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Dokumentenidentifikation DE19953478A1 11.10.2001
Titel Ein Saccharomyces cerevisiae Hefewirtsstamm mit stabiler Integration und Expression der Nukleinsäuresequenz für den humanen erg Kaliumionen-Kanal
Anmelder Lichtenberg-Fraté, Hella, Dr., 53115 Bonn, DE;
Ludwig, Jost, Dr., 72074 Tübingen, DE
Erfinder Lichtenberg-Fraté, Hella, Dr., 53115 Bonn, DE;
Ludwig, Jost, Dr., 72074 Tübingen, DE
DE-Anmeldedatum 06.11.1999
DE-Aktenzeichen 19953478
Offenlegungstag 11.10.2001
Veröffentlichungstag im Patentblatt 11.10.2001
IPC-Hauptklasse C12N 1/19
IPC-Nebenklasse C12Q 1/00   C12N 15/81   
Zusammenfassung Gegenstand der Erfindung ist ein Saccharomyces cerevisiae Hefewirtsstamm, in dem die Nukleinsäuresequenz für den humanen erg Kaliumionen-Kanal (HERG) Gen stabil in das Hefegenom integriert und exprimiert ist. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Saccharomyces cerevisiae Hefewirtsstamm, in dem alle identifizierten Kaliumtranslokationssysteme spezifisch deletiert sind, das Verfahren zur stabilen Integration humaner heterologer Kaliumionen-Kanalproteine in diesen Saccharomyces cerevisiae Hefewirtsstamm sowie ein Verfahren zur Detektion spezifischer Modulatoren des HERG Kaliumionen-Kanals, einschließlich: a) die Behandlung des Saccharomyces cerevisiae Hefewirtsstamms, in dem die Nukleinsäuresequenz für den humanen erg Kaliumionen-Kanal (HERG) Gen stabil in das Hefegenom integriert und exprimiert ist, aber nicht die der Hefe Saccharomyces cerevisiae eigenen TRK1, TRK2 oder TOK1 Kaliumtranslokations-Systeme exprimiert sind, mit Testsubstanzen, b) Wachstumsbestimmungen in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz, und c) Messungen des Anstiegs oder der Abnahme des Kaliumtransportes dieses Stammes in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz Modulatoren von HERG Kaliumionen-Kanälen sind wertvolle pharmakologische Agentien mit möglicher therapeutischer anti-arrhythmischer und/oder anti-fibrillärer Anwendung.

Beschreibung[de]

Gegenstand der Erfindung ist ein Saccharomyces-cerevisiae-Hefewirtsstamm, in dem die Nukleinsäuresequenz für den humanen erg Kaliumionen-Kanal (HERG) Gen stabil in das Hefegenom integriert und exprimiert ist.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Saccharomyces-cerevisiae- Hefewirtsstamm, in dem alle identifizierten Kaliumtranslokations-systeme spezifisch deletiert sind, das Verfahren zur stabilen Integration humaner heterologer Kaliumionen-Kanalproteine in diesem Saccharomyces cerevisiae Hefewirtsstamm sowie ein Verfahren zur Detektion spezifischer Modulatoren des HERG Kaliumionen-Kanals, einschließlich:

  • a) die Behandlung des Saccharomyces cerevisiae Hefewirtsstamms, indem die Nukleinsäuresequenz für den humanen erg Kaliumionen-Kanal (HERG) Gen stabil in das Hefegenom integriert und exprimiert ist, aber nicht die der Hefe Saccharomyces cerevisiae eigenen TRK1, TRK2 oder TOK1 Kaliumtranslokations-Systeme exprimiert sind, mit Testsubstanzen,
  • b) Wachstumsbestimmungen in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz,
  • c) Messungen des Anstiegs oder der Abnahme des Kaliumtransportes dieses Stammes in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz.

Anwendungsgebiet

Identifizierung von Modulatoren von humanen Kaliumionen-Kanalgenen bzw. deren Proteinprodukten, die in genetisch bedingten Krankheiten involviert sind. Der Hefewirtsstamm ist die Basis eines pharmakologischen Durchmusterungssystems natürlicher und/oder chemischer Bibliotheken mit hohem Wirkungsgrad zum industriellen Einsatz.

Stand der Technik

Zellen der Hefe Saccharomyces cerevisiae exprimieren ein durch die Gene TRK1 und TRK2 kodiertes zweifach-affines Kaliumaufnahmesystem, wie beschrieben in:

  • - Rodriguez-Navarro & Ramos (1984). J. Bacteriol. 159: 940-945
  • - Ko & Gaber (1991). Mol. Cell. Biol. 11: 4266-4273
und einen durch das TOK1 Gen kodierten auswärts-gerichteten spannungsabhängigen Kaliumionen-Kanal für Kalium Efflux, wie beschrieben in:

  • - Ketchum, K.A., Joiner, W.J., Sellers, A.J., Kaczmarek, L.K. and Goldstein, S.A.N. (1995). Nature 376: 690-695.

Dieses Protein ist der einzige spannungsabhängige Kaliumionen-Kanal in der Plasmamembran von S. cerevisiae.

S.-cerevisiae-Hefestämme, die Mutationen in den Kaliumtransportproteinen TRK1 und TRK2 beinhalten, zeigen Wachstumsdefekte auf Medien mit niedrigen Kaliumionenkonzentrationen. Im Vergleich zum S. cerevisiae Wildstamm bedürfen diese mutanten Hefestämme eines Zusatzes von 10 mM Kalium im Medium. Die Komplementation dieses Kaliumaufnahmedefektes durch die Anwendung von Expressionsklonierungs- Strategien führte zur Isolierung und Klonierung verschiedener Kaliumtransport-Proteine aus Pflanzen wie beschrieben in:

  • - Anderson, J.A., Huprikar, S.S., Kochian, L.V., Lucas, W.J. and R.F. Gaber (1992). Proc. Natl. Acad. Science USA 89: 3736-3740;
  • - Sentenac, H., Bonneaud, N., Minet, M., Lacroute, F., Salmon, J-M., Gaymard, F. and Grignon, C. (1992). Science 256: 663-665
  • - Schachtman, D.P. and Schroeder, J.I. (1994). Nature 370: 655-658
sowie eines einwärtsgleichrichtenden Kaliumionen-Kanals (gpIRK) aus Meerschweinchen wie beschrieben in:

  • - Tang, W., Ruknudin, A., Yang, W-P., Shaw, S.-Y., Knickerbocker, A. and Kurtz, S. (1995). Mol. Biol. Cell 6: 1231-1240.

Saccharomyces cerevisiae Hefestämme, die Mutationen in den Kaliumtransportproteinen TRK1 und TRK2 beinhalten, verfügen jedoch noch über zusätzliche effektive Mechanismen zur Kaliumaufnahme, vermittelt durch den Kaliumionen-Kanal TOK1, wie kürzlich beschrieben wurde in:

  • - Fairman, C., Zhou, X. and Kung, C. (1999). J Membr. Biol. 168: 149-57.

Damit sind Saccharomyces cerevisiae Stämme, die nur Mutationen in den Genen TRK1 und TRK2 für Kaliumtransport beinhalten, für biotechnologische Zwecke (heterologe Expression von Kaliumionen-Kanal-Proteinen) nicht geeignet. Eine Vielzahl der Kaliumtransport-defekten Mutanten sind außerdem durch einfache Mutationen in haploiden Laborstämmen erzeugt worden. Saccharomyces cerevisiae Wildtyp Stämme sind diploide Organismen mit zweifachem Chromosomensatz. Die modifizierten Allele in haploiden Stämmen sind somit genetisch nicht stabil. Die Nachteile zur Verwendung solcher mutanten Hefewirtsstämme sind insbesondere:

  • - kein definierter genetischer Hintergrund,
  • - die phänotypische Selektion auf exprimierte heterologe Kaliumionen-Kanalgene ist unsicher, da
  • - die Expression heterologer Kaliumionen-Kanalgene das Wachstum der mutanten Hefewirtsstämme nur minimal und unter bestimmten Bedingungen beeinflusst, und
  • - somit die Durchmusterung pharmakologisch wirksamer Substanzen auf heterolog exprimierte Kaliumionen-Kanäle erschwert ist.

Ionenkanäle sind Transmembranproteine, die selektiv den Fluß bestimmter Ionen durch Membranen vermitteln. Unter den bisher bekannten Ionenkanälen stellen Kaliumionen-Kanäle die zahlreichste und heterogenste Gruppe dar. Sowohl in erregbaren als auch in nicht- erregbaren Zellen sind sie für die Aufrechterhaltung des Ruhepotentials verantwortlich. Die durch Kaliumionen-Kanäle vermittelten Auswärtsströme sind die Grundlage sowohl der Form und Frequenz als auch der Repolarisierung von Aktionspotentialen in erregbarem Gewebe. Kaliumionen-Kanäle sind ubiquitäre Membranproteine mit einer erstaunlichen Vielfalt elektrischer Eigenschaften. So gibt es Kaliumionen-Kanäle, die schnell inaktivieren (A-Typ- Kanäle), und solche, die Einwärtsströme (KIR-Kanäle) vermitteln. Die Funktionsvielfalt der Kaliumionen-Kanäle spiegelt sich ebensosehr in der Unterschiedlichkeit ihrer Struktur wieder. "Klassische" spannungsabhängige Kaliumionen-Kanäle der sogenannten Kv-Familie bestehen aus vier Untereinheiten, wobei für jede Untereinheit sechs Transmembranregionen und eine porenbildende Domäne postuliert werden, KIR Ionenkanaluntereinheiten der einwärtsgleichrichtenden Kaliumionen-Kanäle bestehen aus nur zwei Transmembran- und einer Porenregion. Erst kürzlich wurde mit dem S. cerevisiae TOK1 Kaliumionen-Kanal eine Gruppe von Kaliumionen-Kanälen gefunden, für die eine besonders unterschiedliche topologische Struktur durch duplizierte Porenregionen vorgeschlagen wurde, wie beschrieben in:

  • - Ketchum, K.A., Joiner, W.J., Sehers, A.J., Kaczmarek, L.K. and Goldstein, S.A.N. (1995). Nature 376: 690-695.

Während der letzten Jahre wurde in einer Reihe von Arbeiten eine wachsende Anzahl menschlicher Krankheiten als Resultat von Mutationen in für Kaliumionen-Kanäle kodierenden Genen gezeigt. So verursacht z. B. eine Punktmutation in Kv1.1 die Episodische Ataxie, wie beschrieben in:

  • - Adelmann, J.P., Bond, C.T., Pessia, M. and Mylie, J. (1995). Neuron 15: 1449-1454

Das LQT-Syndrom ist eine Krankheit, die die ventrikuläre Repolarisation betrifft. Eine verzögerte Repolarisation ventrikulärer Myocyten verursacht eine Verlängerung des QT- Intervalls im Elektrokardiogramm (EKG). Das LQT-Syndrom wird meist als autosomal dominante oder rezessive Krankheit vererbt. Wenn die ventrikulären Arrythmien zur Fibrillation degenerieren (Herzflimmern), kann plötzlicher Tod die Folge sein.

In diesem Zusammenhang ist die Rolle des humanen erg (human eag related gene, HERG) Kaliumionen-Kanals im Herzen von besonderem Interesse. In ventriculären Myocyten sind repolarisierende Kaliumströme, genannt "delayed rectifier", aktiv, die sich aus mehreren Komponenten zusammensetzen. Diese multiplen Komponenten werden anhand der Geschwindigkeit ihrer Aktivierung (schnell = rapid = IKr; langsam = slow = IKs) und ihrer unterschiedlichen Pharmakologie unterschieden. Die schnelle Komponente IKr wird durch Klasse-III-anti-arrythmische Agentien wie D-Solatol, Dofetilid und Clofilium blockiert. Die durch den HERG Kaliumionenkanal-Kanal vermittelten Ströme entsprechen der in isolierten Herzmuskelzellen gemessenen schnellen IKr Komponente des "delayed rectifier", wie beschrieben in:

  • - Lees-Miller, J.P., Kondo, C., and Wang, L. (1997). Circ. Res. 81: 719-723

HERG vermittelte Kaliumionenströme tragen zur Verkürzung der Aktionspotentiale bei schnellerer Herzschlagrate bei. Mutationen in HERG verursachen eine erbliche Form der polymorphen ventrikulären Arrhythmie (torsades des pointes), auch bekannt als LQT2- Syndrom, wie beschrieben in:

  • - Sanguinetti, M.C., Jiang, C., Curran, M.E., and Keating, M.T. (1995).Cell 81: 299-307
  • - Curran, M.E., Splaski, L, Timothy, K.W., Vincent, G.M., Green, E.D. and Keating, M.T. (1995). Cell 80: 795-803
  • - Keating, M.T. and Sanguinetti, M.C. (1996). Science 272: 681-685

Ein weiteres Syndrom (LQT 1) wird durch einen Defekt im Kv-LQT-1-Gen bedingt, wie beschrieben in:

  • - Wang, Q., M.E. Curran, I. Splawski, T.C. Burn, J. M. Millholland, T.J. VanRaay, J. Shen, K.W. Timothy, G.M. Vincent, T. de Jager, P.J. Schwartz, J.A. Toubin, A.J. Moss, D.L. Atkinson, G.M. Landes, T.D. Connors & M.T. Keating (1996). Nat Genet 12: 17-23

Der Verlust funktioneller auswärts-gleichrichtender KATP-Kanäle in den β-Zellen des Pankreas verursacht eine persistente Hypersekretion von Insulin, die Hyperglykämie, wie beschrieben in:

  • - Kane, C., Shepherd, R.M., Squires, P. E., Johnson, P.R.V., James, R.F.L., Milla, P.J., Aynsley-Green, A., Lindley, K.J., Dunne, M.J. (1996). Nature Medicine 2: 1344-1347.

Bei diesem Defekt der Glucose-Homeostase wurden erfolgreich "therapeutische" Kalium- Kanal-Öffner (KCOs), synthetische pharmakologische Moleküle, zur Behandlung eingesetzt, wie beschrieben in:

  • - Lawson, K. (1996). Clinical Science 91: 651-663
  • - Ashcroft, F.M. (1996). Nature Medicine 2: 1301-1302

Ströme durch spannungsabhängige Kaliumionen-Kanäle werden durch mehrere Substanzen moduliert und/oder blockiert, die entweder organische Salze oder tierische Toxine (Proteinderivate) sind, wie beschrieben in:

  • - Mosczydlowski, E., Lucchesi, K. and Ravindran, A. (1988) J. Membrane Biol. 105: 95-111
  • - Rudy, B. (1988). Neuroscience 25: 729-749
  • - Pongs, O. (1992). Physiological Rev. 72: 69-87
  • - Defarias, F.P., Stevens, S.P. and Leonard, R.D. (1995). Recept. and Channels 3: 273-281
  • - Gomez-Lagungs, F., Olamendi-Portugal, T., Zamudio, F.Z. and Oossani, L.D. (1996). J. Membrane Biol. 152: 49-56

Modulatoren von Kaliumionen-Kanälen sind daher wertvolle pharmakologische Agentien mit möglicher therapeutischer Anwendung. Hoch-selektive Blocker (Inhibitoren) sind nur für eine relativ begrenzte Anzahl von spannungsabhängigen Kaliumionen-Kanälen bekannt, Kalium- Kanal-Öffner (Aktivatoren) sind unbekannt. Zusätzliche Substanzen sind zur möglichen therapeutischen Anwendung bei erworbenen oder vererbten Krankheiten durch Mutationen in Kaliumionen-Kanälen wie z. B. in HERG notwendig. Neue Substanzen werden üblicherweise in Säugerzellinien getestet, die fremde Kaliumionen-Kanal Gene exprimieren. Jedoch ist dieses Verfahren durch das Vorhandensein endogener Kanäle in den verwendeten Zellinien erschwert, und für biotechnologische Zwecke (homologe und heterologe Expression von Kaliumionen-Kanälen) verständlicherweise nur eingeschränkt geeignet. Die Nachteile zur Verwendung tierischer Zellinien sind insbesondere:

  • - die Kultivierung tierischer Zellinien ist wesentlich komplizierter, finanziell aufwendig sowie kontaminationsanfällig.
  • - Homolog und/oder heterolog exprimierte Kaliumionen-Kanäle beeinflussen das Wachstum tierischer Zellinien nicht,
  • - Das Vorhandensein endogener Kaliumionen-Kanäle erschwert die Auswertung der experimentellen Daten.

Ein alternativer Ansatz zur Verwendung tierischer Zellinien ist die Entwicklung von Hefestämmen, die Kaliumionen-Kanäle aus Säugern, insbesondere dem Menschen, funktionell exprimieren.

Traditionell werden die meisten pharmakologisch wirksamen Substanzen durch Massen- Durchmusterung chemischer oder natürlicher Banken entdeckt. Dabei wurden "screening"- Programme in Hinsicht auf die Empfindlichkeit mit der das aktive Material identifiziert werden kann, die Anzahl der Proben, die getestet werden können sowie verschiedene Typen molekularer Ziele und deren erkennbare zelluläre Funktionen optimiert.

Basierend auf der Anwendung von Hefegenetik und Molekularbiologie konnten während des letzten Jahrzehnts verschiedene, diesen Kriterien entsprechende Testsysteme entwickelt werden. So sind z. B. Hefe-Testsysteme mit G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, wie beschrieben in:

  • - King, K., Dohlmann, H.G., Thorner, J., Caron, M.G., and Lefkowitz, R.J. (1990).
  • - Science 250: 121-123
zytoplasmatischen Rezeptoren, wie beschrieben in:

  • - Metzger, D., White, J.H., and Chambon, P. (1988). Nature 334: 31-36
  • - Schena, M., Yamamoto, K.R. (1988). Science 251: 965-967
eines humanen Ionen-Kanals (VDAC), wie beschrieben in:

  • - Blachly-Dyson, E., Brygida Zambronicz, E., Hong Yu, W., Adams, V., McCabe, E.R.B., Adelman, J., Colombini, M., and Forte, M. (1993). J. Bio. Chem. 268: 1835-1841
immunsuppressiven Agentien, wie beschrieben in:

  • - Foor, F., Parent, S.A., Morin, N., Dahl, A.M., Ramadan, N., Cherbet, G., Bostian, K.A. and Nielsen J.B. (1992). Nature 360: 682-684
Sterol-Biosynthese Enzymen, wie beschrieben in:

  • - Basson, M.E., Thorsness, M. Finer-Moore, J., Stroud, R.M., and Rine, J. (1988). Mol. Cell. Biol. 8: 3797-3808
Onkogenen, wie beschrieben in:

  • - Broach, J.R. (1991). Trends Genet. 7: 28-33,
und Proteine für "multiple drug resistance", wie beschrieben in:

  • - Raymond, M., Gros, P., Whiteway, M., and Thomas, D.Y. (1992). Science 256: 232-234
entwickelt worden. Die hohe Homologie essentieller zellulärer Vorgänge in Hefe und Zellen höherer Eukaryonten eröffnet weitreichende Möglichkeiten der Verwendung von Hefe als Expressionssystem zur Untersuchung heterolog exprimierter Kaliumionen-Kanal Proteine. Diese rekombinanten Kaliumionen-Kanal Proteine können für folgende Untersuchungen verwendet werden:

  • - Entdeckung von auf Säuger-Zellen wirksamen Substanzen (Durchmusterungs-Tests),
  • - Anwendung als Biotherapeutika und als
  • - Substrate zur gezielten Medikament Entwicklung.

Aufgabenstellung/Ziel

Die Aufgabe und das Ziel der vorliegenden Erfindung war es, die o. g. Nachteile zu vermeiden und einen genetisch definierten (isogenen) Saccharomyces cerevisiae Hefewirtsstamm zu entwickeln, in dem alle beschriebenen hefe-eigenen Gene für Transport- und Kanalproteine spezifisch deletiert sind und in dem der humane Kaliumionen-Kanal erg (HERG) stabil in das Hefegenom integriert und exprimiert ist.

In der Biotechnologie besteht ein Bedarf an gut wachsenden, genetisch definierten Hefestämmen für die heterologe Expression von in menschlichen Krankheiten involvierten, Kaliumionen transportierenden Kaliumionen-Kanal Genen für pharmakologische Zwecke. Die biotechnologische Verwendbarkeit stabil Kaliumionen-Kanal Gene exprimierender, gut wachsender Hefestämme besteht in der funktionellen und pharmakologischen Analyse der heterologen Kaliumionen-Kanal Zielproteine:

erstens können Hefen in auf Wachstum basierenden Testreihen für Durchmusterungen vieler verschiedener Substanzbibliotheken in sehr kleinem Maßstab und mit hohem Wirkungsgrad ("screening"-Verfahren in Mikrotiterschalen) und

zweitens, als rekombinantes System zur Analyse und Bestätigung therapeutisch wirksamer Substanzen auf Zielproteine humanen Ursprungs verwendet werden und

drittens, die Anwendung als Biotherapeutika und als Substrate zur gezielten Medikament Entwicklung.

Diese Aufgabe wird gelöst durch einen genetisch modifizierten isogenen Saccharomyces- cerevisiae-Hefewirtsstamm mit Deletionen in den TRK1, TRK2 und TOK1 Genen, die zur Kaliumaufnahme notwendig sind, erhältlich durch die Einführung eines oder mehrerer selektiver Marker (Auxotrophie und/oder Resistenzen), nachfolgender Kreuzung zum Erhalt isogener Stämme und Auswahl derjenigen Stämme, welche nach Transformation und stabiler Integration des Plasmids p679pma1HERG in das Hefegenom und Anzucht in Kulturmedien mit limitierter Kaliumkonzentration von 10 mg/l oder weniger wachsen.

Zum Erhalt des trk1trk2tok1 dreifach mutanten Saccharomyces cerevisiae Hefewirtsstammes können die Gene für beide Kaliumtransportproteine (TRK1, TRK2) und das Gen für den Kaliumionen-Kanal (TOK1) durch Einführung eines oder mehrerer selektiver Marker (Auxotrophie und/oder Resistenzen) deletiert und/oder disruptiert werden.

Die selektierbaren biosynthetischen Markergene (Auxotrophiebedürfnisse und/oder Resistenzen) können durch rekombinante DNS-Techniken in die Loci der Wildtyp- Kaliumtransportergene eingeführt werden. Geeignete selektierbare Marker sind z. B. die Auxotrophiemarker URA3 und LEU2 oder Gene, die eine Resistenz z. B. gegen G418 (Aminoglycosid Phosphotransferase Gen) bewirken. Solche modifizierten Allele können dann in Saccharomyces cerevisiae transformiert werden, wo sie durch homologe Rekombination die Wildtyp-Loci ersetzen. Die Stämme mit modifizierten Allelen können durch Selektion auf den oder die biosynthetischen Marker ermittelt werden.

Die in die Loci der Kaliumtranslokations-Systeme eingeführten selektierbaren biosynthetischen Marker stellen außerdem einen einfachen Weg zum Transfer dieser Mutationen in genetisch andere Linien dar (Kreuzung). Ein Stamm, der eine Mutation in einem der Kaliumtranslokationsgene (z. B. TRK1 oder TRK2 oder TOK1) beinhaltet, kann mit einem Stamm des entgegengesetzten Paarungstyps, der eine Mutation in einem anderen Kaliumtranslokationsgen (z. B. TRK2 oder TRK1 oder TOK1) trägt, zu Diploiden gekreuzt werden. Durch anschließende Sporulation zu Haploiden (Tetradenanalyse) kann die isogene Nachkommenschaft dann auf die Anwesenheit der biosynthetischen Marker hin selektiert werden. Der trk1trk2tok1 dreifach-mutante Saccharomyces-cerevisiae-Phänotyp kann durch Wachstumstests auf selektiven Kulturmedien mit Kaliumkonzentrationen von 10 mM oder weniger ermittelt werden.

Ein erfindungsgemäßer Hefestamm kann durch einen Test ermittelt werden, bei dem analysiert wird, ob das zu prüfende exprimierte Gen den trk1trk2tok1 dreifach mutanten Saccharomyces cerevisiae Phänotyp komplementiert. Dazu wird der zu prüfende Stamm durch Wachstumstests auf selektiven Kulturmedien mit Kaliumkonzentrationen von 10 mM oder weniger inkubiert.

Der Wachstumsdefekt des trk1trk2tok1 dreifach mutanten Saccharomyces cerevisiae Hefewirtsstamms kann zur Isolierung und Anreicherung von Kaliumionen-Kanalgenen aus Genbibliotheken (z. B. humane cDNS-Bibliotheken) verwendet werden, wenn die exprimierten Gene die Mutationen in dem dreifach mutanten Hefewirtsstamm komplementieren und ein Wildtypphänotyp hinsichtlich der benötigten Kaliumkonzentration resultiert. Damit können Kaliumionen-Kanäle identifiziert werden, die zwar physiologisch beschrieben, aber bisher noch nicht isoliert wurden. Alternativ können verschiedene Kaliumionen-Kanäle in die Dreifach-Mutante eingeführt werden, um zu testen, ob der Wachstumsdefekt auf Kalium limitierten Medien komplementiert wird. Heterologe Proteine werden dadurch erhalten, daß der erfindungsgemäße Saccharomyces cerevisiae Hefewirtsstamm mit einer rekombinanten DNS transformiert werden, welche das Gen des zu exprimierenden Kaliumionen-Kanals enthält. Der Saccharomyces cerevisiae Wildtypphänotyp kann durch Auswahl derjenigen Stämme, welche nach Transformation, Selektion und nach Anzucht unter Bedingungen von 10 mg/l Kalium im Kulturmedium ermittelt werden.

Jede dieser Anwendungen resultiert in einem Hefestamm, der heterolog einen fremden Kaliumionen-Kanal exprimiert und zur Durchmusterung von Modulatoren des betreffenden Kaliumionen-Kanals verwendet werden kann. Ein Hefestamm, der heterolog einen fremden Kaliumionen-Kanal exprimiert, kann in einfachen Verfahren zur Durchmusterung verschiedener Testsubstanz-Bibliotheken (chemische und natürliche Substanz-Bibliotheken) verwendet werden. Diese einfachen Verfahren, in denen Wachstumsveränderungen oder gesteigerte und/oder verminderte Kaliumaufnahme durch Agarplattentests und/oder in Flüssigkultur beobachtet werden kann, können somit spezifisch wirksame Substanzen detektieren, die die Kaliumionen-Kanal-Funktion modulieren. Zur Durchmusterung auf Aktivatoren einer Kaliumionen-Kanal-Funktion kann das Durchmusterungsverfahren solche Veränderungen wie metabolische Aktivität, gesteigerte Wachstumsrate oder gesteigerte Aufnahme von Kaliumionen beinhalten. Zur Durchmusterung auf Inhibitoren einer Kaliumionen-Kanal-Funktion kann das Durchmusterungsverfahren solche Veränderungen wie verminderte Wachstumsrate oder verminderte Kaliumionen-Aufnahme beinhalten. Die Testsubstanzen, die im Verfahren zur Detektion spezifischer Modulatoren eingesetzt werden, können z. B. synthetische oder natürliche Produkte sein. Natürliche Produkte beinhalten pflanzliche, tierische oder mikrobielle Extrakte.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Detektion spezifischer Modulatoren des exprimierten HERG Kaliumionen-Kanals, einschließlich:

  • a) Die Behandlung des Saccharomyces cerevisiae Hefewirtsstamms, der die Nukleinsäuresequenz für den humanen erg Kaliumionen-Kanal (HERG), aber nicht die der Hefe eigenen Kaliumtranslokations-Systeme TRK1, TRK2 und TOK1 exprimiert, mit Testsubstanzen,
  • b) Wachstumsbestimmungen in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz,
  • c) Messungen des Anstiegs oder der Abnahme des Kaliumtransportes derjenigen Stämme in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz.

Dieses Verfahren ist zur Identifizierung spezifischer Modulatoren des HERG-Ionenkanals geeignet.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiele Allgemeine Methoden Rekombinante DNA-Technik

Zur Anreicherung und Manipulation von DNS wurden Standardmethoden benutzt, wie sie bei Sambrook, J. et al., In: Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989), beschrieben sind. Die verwendeten molekularbiologischen Reagenzien wurden nach den Angaben der Hersteller eingesetzt.

Hefetransformation

Saccharomyces cerevisiae Stämme wurden entsprechend der Lithium-Acetat-Methode, wie sie von Rothstein, R. (1991) in Methods in Enzymology 194: 281-302, beschrieben sind, transformiert.

Hefegenetische Methoden

Saccharomyces cerevisiae Stämme wurden entsprechend der bei Sherman, F. et al. (Methods in Yeast Genetics: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1981) beschriebenen Methode gekreuzt und diploide Stämme durch Mikromanipulation isoliert.

Beispiel 1 Isolierung des isogenen Saccharomyces-cerevisiae-Hefewirtsstammes mit defektem Kaliumtransport 1.1 Einführung der biosynthetischen Marker

Prinzip: Zum Erhalt der spezifischen Gendisruptionen wurde die Technik der flankierenden Homologien-PCR ("Polymerase Chain Reaction") angewendet, in der die kodierende Region (offener Leserahmen) eines Gens durch die Nukleinsäuresequenz für die Aminoglycosid-Phosphotransferase (lox-kanMX-lox; kanR Resistenzmarker) ersetzt wird, die eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Geneticin (G418, Kanamycinsulfat) vermittelt, wie beschrieben in Güldener, U., Heck, S., Fiedler, T., Beinhauer, J. and Hegemann, J. (1996). Nucleic Acid Research 24: 2519-2524.

Ein Saccharomyces cerevisiae Hefestamm JRY379, beschrieben in Reid, J.D., Lukas, W., Shafaatian, R., Bertl, A., Scheuermann-Kettner, C., Guy, H.R. and North, R.A. (1996). Receptors and Channels 4: 51-61, wurde im ersten Schritt mit dem Plasmid pGAL-HO, beschrieben in Rothstein (1991), zum Erhalt des entgegengesetzten Paarungstyps im resultierenden Stamm HLY38 (siehe auch Fig. 3) transformiert.

Durch "polymerase chain reaction" (PCR)-Technik wurde das Strukturgen der Aminoglycosid-Phosphotransferase im Plasmid pUG6, (kanR beschrieben in Güldener, U., Heck, S., Fiedler, T., Beinhauer, J. and Hegemann, J. (1996). Nucleic Acid Research 24: 2519-2524) mit Oligonukleotid-Primern, die jeweils 20-22 homologe Basen zur Sequenz des Aminoglycosid-Phosphotransferase-Gens (kanR) im Plasmid pUG6, und anschließende 40 flankierende Basen zu den 5' stromaufwärts des START-Codons und 3' stromabwärts des STOP-Codons gelegenen Regionen der zu disruptierenden Gene TRK1, TRK2 und TOK1 beinhalten, amplifiziert. Unter Verwendung der Oligonukleotidpaare (siehe auch Fig. 2)



(SEQ. ID. NO. 1)/(SEQ. ID. NO. 2),



TRK1-sense: 5' GAA GGA GGG TAT TCT ATT GGC TCT CAA GGA AGT CAT TCC TGC TGA AGC TTC GTA CGC TGC 3'

TRK1-antisense 5' ACG TAG GCA AAT GTA TAT CAC AAT GTT ACT AAT CAA GGT TGC ATA GGC CAC TAG TGG ATC TG 3'



(SEQ. ID. NO. 3)/(SEQ. ID. NO. 4),



TRK2-sense: 5' CCC CTC GGC CGT GCG GCT GAA AAA GAG AAA TGA TAT TGG AGC TGA AGC TTC GTA CGC TGC 3'

TRK2-antisense: 5' AAT TAC GTT GGC TCT TAT GTA GGT AAA GAG GGG TAA ACT TGC ATA GGC CAC TAG TGG ATC TG 3'



und (SEQ. ID. NO. 5)/(SEQ. ID. NO. 6)



TOK1-sense: 5' GGT TCC GGG ACG AAA GAG IITA GTA TTA IFFA ATG CCA GCT GAA GCT TCG TAC GC 3'

TOK1-antisense: 5' AGC TCT TCG TCT TCT ACT AGA TTA CCA ACT AAG CAT AGG CCA CTA GTG GAT CTG 3'



und dem Plasmid pUG6 als Matrizen-DNS wurden die entsprechenden Disruptionskonstrukte trk1 d51:: lox-kanMX lox, trk2Δ50::lox-kanMX-lox und tok1Δ50::lox-kanMX-lox generiert. In Fig. 1 ist eine schematische Darstellung der genomischen Fragmente, die die Saccharomyces cerevisiae Wildtyp TRK1, TRK2 und TOKI Loci enthalten sowie die entsprechenden mutierten Allele trk1::Δ51lox-kanMX, trk2Δ50::lox-kanMX und tok1Δ1::lox-kanMX dargestellt (zur Verdeutlichung ist das kanR-Gen ist nicht maßstabsgerecht dargestellt, die Größe diese Gens beträgt 1.0 kb). Die TRK1, TRK2 und TOK1 kodierenden Regionen sind durch schwarze Balken gekennzeichnet. Die mutanten Allele wurden zum Ersatz der entsprechenden Wildtyp Loci in Saccharomyces cerevisiae Stämme transformiert. Die zur Konstruktion der mutierten Allele verwendeten Oligonukleotide TRK1-sense (SEQ. ID. NO. 1), TRK1-antisense (SEQ. ID. NO. 2), TRK2-sense (SEQ. ID. NO. 3), TRK2-antisense (SEQ. ID. NO. 4), TOK1-sense (SEQ. ID. NO. 5) und TOK1-antisense (SEQ. ID. NO. 6) sind als gefüllte Pfeile dargestellt. Diese drei Deletionskassetten enthalten das Aminoglycosid- Phosphotransferase-Strukturgen, beidseitig flankiert von den 34 Basenpaare langen loxP "direct repeats" und flankiert von ca. 40 homologen Basenpaaren zu den 5' stromaufwärts des START-Codons und 3' stromabwärts des STOP-Codons gelegenen Regionen der zu disruptierenden Gene TRK1, TRK2 und TOK1 (Fig. 1).

1.2 Selektion von Mutanten auf G418-Resistenz

Der Stamm JRY379, beschrieben in Reid, J.D., Lukas, W., Shafaatian, R., Bertl, A., Scheuermann-Kettner, C., Guy, H.R. and North, R.A. (1996). Receptors and Channels 4: 51-61, wurde separat mit jeder der PCR generierten Deletionskassetten transformiert und transformierte Hefekolonien auf Kulturmedien mit dem Antibiotikum G418 (200 µg/ml, Kanamycinsulfat) selektioniert, wie beschrieben von Güldener, U., Heck, 5., Fiedler, T., Beinhauer, J. and Hegemann, J. (1996). Nucleic Acid Research 24: 2519-2524.

Die Hefestämme HLY39 und HLY40 (siehe auch Fig. 3) haben die vollständigen kodierenden Regionen der Gene TRK1, TRK2 durch das lox-kanMX-lox Modul (Aminoglycosid-Phosphotransferase-Gen; kanR) ersetzt (siehe auch Fig. 5A, 5B für TRK1 und 6A, 6B für TRK2).

In dem Hefestamm HLY41 (siehe auch Fig. 3) ist das TOK1-Gen nicht vollständig durch das lox-kanMX-lox-Modul (Aminoglycosid Phosphotransferase Gen; kanR) ersetzt: von der kodierenden Region verbleiben nach Disruption 223 Nukleotide der 5' kodierenden Region und 88 Nukleotide der 3' kodierenden Sequenz (siehe auch Fig. 7A und 7B). Aus G418 resistenten Kolonien wurde genomische DNS nach Standardmethoden (Rothstein, 1991) isoliert.

1.3 Charakterisierung der positiven Stämme durch PCR

Die korrekte Integration der trk1Δ51::lox-kanMX-lox, trk2Δ50::lox-kanMX-lox und tok1Δ50::lox-kanMX-lox Deletionskassetten am jeweiligen chromosomalen TRK1, TRK2 und TOK1 Locus der Hefestämme HLY39, HLY40 und HLY41 wurde mit PCR-Reaktionen nachgewiesen. Als Matrize wurde die jeweils aus den Hefestämmen HLY39, HLY40 und HLY41 isolierte genomische DNS eingesetzt sowie die Oligonukleotide (siehe auch Fig. 2),



(SEQ. ID. NO. 7),



TRK1-START: 5' CGT TCG GGG CTG ACA ACG CA3'



(SEQ. ID. NO. 8),



TRK2-START: 5' CCC GTC CAT TGA GTG CCC GT 3'



und (SEQ. ID. NO. 9)



TOK1-START: 5' CGC ATT CGC GTC TCG IJTA CC 3'



als 5' sense-Startmoleküle gegen das 3' antisense-Startmolekül (SEQ. ID. NO. 10),

KAN-antisense: 5' CCT CAG TGG CAA ATC CTA AC 3'

welches 358 Basenpaare innerhalb der für die Aminoglycosid Phosphotransferase kodierenden Region (kanR, lox-kanMX-lox-Modul) in Plasmid pUG6 liegt.

Ergebnis

Die Hefestämme HLY39, HLY40 und HLY41 enthalten die trk1Δ51::lox-kanMX-lox, trk2Δ50::lox-kanMX-lox und tok1Δ50::lox-kanMX-lox-Module am korrekten chromosomalen Locus der entsprechenden Gene TRK1, TRK2 und TOK1.

1.4 Excision des biosynthetischen Marker-Gens für 6418-Resistenz

Die isolierten Stämme HLY39 (trk1Δ51::lox-kanMX-lox), HLY40 (trk2Δ50::lox-kanMX-lox) und HLY41 (tok1Δ50::lox-kanMX-lox) (Fig. 3) wurden separat mit dem Plasmid pSH47, welches die Nukleinsäuresequenz für die Cre-loxP-Rekombinase unter Kontrolle des GAL1 Promotors, wie beschrieben in Güldener, U., Heck, S., Fiedler, T., Beinhauer, J. and Hegemann, J. (1996). Nucleic Acid Research 24: 2519-2524, enthält, transformiert. Transformierte Hefekolonien wurden auf Kulturmedien mit Galaktose zur Induktion des Promotors für die Cre-loxP Rekombinase angezogen und aus Einzelzellen stammende Kolonien mit Sensitivität gegenüber 6418 (Kanamycinsulfat) isoliert. In diesen Hefestämmen war die lox-kanMX-lox Kassette durch die Aktivität der pSH47 Plasmid kodierten Cre-loxP Rekombinase jeweils spezifisch ausgeschnitten.

1.5 Isolierung von nicht-plasmid-haltigen Mutanten

Um das Plasmid pSH47 aus diesen Hefestämmen zu entfernen, wurden die 6418 sensitiven Hefestämme auf Kulturmedien mit 5-Fluoro-Orotinsäure (5FOA), wie beschrieben in Rothstein, R. (1991), angezogen. SFOA resistente, aus Einzellen stammende Kolonien wurden isoliert und angezogen, die isolierten Hefestämme (siehe auch Fig. 3) HLY42 (trk1Δ51), HLY43 (trk2Δ50) und HLY44 (tok1Δd50) beinhalten die unmarkierten Mutationen. In Fig. 5 ist die abgeleitete Aminosäure- (SEQ. ID. NO. 11; 5A) und die Nukleinsäuresequenz (SEQ. ID. NO. 12; 5B) des Saccharomyces cerevisiae Kaliumtransportproteins TRK1 dargestellt. Die durch Unterstrich hervorgehobenen Regionen entsprechen der deletierten Sequenz. In der Nukleinsäuresequenz sind die START- und STOP- Codons durch Fettdruck und die verwendeten Oligonukleotide durch Kursivdruck angezeigt. In Fig. 6 ist die abgeleitete Aminosäure- (SEQ. a. NO. 13; 6A) und die Nukleinsäuresequenz (SEQ. ID. NO. 14; 6B) des Saccharomyces cerevisiae Kaliumtransportproteins TRK2 dargestellt. Die durch Unterstrich hervorgehobenen Regionen entsprechen der deletierten Sequenz. In der Nukleinsäuresequenz sind die START und STOP Codons durch Fettdruck und die verwendeten Oligonukleotide durch Kursivdruck angezeigt. In Fig. 7 ist die abgeleitete Aminosäure- (SEQ. ID. NO. 15; 7A) und die Nukleinsäure-sequenz (SEQ. ID. NO. 16; 7B) des Saccharomyces cerevisiae Kaliumionen-Kanalproteins TOK1 dargestellt. Die durch Unterstrich hervorgehobenen Regionen entsprechen der deletierten Sequenz. In der Nukleinsäuresequenz sind die START und STOP Codons durch Fettdruck und die verwendeten Oligonukleotide benannt und durch Kursivdruck angezeigt.

1.6 Isolierung der Kaliumtransport-defekten Dreifach-Mutante

Zur Isolierung des trk1trk2tok1 dreifach mutanten Saccharomyces cerevisiae Stammes und parallelem Erhalt der durch Transformation komplementierbaren Auxotrophien wurden die konstruierten Hefestämme entsprechend der bei Sherman, F. et al. (Methods in Yeast Genetics: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1981) beschriebenen Methode gekreuzt und diploide Stämme durch Mikromanipulation isoliert. Anschließend wurden die diploiden Stämme sporuliert und Segreganten mit den gewünschten Kaliumtrasnportdefekten isoliert.

Dazu wurde der Stamm HLY38 (MATα his3-Δ200 leu2-3, 112 trp1-Δ901 urα3-52 suc2- Δ9) und der Stamm HLY42 (MATα his3-Δ200 leu2-3, 112 trp1-Δ901 urα3-52 suc2-Δ9 trk1Δ51) gekreuzt, der resultierende diploide Stamm sporuliert und Tetraden auf Kulturmedien mit 50 mM KCl vereinzelt. Da das TRK1-Gen für den hoch-affinen Kaliumtransporter in S. cerevisiae kodiert, sollte der trk1 mutante Hefestamm ein Wachstumsbedüfnis für Kalium haben. Das eingekreuzte mutante trk1Δ51 Allel segregierte wie erwartet 2+ : 2-, wobei trk1 mutante Hefestämme aufgrund des schlechten Wachstums auf Kulturmedien mit nur 100 µM Kalium überprüft wurden.

Ein aus den resultierenden trk1Δ51 Sporen angezogener Hefestamm (HLY45) mit MATα Paarungstyp wurde mit dem Stamm HLY43 (MATα his3-Δ200 leu2-3, 112 trp1-Δ901 urα3-52 suc2-Δ9 trk2Δ50) gekreuzt, der diploide Stamm sporuliert und Tetraden auf Kulturmedien mit 50 mM KCl vereinzelt. Der diploide Hefestamm mit jeweils einem nicht mutierten Allel der Kaliumtransporter TRK1 und TRK2 wuchs auf allen getesteten Medien. Dieses Wachstum wurde zur Überprüfung der rezessiven Mutationen eingesetzt. Rezessive Mutationen sind für die Komplementation mit heterologen Genen notwendig. Nach Sporulation und Tetradenanalyse zum Erhalt der Haploiden segregierte der Kaliumaufnahme defekte Phänotyp wie erwartet für zwei nicht verbundene Gene. Drei Phänotypen wurden in Bezug auf Kaliumbedüfnisse aus dieser Kreuzung entsprechend der vier Genotypen erwartet und beobachtet: Wildtyp ohne Defekt in den TRK1, TRK2 Allelen, trk1TRK2 Mutante mit schlechtem Wachstum auf 100 µM Kalium, trk2TRK1 Mutante mit gleichem Phänotyp und trk1 trk2 Mutante mit sehr schlechtem Wachstum auf 100 µM Kalium. Der trk1 trk2 Phänotyp konnte durch Wachstum auf Kulturmedien mit 10 mM Kalium unterdrückt werden.

Ein trk1 trk2 doppelt mutanter Hefestamm HLY46 (trk1Δ51 trk2Δ50) mit MATα Paarungstyp wurde aus einer der resultierenden Sporen angezogen und mit dem Stamm HLY44 (MATα his3-Δ200 leu2-3,112 trp1-Δ901 urα3-52 suc2-Δ9 tok1Δ50) gekreuzt, der diploide Stamm sporuliert und Tetraden auf Kulturmedien mit 50 mM KCl vereinzelt. Der diploide Hefestamm mit jeweils einem nicht mutierten Allel der Kaliumtransporter TRK1, TRK2 und TOK1 wuchs auf allen getesteten Medien. Dieses Wachstum wurde zur Überprüfung der rezessiven Mutationen eingesetzt. Rezessive Mutationen sind für die Komplementation mit heterologen Genen notwendig. Nach Sporulation und Tetradenanalyse zum Erhalt der Haploiden segregierten die drei Deletions-Allele 2+ : 2-. Wie erwartet wurde ein Verbund von trk1Δ51 und tok1Δ50 beobachtet: diese Gene liegen ca. 26 cM voneinander entfernt auf Chromosom X (46 parentaler Dityp, 1 nicht-parentaler Dityp und 48 Tetratypen). In dem trk1trk2tok1 dreifach mutanten Saccharomyces cerevisiae Hefestamm HLY47 (trk1Δ51 trk2Δ50 tok1Δ50) sind alle bisher beschriebenen hefe-eigenen Transport- und Kanalproteine TRK1, TRK2 und TOK1 spezifisch deletiert (siehe auch Fig. 3). Der Phänotyp dieses Stammes ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Wachstum nur auf Kulturmedien mit mindestens 50 mM Kalium erfolgt.

Beispiel 2 Konstruktion des HERG-Integrationsplasmids 2.1 Konstruktion des Plasmids p679/HERG

Das Gen für den humanen erg Kaliumionen-Kanal (HERG) wurde durch Spaltung mit den Restriktionsendonukleasen Bam HI und XbaI als 3.9 Kilobasenpaar (kb) Fragment aus dem Plasmid pcDNAHERG (erhalten von Dr. G. Robertson, University of Wisonsin, Madison, USA) und Auftrennung durch Agarosegelelektrophorese erhalten.

Zur Transkription eines humanen Gens in der Hefe Saccharomyces cerevisiae wurde der hefe-eigene Promotor der Plasmamembran ATPase PMA1 verwendet. Der in Saccharomyces cerevisiae konstitutiv aktive pmal-Promotor wurde als Eco RI/Bam HI 0.9 kb Fragment aus dem Plasmid pRS408 (erhalten von Dr. A. Goffeau, Universite Catholique de Louvain-1a- Neuve, Belgien) nach Auftrennung durch Agarosegelelektrophorese isoliert.

In einer Dreifach-Ligation wurden die 0.9 kb pma1 Eco RI/Bam HI und 3.9 kb HERG Bam HI XbaI Fragmente mit dem Eco RI/Xbal gespaltenen Plasmidvektor pUC 18 ligiert. Das erhaltene Plasmid pmalHerg wurde durch Restriktionskartierung und Sequenzierung bestätigt. Aus diesem Plasmid wurde das 4.8 kb pma1Herg-Verbundfragment durch Spaltung mit den Restriktionsendonukleasen Eco RI/Sal I und nach Auftrennung durch Agarosegelelektrophorese erhalten.

In der folgenden Plasmidkonstruktion wurde das Plasmid p679 (erhalten von Dr. P. Ljungdahl, Ludwig Institute of Cancer Research, Stockholm, Schweden) mit den Restriktionsendonukleasen Eco RI/Sal I gespalten. Dieser lineare Vektor wurde mit dem 4.9 kb pma1Herg Verbundfragment ligiert. Das gewünschte Plasmid wurde durch Restriktionskartierung identifiziert. In Fig. 4 ist eine schematische Darstellung des Plasmidkonstruktes welches zur Expression des humanen erg Kaliumionen-Kanals verwendet wurde dargestellt. Mithilfe des Vektors p679pma1HERG wurde das humane erg-Gen stabil in den Genlocus für den biosynthetischen Marker LEU2 des Saccharomyces cerevisiae Hefewirtsstamms integriert. Die pmal (Saccharomyces cerevisiae Plasmamembran ATPase) Promotorsequenz ist als schraffierter Pfeil dargestellt und die Nukleinsäuresequenz für den humanen erg-Kaliumionen-Kanal (HERG) als gefüllte Box.

Beispiel 3 Konstruktion des HERG-integrierten Hefewirtsstammes 3.1 Konstruktion des HERG-exprimierenden Saccharomyces-cerevisiae-Stammes

In dem Plasmid p679pma1HERG (siehe 2.1, Fig. 4) sind zur gerichteten homologen Rekombination des klonierten Inserts am chromosomalen Locus des LEU2 Gens in Saccharomyces cerevisiae 5' und 3' flankierende Regionen des LEU2 Gens inseriert. Zur gerichteten Integration des Gesamtplasmids einschließlich des 4.9 kb pmalHerg Verbundfragments am chromosomalen Locus des LEU2 Gens wurde mit der Restriktionsendonuklease Not I eine Linearisierung des Plasmids p679pma1HERG an Position 2189, zwischen den flankierenden LEU2 Regionen eingeführt.

Das erhaltene lineare 9.1 Not I Fragment wurde nach Auftrennung durch Agarosegelelektrophorese zur Transformation des trk1trk2tok1 dreifach mutanten Saccharomyces cerevisiae Hefestammes, in dem alle bisher beschriebenen hefe-eigenen Transport- und Kanalproteine TRK1, TRK2 und TOK1 spezifisch deletiert sind, verwendet. Dazu wurden Transformanten auf den in dem Plasmid p679 ebenfalls enthaltenen biosynthetischen Marker HIS3 (HIS3+ Protrophie) selektioniert. Aus Einzellen stammende Kolonien wurden weiterhin auf Kulturmedien mit Kaliumkonzentrationen kleiner als 10 mM selektioniert.

Die Transformation des trk1trk2tok1 dreifach mutanten Saccharomyces cerevisiae Hefestamms mit dem humanen Kaliumionen-Kanal erg Gen unter Kontrolle des pmal- Promotors führte zur Isolierung eines Saccharomyces cerevisiae Hefewirtsstamms, in dem alle bisher beschriebenen hefe-eigenen Transport- und Kanalproteine TRK1, TRK2 und TOK1 spezifisch deletiert sind, und das humane erg Gen (HERG) am chromosomalen Locus des biosynthetischen LEU2 Gens stabil integriert und unter Kontrolle des hefe-eigenen pmal- Promotors exprimiert ist. Die Expression des humanen Kaliumionen-Kanal erg Gens komplementiert den Kaliumtransport defekten Phänotyp der trk1trk2tok1 dreifach Saccharomyces cerevisiae Mutante auf Kulturmedien mit Kaliumkonzentrationen kleiner 10 mM.

Anstelle der hefe-eigenen Kaliumtransport- und Kanalproteine wird in diesem Saccharomyces cerevisiae Stamm (Genotyp MATα his3-Δ200 leu2-3, 112 trp1-Δ901 urα3-52 suc2-Δ9 trk1Δ51trk2Δ50 tok1Δ50 leu2::pma1HERG HIS3) (siehe auch Fig. 3) ausschließlich der humane HERG Kaliumionen-Kanal exprimiert.

3.2 Charakterisierung des HERG exprimierenden Saccharomyces-cerevisiae-Stammes durch RNS-Analyse

Die Bestätigung der Expression des durch homologe Rekombination eingeführten humanen Kaliumionen-Kanal erg Gens (HERG) an den Saccharomyces cerevisiae LEU2 Locus erfolgte durch RNS-Analyse (Fig. 9). In Fig. 8 ist die Nukleinsäure- (SEQ. ID. NO. 17; 8A) und abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ. a. NO. 18; 8B) des humanen erg Kaliumionen-Kanals Gens (HERG) dargestellt. Die Sequenz entspricht der in der Originalpublikation von Trudeau, M.C., Warmke, J.W., Ganetzky, B. and Robertson, G. (1995). Science 269: 92-95 beschriebenen. Die zur RNS Analyse verwendeten Oligonukleotide



(SEQ. ID. NO. 19)

H1119 5' CAG CGG CTT GCT CAA CTC CA 3 und



(SEQ. ID. NO. 20)

H 1557 5' GAT GAG GTC CAC CAC AGC CA 3'



sind durch Kursivdruck und Unterstrich angezeigt.

In Fig. 9 sind die Ergebnisse einer "Reverse-Transcription" Polymerase Ketten-Reaktion dargestellt. Dazu wurde RNS von verschiedenen, das humane Kaliumionen-Kanal erg Gen exprimierenden positiven Klonen (Klone Nr. 5, 6, 7, und 8) nach selektivem Wachstum im Kulturmedium mit 10 mM Kalium isoliert. Die Auftrennung der Gesamt-RNS zur Überprüfung der Integrität und Mengenverhältnisse erfolgte im 1%igen denturierenden Agarosegel (linker Teil in Fig. 9). Diese Gesamt-RNS wurde mit Reverser-Transkriptase in komplementäre DNS umgeschrieben und in einer nachfolgenden PCR-Analyse mithilfe erg- spezifischer Oligonukleotide (SEQ. ID. NO. 19)/(SEQ. ID. NO. 20) ein 440 Basenpaare langes Fragment amplifiziert. Zur Kontrolle auf mögliche DNS-Kontamination in der RNS Präparation wurde nicht-umgeschriebene RNS aus Klon Nr. 6 eingesetzt. Zur Kontrolle des korrekten Amplifikationsproduktes wurde 20 pg des Plasmids p679pma1HERG eingesetzt. Zur Kontrolle des Reaktionsgemisches wurde eine Reaktion ohne Matrize durchgeführt (Wasserkontrolle). Die Auftrennung der Fragmente erfolgte in einem 0.8%igen Agarosegel.

Ergebnis

Durch RNS-Analyse mit der RT-PCR erfolgte die Bestätigung der Expression des durch homologe Rekombination eingeführten humanen Kaliumionen-Kanal erg Gens (HERG) in den trk1trk2tok1 dreifach mutanten Saccharomyces cerevisiae Hefestamm.

3.3 Charakterisierung des HERG exprimierenden Saccharomyces-cerevisiae-Stammes durch Wachstumstests auf Kalium-limitierten Medien

Kulturen von Saccharomyces cerevisiae Wildstamm, des trk1trk2tok1 dreifach mutanten Hefestammes eines HERG exprimierenden Stammes wurden im Vollmedium YPD (2% yeast extract, 1% peptone) mit 2% D-glucose, pH 5.0 bei 30°C über Nacht unter Schütteln angezogen. 1 × 105 Zellen wurden auf Vollmedium-Agarplatten ausgestrichen, bei 30°C über Nacht inkubiert und auf selektive Agarplatten (0.67% yeast nitrogen base with amino acids, 0.5% NH4SO4, 2% D-glucose) mit 100 oder 10 mM KCl bei pH 5.5 und pH 5.0 plattiert. Diese Platten wurden für 48 Stunden bei 30°C inkubiert. In Fig. 10 ist das Wachstum der isolierten trkltrk2tok1 Saccharomyces cerevisiae Dreifach-Mutante mit defektem Kaliumtransport in Abhängigkeit von der Kaliumkonzentration im Kulturmedium gezeigt. Der Saccharomyces cerevisiae Hefestamm mit Defekten in allen Kaliumtranslokations- Systemen TRK1, TRK2 und TOK1 (trk1trk2tok1, Dreifach-Mutante) wächst nicht mit niedrigen Kaliumkonzentrationen (10 mM) im Medium bei pH 5.0 und pH 5.5. Im Gegensatz zur Saccharomyces cerevisiae Dreifach-Mutante ist der das humane Kaliumionen-Kanal erg Gen (HERG) exprimierende Stamm in der Lage, auf 10 mM Kalium im Medium bei pH 5.0 und pH 5.5 dem Saccharomyces cerevisiae Wildstamm vergleichbar gut zu wachsen.

3.4 Charakterisierung des HERG exprimierenden Saccharomyces-cerevisiae-Stammes durch Wachstumstests in Gegenwart von Inhibitoren

Kulturen von Saccharomyces cerevisiae Wildstamm, des trk1trk2tok1 dreifach mutanten Hefestamms und dem HERG exprimierenden Stamm wurden im Vollmedium YPD (2% yeast extract, 1% peptone) mit 2% D-glucose, pH 5.0 bei 30°C über Nacht unter Schütteln angezogen. 1 × 105 Zellen wurden auf Vollmedium-Agarplatten ausgestrichen, bei 30°C über Nacht inkubiert und auf selektive Agarplatten (0.67% yeast nitrogen base with amino acids, 0.5% NH4SO4, 2% D-glucose, pH 5.5) mit 10 mM KCl und 1 mM Barium, 1 mM Cäsium, 40 µM Lanthan und 20 nM Astemisol plattiert. Diese Platten wurden für 48 Stunden bei 30°C inkubiert.

Ergebnis

Die Restaurierung des Kaliumaufnahme Wildtyp Phänotyps ist abhängig von der heterologen Expression des HERG Kaliumionen-Kanals, wie anhand der Inhibierung des exprimierten HERG auf 10 mM Kalium enthaltenden Agarplatten in der Gegenwart von 1 mM Barium, 1 mM Cäsium, 40 µM Lanthan und 20 nM Astemisol bestätigt wurde (Fig. 11).

Durch die Inhibierung des heterolog exprimierten HERG Kaliumionen-Kanals kann der trk1trk2tok1 dreifach-mutante Saccharomyces cerevisiae Stamm mit Defekten in allen Kaliumtranslokations-Systemen auf 10 mM Kaliumkonzentration nicht mehr wachsen. Publikationsliste Adelmann, J.P., Bond, C.T., Pessia, M. and Mylie, J. (1995). Episodic ataxia results from voltage-dependent potassium channels with altered fiinctions. Neuron 15: 1449-1454

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Anspruch[de]
  1. 1. Ein genetisch modifizierter Saccharomyces-cerevisiae-Hefestamm, dessen eigene Kaliumtranslokations-Systeme TRK1, TRK2 und TOK1 spezifisch deletiert sind und in dem die Nukleinsäuresequenz für den humanen erg Kaliumionen-Kanal (HERG) stabil in das Hefegenom integriert und exprimiert ist.
  2. 2. Saccharomyces-cerevisiae-Mutanten mit Defekten in der Kaliumaufnahme die erhältlich sind durch Mutation der Gene für die Kaliumtranslokations-Systeme TRK1, TRK2 und TOK1, durch Einführung einer oder mehrerer selektiver Marker (Auxotrophien und/oder Resistenzen).
  3. 3. Saccharomyces-cerevisiae-trk1trk2tok1-Mutanten.
  4. 4. Verwendung der Saccharomyces-cerevisiae-trk1trk2tok1-Mutanten nach Anspruch 1 oder 2 als Wirtsorganismus zur homologen oder heterologen Expression von humanen Kaliumionen-Kanälen.
  5. 5. Das Verfahren der stabilen Integration humaner Kaliumionen-Kanalgene zur heterologen Expression in das Genom eines Saccharomyces-cerevisiae-trk1trk2tok1- Hefewirtsstammes.
  6. 6. Ein Verfahren zur Detektion spezifischer Modulatoren des HERG Kaliumionen-Kanals, einschließlich:
    1. a) Die Behandlung des Saccharomyces-cerevisiae-Hefewirtsstamms, der die Nukleinsäuresequenz für den humanen erg Kaliumionen-Kanal (HERG) oder ein funktionelles Derivat oder eine Mutationsform dieses Kaliumionen-Kanals aber nicht die der Hefe eigenen TRK1, TRK2 und TOK1 Kaliumtranslokations-Systeme exprimiert mit Testsubstanzen,
    2. b) Wachstumsbestimmungen in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz,
    3. c) Messungen des Anstiegs oder der Abnahme des Kaliumtransportes derjenigen Stämme in Anwesenheit oder nach Anwendung einer Testsubstanz.
  7. 7. Ein Verfahren nach Anspruch 4 zur Detektion von anti-arrythmischen Substanzen.
  8. 8. Ein Verfahren nach Anspruch 4 zur Detektion von anti-fibrillatorischen Substanzen.
  9. 9. Ein Verfahren nach Anspruch 4 zur Detektion von anti-entzündlichen Substanzen.






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