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Dokumentenidentifikation DE69426841T2 06.09.2001
EP-Veröffentlichungsnummer 0931830
Titel Cytopatische Viren zur Therapie und Prophylaxe der Neoplasie
Anmelder Onyx Pharmaceuticals, Inc., Richmond, Calif., US
Erfinder McCormick, Francis, San Francisco, CA 94115, US
Vertreter LEINWEBER & ZIMMERMANN, 80331 München
DE-Aktenzeichen 69426841
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 16.02.1994
EP-Aktenzeichen 981217532
EP-Offenlegungsdatum 28.07.1999
EP date of grant 07.03.2001
Veröffentlichungstag im Patentblatt 06.09.2001
IPC-Hauptklasse C12N 7/00
IPC-Nebenklasse A61K 35/76   G01N 33/50   A61P 35/00   

Beschreibung[de]
GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bietet Zusammensetzungen rekombinanter zytopathologischer Viren, die zur Replikation und/oder Expression von Genen des späten Bereichs in neoplastischen Säugetierzellen fähig sind, aber in nicht-neoplastischen Zellen im wesentlichen nicht zur Replikation fähig sind, Verfahren zum Konstruieren und Propagieren solcher rekombinanter Viren, Verfahren zur Behandlung von Neoplasie mit derartigen rekombinanten Viren und therapeutische Zusammensetzungen, die solche rekombinanten Viren umfassen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Man nimmt an, daß die Proliferation normaler Zellen durch wachstumsfördernde Protoonkogene reguliert wird, deren Gegengewicht die wachstumseinschränkenden Tumorsuppressor-Gene sind. Mutationen, welche die Aktivitäten von Protoonkogenen potenzieren, bilden die Onkogene, die das Wachstum neoplastischer Zellen erzwingen. Im Gegensatz dazu können genetische Läsionen, die Tumorsuppressor-Gene inaktivieren, im allgemeinen durch eine oder mehrere Mutationen, die dazu führen, daß eine Zelle für die inaktivierten Tumorsuppressor-Allele homozygot ist, die Zelle von den durch diese Gene auferlegten replikativen Zwängen befreien. Üblicherweise kann ein inaktiviertes Tumorsuppressor-Gen (z. B. p53, RB, DCC, NF-1) in Kombination mit der Bildung eines aktivierten Onkogens (z. B. eines Protoonkogens, das eine aktivierende Struktur- oder Regulationsmutation enthält) eine neoplastische Zelle liefern, die zu im wesentlichen uneingeschränktem Wachstum fähig ist (d. h. eine transformierte Zelle).

Onkogene Transformation von Zellen führt zu einigen Änderungen des Metabolismus, der Physiologie und Morphologie der Zelle. Eine charakteristische Änderung onkogen transformierter Zellen ist ein Verlust von Reaktionsvermögen auf Einschränkungen der Zellproliferation und -differenzierung, die durch geeignete Expression von zellwachstumsregulierenden Genen normalerweise auferlegt werden.

Obwohl unterschiedliche Arten genetischer Änderungen alle zur geänderten Expression oder Funktion von zellwachstumsregulierenden Genen und zu abnormalem Wachstum führen können, geht man allgemein davon aus, daß mehr als ein Ereignis erforderlich ist, um zur neoplastischen Transformation einer normalen Zelle zu einer malignen zu führen (Land et al., Nature 304, 596 (1983); Weinberg R. A., Cancer Res. 49, 3713 (1989)). Die präzisen molekularen Wege und sekundären Veränderungen, die zu maligner Transformation für die meisten Zelltypen führen, sind unklar. Es wurde über einige Fälle berichtet, in denen die geänderte Expression oder Aktivität einiger Proteine, die vermeintliche Zellzyklus-Steuerfunktionen aufweisen und/oder an der Bildung funktioneller transkriptionaler Komplexe beteiligt sind, z. B. p53 und RB, zum Verlust der Proliferationssteuerung in Zellen führen kann (Ullrich et al., J. Biol. Chem. 267, 15259 (1992); Hollstein et al., Science 253, 49 (1991); Sager, R., Curr. Opin. Cell. Biol. 4, 155 (1992), Levine et al., Nature 351, 453 (1991)).

Man stellte fest, daß einige Onkogene charakteristische aktivierende Mutationen in einem beträchtlichen Teil bestimmter Karzinome besitzen. Beispielsweise sind bestimmte Mutationen in den ras"- und rasK-Kodierbereichen (z. B. Codon 12, Godon 61; Parada et al., Nature 312, 649 (1984)) und dem APC-Gen (Powell et al., Nature 359, 235 (1992)) mit onkogener Transformation kultivierter Zellen assoziiert und in einem auffallend hohen Prozentsatz spezifischer menschlicher Karzinome vorhanden (z. B. Kolonadenokarzinom, Blasenkarzinom, Lungenkarzinom und Adenokarzinom, Hepatokarzinom). Diese Erkenntnisse führten zur Entwicklung diagnostischer und therapeutischer Reagentien (z. B. Polynukleotid-Sonden und Antikörper), die spezifisch die aktivierte(n) Form(en) solcher Onkogen erkennen (US-A-4.798.787 und 4.762.706).

Die exzessive oder ungeeignete Expression anderer Onkogene, z. B. myc, erbB-2 und piml-, scheint onkogene Transformation potenzieren zu können, ohne unbedingt die Gegenwart aktivierender Mutation(en) im Kodierbereich zu erfordern. IDie Überexpression von erbB-2 wird häufig im Adenokarzinom der Brust, des Bauchs und der Eierstöcke festgestellt, wobei erbB-2-Werte in diesen Zelltypen als diagnostischer Marker für Neoplasie dienen und/oder mit einem spezifischen Tumor-Phenotyp korrelieren können (z. B. Resistenz gegenüber spezifischen Arzneimitteln, Wachstumsrate, Differenzierungszustand).

Transgene Tiere, die verschiedene Onkogene (US-A-4.736.866 und 5.087.571) oder funktionell beeinträchtigte Tumorsuppressor-Gene (Donehower et al., Nature 356, 215 (1992)) tragen, wurden neben anderen potentiellen Verwendungszwecken zur Verwendung in Karzinogen-Screeningassays beschrieben.

Trotz dieses Fortschritts bei der Entwicklung eines definierteren Modells der dem transformierten Phenotyp und Neoplasie zugrunde liegenden Mechanismen ergaben sich neben herkömmlicher Chemotherapie wenige bedeutsame therapeutische Verfahren, die sich zur Behandlung von Krebs eignen. Viele herkömmliche chemotherapeutische Mittel besitzen einen niedrigen therapeutischen Index, wobei therapeutische Dosierungswerte bei oder fast bei Dosierungswerten leigen, die Toxizität hervorrufen. Toxische Nebenwirkungen der meisten herkömmlichen chemotherapeutischen Mittel sind unangenehm und führen u. a. zur lebensbedrohenden Knochenmarksuppression.

In letzter Zeit wurden Verfahren zur Durchführung von Gentherapie zwecks Korrektur oder Ergänzung defektiver Allele, die angeborene Krankheiten wie z. B. zystische Fibrose hervorrufen, vorgestellt, doch ihr Anfangserfolg war nur begrenzt. Einige gentherapeutische Ansätze umfassen das Transduzieren einer Polynukleotid-Sequenz, die zur Expression einer funktionellen Kopie eines defektiven Allels fähig ist, in eine Zelle in vivo unter Verwendung von rekombinantem Virus mit Replikationsdefizienz. (Rosenfeld et al., Cell 68, 143 (1992)). Einige dieser gentherapeutischen Verfahren eignen sich zum Transduzieren von Polynukleotiden in aus einem Patienten explantierte isolierte Zellen, erwiesen sich aber in vivo bilsang nicht als sehr effizient. Therapeutische Krebsbehandlungen, die auf der Transfektion explantierter Tumorzellen mit Polynukleotiden beruhen, die für Tumornekrosefaktor (TNF) und Interleukin-2 (IL-2) kodieren, wurden beschrieben (Pardoll, D., Curr. Opin. Oncol. 4, 1124 (1992)).

Obwohl es einmal möglich sein könnte, daß gentherapeutische Modelle an korrekte defektive Allele von Onkogenen oder Tumorsuppressor-Genen in transformierten Zellen in vivo angepaßt werden, wurden bisher noch keine gentherapeutischen Verfahren vorgestellt, die einen ausreichenden Prozentsatz neoplastischer Zellen für praktische Gentherapie von Neoplasie in situ wirksam transduzieren und korrekt darauf abzielen können (z. B. durch homologe Rekombination). Die Art der Krebsbiologie erfordert, daß ein beträchtlicher Teil der neoplastischen Zellen, vorzugsweise die gesamte klonale Nachkommenschaft der transformierten Zelle, zur Erzielung einer günstigen therapeutischen Wirkung ablatiert wird. Außerdem sind die aktuellen Verfahren zur Gentherapie sehr teuer und erfordern das ex vivo-Kultivieren explantierter Zellen vor der Wiedereinsetzung in einen Patienten. Die allgemeine Verbreitung solcher Methoden wäre selbst dann mit prohibitiven Kosten verbunden, wenn sie wirksam wären.

Somit besteht auf dem Gebiet die Notwendigkeit, Verfahren und Zusammensetzungen zur Diagnose und Therapie von Neoplasie bereitzustellen, insbesondere Verfahren, die neoplastische Zellen ohne die unerwünschte Tötung nichtneoplastischer Zellen selektiv ablatieren können - ein Nachteil, der für herkömmliche antineoplastische Chemotherapie typisch ist. Die vorliegende Erfindung berücksichtigt diese und andere Notwendigkeiten.

Die hierin besprochenen Verweise sind lediglich wegen ihrer Offenbarung vor dem Einreichdatum der vorliegenden Anmeldung angeführt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung bietet mehrere neuartige Verfahren und Zusammensetzungen zum Ablatieren neoplastischer Zellen durch deren Infektion mit einem rekombinanten Adenovirus, das im wesentlichen in nicht-neoplastischen Zellen replikationsdefizient ist und zumindest einen Teil-Replikationsphenotyp in neoplastischen Zellen aufweist. Die Differenz im Replikationsphenotyp der Adenovirus-Konstrukte der Erfindung in neoplastischen und nicht-neoplastischen Zellen bietet eine biologische Basis für virale Krebstherapie. Die Expression adenoviraler zytopathologischer Effekte und gegebenenfalls die Expression eines negativ-selektierbaren Arzneimittelgens (z. B. HSV tk) sind mit der adenoviralen Replikationsphenotyp-Charakteristik neoplastischer Zellen korreliert, die mit den rekombinanten Adenovirus-Konstrukten der Erfindung infiziert sind, wodurch zwischen neoplastischen und nicht-neoplastischen Zellen unterschieden und selektive Zytotoxizität neoplastischer Zellen ermöglicht wird. Obwohl ciie Verfahren spezifisch für adenovirale Konstrukte beschrieben sind, geht man davon aus, claß sie sich für im wesentlichen jeden Virustyp eignen, in dem wirksame Replikation die Bindung und/oder Sequestrierung und/oder Inaktivierung eines Wirtszellenproteins erfordert, das in nichtneoplastischen Zellen vorhanden ist, aber in neoplastischen Zellen im wesentlichen fehlt oder nicht-funktionell ist (z. B. p53, RB).

In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein rekombinantes Adenovirus, das einen E1a-Lokus umfaßt, der für ein E1a-Protein kodiert (z. B. p289R oder p243R), das im wesentlichen nicht fähig ist, einen Komplex mit RB-Protein in infizierten Zellen zu bilden, an ein Individuum oder eine Zellpupulation verabreicht, das bzw. die eine neoplastische Zelle umfaßt, die durch das rekombinante Adenovirus infiziert werden kann. Die praktische Unfähigkeit des rekombinanten Adenovirus, RB-Protein in infizierten nichtneoplastischen Zellen wirksam zu sequestrieren, führt dazu, daß das oder die eingeführte(n) rekombinante(n) adenovirale(n) Polynukleotid(e) einen Replikationsphenotyp in nicht-neoplastischen Zellen nicht exprimieren können. Im Gegensatz dazu unterstützen neoplastische Zellen, denen ein funktionelles RB-Protein fehlt, die Expression eines Replikationsphenotyps durch das eingeführte rekombinante Adenovirus, was zur Ablation der neoplastischen Zelle durch einen adenoviralen zytopathologischen Effekt und/oder Expression eines mit dem Replikationsphenotyp verbundenen negativen Selektionsgens führt. In bevorzugten Variationen dieser Ausführungsformen umfaßt das rekombinante Adenovirus einen E1a-Lokus, der für eine E1a-Proteinmutante kodiert (z. B. p289R), der eine CR1- und/oder CR2-Domäne fehlt, die RB (und/oder das 300 kD-Polypeptid und/ oder das 107 kD-Polypeptid) binden kann, jedoch eine funktionelle CR3-Domäne umfaßt, die zur Transaktivierung adenoviraler früher Gene fähig ist. Zusätzliche Variationen dieser Ausführungsformen umfassen jene, wo das rekombinante Adenovirus einen nichtfunktionelle E1a-Lokus umfaßt, der im wesentlichen ein Protein nicht exprimieren kann, das sich an RB bindet und es inaktiviert, und können auch ein funktionelles p19-Protein umfassen (d. h. eines, das zur Stimulierung der Expression acienoviraler früher Bereichsgene in Abwesenheit von E1a-Funktion fähig ist). Rekombinante Adenoviren der Erfindung können überdies eine p19-Genmutante umfassen, die gesteigerte zytopathologische Wirkung erzielt; eine solche auf dem Gebiet bekannte Mutante ist die p19 cyt- Genmutante.

Die Erfindung bietet neuartige rekombinante Adenovirus-Konstrukte mit Replikationsdefizienz in nicht-neoplastischen Zellen, die jedoch fähig sind, einen Replikationsphenotyp in neoplastischen Zellen zu exprimieren, denen funktionelles RB fehlt. Die neuartigen rekombinanten Adenovirus-Konstrukte umfassen eine Mutation, z. B. eine Deletion oder Punktmutation, im E1a- und/oder E1b-Genbereich, insbesondere in den Sequenzen, die für das E1b p55-Protein kodieren, und die CR1- und CR2-Domäne der E1a p289R- oder p243R-Proteine. In einigen Ausführungsformen ist ein negativ selektierbares Gen, z. B. ein HSV tk-Gen, mit einem Enhancer/Promotor des frühen Bereichs (z. B. E2, E1a, E1b), einem Gen-Enhancer/-Promotor des späten Bereichs (z. B. dem späten Hauptpromotor) oder einem Promotor des frühen oder späten Bereichs mit einem CMV- Enhancer in einem rekombinanten Adenovirus-Konstrukt operabel verbunden, das auch eine E1a- oder E1b-Mutation umfaßt, sodaß das negative selektierbare Gen vorzugsweise in infizierten Zellen transkribiert wird, die einen Replikationsphenotyp exprimieren (d. h. neoplastischen Zellen), und für negative Selektion solcher Zellen durch Verabreichung einer wirksamen Dosis eines negativen Selektionsmittels (z. B. Gancyclovir, FIAU) sorgt. Ein negatives selektierbares Gen kann anstelle einer E1a- und/oder E1b-Struktursequenz insertiert sein, um gleichzeitig eine E1a(-)-Mutante mit Replikationsdefizienz, eine E1b(-)-Mutante mit Replikationsdefizienz oder eine E1a/E1b-Doppelmutante zu bilden.

Antineoplastische Zusammensetzungen, die ein derartiges rekombinantes Adenovirus in pharmazeutisch annehmbarer Form zur in vivo-Verabreichung an eine neoplastische Zellpopulation umfassen, werden auch bereitgestellt.

Die Erfindung liefert auch rekombinante Papovaviren, wie z. B. Human-Papillomavirus (HPV), Polyomaviren (z. B. BK, JC) und SV40, denen funktionelle Proteine zur Bindung und/oder Inaktivierung von RB fehlen. Human-Papillomavirus-Mutanten, die kein funktionelles E7 exprimieren, fehlt die Fähigkeit zur effizienten Bindung von RB, weswegen sie in RB(-)-Zellen in der Lage sind, einen Replikationsphenotyp zu manifestieren, nicht aber in Zellen, die ausreichende Mengen an funktionellem RB enthalten. Human-Papillomavirus-Mutanten, die weder funktionelles E6-Protein noch funktionelles E7-Protein exprimieren, fehlt die Fähigkeit zur effizienten Bindung von RB und p53, weswegen sie in p53(-)RBr(-)-Zellen in der Lage sind, einen Replikationsphenotyp zu manifestieren, nicht aber in Zellen, die ausreichende Mengen an funktionellem RB und/oder p53 enthalten. Die Erfindung stellt auch neuartige Verfahren zur Behandlung von Neoplasie bereit, umfassend die Schritte des Verabreichens eines rekombinanten Virus, das zur bevorzugten Expression eines Replikationsphenotyps und/oder zur Expression eines zytopathologischen Effekts in einer neoplastischen Zellpopulation im Vergleich zur Expression in einer nicht-neoplastischen Zellpopulation fähig ist, an einen Patienten. Das rekombinante Adenovirus mit Replikationsdefizienz kann aus Ad5 NT dl1110, Ad5 d11312 und Ad5 dl1520 ausgewählt sein.

KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung der Domänenstruktur und Protein- Protein-Wechselwirkungen eines Adenovirus E1a-289R-Polypeptids.

Fig. 2(a-i) zeigt die Infektion normaler und neoplastisch transformierter menschlicher Zellinien mit Adenovirus der Wildform und rekombinanten Adenovirusmutanten mit Rekombinationsdefizienz. Jede angezeigte Zellinie wurde scheininfiziert, Fig. 2(a); oder mit einer MOI von 1,0 mit Adenovirus 2 der Wildform infiziert, Fig. 2(b-c); Derivatmutante d11010, Fig. 2(d-e); Derivatmutante dl 1520, Fig. 2(f-g); oder Derivatmutante dl 434, Fig. 2(h-i). Fig. 2(a) zeigt die Ergebnisse 9 Tage nach der Scheininfektion. Die übrigen Felder zeigen Ergebnisse der folgenden Postinfektionsperioden: Fig. 2(b), 4 Tage; Fig. 2(c), 7 Tage; Fig. 2(d), 8 Tage; Fig. 2(e) 12 Tage; Fig. 2(f), 14 Tage; Fig. 2(g), 20 Tage; Fig. 2(h), 6 Tage; Fig. 2(i), 14 Tage. An verschiedenen Tagen nach der Infektion (s.o.) wurden die Zellen mit PBS gewaschen, um tote Zellen zu entfernen, und die verbleibenden Zellen mit Kristallviolett eingefärbt. Jede mit PBS alleine scheininfizierte Zellinie wurde als Vergleich für Lebensfähigkeit eingeschlossen.

Fig. 3(a-c) zeigt die Infektion der normalen menschlichen Lungendiploid-Fibroblastenzellinie IMR90 (ATCC CCL 186) mit Adenoviren der Wildform und Mutanten. IMR90- Zellen wurden mit dem angegebenen Virus mit MOIs infiziert, die 0,1, 1,0, 10 und 100 entsprachen. An den angegebenen Tagen nach der Infektion wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit Kristallviolett eingefärbt. Ein Napfin jeder 6-Napf-Schale wurde mit 293-Zellen beimpft, um als positiver Vergleich für Virusinfektion zu dienen. Fig. 3(a) zeigt Zellen, die mit Ad2 der Wildform 9 Tage nach der Infektion infiziert wurden. Fig. 3(b) zeigt Zellen, die mit dl 1010 9 Tage nach der Infektion infiziert wurden. Fig. 3(c) zeigt Zellen, die mit dl 1520 9 Tage nach der Infektion infiziert wurden.

Definitionen

Sofern nicht anders angegeben, besitzen alle technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke hierin die gleiche Bedeutung, wie sie allgemein von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung verstanden wird. Obwohl alle beliebigen Verfahren und Materialien, die den hierin beschriebenen ähneln oder mit ihnen übereinstimmen, in der Praxis oder beim Testen der Erfindung eingesetzt werden können, gibt es bevorzugte Verfahren und Materialien, die hierin beschrieben sind. Die folgenden eingesetzten Ausdrücke sind nachstehend definiert.

Der Ausdruck "natürlich vorkommend" bezieht sich hierin in Zusammenhang mit einem Objekt auf die Tatsache, daß man es in der Natur vorfindet. Eine Polypeptid- oder Polynukleotidsequenz beispielsweise, die in einem Organismus vorkommt (z. B. Viren), der aus einer Quelle in der Natur isoliert werden kann und vom Menschen im Labor nicht absichtlich modifiziert wurde, ist natürlich vorkommend. Der Ausdruck "rekombinant" bedeutet hierin, daß ein Polynukleotid-Konstrukt (z. B. ein Adenovirus-Genom) teilweise durch beabsichtigte Modifikation durch den Menschen erzeugt wurde.

Der Ausdruck "Virus mit Replikationsdefizienz" bezieht sich hierin auf ein Virus, das vorzugsweise Zellproliferation hemmt oder Apoptose in einer vorbestimmten Zellpopulation hervorruft (z. B. Zellen, denen im wesentlichen p53- und/oder RB-Funktion fehlt), die Expression einer Virus-Replikationsphenotyps unterstützt und die im wesentlichen unfähig ist, Zellproliferation zu hemmen, Apoptose hervorzurufen oder einen Replikationsphenotyp in Zellen hervorzurufen, umfassend normale P53- und RB-Funktionswerte, die für nicht-replizierende, nicht-transformierte Zellen charakteristisch sind. Typischerweise zeigt ein Virus mit Replikationsdefizienz eine beträchtliche Abnahme der Plaquebildungseffizienz auf Zellen, die normale p53- und/oder RB-Funktion umfassen.

Der Ausruck "RB-Funktion" bezieht sich hierin auf die Eigenschaft, einen im wesentlichen normalen Wert eines Polypeptids aufzuweisen, für das das RB-Gen kodiert (d. h. im Verhältnis zu nicht-neoplastischen Zellen des gleichen histologischen Typs), worin das RB-Polypeptid zur Bindung eines E1a-Proteins von Wildform-Adenovirus 2 oder 5 fähig ist. Beispielsweise kann RB-Funktion durch Produktion einer inaktiven (d. h. Mutanten-) Form von RB oder durch eine deutliche Abnahme oder Gesamtverlust der Expression von RB-Polypeptid(en) verloren gehen. RB-Funktion kann in neoplastischen Zellen, die RB-Allele umfassen, die für ein RB-Protein der Wildform kodieren, im wesentlichen fehlen; beispielsweise kann eine genetische Veränderung außerhalb des RB- Lokus, z. B. eine Mutation, die zu abnormaler subzellulärer Verarbeitung oder Lokalisierung von RB führt, den Verlust von RB-Funktion hervorrufen.

Der Ausdruck "Replikationsphenotyp" bezieht sich hierin auf eine oder mehrere der folgenden phenotypischen Eigenschaften von mit einem Virus, wie z. B. dem replikationsdefizienten Adenovirus, infizierten Zellen: (1) umfangreiche Expression von späten Genprodukten, z. B. von Capsidproteinen (z. B. adenovirales Polypeptid auf Pentonbasis) oder RNA-Transkripten, die von einem oder mehreren viralen späten Genpromotor(en) initiiert sind, (2) Replikation von viralen Genomen oder Bildung von replikativen Zwischenprodukten, (3) Anordnung viraler Capside oder gepackter Virionpartikel, (4) Auftreten von zytopathologischem Effekt (CPE) in der infizierten Zelle, (5) Abschluß eines viralen lytischen Zyklus und (6) andere phenotypische Veränderungen, die typischerweise von der Abweichung der p53- oder RB-Funktion in neoplasischen Zellen abhängen, die mit einem kompetenten Replikations-DNA-Virus der Wildform infiziert sind, der für funktionelle(s) Onkoprotein(e) kodiert. Ein Replikations-Phenotyp umfaßt zumindest eine der aufgelisteten phenotypischen Eigenschaften, vorzugsweise mehr als eine der phenotypischen Eigenschaften.

Der Ausdruck "anti-neoplastisches Virus mit Replikationsdefizienz" bezieht sich hierin auf ein rekombinantes Virus, das die funktionelle Eigenschaft besitzt, die Entwicklung oder den Fortschritt eines Neoplasma in einem Menschen durch bevorzugte Zelltötung infizierter neoplastischer Zellen im Verhältnis zu infizierten, nicht-replizierenden, nichtneoplastischen Zellen des gleichen histologischen Zelltyps zu hemmen.

Die Ausdrucke "neoplastische Zellen" und "Neoplasie" beziehen sich hierin auf Zellen, die relativ autonomes Wachstum zeigen, sodaß sie einen abnormalen Wachstumsphenotyp aufweisen, der durch einen deutlichen Verlust der Kontrolle über die Zellproliferation gekennzeichnet ist. Neoplastische Zellen umfassen Zellen, die aktiv replizierend sein oder sich in einem temporären nicht-replizierenden Ruhezustand befinden können (G&sub1; oder G&sub0;); in ähnlicher Weise können neoplastische Zellen Zellen umfassen, die einen gut differenzierten Phenotyp, einen schlecht differenzierten Phenotyp oder ein Gemisch beider Typen von Zellen aufweisen. Somit sind nicht alle neoplastischen Zellen notwendigerweise zu einem bestimmten Zeitpunkt replizierende Zellen. Die als neoplastische Zellen definierte Gruppe besteht aus Zellen in gutartigen Neoplasmen und Zellen und bösartigen Neoplasmen. Bösartige neoplastische Zellen werden häufig als Krebs- oder Karzinomzellen, wenn sie aus Zellen mit endodermalem oder ektodermalem histologischem Ursprung stammen, oder als Sarkomzellen, wenn sie aus Mesoderm-Zelltypen stammen, bezeichnet.

Der Ausdruck "operabel verbunden" bezieht sich hierin auf eine Verknüpfung von Polynukleotidelementen in einer funktionellen Beziehung. Eine Nukleinsäure ist "operabel verbunden", wenn sie in funktionelle Beziehung zu einer anderen Nukleinsäuresequenz steht. Beispielsweise ist ein Promotor oder Enhancer mit einer Kodiersequenz operabel verbunden, wenn er die Transkription der Kodiersequenz beeinflußt. Operabel verbunden bedeutet, daß die verknüpften DNA-Sequenzen typischervveise benachbart sind und

- wenn zwei Protein-Kodierbereiche zu verbinden sind - benachbart sind und sich in einem Leserahmen befinden. Da jedoch Enhancer im allgemeinen wirken, wenn sie um mehrere Kilobasen vom Promotor entfernt sind und Intronsequenzen variable Längen besitzen können, können einige Polynukleotidelemente operabel verbunden sein, ohne benachbart zu sein.

Der Ausdruck "physiologische Bedingungen" bezieht sich aclt eine wäßrige Umgebung, deren Ionenstärke, pH-Wert und Temperatur im wesentlichen den Bedingungen in einer intakten Säugetierzelle oder einem Geweberaum oder Organ eines lebenden Säugetiers ähneln. Typischerweise umfassen physiologische Bedingungen eine wäßrige Lösung mit etwa 150 mM NaCl (oder gegebenenfalls KCl), pH 6,5-8,1 und einer Temperatur von etwa 20-45ºC. Im allgemeinen sind physiologische Bedingungen günstige Bindebedingungen für die intermolekulare Assoziation biologischer Makromoleküle. Beispielsweise eignen sich physiologische Bedingungen von 150 mM NaCl, pH 7,4 bei 37ºC.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG

Im allgemeinen sind die nachstehend gebrauchte Nomenklatur und die unten beschriebenen Laborverfahren im Bereich der Zellkultur, Molekulargenetik und Molekularvirologie bekannt und werden allgemein eingesetzt. Es werden für rekombinante Nukleinsäureverfahren, Polynukleotid-Synthese, Polypeptid-Synthese, Erzeugung und Vermehrung von Virusstämmen (u. a. Zelllinien, die zur Transkomplementierung von Virusstämmen mit Replikationsdefizienz fähig sind), Zellkultur und dergleichen Standardtechniken angewendet. Im allgemeinen erfolgen enzymatische Reaktionen und Reinigungsschritte gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Techniken und Vorgangsweisen werden im allgemeinen gemäß den herkömmlichen Verfahren auf dem Gebiet und verschiedenen allgemeinen Quellenangaben (siehe Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.; Virology, 2. Ausgabe, Fields, B. N. und Knipe, D. M. (Hrsg.) (1990), Raven Press, New York, USA) durchgeführt, die hierin beschrieben sind. Die hierin angeführten Verfahren sind auf dem Gebiet allgemein bekannt und werden zur Information des Lesers beschrieben.

Die Neoplasie ist ein pathologischer Zustand, der teilweise durch Erzeugung neoplastischer Zellen mit variierenden Genotypen und Phenotypen gekennzeichnet ist. Einige Tumoren können eine Populationen von Zellen ohne RB-Funktion, jedoch mit p53- Funktion umfassen; solche Zellen werden als RB(-) bezeichnet. Einige Tumorzellen besitzen möglicherweise keine p53-Funktion, jedoch RB-Funktion; solche Zellen werden als p53(-) bezeichnet. Einige Tumoren können Zellen ohne p53 und RB umfassen, die als p53(-)RB(-) bezeichnet werden. Die Zellinie SAOS2 (siehe Versuchsbeispiel weiter unten) ist ein Beispiel für einen neoplastischen Zelltyp, der p53(-)RB(-) ist. Es können auch neoplastische Zellen existieren, die im wesentlichen normale Werte von p53 und RB aufweisen; solchen Zellen mit normalem p53- und normalem RB-Wert fehlt es möglicherweise an anderen Onkoproteinen (z. B. Tumorsuppressor-Genprodukten außer p53 und RB), die die Grundlage für anti-neoplastische virale Konstrukte schaffen können, die einen Replikationsphenotyp in solchen neoplastischen Zellen bevorzugt manifestieren können.

Eine Grundlage der Erfindung ist, daß mehrere DNA-Viren, die Säugetierzellen infizieren (z. B. Adenoviren; Papovaviren wie z. B. BK und JC, SV40 sowie Papillomaviren wie z. B. HPV u. dgl.), für virale Proteine kodieren, die für die wirksamen Fortschritt durch den viralen Replikationszyklus wesentlich sind; einige dieser viralen Proteine sequestrieren zelluläre Proteine, wie z. B. jene, die an der Zellzyklus-Steuerung und/oder Bildung von Transkriptionskomplexen als notwendige Bedingung wirksamer viraler Replikation beteiligt sind. In Abwesenheit der viralen Proteine, die solche zelllulären Proteine wie p53 und RB binden, sequestrieren oder abbauen, wird virale Replikation deutlich gehemmt. Normale (d. h. nicht-neoplastische) Zellen, die mit einer Virusmutante infiziert sind, die nicht die Fähigkeit besitzt, p53 und/oder RB zu sequestrieren oder abzubauen, sind im allgemeinen nicht in der Lage, die Replikation der Virusmutante zu fördern, weshalb solche Virusmutanten als replikationsdefizient oder replikationsdefektiv gelten. DA jedoch die Sequestrierung oder der Abbau von p53 oder RB für viralle Replikation in Zellen ohne funktionelles p53 oder RB nicht notwendig ist (solche Zellen werden als p53(-) bzw. RB(-) bezeichnet), ist es möglich, daß replikationsdefiziente Virusmutanten, die hinsichtlich p53- und/oder RB-Sequestrierung oder -Abbau defektiv sind, einen Replikationsphenotyp in solchen p53(-) oder RBr(-)-Zellen in größerem Umfang exprimieren können als in Zellen mit im wesentlichen normaler p53- und/oder RB-Funktion.

Neoplastische Zellen mangelt es häufig an p53-Funktion (eine p53(-)-Zelle), RB-Funktion (eine RBr(-)-Zelle) oder an beiden Funktionen (eine p53(-)RBr(-)-Zelle). Einige Virenmutanten mit Replikationsdefizienz können daher einen Replikationsphenotyp in neoplastischen Zellen aufweisen.

Virale Mutanten ohne Fähigkeit, ein funktionelles RB-inaktivierendes Protein zu exprimieren (z. B. Adenovirus E1a, HPV E7-Protein) weisen einen Replikationsphenotyp in RB(-)-Zellen und RB(-)p53(-)-Zellen auf. Virale Mutanten ohne die Fähigkeit, ein funktionelles p53-inaktivierendes Protein zu exprimieren (z. B. Adenovirus E1b p55, HPV E6- Protein) weisen einen Replikationsphenotyp in p53(-) und RB(-)p53(-)-Zellen auf. Virale Mutanten ohne Fähigkeit, sowohl ein funktionelles p53-inaktivierendes Protein (z. B. Adenovirus E1b p55, HPV E6-Protein) als auch ein funktionelles RB-inaktivierendes Protein (z. B. Adenovirus Ela, HPV E7-Protein) zu exprimieren, weisen einen Replikationsphenotyp in RB(-)p53(-)-Zellen auf. Zytotoxizität in Verbindung mit der Expression eines replikativen Phenotyps kann daher als Basis für das bevorzugte Töten neoplastischer Zellen mit einem RB(-), p53(-)- oder RB(-)p53(-)-Phenotyp genutzt werden. Obwohl einige replizierende nicht-neoplastische Zellen vorübergehend einen RB(-)-Phenotyp, p53(-)-Phenotyp oder RB(-)p53(-)-Phenotyp während des Ablaufs des Zellzyklus aufweisen können, können die viralen Mutanten der Erfindung für die bevorzugte, wenn auch nicht notwendigerweise vollständig selektive Tötung neoplastischer Zellen eingesetzt werden, wodurch sie eine nützliche anti-neoplastische Therapiemodalität darstellen, die alleine oder in Kombination mit anderen Behandlungsmethoden eingesetzt werden kann. Deletionen (oder andere inaktivierende Mutationen) in den 37 aminoterminalen Resten des HPV E7-Poiypeptids sind bevorzugte HPV-Mutanten zur Anwendung auf RB(-)-Zellen, da diese Reste für die RB-Bindung von Bedeutung sind.

Obwohl die nachstehend präsentierten Verfahren und Zusammensetzungen spezifisch im Zusammenhang mit Verfahren beschrieben werden, die sich auf Adenovirus-Konstrukte mit Keplikationsdefizienz beziehen, wird angenommen, daß die Erfindung auch mit anderen DNA-Viren in die Praxis umgesetzt werden kann, die für Onkoproteine kodieren, die den Abbau von p53-Protein oder RB-Protein sequestrieren oder fördern, wie z. B. replikationsdefiziente Papillomavirus-Spezies (z. B. Mutanten der HPV-Typen 16, 18 und 33), die Mutationen im E6- und/oder E7-Gen enthalten, welche die p53- bzw. die RB-Funktion wesentlich hemmen. Zusätzlich zu Vertretern der Familie der Adenoviridae (insbesondere des Genus Mastadenovirus) wird angenommen, daß Vertreter der Familie der Papovaviridae, insbesondere Papillomavirus und Polyomavirus, die für virale Proteine kodieren, die p53 oder RB sequestrieren oder inaktivieren, zur Verwendung in den Verfahren der Erfindung geeignet sind.

Eine allgemeine Beschreibung von Adenovirus-Biologie findet sich in Virology, 2. Ausgabe, Fields, B. N. und Knipe, D. M. (Hrsg.), Bd. 2, S. 1651-1740, Raven Press, New York, NY, USA. Die folgenden spezifischen Beschreibungen beziehen sich u. a. auf Adenovirus Serotyp 5 und Adenovirus Serotyp 2. Obwohl man davon ausgeht, daß andere adenovirale Serotypen eingesetzt werden können, bietet Adenovirus Typ 5 einen gemeinsamen Bezugspunkt für die Nukleotid-Numerierungskonvention viraler Polynukleotide und Aminosäuren-Numerierung viral-kodierter Polypeptide des viralen E1a-Kodierbereichs und anderer viraler Gene. Adenovirus Typ 2 bietet einen geeigneten Bezug für die Numerierungskonvention des viralen E1b-Genbereichs und anderer viraler Genbereiche. Man ist der Ansicht, daß Fachleute auf dem Gebiet die entsprechenden Positionen in anderen adenoviralen Serotypen leicht identifizieren können. Verweise auf Human-Papillomavirus beziehen sich im allgemeinen auf einen mit Neoplasie assoziierten Typus (z. B. die Typen 16, 18 oder 33), obwohl auch nicht-onkogene Typen eingesetzt werden können.

E1a-Mutanten

Der Verlust der Retinoblastom-Tumorsuppressorgen- (RB-Gen-) Funktion wurde mit der Ätiologie verschiedener Tumortypen in Zusammenhang gebracht. Das Produkt dieses Tumorsuppressorgens, ein 105 kD-Polypeptid, das pRB oder p105 genannt wird, ist ein den Zellzyklus regelndes Protein. Das pRB-Polypeptid, hemmt die Zellvermehrung durch Arretieren von Zellen in der G1-Phase des Zellzyklus. Das pRB-Protein ist auch das Hauptziel mehrerer DNA-Virus-Onkoproteine, einschließlich von Adenovirus Ela, des großen T Ag von SV40 und von Papillomavirus E7. Diese viralen Protein binden und inaktivieren pRB, und die Funktion der Inaktivierung von pRB ist bei der Förderung der viralen Replikation von Bedeutung. Das pRB-Protein steht mit dem E2F-Transkriptionsfaktor in Wechselwirkung, der an der Expression des Adenovirus-E2-Gens und mehrerer Zellgene beteiligt ist, und hemmt die Aktivität dieses Transkriptionsfaktors (Bagchi et al., Cell 65, 1063 (1991); Bandara et al., Nature 351, 494 (1991); Chellappan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.) 89, 4549 (1992)). Die viralen Onkoproteine, wie z. B. Adenovirus-E1a, zerstören den pRB-E2F-Komplex, was zur Aktivierung von E2F führt. Zellen, denen ausreichende Mengen an funktionellem pRB zur Komplexbildung mit dem E2F fehlen, benötigen jedoch nicht die Gegenwart eines funktionellen Onkoproteins wie Ela, um transkriptionell aktives E2F zu besitzen. Daher wird angenommen, daß Adenovirus-Spezies mit Replikationsdefizienz, denen die Fähigkeit zur Komplexierung von RB fehlt, die aber andere essentielle Replikationsfunktionen im wesentlichen beibehalten, in Zellen, denen es an RB-Funktion fehlt (z. B. Zellen, die homozygot oder in Bezug auf im wesentlichen deletierte RB-Allele heterozygot sind, Zellen, die RB-Allele besitzen, die für mutierte RB-Proteine kodieren, die im wesentlichen nicht-funktionell sind, Zellen, die Mutationen umfassen, die in einer Defizienz an einer RB-Protein-Funktion resultieren) einen Replikationsphenotyp manifestieren, in nicht-replizierenden, nichtneoplastischen Zellen jedoch keinen Replikationsphenotyp manifestieren. Derartige replikationsdefiziente Adenovirus-Spezies werden hierin der Einfachkeit halber als E1a- RB< -replikationsdefiziente Adenoviren bezeichnet.

Eine Zellpopulation (wie z. B. gemischte Zellkulturen oder ein menschlicher Krebspatient), die eine Subpopulation von neoplastischen Zellen, denen es an RB-Funktion fehlt, und eine Subpopulation von nicht-neoplastischen Zellen, die irm wesentlichen normale RB-Funktion exprimieren, umfaßt, kann unter infektiven Bedingungen (d. h. Bedingungen, die für adenovirale Infektion der Zellpopulation geeignet ist, typischerweise physiologische Bedingungen) mit einer Zusammensetzung in Kontakt gebracht werden, die eine infektive Dosis eines E1a-RB(-)-replikationsdefizienten Adenovirus umfaßt. Dieser Kontakt führt zur Infektion der Zelipopulation mit dem E1a-RB(-)-replikationsdefizienten Adenovirus. Die Infektion bewirkt die bevorzugte Expression eines Replikationsphenotyps in einem beträchtlichen Anteil der Zellen, welche die Subpopulation von neoplastischen Zellen, denen es an RB-Funktion fehlt, umfassen, bewirkt jedoch keine nennenswerte Expression eines Replikationsphenotyps bei der Subpopulation von nichtneoplastischen Zellen, die im wesentlichen normale RB-Funktion aufweisen. Die Expression eines Replikationsphenotyps in einer infizierten RBr-r-Zelle führt zum Absterben der Zelle, wie z. B. durch zytopathologischen Effekt (CPE), Zelllyse, Apoptose u. dgl., was zu einer selektiven Ablation neoplastischer p53(-)-Zellen aus der Zellpopulation führt.

Typischerweise umfassen E1a-RB(-)-Adenoviruskonstrukte mit Replikationsdefizienz, die sich zur selektiven Tötung neoplastischer RBr(-)-Zellen eignen, Mutationen (z. B. Deletionen, Substitutionen, Rahmenverschiebungen), welche die Fähigkeit eines E1a-Polypeptids inaktivieren, RB-Protein wirksam zu binden. Solche inaktivierenden Mutationen treten typischerweise in der E1a-CR1-Domäne (den Aminosäuren 30-85 in Ad5; Nukleotid- Positionen 697-790) und/oder -CR2-Domäne (Aminosäuren 120-139 in Ad5; Nukleotid- Positionen 920-967) auf, die an der Bindung des p105-RB-Proteins und des p107-Proteins beteiligt sind. Vorzugsweise bleibt die CR3-Domäne (die die Aminosäuren 150- 186 überspannt) und wird als als verkürztes p289R-Polypeptid exprimiert und ist bei der Transaktivierung von frühen Adenovirus-Genen funktionell. Fig. 1 zeigt schematisch die Domänenstruktur des E1a-289R-Polypeptids.

Geeignete E1a-RB(-)-Adenoviruskonstrukte mit Replikationsdefizienz zur Verwendung in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung sind u. a. (ohne darauf beschränkt zu sein): (1) Adenovirus Serotyp 5 NT dl 1010, der für ein E1a-Protein kodiert, dem die CR1- und CR2-Domänen fehlen (Deletion der Aminosäuren 2 bis 150; Nukleotide 560-1009), die für wirksame RB-Bindung essentiell sind, in dem die CR3-Domäne jedoch im wesentlichen beibehalten wird (Whyte et al., Cell 56, 67 (1989)); und (2) Adenovirus-Serotyp 5 dl 312, der ein deletiertes virales Genom umfaßt, dem der die Nukleotide 448-1349 überspannende Bereich fehlt, der im Adenovirus der Wildform für den gesamten E1a-Bereich kodiert (N. Jones und T. Schenk, Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.) 76, 3665 (1979)). Ad5 NT dl 1010 ist ein bevorzugtes E1a-RB'-~ -replikationsdefizientes Adenovirus und ist von Dr. E. Harlow (Massachusetts General Hospital, Boston, MA, USA) erhältlich.

Es kann vorzuziehen sein, zusätzliche Mutationen in solchen Adenovirus-Konstrukten einzubauen, um die Bildung infektiöser Virione in neoplastischen Zellen zu hemmen, die ansonsten die Replikation der E1a-RB(-)Mutanten unterstützen würden. Solche zusätzliche inaktivierende Mutationen wären in therapeutischen Modalitäten bevorzugt, in denen eine vollständige virale Replikation, die infektiöse Virione bildet, die sich in benachbarte Zellen ausbreiten und sie infizieren können, unerwünscht ist. Diese vollständig inaktivierten Mutanten werden als nicht-replizierbare E1a-RB(-)-Mutanten bezeichnet. Derartige nicht-replizierbare Mutanten umfassen Mutationen, welche die Bildung infektiöser Virione sogar in p53(-)RB(-)-Zellen verhindern; solche Mutationen sind typischerweise strukturelle Mutationen in einem/einer wesentlichen Virionprotein oder -protease. In vielen Modalitäten ist es aber wünschenswert, daß die Virusmutante replizierbar ist und infektiöse Virione bildet, welche die virale Genommutante enthalten, die sich auf andere Zellen ausbreiten und diese infizieren kann, wodurch die anti-neoplastische Wirkung einer Anfangsdosis der Virusmutante verstärkt wird.

Zusätzliche E1a(-)-Mutanten ohne Fähigkeit, RB zu binden, können von Fachleuten auf dem Gebiet erzeugt werden, indem Mutationen im E1a-Genbereich erzeugt werden, die für E1a-Polypeptide kodieren, typischerweise in den CR1- und/oder CR2-Domänen, die das mutierte E1a-Polypeptid exprimieren, wobei die mutierten E1a-Polypeptide mit p105 oder einem bindenden Fragment von RB unter wäßrigen Bindungsbedingungen in Kontakt gebracht und mutierte E1a-Polypeptide, die RB nicht spezifisch binden, als E1a(-)-Kandidatenmutanten identifiziert werden, die sich zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung eignen. Alternative Assays umfassen das In-Kontakt-Bringen der mutierten Polypeptide mit dem 300 kD-Protein und/oder p107-Protein oder einem bindenden Fragment davon unter wäßrigen Bindungsbedingungen und das Iclentifizieren mutierter E1a-Polypeptide, welche die 300 kD- und/oder p107-Polypeptide nicht spezifisch binden, als E1a(-)-Kandidatenmutanten, die sich zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung eignen. Alternative Bindungsassays umfassen die Bestimmung der Unfähigkeit von mutiertem E1a-Protein (oder die Abwesenheit von E1a-Protein) zur Bildung von Komplexen mit dem Transkriptionsfaktor E2F und/oder des Fahlens der Fähigkeit der Dissoziation des RB-Proteins aus RB:E2F-Komplexen unter physiologischen Bedingungen (Chellappan et al. (1991), s.o.).

Auch andere funktionelle Assays zur Bestimmung von Mutanten, denen E1a-Funktion fehlt, z. B. anhand des Verlust von Transaktivierung der Transkription verschiedener Reporter-Polypeptide, die mit einer E1a-abhängigen, die Transkription regelnden Sequenz verbunden sind, durch E1a und dergleichen werden eingesetzt.

Einigen menschlichen Tumorzellen mangelt es sowohl an p53- als auch an RB-Funktion (entweder aufgrund von Mutationsinaktivierung oder Deletion einer oder beider Proteinspezies). Solche Zellen werden als p53 RB(-)-Zellen bezeichnet.

Man geht davon aus, daß Adenovirus-Spezies mit Replikationsdefizienz, die keine Fähigkeit besitzen, p53 und RB zu binden, jedoch im wesentlichen andere wichtige virale replikative Funktionen bewahren, vorzugsweise einen Replikationsphenotyp in p53(-) RB(-)-Zellen aufweisen. Solche Adenovirus-Spezies mit Replikationsdefizienz werden hierin der Einfachheit halber als E1a-RB(-)/E1b-p53(-)-Adenoviren mit Replikationsdefizienz oder einfach als E1a/E1b-Doppelmutanten bezeichnet. Solche IE1a/E1b-Doppelmutanten können von Fachleuten auf dem Gebiet konstruiert werden, indem zumindest eine E1a-RB(-)-Mutation im E1a-Bereich und zumindest eine E1b-p53(-)-Mutation im E1b- Bereich, der für p55 kodiert, kombiniert werden, um ein E1a/E1b-Doppelmutanten-Adenovirus zu bilden. Ein derartiges Doppelmutanten-Adenovirus mit Keplikationsdefizienz weist in Zellen einen Replikationsphenotyp auf, die sowohl einen Mangel an p53- als auch an RB-Funktionen besitzen, weisen aber im wesentlichen keinen replikativen Phenotyp in nicht-replizierenden, nicht-transformierten Zellen oder in Zellen auf, die einen Mangel an p53- oder RB-Funktion, jedoch nicht beiden Funktionen besitzen. Beispielsweise umfaßt die Ad5 dl 434-Mutante (Grodzicker et al., Cell 21, 454 (1980)) eine Deletion des E1a-Lokus und eine partielle Deletion des E1b-Lokus und ist im wesentlichen nicht imstande, für funktionelle E1a- und Elb p55-Protiene zu kodieren.

Eine Zellpopulation (z. B. eine gemischte Zellkultur oder ein menschlicher Krebspatient), umfassend eine Subpopulation neoplastischer Zellen ohne p53- und RB-Funktionen und eine Subpopulation neoplastischer Zellen, die im wesentlichen normale p53-Funktion und/oder RB-Funktion exprimieren, kann unter infektiösen Bedingungen (d. h. Bedingungen, die sich zur adenoviralen Infektion der Zellpopulation eignen, typischerweise physiologische Bedingungen) mit einer Zusammensetzung kontaktiert werden, die eine infektiöse Dosis eines Ea1/E1b-Doppelmutanten-Adenovirus mit Keplikationsdefizienz umfaßt. Dieses In-Kontakt-Bringen bewirkt die Infektion der Zelipopulation mit dem Ea1/E1b-Doppelmutanten-Adenovirus. Die Infektion sorgt für bevorzugte Expression eines Replikationsphenotyps in einem signifikanten Teil der Zellen, welche die Subpopulation neoplastischer Zellen ohne p53- und RB-Funktion umfassen, bewirkt aber im wesentlichen keine Expression eines replikativen Phenotyps in der Subpopulation nichtneoplastischer Zellen mit im wesentlichen normaler p53-Funktion und/oder RB-Funktion. Die Expression eines Replikationsphenotys in einer infizierten p53(-)RB(-)-Zelle führt zum Tod der Zelle, z. B. durch zytopathologischen Effekt (CPE), Zelllyse und dergleichen, was wiederum eine selektive Ablation neoplastischer p52(-)RB(-)-Zellen aus der Zellpopulation zur Folge hat.

Es kann vorzuziehen sein, zusätzliche Mutationen in solche Adenovirus-Konstrukte einzubauen, um die Bildung infektiöser Virione in neoplastischen Zellen zu hemmen, die ansonsten die Replikation einer E1a/E1b-Doppemutante unterstützen würden. Derartige zusätzlichen Inaktivierungsmutationen wären in therapeutischen Modalitäten vorzuziehen, in denen vollständige virale, replikationsbilden de, infektiöse Virione, die sich auf benachbarte Zellen ausbreiten und diese infizieren können, unerwünscht sind. Diese vollständig inaktivierten Mutanten werden als nicht-replizierbare E1 a/E1 b-Doppelmutanten bezeichnet. Solche nicht-replizierbaren Mutanten umfassen Mutationen, welche die Bildung infektiöser Virione sogar in p53(-)RB(-)-Zellen verhindern; solche Mutationen sind typischerweise strukturelle Mutationen in einem/einer wesentlichen Virion-Protein oder -Protease.

In vielen Modalitäten ist es aber wünschenswert, daß sich die Virusmutante repliziert und infektiöse Virione bildet, welche die virale Genommutante enthalten, die sich auf andere Zellen ausbreiten und sie infizierten kann, wodurch die anti-neoplastische Wirkung einer Anfangsdosis von Virusmutante gesteigert wird.

Virale Konstrukte mit negativer Selektion

Obwohl die Expression eines adenoviralen Replikationsphenotyps in einer infizierten Zelle mit viralinduzierter Zytotoxizität (im allgemeinen durch Zellyse, zytopathologischen Effekt (CPE), Apoptose oder andere Mechanismen des Zelltods) korreliert, kann es oft vorzuziehen sein, die Zytotoxizität eines rekombinanten Adenovirus zu erhöhen, das in der antineoplastischen Therapie eingesetzt werden soll. Eine solche Erhöhung kann die Form des Einschlusses eines negativen Selektionsgens im rekombinanten Adenovirus annehmen (typischerweise mit einem adenoviralen Promotor operabel verbunden, der positive Transkriptionsmodulation in Zellen aufweist, die einen Replikationsphenotyp exprimieren). Beispielsweise kann eine HSV tk-Genkassette unmittelbar stromab von einem E3-Promotor eines replikationsdefizienten Adenovirus, z. B. Ad5 NT dl 1110, operabel verbunden sein. Häufig ist es wünschenswert, einen unwesentlichen Anteil (d. h. zur viralen Replikation und Packung) des adenoviralen Genoms zu deletieren, um die negative Selektionskassette einzubauen; somit kann ein beträchtlicher Teil des E3-Genbereichs deletiert und mit einer negativen Selektionskassette, wie z. B. einem HSV tk- Gen ersetzt werden, das operabel mit einem E2-Promotor (und Enhancer) oder einem anderen geeigneten Promotor/Enhancer verbunden ist. Alternativ dazu kann ein negatives Selektionsgen mit einem späten Adenovirus-Bereichspromotor operabel verbunden sein, um für wirksame Expression des negativen Selektions-Genprodukts in Zellen zu sorgen, die einen Replikationsphenotyp exprimieren, der durch Transkription von späten Genpromotoren gekennzeichnet ist.

Für Ausführungsformen, wo virale replikationsbildende, infektiöse Virione in vivo unerwünscht sind, werden nicht-replizierbare Adenovirus-Konstrukte mit Replikationsdefizienz eingesetzt. Solche nicht-replizierbaren Mutanten umfassen eine E1a(-) und/oder E1b(-)-Mutation und alle genetischen Funktionen, die zur Erzeugung eines Replikationsphenotyps in einer geeigneten neoplastischen Zelle (z. B. einer p53(-)-Zelle, einer RB(-)- Zelle oder einer p53(-)RB(-)-Zelle) notwendig sind, doch es wurde aus ihnen zumindest eine wesentliche Genfunktion deletiert, die zur Bildung infektiöser Virione notwendig ist, z. B. strukturelle Hüllenproteine, Proteasen und dergleichen. Alternativ dazu kann eine hervorgerufene, virusinduzierte Reaktion infektiöse Virione neutralisieren und die Ausbreitung viraler Infektion mäßigen. Nicht-replizierbare Mutanten ohne komplementierbare transagierende Funktion zusätzlich zu einer E1a- und/oder E1b-Mutation können in Kombination mit einem komplementären Helper-Virus oder einer Helper-Zellinie vermehrt werden, welche die deletierte(n) transagierende(n) Funktion(en) bereitstellen kann. Beispielsweise kann die 293-Zellinie (ATCC # CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)), die E1a- und E1b-Funktionen in trans bereitstellt, modifiziert sein, um zusätzliche Funktionen in trans-Form bereitzustellen, z. B. ein Virion-Hüllenprotein oder dergleichen, um die Vermehrung der "nicht-replizierbaren" Mutanten zur Entwicklung von Virusstämmen zu ermöglichen.

Die Expression des HSV tk-Gens in einer Zelle ist für die Zelle nicht direkt toxisch, sofern die Zelle nicht einem negativen Selektionsmittel, wie z. B. Gancyclovir oder FlAU, ausgesetzt ist. Infizierte Zellen, die einen Replikationsphenotyp exprimieren, in dem ein negatives Selektionsgen nennenswert exprimiert wird, können im wesentlichen keine zusätzliche Zytotoxizität erzeugen, bis das negative Selektionsmittel (z. B. Gancyclovir) in einer wirksamen selektiven Dosis verabreicht wird, zu welchem Zeitpunkt die das tk- Gen exprimierenden infizierten Zellen selektiv ablatiert werden; somit kann die negative Selektion zur verstärkten zytopathologischen Tötung und/oder Eindämmung weiterer viraler Replikation durch Töten von Zellen, die einen replikativen Phenotyp aufweisen, genutzt werden. Durch Einstellen der Dosierungen und/oder Verabreichungspläne des negativen Selektionsmittels ist es möglich, nur eine Teilablation der infizierten Zellppulation hervorzurufen, die das negative Selektionsgen exprimiert. Im allgemeinen wird die Dosierung von Gancyclovir durch Erzeugen einer herkömmlichen Dosis-Response- Kurve und Bestimmen des Dosierungswerts, bei dem ein gewünschtes Ablationsausmaß infizierter neoplastischer Zellen beobachtet wird, kalibriert. Information betreffend die Verabreichung von Gancyclovir (GANC) an Tiere ist aus verschiedenen Quellen erhältlich, z. B. aus Verabreichungsanweisungen für Menschen auf Beipackzetteln. Bei Verwendung in Zellkultur liegt eine selektive Konzentration von Gancyclovir typischerweise im Bereich von 0,05 uM bis 50 uM, vor allem etwa 1 um, wobei etwa 0,2 uM für in vitro-Anwendungen und etwa 1-5 uM für in vivo-Anwendungen verabreicht werden (typischerweise in einem Zeitraum von etwa 24 Stunden durch Dauerinfusion aus einer osmotischen Pumpe verabreicht, die mit 125 mg/ml Gancyclovir in wäßriger Lösung beladen ist). Ein Dosierungsplan für in vivo-Verabreichung kann Galncycovir mit einer Dosis von 5 mg/kg Körpergewicht B. I. D. und die intravenöse Gabe über 7 Tage vorsehen.

Negative Selektionsgene können in E1a-RBtAdenovirus-Konstrukte mit Replikationsdefizienz, E1ba(-)p53(-)-Adenovirus-Konstrukte mit Replikationsefizienz, E1a/E1b-Doppelmutanten-Viralkonstrukte mit Replikationsdefizienz oder dergleichen eingebaut werden. Eine bevorzugte Ausführungsform ist eine HSV tk-Genkassette (Zjilstra et al., Nature 342, 435 (1989); Mansour et al., Nature 336, 348 (1988); )ohnson et al., Science 245, 1234 (1989); Adair et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86, 4574 (1989); M. Capecchi, Science 244, 1288 (1989)), mit dem E2-Promotor von Ad5 NT dl 1110 oder einem alternativen Promotor und/oder Enhancer operabel verbunden (z. B. dem wesentlichen späten Promotor, E1a-Promotor/Enhancer, E1b-Promotor/Enhancer), mit einer Polyadenylierungsstelle zur Bildung einer tk-Expressionskassette. Die tk-Expressionskassette (oder eine andere Expressionskassette negativer Selektion) wird in das adenovirale Genom, z. B. als Ersatz für eine substantielle Deletion des E3-Gens, insertiert. Andere negative Selektionsgene und replikationsdefiziente Adenovirus-Konstrukte sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Man geht davon aus, daß ein mit dem E2-Promotor operabel verbundenes negatives Selektionsgen eine besonders bevorzugte Ausführungsform zum Einbau in Ea1(-)-Adenovirus-Mutanten mit Replikationsdefizienz ist, da der E2-Promotor mehrere E2F-Stellen ethält, während RB(-) und p53(-)RB(-) keine RB-Funktion und vermutlich eine wirksamere Transkription aus dem E2-Promotor aufweisen.

Diagnostische und in vitro-Anwendungen

Die replikationsdefizienten Adenoviren der Erfindung können dazu dienen, die Gegenwart von Zellen zu detektieren, denen p53- und/oder RB-Funktion fehlt. Beispielsweise kann eine Zellprobe, die eine Subpopulation neoplastischer Zellen ohne p53- und/oder RB umfaßt, mit einer geeigneten Adenovirus-Spezies mit Replikationsdefizienz infiziert werden. Nach geeigneter Inkubationsdauer können die Zellen in der Zellprobe, die einen Replikationsphenotyp exprimieren (z. B. Verlust der Fähigkeit, Trypanblau auszuschließen, Virion-Bildung, 3H-Thymidin-Einbau in virale DNA), quantifiziert werden, um ein Maß für die Zahl oder den Anteil replikativer und/oder neoplastischer Zellen in der Zeliprobe zu bieten. Solche Verfahren können dazu dienen, Neoplasmen zu diagnostizieren und/oder Tumorzellbelastung nach Chemotherapie bei einem Patienten auf der Grundlage einer explantierten Zellprobe zu beurteilen (z. B. eine Lymphozytenprobe aus einem Patienten, der aufgrund von lymphozytischer Leukämie mit Chemotherapie behandelt wird).

Alternative diagnostische Verwendungen und Variationen sind offenkundig; beispielsweise kann ein Reporter-Gen (z. B. Luciferase, β-Galactosidase) für ein negatives Selektionsgen in einem replikationsdefizienten Adenovirus substituiert werden; transformierte Zellen können (z. B. in einer Zellprobe oder einem Transformationsassay) durch Expression des Reporter-Gens markiert werden, die mit der Expression eines Replikationsphenotyps korreliert, dem p53 und/oder RB in einer Zelle fehlt.

Therapeutische Verfahren

Die Therapie von Neoplasie kann durch Verabreichung einer Zusammensetzung an einen Patienten durchgeführt werden, die replikationsdefektive Adenoviren der Erfindung enthält, umfassend E1a-RB(-)tAdenoviren mit Replikationsdefizienz, p53(-)-Adenoviren mit Replikationsdefizienz, E1a/E1b-Doppelmutanten und Adenoviren mit Replikationsdefizienz, die ferner ein negatives Selektionsgen umfassen.

Verschiedene menschliche Neoplasmen, die Zellen ohne p53- und/oder RB-Funktionen umfassen, können mit den adenoviralen Konstrukten mit Replikationsdefizienz behandelt werden. Beispielsweise kann ein menschlicher Patient oder ein anderes Säugetier als der Mensch mit bronchogenem Karzinom, nasopharyngealem Karzinom, Kehlkopfkarzinom, Kleinzellen- und Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinom, Lungenadenokarzinom, Hepatokarzinom, Pankreaskarzinom, Blasenkarzinom, Darmkarzinom, Brustkarzinom, Zervixkarzinom, Eierstockkarzinom oder lymphozytischer Leukämie behandelt werden, indem eine wirksame anti-neoplastische Dosis eines geeigneten Adenovirus mit Replikationsdefizienz verabreicht wird. Suspensionen infektiöser Adenoviruspartikel können auf verschiedenen Wegen, z. B. intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subdermal und topisch, auf neoplastisches Gewebe aufgebracht verden. Eine Adenovirus-Suspension, die etwa 10³ bis 10¹² oder mehr Virionpartikel pro ml enthält, kann als Aerosol inhaliert werden (z. B. zur Versorgung der Lunge zur Behandlung von bronchogenem Karzinom, Kleinzellen-Lungenkarzinom, Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinorn, Lungenadenokarzinom oder Kehlkopfkarzinom), direkt auf eine Tumorstelle aufgetupft werden, um einen Tumor zu behandeln (z. B. bei bronchogenem Karzinom, nasopharyngealem Karzinom, Kehlkopfkarzinom, Zervixkarzinom) oder durch Infusion (z. B. in den Peritonäalraum zur Behandlung von Eierstockkrebs, in die Pfortader zur Behandlung von Hepatokarzinom oder Lebermetastasen anderer nicht-hepatischer Primärtumore) oder andere geeignete Wege verabreicht werden, z. B. durch direkte Injektion in eine Tumormasse (z. B. bei Brusttumor), Klistier (z. B. bei Darmkrebs) oder Katheter (z. B. bei Blasenkrebs).

Antineoplastische Adenovirus-Kandidatenmutanten können außerden hinsichtlich ihrer Fähigkeit untersucht werden, Tumorbildung oder neoplastische Zellbelastung in nu/nu- Mäusen zu verringern, die ein Transplantat neoplastischer Zellen ohne p53- und/oder RB-Funktion aufweisen (im Vergleich zu unbehandelten Zellen mit einem äquivalenten Transplantat der neoplastischen Zellen).

Antineoplastische Adenovirusmutanten mit Replikationsdefizienz können zur therapeutischen und diagnostischen Verabreichung an einen Patienten mit Neoplasie verabreicht werden. Für therapeutische oder prophylaktische Verwendungszwecke wird eine sterile Zusammensetzung, umfassend eine pharmakologisch wirksame Dosis einer oder mehrerer Spezies antineoplastischer Adenovirusmutanten mit Replikationsdefizienz, an einen menschlichen oder nichtmenschlichen Patienten zur Behandlung eines neoplastischen Zustands verabreicht. Im allgemeinen umfaßt die Zusammensetzung etwa 10³ bis 10¹&sup5; oder mehr Adenoviruspartikel in einer wäßrigen Suspension. Ein pharmazeutisch annehmbarer Träger oder Exzipient wird in solchen sterilen Zusammensetzungen häufig eingesetzt. Eine Vielzahl wäßriger Lösungen kann eingesetzt werden, z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Salzlösung, 0,3% Glycin und dergleichen. Diese Lösungen sind steril und im allgemeinen frei von Partikeln mit Ausnahme der adenoviralen Virione. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare Zusatzsubstanzen enthalten, die notwendig sind, um physiologischen Bedingungen gerecht zu werden, z. B. pH-Regler und Puffermittel, Toxizitätseinstellungsmittel und dergleichen, beispielsweise Natriumacetat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Natriumlactat usw. Exzipienten, welche die Infektion von Zellen durch Adenovirus steigern, können ebenfalls eingesetzt werden.

Replikationsdefiziente Viren können neoplastischen Zellen durch Liposomen- oder Immunliposomenzufuhr zugeführt werden; eine derartige Zufuhr kann spezifisch auf neoplastische Zellen auf der Grundlage einer Zelloberflächeneigenschaft der neoplastischen Zellpopulation abzielen (z. B. Gegenwart eines Zelloberflächenproteins, das ein Immunglobulin in einem Immunliposom bindet). Typischerweise ist eine die Virione enthaltende wäßrige Suspension in Liposome oder Immunliposome eingekapselt. Beispielsweise kann eine Suspension replikationsdefizienter Adenovirus-Virione in Micellen eingekapselt sein, um Immunliposome nach herkömmlichen Verfahren herzustellen (US-A- 5.043.164, US-A-4.957.735, US-A-4.925.661; Connor und Huang,). Cell Biol. 101, 582 (1985); Lasic, D. D., Nature 355, 279 (1992); Novel Drug Delivery, Presscot, L. F. und Nimmo, W. S. (Hrsg.): Wiley, New York, 1989); Reddy et al., J. Immunol. 148, 1585 (1992)). Immunliposome, die einen Antikörper umfassen, der sich spezifisch an ein Krebszellen-Antigen bindet (z. B. CALLA, CEA), das auf den Krebszellen des Individuums vorhanden ist, können zum Abzielen solcher Virione auf diese Zellen eingesetzt werden.

Die Zusammensetzungen, welche die vorliegenden antineoplastischen Adenoviren mit Replikationsdefizienz oder Mischungen davon enthalten, können für prophylaktische und/oder therapeutische Behandlungen von Neoplasie verabreicht werden. Bei der therapeutischen Anwendung werden Zusammensetzungen an einen Patienten, der bereits an der jeweiligen Neoplasie leidet, in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um den Zustand und seine Komplikationen zu heilen oder zumindest aufzuhalten. Eine Menge, die dieses Ziel erreicht, ist als "therapeutisch wirksame Dosis" oder "wirksame Dosis" definiert. Diese Mengen hängen vom Schweregrad des Zustands, der allgemeinen Verfassung des Patienten und von der Verabreichungsweise ab.

In prophylaktischen Anwendungen werden Zusammensetzungen, welche die antineoplastischen Adenoviren mit Replikationsdefizienz enthalten, an einen Patienten verabreicht, der sich derzeit in keinem neoplastischen Krankheitszustand befindet, um die Resistenz des Patienten gegen das Wiederauftreten von Neoplasma oder die Remissionszeit zu verlängern. Eine solche Menge ist als "prophylaktisch wirksame Dosis" definiert. Bei dieser Verwendung hängen die präzisen Mengen wiederum vom Gesundheitszustand und seiner allgemeinen Immunitätsverfassung ab.

Einzel- oder Mehrfachverabreichungen der Zusammensetzungen können mit Dosismengen und -mustern durchgeführt werden, die vom behandelnden Arzt ausgewählt werden. Die pharmazeutischen Formulierungen sollten in jedem Fall eine Menge der antineoplastischen Adenoviren mit Replikationsdefizienz der Erfindung bereitstellen, die zur wirksamen Behandlung des Patienten erforderlich ist.

Die Therapie mit antineoplastischen Adenoviren mit Replikationsdefizienz kann mit anderen antineoplastischen Arbeitsvorschriften, wie z. B. herkömmlicher Chemotherapie, kombiniert werden.

Vermehrung von Adenovirusmutanten

Adenovirusmutanten der Erfindung (z. B. E1a-RB(-)-Adenoviren mit Replikationsdefizienz und E1a/E1b-Doppelmutanten) werden typischerweise als Virenstämme in einer Zellinie (z. B. der 293-Zellinie ATCC # CRL 1573, American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA; Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)), die E1a-Funktion, E1b-Funktion oder sowohl E1a- als auch E1b-Funktionen bereitstellen kann, in trans vermehrt, um Replikation und Bildung infektiöser Virionmutanten zu unterstützen.

Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und sind nicht einschränkend. Variationen und alternative Ausführungsformen sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.

VERSUCHSBEISPIEL

Das folgende Versuchsbeispiel zeigt, daß die Verabreichung eines rekombinanten Adenovirus-Präparats mit Replikationsdefizienz an neoplastische Zellen ohne p53- und/oder Rb-Funktion neoplastische Zellen wirksam töten kann. Das Beispiel veranschaulicht auch, daß nicht-neoplastische Zellen mit p53- und Rb-Funktion relativ resistent gegenüber der Tötung durch das rekombinante Adenovirus-Präparat mit Replikationsdefizienz sind. Daher bieten die hierin vorgestellten Daten eine auf experimentellem Weg erbrachte Verifizierung, daß die Verabreichung von rekombinantem Adenovirus mit Replikationsdefizienz zur selektiven Tötung neoplastischer Zellen dienen kann. Die selektive Tötung wird durch Ausnützen der unterschiedlichen Fähigkeit der Adenovirusmutanten erreicht, einen Replikationsphenotyp in neoplastischen Zellen hervorzurufen, einen Replikationsphenotyp (oder assoziierten zytopathologischen Effekt) in nicht-neoplastischen Zellen aber im wesentlichen nicht hervorzurufen.

Nicht-neoplastische Vergleichszellen und Zellinien, die eine Vielzahl neoplastischer Zelltypen darstellen, wurden in 6-Napf-Kulturschalen bei oder fast bei Konfluenz in (glucosereichem) DMEM mit 10% Rinderfötenserum plattiert und bei 37ºC, 5% CO&sub2;, unter herkömmlichen Kulturbedingungen inkubiert. Zellen wurden plattiert, um bei einer Dichte von 5 · 10&sup5; Zellen/Napfgescreent zu werden. Die untersuchten neoplastischen Zellinien waren: SAOS-2 (ATCC HTB85) aus einem menschlichen primären osteogenem Sarkom; U-20S (ATCC HTB96) aus einem menschlichen osteogenem Sarkom; HS700T (ATCC HTB147) aus einem menschlichen metastatischem Adenokarzinom, das in der Pankreas oder im Darm entstand; 293 (ATCC CRL1573), transformierte menschliche Embryonieren; und DLD-1 (ATCC CCL221) aus einem menschlichen Kolonadenokarzinom. Jede der Zellinien ist bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA erhältlich. Die nicht-neoplastischen Vergleichszellewn waren IMR90 (ATCC CCL 186) und WI-38 (ATCC CCL 75), beides menschliche Diploid-Lungenfibroblastenlinien.

Diese Zellkulturen wurden anschließend parallel mit Wildform-Adenovirus Typ 2 sowie replikationsdefizienten rekombinanten Adenovirusmutanten dl 11010, dl434 und d11520 infiziert. Eine zusätzliche Kulturschale wurde zum Zählen der Zellen plattiert. Diese Zellen stammten aus der gleichen Suspension von Zellen, die für die viralen Infektionen eingesetzt wurde. Die Zellen wurden gezählt, um die Anzahl Viralplaque-bildender Einheiten (PFU) zu bestimmen, um sie den Zellkulturen für eine gewünschte Multiplizität der Infektion (MOI) zuzugeben. Das Wildform-Adenovirus Typ 2 und die Adenovirusmutanten wurden den parallelen Zellkulturen mit MOIs VOn 0,1, 1,0, 10 und 100 zugegeben. In PBS suspendiertes Virus wurde den Zellnäpfen in einer Menge von 1 ml zugegeben. Die geimpften Kulturschalen wurden sowohl in X- als auch Y-Achse unmittelbar nach der Impfung und nach der Hälfte der Adsorptionszeit von etwa 1 Stunde bei 37ºC, 5% CO&sub2;, geschüttelt. Nach der einstündigen Adsorptionsdauer wurden 2 ml glucosereiches DMEM mit 2% Rinderfötenserum zugegeben und die Kulturen bei 37ºC, 5% CO&sub2;, unter Standard-Kulturbedingungen inkubiert.

Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion (siehe Fig. 2(a-i), wurden Zellkulturen mit 0,5% Kristallviolett in 20% Methanol eingefärbt, um die Wirksamkeit der Zelltötung durch die Viruspräparate zu bestimmen. Tote Zellen wurden gelöst und aus den Näpfen gespült, während lebende Zellen im Napfverblieben und mit dem Farbstoff eingefärbt wurden. Die Ergebnisse zeigen, daß die rekombinanten Adenovirus-Präparate mit Replikationsdeizienz neoplastische Zellen im Gegensatz zu nicht-neoplastischen Zellen bevorzugt töten konnten und daß Wildform-Adenovirus Typ 2 sowohl neoplastische als auch nicht-neoplastische Zellen etwa gleich gut tötete. Die Ergebnisse belegen, daß die dl 11010-Mutante beim Töten neoplastischer Zellen besonders wirksam war, wobei auch die dl 1520-Mutante und die dl 434-Mutante wirksam waren. Ein Beispiel der Ergebnisse ist in Fig. 2a-i dargestellt, bei denen es sich um Fotografien der eingefärbten Zelinäpfe zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion mit Adenovirus 2 der Wildform und den Mutanten dl 1010 (E1A(-)), dl 11520 (E1B(-)) oder dl 434 handelt. Fig. 2a zeigt, daß in Abwesenheit von Virus jede der Zellkulturen bis zur Konfluenz wuchs und an den Kulturnäpfen anhaftete. Fig. 2b-c zeigt, daß Adenovirus 2 der Wildform Zellen in jedem der Kulturnäpfe - wenn auch mit variabler Wirksamkeit und unvollständig töten konnte, wobei einige Zellen in jedem Napfeingefärbt waren. Man beachte, daß WI-38- und SAOS-2-Linien keine guten Wirte für adenovirale Infektion sind und daß IMR90 (Fig. 3a-c) als alternative Vergleichszellinie für menschliche Diploid-Fibroblasten dient. Fig. 2d-e zeigt, daß die dl 1010-Mutante alle neoplastischen Zellinien mit Ausnahme des infektionsresistenten SAOS-2 töten konnte. dl 1010 tötete die 293-, U20S-, HS700T- und DLD-1-Linien bis zu 12 Tagen nach der Infektion und tötete menschliche Diploid- Lungenfibroblasten (WI-38) im wesentlichen nicht. Fig. 2f-g zeigt, daß die dl 1520- Mutante 3 der 5 neoplastischen Zellinien (293, HS700T und DLD-1) bis zu 14-20 Tagen nach der Infektion wirkungsoll töten konnte und menschliche Diploid-Lungenfibroblasten (WI-38) im wesentlichen nicht tötete. dl 1520 ist eine E1B(-)&submin;Mutante, und Zellinie U20S ermöglicht keine Replikation einer derartigen E1b(-)-Mutante - ein Anzeichen für die vorhergesagte Spezifität der unterschiedlichen transformierten Zellinien für die Infektion durch die Adenovirusmutanten mit Replikationsdefizienz. Fig. 2h-i zeigt, daß die dl 434-Mutante (eine Doppelmutante E1A(-)E1B(-)) 3 der 5 neoplastischen Zellinien (293, HS700T und DLD-1) bis zu 14-20 Tagen nach der Infektion wirksam töten konnte und menschliche Diploid-Lungenfibroblasten (WI-38) im wesentlichen nicht tötete. Die DLD-1- und U20S-Linien wiesen einen teilweise resistenten Phenotyp zur Replikation von dl 434 auf.

Fig. 3(a-c) zeigt, daß menschliche IMR90-Diploid-Lungenfibroblasten differenziert durch Ad2 der Wildform, dl 1010 un ddl 1520 getötet wurden. Die 293-Zellinie dient als positiver Vergleich. Fig. 3(a) zeigt, daß Ad2 der Wildform die IMR90-Zellen wirksam mit MOI = 10 oder 100 tötete. Fig. 3(b) zeigt, daß sich dl 1010 in IMR90-Zellen beim höchsten untersuchten MOI nicht replizieren konnte, obwohl dl 1010 neoplastische Zellinien 293, U20S, HS700T und DLD-1 tötete, wie aus Fig. 2(d-e) ersichtlich. Fig. 3(c) zeigt, daß das dl 1520-Virus IMR90-Zellen nur bei einer MG! von 100 wirksam töten konnte; bei dieser hohen Virusdosierung kann die Möglichkeit, daß die Zellen nicht durch Replikation, sondern infolge einer Virusüberbelastung sterben, nicht ausgeschlossen werden.

Die in den Fig. 2(a-i) und 3(a-c) dargestellten Daten veranschaulichen demnach, daß rekombinante Adenovirusmutanten mit Replikationsdefizienz wie vorhergesagt dazu dienen können, neoplastische Zellen ohne p53- und/oder Rb-Funktion selektiv zu töten.


Anspruch[de]

1. Rekombinantes Virus mit Replikationsdefizienz, dem ein exprimiertes virales Onkoprotein fehlt, das zur Bindung eines funktionellen RB-Tumorsuppressor-Genprodukts fähig ist, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Therapie eines Säugetiers;

wobei die Behandlung oder Therapie die Ablation neoplastischer Zellen in einer Zellpopulation umfaßt, welche die neoplastischen Zellen und nicht-neoplastische Zellen umfaßt;

wobei die nicht-neoplastischen Zellen ein funktionelles RB-Tumorsuppressor- Genprodukt enthalten, das zur Bildung eines gebundenen Komplexes mit dem viralen Onkoprotein fähig ist, und den neoplastischen Zellen das funktionelle RB-Tumorsuppressor-Genprodukt fehlt.

2. Rekombinantes Virus mit Replikationsdefizienz zur Verwendung nach Anspruch 1, das ein Adenovirus oder ein Papillomavirus ist.

3. Rekombinantes Virus mit Replikationsdefizienz zur Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die neoplastischen Zellen p53(-)RB(-) sind.

4. Rekombinantes Virus mit Replikationsdefizienz zur Verwendung nach Anspruch 1, das ein Adenovirus ist, dem ein exprimiertes virales E1a-Onkoprotein fehlt, das zur Bindung eines funktionellen Tumorsuppressor-Genprodukts fähig ist.

5. Rekombinantes Adenovirus mit Replikationsdefizienz zur Verwendung nach Anspruch 4, worin das virale E1a-Onkoprotein eine inaktivierende Mutation in der CR1- Domäne an den Aminosäuren 30-85 in AdS, Nukleotidpositionen 697-790, und/oder der CR2-Domäne an den Aminosäuren 120-139 in Ad5, Nukleotidpositionen 920-967, aufweist.

6. Rekombinantes Adenovirus mit Replikationsdefizienz zur Verwendung nach Anspruch 4 oder 5, worin das Virus Adenovirus vom Typ 2 dl 312 oder Adenovirus vom Typ 5 NT dl 1010 ist.

7. Rekombinantes Virus mit Replikationsdefizienz zur Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Säugetier ein Mensch ist.

8. Rekombinantes Virus mit Replikationsdefizienz nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Adenovirus zur Bildung von infektiösen Virionen in der neoplastischen Zelle fähig ist, die sich in vivo in einem Patienten auf benachbarte Zellen ausbreiten und diese infizieren können.

9. Rekombinantes Virus mit Replikationsdefizienz zur Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, das nicht-replizierbar ist, um infektiöse Virione in nichtneoplastischen Zellen eines Menschen zu bilden.

10. Rekombinantes Virus mit Replikationsdefizienz zur Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, das weiters ein negatives Selektionsgen umfaßt, das mit einem viralen Promotor operabel verbunden ist.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein rekombinantes Virus mit Replikationsdefizienz, wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, die weiters ein Chemotherapeutikum umfaßt.

13. Verwendung eines rekombinanten Virus mit Replikationsdefizienz, dem ein exprimiertes virales Onkoprotein fehlt, das zur Bindung eines funktionellen RB-Tumorsuppressor-Genprodukts fähig ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Ablation neoplastischer Zellen in einer Zellpopulation, welche die neoplastischen Zellen und nicht-neoplastische Zellen enthält;

wobei die nicht-neoplastischen Zellen ein funktionelles RB-Tumorsuppressor- Genprodukt enthalten, das zur Bildung eines gebundenen Komplexes mit dem viralen Onkoprotein und den neoplastischen Zellen fähig ist, denen das funktionelle RB-Tumorsuppressor-Genprodukt fehlt.

14. Verwendung nach Anspruch 13, worin das rekombinante Virus mit Replikationsdefizienz wie in einem der Ansprüche 2 bis 10 definiert ist.

1 S. Verwendung nach Anspruch 13 oder 14, worin das Medikament weiters ein Chemotherapeutikum umfaßt.

16. Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 15 zur Behandlung von RB-negativem Krebs, der aus bronchogenem Karzinom, nasopharyngealem Karzinom, Kehlkopfkarzinom, Kleinzellen- und Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinom, Lungenadenokarzinom, Hepatokarzinom, Pankreaskarzinom, Blasenkarzinom, Darmkarzinom, Brustkarzinom, Zervixkarzinom, Eierstockkarzinom oder lymphozytischer Leukämie ausgewählt ist.

17. In vitro-Verfahren zur Ablation neoplastischer Zellen, denen ein funktionelles RB- Tumorsuppressor-Genprodukt fehlt, in einer Zellpopulation aus neoplastischen und nicht-neoplastischen Zellen, die RB-Tumorsuppressorfunktion aufweisen, wobei das Verfahren Folgendes umfaßt:

das Kontaktieren (1) eines rekombinanten Virus mit Replikationsdefizienz, dem ein exprimiertes virales Onkoprotein fehlt, das zur Bindung eines funktionellen RB-Tumorsuppressor-Genprodukts fähig ist, mit (2) einer Zellpopulation, welche die neoplastischen Zellen und nicht-neoplastische Zellen umfaßt, unter infektiösen Bedingungen, wodurch eine infizierte Zellpopulation erzeugt wird, so daß Ablation der neoplastischen Zellen erfolgt.

18. Verfahren nach Anspruch 17, worin das Virus wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert ist.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, worin die neoplastischen Zellen, denen RB-Suppressorfunktion fehlt, Krebszellen von einem bronchogenen Karzinom, nasopharyngealen Karzinom, Kehlkopfkarzinom, Kleinzellen- und Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinom, Lungenadenokarzinom, Hepatokarzinom, Pankreaskarzinom, Blasenkarzinom, Darmkarzinom, Brustkarzinom, Zervixkarzinom, Eierstockkarzinom oder lymphozytischer Leukämie sind.

20. In vitro-Verfahren zum Detektieren der Abwesenheit funktioneller Tumorsuppressor-Aktivität in einer Zellpopulation, umfassend:

das Kontaktieren der Zellpopulation mit einem rekombinanten Adenovirus mit Replikationsdefizienz, dem ein exprimiertes virales Onkoprotein fehlt, das zur Bindung eines funktionellen RB-Tumorsuppressor-Genprodukts fähig ist, unter infektiösen Bedingungen, und das Bestimmen der Anzahl oder des Anteils an Zellen mit einem Replikationsphenotyp in der Population.

21. Verfahren nach Anspruch 20, worin das Bestimmen das Messen der Fähigkeit von Zellen, Farbstoffe auszuschließen, ein markiertes Nukleotid in virale DNA einzubauen oder Virione zu bilden, umfaßt.

22. Verfahren zur Herstellung von Adenovirus, das nicht fähig ist, für ein funktionelles Onkoprotein zu kodieren, das sich an ein RB-Tumorsuppressor-Protein bindet, umfassend das Kontaktieren von Zellen, denen das Tumorsuppressor-Protein im wesentlichen fehlt, mit dem Adenovirus, wodurch die Zellen infiziert werden, und das Verstreichenlassen von genügend Zeit, damit sich die Virionen in den Zellen replizieren.

23. Verfahren nach Anspruch 22, worin das Adenovirus nicht fähig ist, für ein funktionelles Onkoprotein zu kodieren, für das eine E1a-Region von Adenovirus kodiert.







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