanismus konnte jedoch erfolgreich durch Verwendung derjenigen Peptide gemäss vorliegender Erfindung überwunden werden, in denen entweder Asp (D) oder benachbartes Lys (K) durch Asparagin (N) ersetzt sind.

[0018] Zumindest eines und bevorzugt ein Gemisch aller sechs Peptide kann für die Herstellung eines Medikaments zur Induzierung von Antikörpern verwendet werden, die neutralisierende Aktivität gegenüber verschiedenen Stämmen und/oder klinischen Isolaten von HIV-1 aufweisen und/oder die durch HIV-1 verursachte Zellfusion inhibieren.

[0019] In einer weiteren Ausführungsform können dieselben Peptide, entweder jedes für sich oder in einem Gemisch mit zumindest einem anderen der benannten Peptide, dazu verwendet werden, ein Medikament zur Induktion von Anti-HIV-1-IgA-Antikörpern herzustellen, die nach bevorzugt intranasaler Anwendung in Säugern von Schleimhautoberflächen ausgeschieden werden.

[0020] In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist zumindest eines der benannten sechs Peptide an einen Träger gebunden. Ein solcher Träger kann zum Beispiel ein Virus sein, bevorzugt in seiner abgeschwächten und/oder rekombinanten Form. Vorteilhafterweise können Influenzavirus, Baculovirus oder Vacciniavirus benutzt werden. Durch Bindung der kleinen Peptide an einen Träger wie zum Beispiel ein Virusprotein oder ein vollständiges Virus erhöht sich die Wirksamkeit der Antikörperinduktion, wenn solche Kombinationen aus chimärem Peptid und Träger oder chimäre Fusionsproteine dem Immunsystem dargeboten werden.

[0021] Es ist besonders vorteilhaft, jedes der obigen Peptide als ein Fusionsprotein mit einem Virusprotein als Träger einzusetzen, worin zumindest eine der erfindungsgemässen Aminosäuresequenzen zumindest einen Teil des viralen Trägerproteins ersetzt oder in zumindest eine der Antigenerkennungsstellen des Virusproteins eingesetzt ist. Dieses Merkmal stellt daher eine wichtige Ausführungsform dar. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das benannte Virusprotein das Hämagglutinin (HA) des Influenzavirus, die Neuraminidase (NA) des Influenzavirus oder das Oberflächenantigen des Hepatitis-B-Virus. In einer anderen Ausführungsform kann es von einem (bevorzugt rekombinanten) Baculovirus oder Vacciniavirus abgeleitet sein.

[0022] Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung irgend eines der oben identifizierten, aus sieben oder acht Aminosäuren bestehenden Peptide und/oder Peptid/Träger-Kombinationen oder Fusionsproteine zur Herstellung eines Medikaments zur Induzierung von Antikörpern, die neutralisierende Aktivität gegenüber verschiedenen Stämmen und/oder klinischen Isolaten von HIV-1 aufweisen und/oder die durch HIV-1 verursachte Zelifusion inhibieren. Insbesondere ist beabsichtigt, einen wirksamen Impfstoff auf der Basis von zumindest einem, bevorzugt eines Gemisches aller sechs der benannten Peptide und/oder der benannten, an einen Träger gebundenen sechs Peptide zur prophylaktischen Behandlung von HIV-1- gefährdeten Individuen und/oder zur therapeutischen Behandlung von HIV-1-infizierten Patienten zu schaffen, insbesondere zur Verhütung des Fortschreitens der Infektion zu AIDS.

[0023] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die benannten sechs Peptide und/oder benannten, an einen Träger gebundenen sechs Peptide verwendet, um pharmazeutische Formulierungen zuzubereiten und zu produzieren, die nach Anwendung auf das Säuger-Immunsystem zur Induktion von Anti-HIV-1-Antikörpem fuhren, die von den Schleimhautoberflächen der tierischen oder menschlichen Patienten ausgeschieden werden. In diesem Falle wird eine intranasale Anwendung bevorzugt.

[0024] Folglich können die benannten sechs Peptide und/oder Peptid-Träger-Kombinationen der vorliegenden Erfindung auch fix die Produktion eines Medikaments für die Vorbeugung und Verhütung von HIV-1-Infektion bei gefährdeten Individuen verwendet werden.

[0025] Es scheint, dass dieses besondere Merkmal der vorliegenden Erfindung die Hoffnung wecken kann, dass durch Induktion von anti-HIV-1-spezifischen sekretorischen IgA-Antikörpem in den Schleimhautoberflächen gemäss vorliegender Erfindung eine medizinische Waffe geschaffen wird, die die eindringenden Viren bereits auf der allerersten Stufe ihres Eintretens in den Säugerkörper wirkungsvoll angreift. Es wird angenommen, dass Verfahren des Standes der Technik zur Behandlung von HIV-1-infizierten Patienten zumindest teilweise darin scheitern, vor der Krankheit zu schützen, weil das Virus primär im Blutstrom und in einem ziemlich späten Stadium verfolgt wird, nämlich nach weitgestreuter Verbreitung im humoralen System.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiter auf einen Antikörper, der eine HIV- 1 neutralisierende Aktivität aufweist und in der Lage ist, die von HIV-1 verursachte Zelfusion zu inhibieren, dadurch gekennzeichnet, dass er durch eines der benannten sechs Peptide induziert wird.

[0026] In einer bevorzugten Ausführungsform ist der benannte Antikörper ein sekretorischer Antikörper, bevorzugt ein Anti-HIV-1-IgA-Antikörper und vorteilhafterweise von Schleimhautoberflächen ausgeschieden.

[0027] Des weiteren bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Verfahren zur Herstellung irgend eines der benannten sechs Peptide entweder durch mikrobiologische oder durch chemische Methoden.

[0028] In einer Ausführungsform werden die benannten sechs Peptide nach biochemischen Standardverfahren chemisch synthetisiert werden, bevorzugt unter Verwendung eines Peptid-Synthetisators 431A von Applied Biosystems.

[0029] In einer anderen Ausführungsform werden die benannte Aminosäuresequenzen durch ein mikrobiologisches Verfahren erhalten, das die Schritte umfasst, in das Genom eines Wirtsorganismus eine Nucleotidsequenz einzusetzen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus

a) einer Nucleotidsequenz, die einem der benannten sechs Peptide entspricht;

b) einer Nucleotidsequenz, die zu einer der Nucleotidsequenzen unter (a) hybridisiert;

c) einer durch Degeneration aus einer der Nucleotidsequenzen unter (a) abgeleiteten Nucleotidsequenz

besteht, die Expression des Genoms unter Verwendung mikrobiologischer Standard- Kultivierungsverfahren auszuführen und zumindest eines, bevorzugt eine Vielzahl der benannten Peptide zu isolieren.

[0030] Chimäre Fusionsproteine oder Peptid-Träger-Kombinationen können nach einer Ausführungsform hergestellt werden, die beinhaltet, eine aus der aus den benannten sechs Peptiden bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäuresequenz durch chemische oder mikrobiologische Methoden an einen Träger zu binden, bevorzugt ein Virus oder ein Virusprotein.

[0031] In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren zur Herstellung der an einen Träger, bevorzugt ein Virus oder ein Virusprotein, gebundenen sechs Peptide mikrobiologisch und umfasst die Schritte, mit einer einer Aminosäuresequenz des Trägers entsprechenden Nucleotidsequenz eine Nucleotidsequenz zu verbinden, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus

a) einer Nucleotidsequenz, die einer der Aminosäuresequenzen der benannten sechs Peptide entspricht;

b) einer Nucleotidsequenz, die zu einer der Nucleotidsequenzen unter (a) hybridisiert;

c) einer durch Degeneration aus einer der Nucleotidsequenzen unter (a) abgeleiteten Nucleotidsequenz

besteht, die verbundenen Nucleotidsequenzen zu einem Wirtsorganismus zu überführen, die Expression der verbundenen Sequenz unter Verwendung mikrobiologischer Standard-Kultivierungsverfahren auszuführen und zumindest eines, bevorzugt eine Vielzahl der benannten, an einen Träger gebundenen Peptide zu isolieren.

[0032] In einer weiteren Ausführungsform ist das Verfahren zur Herstellung der benannten, an einen Träger, bevorzugt ein Virus oder Virusprotein, gebundenen sechs Peptide dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eine der Nucleotidsequenzen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus

a) einer Nucleotidsequenz, die einer der Aminosäuresequenzen der benannten sechs Peptide entspricht;

b) einer Nucleotidsequenz, die zu einer der Nucleotidsequenzen unter (a) hybridisiert;

c) einer durch Degeneration aus einer der Nucleotidsequenzen unter (a) abgeleiteten Nucleotidsequenz

besteht, mit einer Nucleotidsequenz verbunden wird, die einer Aminosäuresequenz eines Virusproteins als des Trägers entspricht, wodurch zumindest ein Teil der Nucleotidsequenz ersetzt wird, die der Aminosäuresequenz des Virusproteins entspricht oder an zumindest einer Stelle der benannten Sequenz eingesetzt wird, die einer Antigenerkennungsstelle des Virusproteins entspricht.

[0033] In einer speziellen Ausführungsform ist das eingesetzte Virusprotein aus der Gruppe ausgewählt, die aus Hämagglutinin des Influenzavirus, Neuraminidase des Influenzavirus und dem Oberflächenantigen des Hepatitis-B-Virus besteht, während in einer anderen charakteristischen Ausführungsform ein Influenzavirus, Baculovirus oder Vacciniavirus - jeweils bevorzugt in einer rekombinanten Form - als der Wirtsorganismus verwendet wird.

[0034] Einsetzen der Sequenzen der benannten sechs Peptide an der Antigenerkennungsstelle B des HA von Influenzastämmen, die kein WSN sind (der Stamm, auf den in den folgenden Beispielen hauptsächlich Bezug genommen werden wird), führt gleichermassen zu Fusionsproteinen und/oder chimären Viren, die neutralisierende Anti-HIV-1-Antikörper induzieren und HIV-1-gelenkte Zellfusion verhindern.

[0035] Die Einführung dieser Sequenzen an andere Stellen des HA des Influenzavirus oder in die Neuraminidase (NA) des Influenzavirus führt ebenfalls zu Peptid- Träger-Fusionsproteinen und/oder chimären Viren, die neutralisierende Anti-HIV- Antikörper induzieren und HIV-gelenkte Zelifusion verhindern.

[0036] Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen, die den Rahmen der vorliegenden Erfindung in keiner Hinsicht einschränken, weiter erläutert und veranschaulicht.

Beispiel 1: Epitop-Kartierung

[0037] Das Epitop des monoklonalen Antikörpers 2F5 wurde nach der von Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76 : 4350, beschriebenen Methode durch Immuno-Blotting identifiziert. Peptide von überlappenden Fragmenten des gp41 von HIV-1-Isolat BH10 wurden als Fusionspeptide mit Glutathion-S-transferase geklont. Die verschiedenen Fusionspeptide wurden durch Hybridisierung von dem gp41 entsprechenden Oligonucleotiden erhalten, die zwischen den Stellen Bam HI und Eco RI des Plasmids pGEX-2T (Pharmacia) geklont waren. Die rekombinanten Plasmide wurden in den E. coli-Stamm DH5 übertragen, und die Expression der Fusionsproteine wurde mit Isopropylthiogalactosid (IPTG), induziert. Der E ecoli-Auszug wurde dann mit Glutathion-Sepharose 4B-Säulen gereinigt, auf Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamid-Gele aufgegeben, durch Elektrophorese aufgetrennt und die Proteinexpression durch Färbung mit Silber und Immuno-Blotting analysiert (Fig. 1). Die Immuno-Blotting-Daten zeigen, dass das Epitop des menschlichen monoklonalen Antikörpers 2F5 die den Aminosäuren 662-667 von gp160 entsprechende Aminosäuresequenz ELDKWA umfasst.

Fig. 1 veranschaulicht die Spezifität des menschlichen monoklonalen Antikörpers 2F5 (siehe Beispiel 1).

Fig. 2 veranschaulicht den Aufbau von chimären Hämagglutininen, die die 2F5- Epitopsequenz tragen (siehe Beispiel 2).

Fig. 3 veranschaulicht ELISA-Titer der Antiseren von Mäusen., die mit den chimären Influenzaviren immunisiert wurden (siehe Beispiel 3).

Fig. 4 veranschaulicht ELISA-Titer von Mäusen, die mit Zellen immunisiert wurden, die mit den rekombinanten Baculoviren infiziert waren (siehe Beispiel 5).

[0038] Fig. 1 zeigt Immunoblots von Fusionspeptiden mit überlappenden Fragmenten von HIV-1-gp160 (Isolat BH10). Im Gegensatz zu Konstrukten, die die Aminosäuren 597 bis 677 (Bahn 2), 634 bis 677 (Bahn 3) und 648 bis 677 (Bahn 4) umfassen und Reaktivität gegenüber dem Antikörper 2F5 aufweisen, zeigte ein die Aminosäuren 667 bis 677 umfassendes Fusionspeptid (Bahn 5) keine positive Reaktion.

[0039] Dies war der erste Hinweis darauf, das das Epitop des monoklonalen Antikörpers 2F5 von Aminosäuren innerhalb der Sequenz von Stelle 648 bis Stelle 667 von gp 160 gebildet ist. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurden überlappende hexamere Peptide dieser Region mit Glutathion-S-transferase verschmolzen.

[0040] Wie in Fig. 1b gezeigt, war das die Aminosäuresequenz GLU LEU ASP LYS TRP ALA (Aminosäuren 662-667, Bahn 2) enthaltende Peptid gegenüber dem Antikörper 2F5 hochreaktiv, während bei Peptiden, die die Aminosäuresequenzen LEU ASP LYS TRP ALA SER (LDKWAS, Aminοsäuren 663-668,; Bahn 3) oder ASP LYS TRP ALA SER LEU (DKWASL, Aminosäuren 664-669, Bahn 4) enthielten, die Reaktivität gegenüber dem monoklonalen Antikörper vermindert ist. Ein die Aminosäuresequenz LEU GLU LEU ASP LYS TRP (LELDKW·, Aminosäuren 661-666, Bahn 1) enthaltendes Peptid zeigte keine signifikante Reaktivität. Diese Daten beweisen, dass das Epitop des monoklonalen Antikörpers die Aminosäuresequenz GLU LEU ASP LYS TRP ALA (ELDKWA) umfasst, die den Aminosäuren 662-667 auf gp160 des HN-1-BH10-Isolats entspricht. In diesem Zusammenhang waren sowohl ein dieser Epitop-Sequenz entsprechendes synthetisches Peptid wie auch ein diese Sequenz enthaltendes Fusionsprotein in der Lage, durch den 2F5- Antikörper vermittelte Neutralisation zu inhibieren.

Beispiele: Aufbau von Plasmiden und chimäre Influenzaviren

[0041] Alle genetischen Manipulationen folgten den von Sambrook et al. (1989) in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, beschriebenen Standardprozeduren. Wie in Fig. 2 veranschaulicht, wurden die pg41-Sequenzen Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser (LELDKWAS) oder Glu Leu Asp Lys Irp Ala Ser (ELDKWAS) in die Antigenerkennungsstelle B des HA des Influenza-WSN-Virus eingesetzt. Die Plasmide pHA-ELDKWAS und pHA- LELDKWAS wurden aufgebaut, indem das Pst I-Hind III-Fragment des Plasmids p13/WSN-HAm1, das von Li et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 5214- 5218) beschrieben worden ist, durch ein PCR-Produkt ersetzt wurde, das unter Benutzung von pT3/WSN-HAMI als Matrix sowie von aus dem Influenzavirus WSN HAM1 abgeleiteten Richtungs- und Gegenrichtungsprimem erhalten wurde, wobei der Gegenrichtungsprimer zusätzlich einen 21- oder 24-Nucleotideinschub enthielt, der den gp 160-Stellen 1981 oder 1984 bis 2004 entspricht. Die Plasmide pHA- ELNKWAS, pHA-LELNKWAS, pHA-ELDNWAS und pHA-LELDNWAS wurden auf gleiche Weise hergestellt.

[0042] Die Sequenz des WSN-HA wurde von Hiti geliefert (J. Virol. (1982) 41: 730-734), die Sequenz des gp160 von der Eintragung ENV$HN10 der Swissprot- Datenbank. Die Transfektion der von diesem Plasmid abgeleiteten RNA in MDBK- Zellen sowie die Auswahl und Herstellung der chimären Viren erfolgten gemäss Enami et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (1990) 87: 3802-3805) mit den von Enami und Palese (J. Virol. (1991) 65: 2711-2713) beschriebenen Abwandlungen.

Beispiel 3: Immunisierung und Antikörperreaktion von mit den chimären Influenzaviren immunisierten Mäusen

[0043] OF-1-Mäuse wurden mit dem chimären Influenza-ELDKWAS-Virus (Mäuse M1, M2, M3, M4) oder dem Influenza-LELDKWAS-Virus (Maus M5) immunisiert. Die Mäuse wurden zuerst intranasal (i.n.) mit 10² TCD50 immunisiert, darauf folgte nach sechs Wochen eine Booster-Immunisierung mit 5 · 10&sup5; TCID&sub5;&sub0;, nach weiteren drei Wochen eine intraperitoneale (i.p.) Immunisierung mit 20 ug sucrose-gereinigten Lebendviren und nach nochmals drei Wochen eine abschliessende Verstärkung mit 20 ug SDS-denaturierten Viren in unvollständigem Freundschem Adjuvans. Für die intranasale Immunisierung befanden sich die Mäuse unter Ether-Anästhesie. Für die Kontrollviren des WSN-Wildtyps (wt 1, wt 2) wurde dasselbe Protokoll verwendet. Zwölf Tage nach dem letzten Verstärkungsschub wurde den Mäusen Blut entnommen, Antiseren wurden in 1 h bei 56ºC desaktiviert, und die ELISA-Titer und neutralisierende Aktivität der Antiseren wurden bestimmt.

[0044] Fig. 3A zeigt die Bindung der Influenza-ELDKWAS-Antiseren an ein die Sequenz ELDKWAS an seinem C-Terminus enthaltendes Glutathion-S-transferase (GST)-Fusionspeptid. Die Sequenz wurde mit ELISA bestimmt. Mikrotiterplatten mit 96 Löchern wurden mit dem GST-ELDKWA-Fusionspeptid (4 ug/mL in Carbonatpuffer, pH 9,6, vier Stunden bei Raumtemperatur, 100 uL/Loch) beschichtet. Die Platten wurden dann mit PBS/0,05% Tween (PBS: phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung) gewaschen. Mit PBS/l % BSA/0,05% Tween verdünntes Antiserum wurde hinzugefügt, dann wurde während einer Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurden Antikörper durch Inkubation mit einem mit Meerrettich-Peroxidase konjugierten Ziegen-Antimaus-IgG-γ-Ketten-Antikörper nachgewiesen. Die Platten wurden unter Verwendung von o-Phenylendiamindihydrochlorid als Substrat angefärbt. Die Reaktion wurde mit 2,5 M HzSO&sub4; abgebrochen, und die Platten wurden ausgemessen (Messwellenlänge 492 nm, Bezugswellenlänge 620 nm).

[0045] Fig. 3B: Dieselbe Prozedur wie die in Fig. 3A beschriebene wurde befolgt, ausser dass zum Nachweis der Antikörper ein mit Meerrettich-Peroxidase konjugierter Ziegen-Antimaus-IgA-Antikörper verwendet wurde. Die neutralisierende Aktivität der Antiseren wurde durch Synzytium-Inhibitionsprüfungen bestimmt. Die reziproken Serumverdünnungen, die Synzytienbildung zu 50% inhibieren (EC50), sind in Tabelle 1 aufgeführt. Antiseren von Mäusen M 1 bis M3 neutralisierten das gesamte Prüffeld bei verschiedenen Serumverdünnungen. Antiseren M4 und M5 neutralisierten die HIV-1-Isolate MN und RF, aber nicht IIIB. Die durch den WSN- Wildtypvirus induzierten Antiseren neutralierten bei der geringsten Serumverdünnung (1 : 20) keines der geprüften HIV-1-Isolate. Tabelle 1

Neutralisierung von HIV-1 durch gegen chimäre Influenzaviren gezüchtete Seren Neutralisationstiter (EC&sub5;&sub0;)

[0046] Für die Synzytieninhibierungsprüfung wurde die Indikatorenzelllinie AA-2 benutzt, die von Chaffee et al., J. Exp. Med. (1988) 168: 605, beschrieben wurde, während als Vireninokulum gefrorene Bestände der HIV-1-Stämme MIN, RF und III B eingesetzt wurden. Alle Stammviren wurden auf 101,9 bis 102,5 TCD&sub5;&sub0; pro mL verdünnt. Mäuse-Antiseren wurden in Substratlösung aufs Doppelte verdünnt und auf die 96-Loch-Mikrotiterplatten verteilt (vier Doppel bei jeder Verdünnung). Fünfzig uL des Virus wurden zu 50 uL der verdünnten Antiseren hinzugefügt, und die Virus/Antikörper-Mischung wurde während 2 h bei 4ºC vorinkubiert. Zur Infektion wurden 100 uL AA-2-Zellen (5 · 10&sup6; Zellen/mL) in jedes Loch gegeben; das Vorhandensein von Synzytien wurde als Indikation einer HIV-1-Infektion nach fünf Tagen notiert. Die Abschätzung der zu 50% inhibierdnden Dosis (EC&sub5;&sub0;) erfolgte nach Reed und Muench, wie in Am. J. Hyg. (1938) 27: 493 beschrieben. Die reziproken Serumverdünnungen, die Synzytienbildung zu 50% inhibieren (EC&sub5;&sub0;), sind aufgeführt.

Beispiel 4: Expression von die verlängerten 2F5-Epitope tragenden chimären Hämagglutininen durch rekombinante Baculoviren

[0047] Die die benannten sechs Peptide enthaltenden chimären Hämagglutinine wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Die kodierende Region dieser chimären Hämagglutinine war von der Restriktionsenzymstelle BamHI: flankiert und in die BamHI-Stelle des Plasmids (Bluebac III, Invitrogen, San Diego CA) eingesetzt. Transfektionsversuche, um rekombinante Baculoviren zu erhalten, die die chimären Hämagglutinine enthalten, wurden nach den von Groebe et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18: 4033, und Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84: 7413, beschriebenen Verfahren ausgeführt. Die anfallenden rekombinanten chimären Baculoviren können dazu verwendet werden, HIV-1 neutralisierende Antikörper zu induzieren.

Beispiel 5: Immunisierung und Antikörperreaktion von Mäusen, die mit durch rekombinante Baculoviren infizierte Zellen immunisiert worden waren

[0048] Für Immunisierungen verwendete SIP-Zellen wurden bei einem Infektions- Vielfachen (MOI, multiplicity of infection) von 1 bis 5 durch rekombinante Baculoviren infiziert und drei Tage nach der Infektion geerntet. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und in einer Konzentration von 5 · 10&sup6; Zellen/mL wieder in steriler PBS aufgeschlämmt. Diese Zellen reagierten in Western Blot-Tests spezifisch mit dem monoklonalen Antikörper 2F5, was darauf hinweist, das diese Zellen die Sequenzen ELDKWAS oder LELDKWAS tragendes Hämagglutinin enthielten. Bal/c-Mäuse wurden in Zweiwochen-Intervallen mit vier intraperitonealen Injektionen von 1 · 10&sup6; infizierten Sf9-Zellen immunisiert (Van Wyyke Coelingh et al., Virology (1987) 160: 4465). Sieben Tage nach der vierten Immunisierung wurde den Mäusen Blut entnommen, und die ELISA-Titer der Antiseren wurden bestimmt.

Fig. 4 zeigt die Bindung der von rekombinanten Baculoviren abgeleiteten Antiseren an ein die Sequenz Gly Gly Gly Glu Leu Asp Lys Trp Ala (GGGELDKWA) umfassendes synthetisches Peptid in einem ELISA, der wie in Beispiel 2 beschrieben ausgeführt wurde.

Induktion sekretorischer Antikörper

[0049] Durch Anwendung von zumindest einem, bevorzugt von einer Mischung der benannten sechs Peptide vorgenommene Immunisierungen ergaben signifikant verbesserte IgG-ELDKWA-spezifische ELISA-Titer. Des weiteren ergaben im Gegensatz zu die ELDKWA-Sequenz verwendenden Immunisierungen die mit Hilfe der benannten sechs Peptide ausgeführten Immunisierungen auch eine signifikante IgA- Reaktion. Überraschenderweise wurde diese IgA-Immunreaktion auch auf der Ebene der Schleimhäute ausgelöst.

Beispiel 6: IgA-Antikörper in Atemwegsekreten von mit Influenza-ELDKWAS-Viren immunisierten Balb/c-Mäusen

[0050] Die Mäuse wurden intranasal mit 102 PBE immunisiert und nach vier Wochen auf demselben Wege mit 105 PBE nachimmunisiert. Die dritte Immunisierung wurde nach vier weiteren Wochen intranasal (IN) oder intraperitoneal (IP) mit 10&sup7; PBE erteilt. Nasenspülflüssigkeit wurde acht Wochen nach der dritten Immunisierung gesammelt und vereinigt, die Reaktivität dieser Muster gegenüber dem Peptid ELDKWA wurde durch ELISA bestimmt. Als Kontrolle (WT Pool) wurde Nasenspülflüssigkeit von mit Influenzaviren des Wildtyps (WT) immunisierten Mäusen gesammelt und analysiert. Das benutzte Immunisierungsschema war das gleiche wie das für die IN-Gruppe benutzte (siehe Fig. 5). Die induzierten Antikörper sind primär von der Nasenschleimhaut erzeugt worden, und es ist zu erkennen, dass die Antikörpertiter ungewöhnlich hoch sind. Aus Fig. 5 ist weiter ersichtlich, dass eine intranasale Anwendung der Influenza-ELDKWAS-Viren zu einer höheren Konzentration von HIV-1 neutralisierenden Antikörpern führt als die intraperitoneale Anwendung.

Beispiel 7: IgA-Antikörper in Darmsekreten von mit Influenza-ELDKWAS-Viren immunisierten Balb/c-Mäusen

[0051] Die Mäuse wurden intranasal mit 102 PBE immunisiert und nach vier Wochen auf demselben Wege mit 10&sup5; PBE nachimmunisiert. Die dritte Immunisierung wurde nach vier weiteren Wochen intranasal (siehe Fig. 6a) oder intraperitoneal (Fig. 6b) mit 10&sup7; PBE erteilt. Die von den Darmschleimhäuten freigesetzte Antikörper enthaltenden Exkremente wurden acht Wochen nach der dritten Immunisierung gesammelt und extrahiert, und die Reaktivität dieser Muster gegenüber dem Peptid ELDKWA wurde durch ELISA bestimmt. Die Muster IN O, IN R, IN B und IN S stammen von Mäusen, die die dritte Immunisierung intranasal empfangen hatten, während die Muster IP O, IP R, IP RS und IP S von Mäusen genommen wurden, die die dritte Immunisierung intraperitoneal empfangen hatten. WT1 und WT2 sind Muster von mit Influenzaviren des Wildtyps (WT) immunisierten Mäusen.


Anspruch[de]

1. Peptid, Antikörper induzierend, die eine neutralisierende Aktivität gegenüber verschiedenen Stämmen und/oder klinischen Isolaten von HIV-1 aufweisen und/oder die von HN-1 verursachte Zelifusion inhibieren, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid aus einer aus der aus ELDKWAS, LELDKWAS, ELDNWA. S. ELNKWAS, LELDNWAS und LELNKWAS bestehenden Gruppe ausgewählten Aminosäuresequenz zusammengesetzt ist.

2. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es mit einem Träger verbunden ist.

3. Peptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es Teil eines - bevorzugt rekombinanten - Virus ist, der vorteilhaft aus der aus einem Influenzavirus, einem Baculovirus und einem Vacciniavirus bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

4. Peptid nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eine der benannten Aminosäuresequenzen zumindest einen Teil der Aminosäuresequenz eines Virusproteins ersetzt oder in zumindest einer Antigenerkennungsstelle eines Virusproteins eingesetzt ist.

5. Peptid nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Virusprotein aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Hämagglutinin (HA) des Influenzavirus, Neuraminidase (NA) des Influenzavirus und dem Oberflächenantigen des Hepatitis-B-Virus besteht.

6. Peptid nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Virusprotein von einem - bevorzugt rekombinanten - Baculovirus oder Vacciniavirus abgeleitet ist.

7. Verwendung von zumindest einem Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Medikaments zur Induktion von Anti-HIV-1-Antikörpern in Menschen und Tieren.

8. Verwendung nach Anspruch 7, worin die benannten Antikörper bevorzugt aus Schleimhautoberflächen ausgeschiedene IgA-Antikörper sind.

9. Verwendung nach Anspruch 7 oder 8 für die Herstellung eines Medikaments für die prophylaktische und/oder therapeutische Behandlung von HIV-1-gefährdeten oder -infizierten Individuen.

10. Antikörper mit HN-1-neutralisierender Aktivität und in der Lage, die durch HIV-1 verursachte Zellfusion zu verhindern, dadurch gekennzeichnet, dass er ein IgA-Antikörper ist, der in der Lage ist, an ein die Aminosäuresequenz ELDKWA tragendes Peptid zu binden.

11. Antikörper nach Anspruch 10, von einer Schleimhautoberfläche ausgeschieden.

12. Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine wie in Anspruch 1 definierte Aminosäuresequenz chemisch synthetisiert wird, vorzugsweise mittels eines handelsüblichen Peptidsynthetisators.

13. Verfahren zur Herstellung eines Peptis nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid durch eine mikrobiologische Methode hergestellt wird, wobei die benannte Methode umfasst, in das Genom eines Wirtsorganismus eine Nucleotidsequenz einzusetzen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus

a) einer Nucleotidsequenz, die einer der benannten Aminosäuresequenzen entspricht;

b) einer Nucleotidsequenz, die zu einer der Nucleotidsequenzen unter (a) hybridisiert;

c) einer durch Degeneration aus einer der Nucleotidsequenzen unter (a) abgeleiteten Nucleotidsequenz besteht; die Expression des Genoms unter Verwendung mikrobiologischer Standard- Kultivierungsverfahren auszuführen und zumindest eines, vorzugsweise eine Vielzahl der benannten Peptide zu isolieren.

14. Verfahren zur Herstellung von zumindest einem Peptid nach einem der Ansprüche 2 bis 6, einschliessend, eine Aminosäuresequenz des Anspruchs 1 durch chemische oder mikrobiologische Methoden mit einem Träger, vorzugsweise einem Virus oder einem Virusprotein, zu verbinden.

1 S. Verfahren nach Anspruch 14, worin die benannte Methode mikrobiologisch ist und die Schritte umfasst, mit einer einer Aminosäuresequenz des Trägers entsprechenden Nucleotidsequenz eine Nucleotidsequenz zu verbinden, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus

a) einer Nucleotidsequenz, die einer der benannten Aminosäuresequenzen entspricht;

b) einer Nucleotidsequenz, die zu einer der Nucleotidsequenzen unter (a) hybridisiert;

c) einer durch Degeneration aus einer der Nucleotidsequenzen unter (a) abgeleiteten Nucleotidsequenz besteht; die verbundenen Nucleotidsequenzen zu einem Wirtsorganismus zu überfuhren, die Expression der verbundenen Sequenz unter Verwendung rnikrobiologischer Standard-Kultivierungsverfahren auszuführen und zumindest eines, vorzugsweise eine Vielzahl der mit dem benannten Träger verbundenen Peptide zu isolieren.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin zumindest eine der Nucleotidsequenzen

(a) bis (c) mit einer Nucleotidsequenz verbunden ist, die einer Aminosäuresequenz eines Virusproteins als des Trägers entspricht, wodurch zumindest ein Teil der Nucleotidsequenz ersetzt wird, die der Aminosäuresequenz des Virusproteins entspricht oder an zumindest einer Stelle der benannten Sequenz eingesetzt wird, die einer Antigenerkennungsstelle des Virusproteins entspricht.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin das benannte Virusprotein aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Hämagglutinin des Influenzavirus, Neuraminidase des Influenzavirus und dem Oberflächenantigen des Hepatitis-B-Virus besteht.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 13, 15 bis 17, worin ein Virus der Gruppe, die aus einem - bevorzugt rekombinanten - Influenzavirus, Baculovirus und Vacciniavirus besteht, als Wirtsorganismus verwendet wird.

19. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers mit HJV-1 neutralisierender Aktivität und in der Lage, die durch HIV-1 verursache Zellfusion zu verhindern, dadurch gekennzeichnet, dass auf das Immunsystem eines Menschen oder Tieres ein bevorzugt mit einem Träger verbundenes Peptid angesetzt wird, das aus der aus ELDKWAS, LELDKWAS, ELDNWAS, ELNKWAS, LELDNWAS und

LELNKWAS bestehenden Gruppe ausgewählt ist, woraufhin der benannte Antikörper erzeugt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin das benannte Peptid über eine Schleimhautoberfläche, bevorzugt intranasal, auf das Immunsystemangesetzt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, worin der benannte Antikörper über Ausscheidung durch eine Schleimhautoberfläche erzeugt wird.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei das benannte Peptid mit einem Träger verbunden ist und worin der benannte Träger ein Virus, vorzugsweise ein Influenzavirus, oder ein Teil eines Virus, vorzugsweise Hämagglutinin des Influenzavirus, ist.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, worin der erzeugte Antikörper ein IgA-Antikörper ist.

24. Anti-HIV-1-Impfstoff mit zumindest einem Peptid, vorzugsweise einer Mischung von zumindest zwei Peptiden nach einem der Ansprüche 1 bis 6.







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