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Dokumentenidentifikation DE69704861T2 25.10.2001
EP-Veröffentlichungsnummer 0896795
Titel Herstellung einer Aglukon-Isoflavon-angereicherten pflanzlichen-Protein Molke
Anmelder Protein Technologies International, Inc., Saint Louis, Mo., US
Erfinder Shen, Jerome L., St Louis, Missouri 63109, US;
Roussey, Mark A., Chesterfield, Missouri 63005, US;
Bryan, Barbara A., University City, Missouri 63130, US;
Allred, Maryann C., Collinsville, Illinois 62234, US
Vertreter derzeit kein Vertreter bestellt
DE-Aktenzeichen 69704861
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 07.08.1997
EP-Aktenzeichen 973060031
EP-Offenlegungsdatum 17.02.1999
EP date of grant 16.05.2001
Veröffentlichungstag im Patentblatt 25.10.2001
IPC-Hauptklasse A23J 3/16
IPC-Nebenklasse A23J 3/14   A23L 1/20   A23L 1/211   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer mit Aglucon-Isoflavon angereicherten Pflanzenproteinmolke, eines mit Aglucon-Isoflavon angereicherten Molke-Proteinmaterials, eines Aglucon-Isoflavon-Materials, eines Materials mit hohem Genisteingehalt und eines Materials mit hohem Daidzeingehalt aus einer Pflanzenproteinmolke.

Isoflavone kommen in einer Vielfalt von zu den Leguminosen gehörenden Pflanzen einschließlich Pflanzenproteinmaterialien wie beispielsweise Sojabohnen vor. Zu diesen Verbindungen gehören Daidzin, 6"-OAc-Daidzin, 6"-OMal-Daidzin, Daidzein, Genistin, 6"-OAc-Genistin, 6"-OMal-Genistin, Genistein, Glycitin, 6"-OAc-Glycitin, 6"-OMal-Glycitin, Glycitein, Biochanin A, Formononetin und Coumestrol. Typischerweise sind diese Verbindungen mit dem inhärent bitteren Geschmack von Sojabohnen verbunden.

Bei der Herstellung von handelsüblichen Produkten, wie beispielsweise Pflanzenproteinisolate und -konzentrate, lag der Brennpunkt in der Entfernung dieser Materialien. Zum Beispiel werden in einem herkömmlichen Verfahren zur Herstellung eines Sojaproteinisolats, bei dem Sojaflocken mit einem wäßrigen alkalischen Medium extrahiert werden, viele von den Isoflavonen zusammen mit dem Sojaprotein in dem Extrakt solubilisiert. Das Protein wird aus dem Extrakt durch Ansäuern des Extraktes ausgefällt und wird zur Erzeugung eines Isolats abgetrennt, wobei eine Molke zurückgelassen wird, die viele von den solubilisierten Isoflavonen zurückhält. Restliche Isoflavone, die in dem mit Säure ausgefällten Proteinisolat zurückgelassen werden, werden gewöhnlich durch erschöpfendes Waschen des Isolats entfernt. Die Molke und die Waschflüssigkeiten werden typischerweise verworfen.

Wir haben entdeckt, daß zu den Isoflavonen in Pflanzenproteinmolke Isoflavon-Glucoside (Glucone), Isoflavon-Konjugate und Aglucon-Isoflavone gehören. Isoflavon-Glucoside haben ein Glucosemolekül, das an die Isoflavoneinheit der Verbindung gebunden ist. Isoflavon-Konjugate haben zusätzliche Einheiten, die an das Glucosemolekül gebunden sind, zum Beispiel enthält 6"-OAc-Genistin eine Acetatgruppe, die an die Position sechs des Glucosemoleküls gebunden ist. Aglucon-Isoflavone bestehen aus einer Isoflavoneinheit ohne ein angebundenes Glucosemolekül.

Sojamolke enthält drei "Familien" von Isoflavonverbindungen mit entsprechenden Glucosid-, Konjugat- und Aglucon-Bestandteilen: die Genisteinfamilie, die Daidzeinfamilie und die Glyciteinfamilie. Zu der Genisteinfamilie gehören das Glucosid Genistin; die Konjugate 6"-OMal-Genistin (6"-Malonatester von Genistin) und 6"-OAc-Genistin (6"-Acetatester von Genistin) sowie das Aglucon Genistein. Zu der Daidzeinfamilie gehören das Glucosid Daidzin; die Konjugate 6"-OMal-Daidzin und 6"-OAc-Daidzin sowie das Aglucon Daidzein. Zu der Glyciteinfamilie gehören das Glucosid Glycitin, das Konjugat 6"- OMal-Glycitin und das Aglucon Glycitein.

Wenn auch bei einer medizinischen Bewertung alle Isoflavone von Interesse sind, sind die Aglucone die speziellen Isoflavone von höchstem Interesse. Genistein und Daidzein können kardiovaskuläre Risikofaktoren signifikant verringern. "Plant and Mammalian Estrogen Effects on Plasma Lipids of Female Monkeys" ("Pflanzen- und Säugetier-Estrogen-Wirkungen auf Plasmalipide weiblicher Affen"), Circulation, Bd. 90, S. 1259 (Okt. 1994). Man denkt auch, daß Genistein und Daidzein die Symptome von Zuständen verringern, die durch verringerte oder veränderte Mengen von endogenem Estrogen bei Frauen verursacht werden, wie Menopause oder prämenstruelles Syndrom. Weiterhin wurde kürzlich erkannt, daß die Aglucon-Isoflavone, die in Pflanzenmaterial wie beispielsweise Sojabohnen enthalten sind, das Wachstum von menschlichen Krebszellen, wie beispielsweise Brustkrebszellen und Prostatakrebszellen, hemmen können, wie in den folgenden Artikeln beschrieben ist: "Genistein Inhibition of the Growth of Human Breast Cancer Cells, Independence from Estrogen Receptors and the Multi-Drug Resistance Gene" ("Hemmung des Wachstums von menschlichen Brustkrebszellen durch Genistein, Unabhängigkeit von Estrogenrezeptoren und das Multiarzneimittelresistenz-Gen") von Peterson und Bames, Biochemical and Biophysical Research, Communications, Bd. 179, Nr. 1, S. 661-667, 30. Aug. 1991; "Genistein and Biochanin A inhibit the Growth of Human Prostate Cancer Cells but not Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Autophosphorylation" ("Genistein und Biochanin A hemmen das Wachstum menschlicher Prostatakrebszellen, aber nicht die Autophosphorylierung des Rezeptors des epidermalen Wachstumsfaktors Tyrosin") von Peterson und Barnes, The Prostate, Bd. 22, S. 335-345 (1993); und "Soybeans Inhibit Mammary Tumors in Models of Breast Cancer" ("Sojabohnen hemmen Mammatumore in Modellen von Brustkrebs") von Barnes et al., Mutagens and Carcinogens in the Diet, S. 239-253 (1990).

Wie vorstehend bemerkt, gehören zu den Aglucon-Isoflavonen Daidzein, Genistein und Glycitein. Diese Aglucone haben die folgende allgemeine Formel:

in der E¹, R², R³ und R&sup4; gleich oder verschieden sind und jeder ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe oder eine Methoxygruppe darstellt. Genistein hat die vorstehende Formel, in der R¹ = OH, R² = H, R³ = OH und R&sup4; = OH, Daidzein hat die vorstehende Formel, in der R¹ = OH, R² = H, R³ = H und R&sup4; = OH, und Glycitein hat die vorstehende Formel, in der R¹ = OH, R² = OCH&sub3;, R³ = H und R&sup4; = OH.

Es sind deshalb die Aglucone und die Anreicherung einer Pflanzenproteinmolke und eines Molke- Proteinmaterials mit diesen Verbindungen und insbesondere ein Material mit hohem Genisteingehalt, ein Material mit hohem Daidzeingehalt und ein Aglucon-Isoflavon-Material, auf die die vorliegende Erfindung ausgerichtet ist. Die vorliegende Erfindung ist auch auf Verfahren zur Herstellung einer mit Aglucon angereicherten Pflanzenproteinmolke, eines mit Aglucon angereicherten Pflanzenmolke-Proteinmaterials, eines Materials mit hohem Genisteingehalt, eines Materials mit hohem Daidzeingehalt und eines Aglucon- Isoflavon-Materials ausgerichtet.

Vor der vorliegenden Erfindung war man sich nicht bewußt, daß Pflauzenproteinmolke Isoflavon- Konjugate in einer signifikanten Menge enthält.

WO 95/10512 offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer mit Aglucon-Isoflavon angereicherten Pflanzenproteinmolke, umfassend die Umsetzung einer Pflanzenproteinmolke bei pH 4-8 und einer Temperatur von 40-60ºC für eine Zeit, die ausreichend ist, um die Enzyme zumindest eine Mehrheit von Glucon-Isoflavonen in Aglucon-Isoflavone umwandeln zu lassen.

Diese Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer mit Aglucon-Isoflavon angereicherten Pflanzenproteininolke aus einer Pflanzenproteinmolke, die Isoflavon-Konjugate enthält. Das Verfahren umfaßt in einem ersten Schritt die Behandlung einer Isoflavon-Konjugate enthaltenden Pflanzenproteinmolke bei einer Temperatur und einem pH für eine Zeit, die ausreichend ist, um zumindest eine Mehrheit der Isoflavon-Konjugate in Isoflavon-Glucoside umzuwandeln. In einem zweiten Schritt wird ein Enzym mit den Isoflavon-Glucosiden in der Pflanzenproteinmolke bei einer Temperatur und einem pH für eine Zeit in Kontakt gebracht, die ausreichend ist, um zumindest eine Mehrheit der Isoflavon-Glucoside in Aglucon-Isoflavone umzuwandeln.

In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Isoflavon-Konjugate in Isoflavon-Glucoside umgewandelt, indem die Pflanzenproteinmolke bei einer Temperatur von 2ºC bis 121ºC und bei einem pH- Wert von 6 bis 13,7 behandelt wird.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die Isoflavon-Glucoside in Aglucon- Isoflavone umgewandelt, indem bei einer Temperatur von 5ºC bis 75ºC und einem pH-Wert von 3 bis 9 die Isoflavon-Glucoside mit einem Enzym in der Pflanzenproteinmolke in Kontakt gebracht werden.

Hohe Umwandlungsgeschwindigkeiten von Isoflavon-Konjugaten in Isoflavon-Glucoside und von Isoflavon-Glucosiden in Aglucon-Isoflavone werden realisiert. In einer Ausführungsform werden mindestens 80% der Isoflavon-Konjugate in Isoflavon-Glucoside umgewandelt, und mindestens 80% der Isoflavon-Glucoside werden in Aglucon-Isoflavone umgewandelt.

In einem anderen Aspekt ist diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Aglucon- Isoflavon-Molke-Proteinmaterials aus einer Isoflavon-Konjugate enthaltenden Pflanzenproteinmolke. Ein Protein und Isoflavon-Konjugate enthaltendes Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial wird aus einer mit Aglucon angereicherten Pflanzenproteinmolke gewonnen. In einer Ausführungsform der Erfindung wird das Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial durch mindestens eines von Ultrafiltration, Hitzekoagulation und Entwässerung gewonnen.

In noch einem anderen Aspekt ist diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Materials mit hohem Genisteingehalt aus Isoflavon-Konjugate enthaltender Pflanzenproteinmolke. Ein Aglucon- Isoflavon-Molke-Proteinmaterial, erhalten aus einer Pflanzenproteinmolke, wird mit einem Extraktionsmittel in Form eines wäßrigen Alkohols extrahiert, um einen mit Aglucon-Isoflavon angereicherten Extrakt herzustellen. Der Extrakt wird mit einem Adsorptionsmaterial für eine Zeit in Kontakt gebracht, die ausreichend ist, um ein Material mit hohem Genisteingehalt aus dem Extrakt abzutrennen.

In noch einem anderen Aspekt ist diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Materials mit hohem Daidzeingehalt aus einer Isoflavon-Konjugate enthaltenden Pflanzenproteinmolke. Ein Aglucon- Isoflavon-Molke-Proteinmaterial, erhalten aus einer Pflanzenproteinmolke, wird mit einem Extraktionsmittel in Form eines wäßrigen Alkohols extrahiert, um einen mit Aglucon-Isoflavon angereicherten Extrakt herzustellen. Der Extrakt wird mit einem Adsorptionsmaterial für eine Zeit in Kontakt gebracht, die ausreichend ist, um ein Material mit hohem Daidzeingehalt aus dem Extrakt abzutrennen.

In noch einem anderen Aspekt ist diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Aglucon- Isoflavon-Materials aus einer Isoflavon-Konjugate umfassenden Pflanzenproteirunolke. Ein Aglucon- Isoflavon-Molke-Proteinmaterial, erhalten aus einer Pflanzenproteinmolke, wird mit einem Extraktionsmittel in Form eines wäßrigen Alkohols extrahiert, um einen mit Aglucon-Isoflavon angereicherten Extrakt herzustellen. Der Extrakt wird auf 15% bis 30% seines ursprünglichen Volumens eingeengt, und ein Aglucon-Isoflavon-Material wird aus dem Extrakt ausgefällt, indem Wasser zu dem Extrakt hinzugegeben wird.

In einer Ausführungsform wird ein Material mit hohem Genisteingehalt aus dem Aglucon- Isoflavon-Material abgetrennt. Das Aglucon-Isoflavon-Material wird in einer Lösung in einem wäßrigen Alkohol solvatisiert, und die Lösung in einem wäßrigen Alkohol wird mit einem Adsorptionsmaterial für eine Zeit in Kontakt gebracht, die ausreichend ist, um ein Material mit hohem Genisteingehalt abzutrennen.

In einer anderen Ausführungsform wird ein Material mit hohem Daidzeingehalt aus dem Aglucon- Isoflavon-Material abgetrennt. Das Aglucon-Isoflavon-Material wird in einer Lösung in einem wäßrigen Alkohol solvatisiert und die Lösung in einem wäßrigen Alkohol wird mit einem Adsorptionsmaterial für eine Zeit in Kontakt gebracht, die ausreichend ist, um ein Material mit hohem Daidzeingehalt abzutrennen.

Das Ausgangsmaterial des Verfahrens ist eine Pflanzenproteinmolke, wobei eine Pflanzenproteinmolke als eine wäßrige Lösung von löslichen Proteinen, Isoflavonen und anderen wasserlöslichen Verbindungen definiert ist, die nach der Entfernung von Pflanzenproteinquark aus einem Pflanzenproteinextrakt verbleibt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Ausgangsmaterial eine Sojabohnenmolke, da das Verfahren besonders für die Herstellung von mit Aglucon-Isoflavon angereicherter Molke, Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial, Material mit hohem Genisteingehalt, Material mit hohem Daidzeingehalt und Aglucon-Isoflavon-Material aus Sojabohnenmaterialien geeignet ist. Andere Pflanzenproteinmolke-Materialien können jedoch in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden, zum Beispiel andere Ölsaatproteinmolke-Materialien, wie beispielsweise diejenigen, die aus Saflorsamen, Sonnenblumensamen, Raps und anderen ähnlichen Materialien erhalten werden.

Das Pflanzenproteimnolke-Ausgangsmaterial enthält Isoflavon-Konjugate, Isoflavon-Glucoside und Aglucon-Isoflavone. Zum Beispiel enthält Sojamolke: Isoflavon-Glucoside - Genistin, Daidzin und Glycitin; Isoflavon-Konjugate - 6"-Malonatester von Genistin, Daidzin und Glycitin sowie 6"-Acetatester von Genistin und Daidzin; und Aglucon-Isoflavone - Genistein, Daidzein und Glycitein. Wir haben überraschenderweise gefunden, daß die Isoflavone in einem Sojamolke-Ausgangsmaterial vorwiegend Isoflavon-Konjugate sind.

Das Pflanzenproteinmolke-Ausgangsmaterial kann typischerweise als Nebenprodukt eines herkömmlichen Verfahrens zur Herstellung von Pflanzenproteinisolat erhalten werden. Eine Pflanzenproteinquelle, wie beispielsweise Sojabohnenflocken, aus denen das Öl durch Lösungsmittelextraktion entfernt worden ist, kann mit einem wäßrigen Extraktionsmittel extrahiert werden, das einen pH oberhalb des isoelektrischen Punktes des Proteins in der Pflanzenproteinquelle hat, wobei ein Extrakt hergestellt wird, der Protein, Isoflavone und andere Verbindungen enthält, die durch den Extrakt aus der Pflanzenproteinquelle solubilisiert werden. Der Extrakt wird von Pflanzenxnaterial, das in dem Extrakt nicht löslich ist, abgetrennt. Der pH des so erhaltenen Extrakts, der die solubilisierten Proteine und Isoflavone enthält, wird dann auf etwa den isoelektrischen Punkt des Proteins, etwa pH 4,4-4,6 für Sojaprotein, eingestellt, um das Protein aus dem Extrakt auszufällen. Das ausgefällte Protein wird abgetrennt, um ein Pflanzenproteinisolat herzustellen, wobei das Pflanzenproteinmolke-Ausgangsmaterial zurückgelassen wird. Die Isoflavone bleiben zum größten Teil in der Molke solubilisiert. Um die Isoflavongewinnung in der Molke zu maximieren, kann zusätzliches Waschen des ausgefällten Proteins wünschenswert sein, wobei jede Waschflüssigkeit zu der Molke hinzugefügt wird.

Das Pflanzenproteinmolke-Ausgangsmaterial kann in Wasser aufgeschlämmte sprühgetrocknete Pflanzenproteinmolke sein. Für eine leichte Handhabung kann die Pflanzenproteinmolke sprühgetrocknet werden, um Molkenprotein (nach dem Ausfällen des Proteinisolats noch in der Molke lösliches Protein), Isoflavone und andere Verbindungen als festes Material zu gewinnen. Das sprühgetrocknete Material kann zu Wasser hinzugefügt werden, um ein Pflanzenproteinmolke-Ausgangsmaterial wiederherzustellen. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält eine Aufschlämmung etwa 2-10 g sprühgetrocknetes Material für jeweils 100 g Wasser, um sicherzustellen, daß die Molke nicht zu viskos ist, während hinreichend Isoflavone bereitgestellt werden, um die gewünschte, mit Aglucon-Isoflavon angereicherte Molke, Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial, Material mit hohem Genisteingehalt, Material mit hohem Daidzeingehalt und Aglucon-Isoflavon-Material herzustellen.

In einem ersten Umwandlungsschritt oder Arbeitsgang werden Isoflavon-Konjugate in dem Pflanzenproteinmolke-Ausgangsmaterial in Isoflavon-Glucoside umgewandelt, um eine mit Isoflavon- Glucosid angereicherte Pflanzenproteinmolke herzustellen. Es wurde gefunden, daß die Umwandlung von dem pH und der Temperatur der Molke abhängig ist.

Der pH-Bereich für die Umwandlung der Isoflavon-Konjugate in Isoflavon-Glucoside liegt vorzugsweise bei 6 bis 13,5. Der pH der Pflanzenproteinmolke sollte, wenn notwendig, auf den gewünschten pH eingestellt werden. Sojaproteinmolke hat typischerweise einen pH-Wert von etwa 4,4-4,6 und sollte mit einer Base oder einem basischen Reagenz auf den gewünschten pH-Bereich eingestellt werden. Der pH kann mit einer geeigneten Base, einem kaustischen Reagenz oder basischen Reagenz, die den pH des Systems erhöhen, eingestellt werden. Im allgemeinen sollte die verwendete Base vorzugsweise ein lebensmittelgerechtes Material sein, wie es alle Materialien sein sollten, die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zu Beispielen solcher Basen gehören Alkalimetall- oder Erdalkalimetallverbindungen, vornehmlich ein Hydroxid, einschließlich Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Calciumhydroxid. Es wurde gefunden, daß die Umwandlung leichter unter relativ stark basischen Bedingungen abläuft, stärker bevorzugt von pH 9 bis pH 11. Am meisten bevorzugt sollte der pH unter pH 12 gehalten werden, da Isoflavon-Glucoside - Genistin, Daidzin und Glycitin, besonders Daidzin - dazu neigen, bei pH-Werten von 12 und darüber zersetzt zu werden. Die Reaktion verläuft weniger leicht unter niedrigeren pH-Bedingungen, zum Beispiel etwa pH 6, jedoch verläuft die Reaktion bei höheren Temperaturen und/oder unter erhöhtem Druck.

Der Temperaturbereich für die Umwandlung der Isoflavon-Konjugate in Isoflavon-Glucoside liegt vorzugsweise bei 2ºC bis 121ºC. Der Temperaturbereich, bei dem die Umwandlung leicht erfolgt, hängt von dem pH der Molke ab. Wir haben gefunden, daß die Umwandlung leicht bei tieferen Temperaturen erfolgt, wenn der pH relativ hoch ist. Zum Beispiel erfolgt bei einem pH der Molke von etwa 11 die Umwandlung schnell und wirkungsvoll in einem Temperaturbereich von 5ºC bis 50ºC. Bei einem pH der Molke von etwa 9 erfolgt die Umwandlung wirkungsvoll in einem Temperaturbereich von 45ºC bis 73ºC. Wenn der pH der Molke relativ niedrig ist, erfolgt die Umwandlung bei höheren Temperaturen. Zum Beispiel erfolgt die Umwandlung bei einem pH der Molke von 6 in einem Temperaturbereich von 80ºC bis 121ºC. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Umwandlung bei etwa 35ºC bei einem pH der Molke von etwa 11 ausgeführt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die Umwandlung bei etwa 73ºC bei einem pH der Molke von etwa 9 ausgeführt.

Die Zeit, die für eine im wesentlichen vollständige Umwandlung der Isoflavon-Konjugate in Isoflavon-Glucoside erforderlich ist, ist von dem pH und der Temperatur der Pflanzenproteinmolke abhängig. Die Zeiträume reichen von 15 Minuten bis zu 24 Stunden. Die Umwandlung erfolgt bei einem höheren pH und bei einer höheren Temperatur schneller. Bei einem pH von etwa 9-10 ist die Umwandlung in 4 bis 6 Stunden bei 73ºC im wesentlichen vollständig. Bei einem pH von etwa 10-11 ist die Umwandlung in 30 Minuten bis 1 Stunde bei 35ºC im wesentlichen vollständig. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform werden die Isoflavon-Konjugate in etwa 45 Minuten bei einem pH-Wert von etwa 11 und bei einer Temperatur von etwa 35ºC in Isoflavon-Glucoside umgewandelt.

Der erste Umwandlungsschritt ist bemerkenswert wirkungsvoll, indem von etwa 80% bis etwa 100% der Isoflavon-Konjugate in Isoflavon-Glucoside umgewandelt werden. Typischerweise werden Umwandlungsraten von mindestens 95% beobachtet. Diese hohen Umwandlungsraten sind besonders für die Verwendung in kommerziellen Arbeitsgängen in großem Maßstab attraktiv.

In einem zweiten Umwandlungsschritt oder Arbeitsgang werden die Isoflavon-Glucoside, die im ersten Schritt hergestellt wurden, ebenso wie die Isoflavon-Glucoside, die vorher in der Molke vorhanden waren, durch eine Enzymreaktion in Aglucon-Isoflavone umgewandelt. Die Umwandlung erzeugt aus der mit Isoflavon-Glucosid angereicherten Molke eine mit Aglucon-Isoflavon angereicherte Pflanzenproteinmolke.

Es wurde gefunden, daß der zweite Umwandlungsschritt von der Konzentration der in der Molke vorhandenen Enzyme und deren Eigenschaften abhängt. Die Enzyme, die erforderlich sind, um die Umwandlung zu bewirken, sind Enzyme, die imstande sind, die glucosidische Bindung zwischen der Isoflavoneinheit und dem Glucosemolekül der Isoflavonglucoside zu spalten. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Enzyme Saccharidase-Enzyme, die imstande sind, 1,4-Glucosid-Bindungen zu spalten. Die Konzentration an Enzymen, die erforderlich ist, um die Isoflavon-Glucoside in Aglucon- Isoflavone umzuwandeln, ist von einer Vielfalt von Faktoren abhängig, einschließlich der in der Molke vorhandenen Arten von Enzymen, der Verteilung der Enzymkonzentrationen, der Aktivitäten der Enzyme, der Konzentration der Isoflavon-Glucoside und des pH und der Temperatur der Molke während der Umwandlung.

Die Enzyme können auf natürliche Weise in der Pflanzenproteinmolke vorhanden sein, aus mikrobiologischem Wachstum in der Molke vorhanden sein oder können als Ergänzung zu der Molke hinzugegeben werden. Enzym, das in der Molke auf natürliche Weise vorhanden ist oder aus einem mikrobiologischen Wachstum vorhanden ist, wird hier als "Rest"enzym bezeichnet, und Enzym, das zu der Molke hinzugegeben wird, wird hier als "ergänzendes" Enzym bezeichnet.

Ausreichend Enzym sollte in der Molke vorhanden sein, um zumindest eine Mehrheit und vorzugsweise im wesentlichen alle Isoflavon-Glucoside in Aglucon-Isoflavone umzuwandeln. Im allgemeinen sollten, wenn die Restenzyme in der Molke nicht ausreichend sind, um die Umwandlung zu bewirken, ergänzende Enzyme zu der Molke hinzugegeben werden. Wie vorstehend bemerkt, bestimmt eine Vielfalt von Faktoren, ob die Enzyme in angemessener Konzentration vorhanden sind, um die Umwandlung durchzuführen.

Wenn ergänzendes Enzym hinzugegeben wird, sollte das ergänzende Enzym so hinzugegeben werden, daß die Gesamtkonzentration an vorhandenem Enzym vorzugsweise 0,1 bis 10 Gew.-% der Molkenfeststoffe auf einer Trockenbasis ausmacht. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ergänzendes Enzym zu der Molke hinzugegeben, ungeachtet dessen, ob hinreichend Restenzym in der Molke vorhanden ist, da Zugabe von ergänzendem Enzym die Zeit dramatisch verkürzt, die notwendig ist, um im wesentlichen vollständige Umwandlung der Glucoside in Aglucone zu bewirken.

Ergänzende Enzyme werden auf der Grundlage optimaler Aktivität bei ausgewählten pH- und Temperaturbedingungen und der Kostenwirksamkeit ausgewählt. Die ergänzenden Enzyme sind Enzyme, die imstande sind, die Bindung zwischen der Isoflavoneinheit und der Glucoseeinheit der Isoflavon- Glucoside zu spalten, wie beispielsweise Saccharidase-Enzyme, die imstande sind, 1,4-Glucosid-Bindungen zu spalten. Bevorzugte ergänzende Enzyme sind im Handel erhältliche alpha- und beta-Glucosidase- Enzyme, beta-Galactosidase-Enzyme, Glucoamylase-Enzyme und Pectinase-Enzyme. Besonders bevorzugt sind Enzyme wie Biopectinase 100L (welche vorzugsweise in einem pH-Bereich von 3 bis 6 verwendet wird), Biopectinase 300L (optimaler pH-Bereich von 3 bis 6), Biopectinase OK 70L (optimaler pH-Bereich von 3 bis 6), Biolactase 30000 (optimaler pH-Bereich von 3 bis 6) und Neutral Lactase (optimaler pH- Bereich von 6 bis 8), von denen alle von Quest International, 1833 57th Street, Post Office Box 3917, Sarasota, Florida 34243, erhältlich sind. Ebenfalls besonders bevorzugt sind Lactase F (optimaler pH- Bereich von 4 bis 6) und Lactase 50000 (optimaler pH-Bereich von 4 bis 6), welche von Amano International Enzyme Co., Inc., Post Office Box 1000, Troy, Virginia 22974, erhältlich sind. Zu anderen besonders bevorzugten ergänzenden Enzymen gehören: G-Zyme G990 (optimaler pH von 4 bis 6) und Enzeco Fungal Lactase Concentrate (optimaler pH-Bereich von 4 bis 6), erhältlich von Enzyme Development Corporation, 2 Penn Plaza, Suite 2439, New York, New York 10121; Lactozyme 3000L (optimaler pH-Bereich von 6 bis 8) und Alpha-Gal 600L (optimaler pH von 4 bis 6,5), erhältlich von Novo Nordisk Bioindustrials, Inc., 33 Turner Road, Danbury, Connecticut 06813; Neutral Lactase (optimaler pH- Bereich von 6 bis 8), erhältlich von Pfizer Food Science Group, 205 East 42nd Street, New York, New York 10017; und Maxilact L2000 (optimaler pH-Bereich von 4 bis 6), erhältlich von Gist Brocades Food Ingredients, Inc., King of Pmssia, Pennsylvania 19406.

Sobald hinreichende Konzentrationen an Enzymen vorhanden sind, entweder von Restenzymen, ergänzenden Enzymen oder beiden, werden die Enzyme mit den Isoflavon-Glucosiden in der Molke in Kontakt gebracht, bei einem pH und einer Temperatur und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um zumindest eine Mehrheit und vorzugsweise im wesentlichen alle Isoflavon-Glucoside in Aglucon- Isoflavone umzuwandeln. Wenn notwendig, sollte der pH der mit Isoflavon-Glucosid angereicherten Molke eingestellt werden, innerhalb eines pH-Bereichs zu sein, in dem die Enzyme aktiv mit den Isoflavon- Glucosiden reagieren. Der pH-Bereich, über welchen die vereinigten Restenzyme und ergänzenden Enzyme mit den Isoflavon-Glucosiden reagieren, liegt vorzugsweise bei 3 bis 9.

Die Erfinder haben gefunden, daß das Restenzym in der Molke innerhalb eines pH-Bereichs von 7 bis 9 aktiv ist, obwohl man annimmt, daß der pH der Molke während des Verlaufs der Reaktion herabgesetzt wird. Die ergänzenden Enzyme sind innerhalb eines optimalen pH-Bereichs aktiv, der vom Hersteller des Enzyms spezifiziert ist, wie vorstehend für mehrere spezielle Enzyme angegeben ist. Typischerweise sind die ergänzenden Enzyme entweder in einem neutralen pH-Bereich von 6 bis 8 oder in einem sauren pH-Bereich von 4 bis 6 aktiv. Es wurde auch gezeigt, daß die sauren Enzyme bei einem pH von etwa 3 aktiv sind.

Der pH der Molke kann von dem relativ hohen oder basischen pH des ersten Schritts durch die Zugabe einer oder mehrerer geeigneter Säuren, wie Essigsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Chlorwasserstoffsäure, oder eines anderen geeigneten Reagenzes eingestellt, in den meisten Fällen verringert werden. Vorzugsweise ist das verwendete Reagenz ein lebensmittelgerechtes saures Reagenz oder eine Säure.

Der Temperaturbereich für die Umwandlung der Isoflavon-Glucoside in Aglucon-Isoflavone liegt vorzugsweise bei 5ºC bis 75ºC. Die Temperatur beeinflußt die Aktivität der Enzyme und deshalb die Umwandlungsgeschwindigkeit wesentlich. Die ergänzenden Enzyme können oberhalb von 72,5ºC aktiv sein, zum Beispiel ist Alpha-Gal 600L bei 75ºC aktiv, es wird jedoch bevorzugt, die Umwandlung bei tieferen Temperaturen durchzuführen, um eine Desaktivierung des Enzyms zu vermeiden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Umwandlung bei einer Temperatur von 35ºC bis 45ºC ausgeführt.

Vorzugsweise wird die Enzymreaktion bei der gleichen Temperatur durchgeführt wie der erste Reaktionsschritt, wodurch die Notwendigkeit beseitigt wird, die Temperatur der Molke nach dem ersten Umwandlungsschritt zu ändern. Am meisten bevorzugt werden der zweite Umwandlungsschritt und der erste Umwandlungsschritt beide bei etwa 35ºC durchgeführt.

Es wird ebenfalls bevorzugt, daß während der Umwandlung der Isoflavon-Glucoside in Aglucon- Isoflavone eine konstante Temperatur aufrechterhalten wird. In einigen Fällen kann es jedoch wünschenswert sein, die Temperatur während des Verlaufs der Reaktion zu erhöhen, herabzusetzen oder in anderer Weise zu ändern.

Die Zeit, die für den zweiten Reaktionsschritt erforderlich ist, hängt von Faktoren ab, die mit dem Enzym in Zusammenhang stehen, insbesondere Konzentration und die Temperatur und der pH der Molke. In den meisten Fällen ist es möglich, innerhalb von 24 Stunden eine vollständige Umwandlung zu erreichen, es wird jedoch bevorzugt, daß ergänzendes Enzym hinzugegeben wird, wobei die Geschwindigkeit der Reaktion dramatisch erhöht wird. Das ausgewählte ergänzende Enzym, die Enzymkonzentration, der pH und die Temperatur bewirken vorzugsweise eine im wesentlichen vollständige Umwandlung innerhalb von 2 Stunden und am meisten bevorzugt innerhalb von 1 Stunde.

Das Ausmaß der Umwandlung von Isoflavon-Glucosiden in Aglucon-Isoflavone im zweiten Umwandlungsschritt ist bemerkenswert, typischerweise von 80% bis zu 100%. Eine Umwandlung von mindestens 95% der Isoflavon-Glucoside in Aglucon-Isoflavone wird gewöhnlich erreicht.

Die gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugte Pflanzenproteinmolke hat im Anschluß an die zwei Umwandlungsschritte eine signifikant erhöhte Konzentration an Aglucon-Isoflavonen. Typischerweise sind im Anschluß an die zwei Umwandlungsschritte zumindest eine Mehrheit der Isoflavone in der Pflanzenproteinmolke Aglucon-Isoflavone. Vorzugsweise enthält eine Pflanzenproteinmolke nach den zwei Umwandlungsschritten mindestens 0,5 mg/g Genistein und mindestens 0,3 mg/g Daidzein auf einer Trockenbasis und enthält stärker bevorzugt von 1,0 bis 2,0 mg/g Genistein und von 1,0 bis 2,0 mg/g Daidzein auf einer Trockenbasis und enthält am meisten bevorzugt mindestens 1,5 mg/g (vornehmlich von 1,5 bis 2,0 mg/g) Genistein und mindestens 1,3 mg/g (vornehmlich von 1,3 bis 2,0 mg/g) Daidzein auf einer Trockenbasis.

Im Anschluß an die Umwandlung der Isoflavon-Glucoside in Aglucon-Isoflavone kann die mit Aglucon-Isoflavon angereicherte Molke wie gewünscht, ohne zu trocknen oder das Protein in der Molke abzutrennen, verwendet werden, oder in einer anderen Ausführungsform kann ein Aglucon-Isoflavon- Molke-Proteinmaterial gewonnen werden, wobei die Aglucon-Isoflavone in dem Proteinmaterial angereichert werden. Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial, wie es hier verwendet wird, ist als Material definiert, das Protein, Aglucon-Isoflavone und restliche Pflanzenverbindungen enthält, die von einer Pflanzenproteinmolke abgetrennt werden können. Mit Aglucon-Isoflavonen angereichertes Proteinmaterial kann durch herkömmliche Verfahren wie Ultrafiltration, Hitzekoagulation und Entwässerung gewonnen werden. Das so erhaltene Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial kann durch herkömmliche Mittel entwässert und getrocknet werden.

Das Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial kann auch aus der Molke gewonnen werden, indem die Molke abgekühlt wird. Das Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial ist in der abgekühlten Molke unlöslich und kann als Niederschlag von der Molke abgetrennt werden, indem die abgekühlte Molke zentrifugiert wird. Vorzugsweise wird die Molke auf etwa 4ºC gekühlt, um das Proteinmaterial auszufällen.

Das Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial hat eine im Vergleich mit einem herkömmlichen Molke-Proteinmaterial signifikant erhöhte Konzentration an Aglucon-Isoflavonen. Typischerweise sind zumindest eine Mehrheit der Isoflavone in dem Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial Aglucon- Isoflavone. Vorzugsweise enthält das mit Aglucon-Isoflavon angereicherte Molke-Proteinmaterial mindestens 3,0 mg/g Genistein und mindestens 2,5 mg/g Daidzein und enthält stärker bevorzugt 4,0 bis 11,0 mg/g Genistein und 2,6 bis 8,0 mg/g Daidzein und enthält am meisten bevorzugt mindestens 9,0 mg/g (vornehmlich von 9,0 bis 11,0 mg/g) Genistein und mindestens 6,1 mg/g (vornehmlich von 6,1 bis 8,0 mg/g) Daidzein.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Molke eingeengt, um die Gewinnung des Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterials zu erhöhen. Es wurde gefunden, daß die Vergrößerung des Verhältnisses Feststoffe zu Flüssigkeit in der Molke durch Einengen der Molke die Gewinnung des Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterials aus der Molke vergrößert. Die Molke kann eingeengt werden, indem sie erhitzt wird, die Molke unter verminderten Druck gesetzt wird oder beides. Vorzugsweise wird die Molke auf ein Verhältnis Feststoffe zu Flüssigkeit von 1 : 3 bis 1 : 6, am meisten bevorzugt etwa 1 : 3, eingeengt.

Ein Material mit hohem Genisteingehalt und ein Material mit hohem Daidzeingehalt können aus dem gewonnenen Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial hergestellt werden. Wie hier verwendet, ist ein Material mit hohem Genisteingehalt als ein Pflanzenmaterial definiert, das mindestens 40% Genistein und am meisten bevorzugt mindestens 90% Genistein enthält, zusammen mit restlichem Pflanzenmaterial, welches restliches Sojamaterial ist, wenn das Material mit hohem Genisteingehalt aus einer Sojamolke gewonnen wird. Ein Material mit hohem Daidzeingehalt enthält mindestens 40% Daidzein zusammen mit restlichem Pflanzenmaterial.

Um die Materialien mit hohem Genistein- und hohem Daidzeingehalt herzustellen, wird das Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial am Anfang gewaschen, um unerwünschte Salze und Zucker zu entfernen, und dann getrocknet. Um das Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial zu waschen, wird das Material mit Wasser verdünnt, vorzugsweise auf 1% Feststoffe bis 6% Feststoffe und am meisten bevorzugt auf etwa 2% Feststoffe. Das Waschwasser kann eine beliebige Temperatur haben, es wird jedoch bevorzugt, daß das Waschen bei 25ºC bis 75ºC, am meisten bevorzugt etwa 60ºC, geschieht. Nach dem Waschen des Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterials wird das Material von der Waschflüssigkeit abgetrennt und getrocknet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Material abgetrennt, indem das Material zentrifugiert wird und die überstehende Flüssigkeit von dem Material dekantiert wird.

Das Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial kann dann mit einem Extraktionsmittel in Form eines wäßrigen Alkohols extrahiert werden, um die Aglucon-Isoflavone aus dem Molkenprotein zu entfernen und einen mit Aglucon-Isoflavon angereicherten Extrakt herzustellen. Alkohole mit niedrigem Molekulargewicht wie Methanol und besonders Ethanol werden als die Alkoholkomponente des Extraktionsmittels bevorzugt. Es wurde gefunden, daß die Aglucon-Isoflavone bei fast allen Alkoholkonzentrationen des Extraktionsmittels löslich sind. Die Aglucon-Isoflavone sind besonders löslich, wenn das Extraktionsmittel von 30% Alkohol bis 90% Alkohol, am meisten bevorzugt von 60% Alkohol bis 80% Alkohol, enthält. Obgleich wäßriger Alkohol das bevorzugte Lösungsmittel ist, können andere Lösungsmittel einschließlich Wasser, Acetonitril, Methylenchlorid, Aceton und Ethylacetat sowie Gemische dieser Lösungsmittel verwendet werden, um die Extraktion der Aglucon-Isoflavone aus dem Molke-Proteinmaterial zu bewirken.

Die Extraktion wird vorzugsweise unter Verwendung einer minimalen Menge von Extraktionsmittel ausgeführt. Es wird bevorzugt, daß das Gewichtsverhältnis von Extraktionsmittel zu Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial 11 : 1 nicht überschreitet. In einer Ausführungsform kann das Material extrahiert werden, indem ein Verfahren einer Gegenstromextraktion verwendet wird, wobei das Gewichtsverhältnis von Extraktionsmittel zu Material von 6 : 1 bis etwa 8 : 1 beträgt. In einer anderen Ausführungsform kann das Material mit zwei Portionen des Extraktionsmittels extrahiert werden, wobei das vereinigte Gewichtsverhältnis von Extraktionsmittel zu Material 11 : 1 nicht überschreitet.

Obwohl die Extraktion bei einem beliebigen ph ausgeführt werden kann, wird bevorzugt, daß das Extraktionsmittel einen ph um den isoelektrischen Punkt des Proteins in dem Aglucon-Isoflavon-Molke- Proteinmaterials herum hat, um die Löslichkeit des Proteins in dem Extraktionsmittel zu minimieren.

Vorzugsweise hat das Extraktionsmittel einen pH-Wert von 3 bis 6 und am meisten bevorzugt etwa 4,5, wenn das Molkenprotein ein Sojamolkenprotein ist.

Die Extraktion kann bei einer beliebigen Temperatur bis zum Siedepunkt des Extraktionsmittels durchgeführt werden und wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 25ºC bis 70ºC durchgeführt. Um die Zeit zum Extrahieren der Aglucon-Isoflavone aus dem Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial zu verringern, wird bevorzugt, die Extraktion bei einer über die Raumtemperatur angehobenen Temperatur durchzuführen, am meisten bevorzugt bei etwa 60ºC.

Im Anschluß an die Extraktion können ein Material mit hohen Genisteingehalt und ein Material mit hohem Daidzeingehalt aus dem mit Aglucon-Isoflavon angereicherten Extrakt abgetrennt werden, indem der Extrakt mit einem Adsorptionsmaterial für eine Zeit in Kontakt gebracht wird, die ausreichend ist, um die Materialien mit hohem Genistein- und hohem Daidzeingehalt aus dem Extrakt abzutrennen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Materialien mit hohem Genistein- und hohem Daidzeingehalt durch Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie ("HPLC") aus dem Extrakt abgetrennt. Genistein und Daidzein werden von anderen Isoflavonen und Verunreinigungen in dem Extrakt getrennt, indem der Extrakt durch Teilchen eines Adsorptionsmaterials, welches das Genistein, Daidzein, andere Isoflavone und Verunreinigungen in einer verbindungsspezifischen Weise lösbar bindet, hindurch eluiert wird, wodurch ermöglicht wird, daß jede von den Verbindungen abgetrennt wird.

Der mit Aglucon-Isoflavon angereicherte Extrakt wird am Anfang filtriert, um unlösliches Material zu entfernen, das eine HPLC-Säule verstopfen könnte. Eine HPLC-Säule wird hergestellt, indem eine herkömmliche, im Handel erhältliche HPLC-Säule mit einem Partikel-Adsorptionsmaterial gepackt wird, welches das Genistein, Daidzein, andere Isoflavone und Verunreinigungen in einer verbindungsspezifischen Weise lösbar bindet. Das Adsorptionsmaterial kann ein beliebiges Umkehrphasen-HPLC-Packungsmaterial sein, ein bevorzugtes Packungsmaterial kann jedoch nach Kriterien der Belastbarkeit, der Trennwirkung und der Kosten ausgewählt werden. Ein solches bevorzugtes Packungsmaterial ist Kromasil C18 16 um, 100-Å-Kügelchen, erhältlich von Eka Nobel, Nobel Industries, Schweden.

Der filtrierte Extrakt wird durch die gepackte HPLC-Säule fließen gelassen, bis alle Bindungsstellen der Säule vollständig mit Isoflavonen gesättigt sind, was durch das Erscheinen von Isoflavonen im Ablauf aus der Säule festgestellt wird. Die HPLC-Säule kann dann mit einem polaren Eluenten eluiert werden, um die Trennung zu bewirken. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Eluent ein wäßriger Alkohol. Der Eluent in Form eines wäßrigen Alkohols kann einen Alkoholgehalt von 30% bis etwa 90% Alkohol haben und hat vorzugsweise einen Alkoholgehalt von etwa 50% Alkohol, um sowohl gute Trennung als auch gute Löslichkeit der Isoflavone bereitzustellen. Der Alkohol ist vorzugsweise Methanol oder Ethanol, wobei Ethanol bevorzugt wird, wenn Produktmaterialien mit hohem Genistein- oder hohem Daidzeingehalt in Nahrungsmittel- oder Arzneimittelanwendungen verwendet werden sollen.

Die Materialien mit hohem Genistein- und hohem Daidzeingehalt werden aus dem Ablauf der Säule gesammelt. Eine Fraktion des Ablaufs, die Daidzein enthält, wird zuerst aus der Säule eluiert, gefolgt von einer Glyciteinfraktion, der die polarere Genisteinfraktion folgt. Die Daidzein- und Genisteinfraktion werden gesammelt, wenn sie aus der Säule eluiert werden. Die Glyciteinfraktion kann, wenn gewünscht, ebenfalls gesammelt werden.

Der Alkohol in den Fraktionen kann durch Verdampfung entfernt werden, wonach die Materialien mit hohem Genistein- und hohem Daidzeingehalt und ein Material mit hohem Glyciteingehalt durch herkömmliche Trennungsmethoden wie Zentrifugieren oder Filtrieren gewonnen werden können. Das gewonnene Material mit hohem Genisteingehalt enthält mindestens 40% Genistein und vorzugsweise mindestens 90% Genistein zusammen mit restlichem Pflanzenmaterial, welches restliches Sojamaterial ist, wenn das Genistein aus einer Sojamolke gewonnen wird. Das gewonnene Material mit hohem Daidzeingehalt enthält mindestens 40% Daidzein, zusammen mit restlichem Pflanzenmaterial, welches typischerweise eine signifikante Menge von Glycitein einschließt.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Aglucon-Isoflavon-Material aus dem mit Aglucon-Isoflavon angereicherten Extrakt hergestellt. Wie hier verwendet ist ein Aglucon-Isoflavon- Material als ein Material definiert, das mindestens 10% Genistein und mindestens 5% Daidzein wie auch andere Isoflavone und restliche Pflanzenverbindungen enthält.

Im Anschluß an die Extraktion des Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterials kann der mit Aglucon-Isoflavon angereicherte Extrakt eingeengt werden, um die Ausfällung der Aglucon-Isoflavone aus dem Extrakt zu erleichtern. Der Extrakt kann eingeengt werden, indem der Extrakt erhitzt wird, der Extrakt unter verminderten Druck gesetzt wird oder beides. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Extrakt auf 15% bis 30% seines ursprünglichen Volumens eingeengt.

Ein Aglucon-Isoflavon-Material wird aus dem Extrakt ausgefällt, indem Wasser zu dem Extrakt hinzugegeben wird. In einer bevorzugten Ausführungsform werden 6 bis 8 Teile Wasser pro Teil des eingeengten Extrakts hinzugegeben. Nach Zugabe von Wasser zu dem Extrakt wird etwas Aglucon- Isoflavon-Material ausgefällt.

Um die Gewinnung des Aglucon-Isoflavon-Materials aus dem Extrakt zu maximieren, werden der Extrakt und das Wasser sorgfältig gemischt und dann abgekühlt. Der Extrakt und das Wasser werden für einen Zeitraum, vorzugsweise von 30 Minuten bis 1 Stunde, zusammengemischt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden der Extrakt und das Wasser bei einer Temperatur von 50ºC bis 75ºC, am meisten bevorzugt etwa 70ºC, gemischt. Nachdem das Wasser und der Extrakt sorgfältig gemischt sind, wird das Gemisch abgekühlt, um das Aglucon-Isoflavon-Material auszufüllen. Vorzugsweise wird das Extrakt/Wasser-Gemisch auf eine Temperatur von 5ºC bis 20ºC und am meisten bevorzugt auf etwa 10ºC für einen Zeitraum abgekühlt, der ausreichend ist, im wesentlichen das ganze Aglucon-Isoflavon-Material auszufällen. Das ausgefällte Aglucon-Isoflavon-Material kann dann von dem Extrakt/Wasser-Gemisch in einer herkömmlichen Weise wie beispielsweise durch Zentrifugieren oder Filtrieren, getrennt werden.

Das abgetrennte Aglucon-Isoflavon-Material kann dann mit Wasser gewaschen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Aglucon-Isoflavon-Material mit Wasser für etwa 5 Minuten bei einer Temperatur von etwa 70ºC gewaschen, wobei das Gewichtsverhältnis der Wasserwaschflüssigkeit zu dem Material 0,8 : 1 bis 2 : 1 beträgt. Das Aglucon-Isoflavon-Material wird von der Waschflüssigkeit durch herkömmliche Mittel wie Filtrieren oder Zentrifugieren getrennt und getrocknet. Das gewonnene Aglucon- Isoflavon-Material enthält typischerweise mindestens 20% Genistein und mindestens 10% Daidzein, wobei der verbliebene Inhalt des Materials aus restlichen Pflanzenmaterialien, einschließlich anderer Aglucon- Isoflavone, gebildet wird. Die restlichen Pflanzenmaterialien sind Sojamaterialien, wenn das Aglucon- Isoflavon-Material aus Sojamolke isoliert wird.

Das gewonnene Aglucon-Isoflavon-Material kann weiter gereinigt werden, um ein Material mit hohem Genisteingehalt, das mindestens 40% Genistein und vorzugsweise mindestens 90% Genistein enthält, und ein Material mit hohem Daidzeingehalt, das mindestens 40% Daidzein enthält, herzustellen. Das Aglucon-Isoflavon-Material kann in einem Lösungsmittel in Form eines wäßrigen Alkohols solvatisiert werden. Alkohole mit niedrigem Molekulargewicht werden als die Alkoholkomponente des Lösungsmittels bevorzugt, wobei Ethanol wegen seiner geringen Toxizität für Lebensmittel- und Arzneimittelanwendungen am meisten bevorzugt wird. Der Alkoholgehalt des Lösungsmittels beträgt vorzugsweise von 30% bis 90%, wobei ein Alkoholgehalt von etwa 80% am meisten bevorzugt wird, um gute Solvatisierung des Aglucon- Isoflavon-Materials bereitzustellen.

Die das solvatisierte Aglucon-Isoflavon-Material enthaltende Lösung in einem wäßrigen Alkohol kann mit einem Adsorptionsmaterial für eine Zeit in Kontakt gebracht werden, die ausreichend ist, um die Materialien mit hohem Genistein- und hohem Daidzeingehalt aus der Lösung in einem wäßrigen Alkohol abzutrennen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Materialien mit hohem Genistein- und hohem Daidzeingehalt aus der Lösung in einem wäßrigen Alkohol durch Umkehrphasen-HPLC abgetrennt. Eine HPLC-Säule wird wie vorstehend beschrieben hergestellt, die Lösung in einem wäßrigen Alkohol, die das Aglucon-Isoflavon-Material enthält, wird auf die Säule aufgegeben, und ein Material mit hohem Genisteingehalt und ein Material mit hohem Daidzeingehalt werden in der vorstehend beschriebenen Weise aus der Säule eluiert. Das Material mit hohem Genisteingehalt enthält mindestens 40% Genistein, vorzugsweise mindestens 90% Genistein, zusammen mit restlichem Pflanzenmaterial, welches restliches Sojamaterial ist, wenn das Genistein aus einer Sojamolke gewonnen wird. Das Material mit hohem Daidzeingehalt enthält mindestens 40% Daidzein, zusammen mit restlichem Pflanzenmaterial.

EXPERIMENTELLES

Die vorliegende Erfindung wird ausführlicher durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, wobei eine Sojamolke als die Pflanzenproteinmolke verwendet wird.

Wie vorstehend vermerkt schließt Sojamolke die Genistein-, Daidzein- und Glycitein-"Familien" von Isoflavonen ein, die entsprechende Glucosid-, Konjugat- und Agluconbestandteile haben, wobei die Genistein-Familie die Konjugate 6"-OMal-Genistin und 6"-OAc-Genistin, das Glucosid Genistin und das Aglucon Genistein enthält; die Daidzein-Familie die Konjugate 6"-OMal-Daidzin und 6"-OAc-Daidzin, das Glucosid Daidzin und das Aglucon Daidzein enthält; und die Glycitein-Familie das Konjugat 6"-OMal- Glycitin, das Glucosid Glycitin und das Aglucon Glycitein enthält. In den folgenden Tabellen sind die relativen Konzentrationen der Isoflavone als Prozentsatz einer Familie von Isoflavonen gemessen. Zum Beispiel in der Genistein-Familie: % Genistin + % 6"-OMal-Genistin + % 6"-OAc-Genistin + % Genistein = 100%. Das Ausmaß der Umwandlung von Konjugaten in Glucoside und von Glucosiden in Aglucone kann durch Vergleichen der Prozentsätze jeder Art von Verbindung in einer Isoflavon-Familie bestimmt werden.

BEISPIEL 1

In einem ersten Experiment wird die Umwandlung von Isoflavon-Konjugaten in Isoflavon- Glucoside untersucht. Das Ausmaß der Umwandlung wird durch die quantitative Abnahme des Prozentgehalts der Malonat- und Acetatester einer Isoflavon-Familie, gekoppelt mit einer entsprechenden quantitativen Zunahme des Prozentgehalts des Glucosids der gleichen Isoflavon-Familie bestimmt. Die Auswirkung unterschiedlicher pH-Bedingungen auf den ersten Schritt der Umwandlung von Isoflavon-Konjugaten in Isoflavon-Glucoside wird bei zwei verschiedenen Temperaturen gemessen.

Sprühgetrocknete Sojamolke wird in Wasser aufgeschlämmt, um eine Sojamolkensuspension mit 2 Gew.-% Feststoffen zu erzeugen. Die Sojamolke wird in zwei Gruppen von vier Proben aufgeteilt. Die Proben jeder Gruppe werden auf einen pH von 6,0, 7,0, 9,0 bzw. 11,0 eingestellt. Die Gruppen von Proben werden 24 Stunden lang inkubiert, wobei eine Gruppe von Proben bei 45ºC inkubiert wird und die andere Gruppe von Proben bei 72,5ºC inkubiert wird. Periodische Analyse wird an jeder Probe nach 0, 2, 4, 6, 8 und 24 Stunden durchgeführt, um den Isoflavongehalt der Proben zu bestimmen. Die nachstehende Tabelle 1 zeigt die Änderung und Verteilung der Isoflavone während des Verlaufs des Experiments.

TABELLE 1
TABELLE 1 (FORTSETZUNG)
TABELLE 1 (FORTSETZUNG)
TABELLE 1 (FORTSETZUNG)
TABELLE 1 (FORTSETZUNG)
TABELLE 1 (FORTSETZUNG)
TABELLE 1 (FORTSETZUNG)
TABELLE 1 (FORTSETZUNG)

Wie durch die Abnahmen der relativen Konzentration der 6"-OMal- und der 6"-OAc-Isoflavon- Konjugatverbindungen und die entsprechenden Zunahmen der Konzentration der Glucoside Genistin, Daidzin und Glycitin gezeigt ist, ist der erste Umwandlungsschritt am schnellsten und vollständigsten bei höheren, stärker basischen pH-Bedingungen und höheren Temperaturen. Eine im wesentlichen vollständige Umwandlung der Isoflavon-Konjugate in Isoflavon-Glucoside erfolgt in den pH-9- und -11-Proben sowohl bei 45ºC als auch bei 72,5ºC. Die Umwandlung verläuft auch in den pH-6- und -7-Proben bei 72,5ºC nahezu bis zur Vollständigkeit.

BEISPIEL 2

In einem zweiten Experiment wird die Umwandlung von Isoflavon-Glucosiden in Aglucon- Isoflavone untersucht. Eine mit Isoflavon-Glucosid angereicherte Molke, hergestellt durch den ersten Umwandlungsschritt, wird verwendet, um den zweiten Umwandlungsschritt zu untersuchen. Das Ausmaß der Umwandlung wird durch die quantitative Abnahme des Prozentgehalts des Glucosids einer Isoflavon- Familie, gekoppelt mit einer entsprechenden quantitativen Zunahme des Prozentgehaltes des Aglucons der selben Isoflavon-Familie bestimmt.

Sojamolke wird in mit Isoflavon-Glucosid angereicherte Molke umgewandelt, indem der pH der Molke auf 11,0 eingestellt wird und 30 Minuten bei 35ºC inkubiert wird. Eine Probe der mit Glucosid angereicherten Molke wird für 24 Stunden bei 45ºC inkubiert, um die Umwandlung von Isoflavon- Glucosiden in Aglucon-Isoflavone durch Restenzyme in der Molke zu messen. Andere Proben der mit Glucosid angereicherten Molke werden mit den folgenden im Handel erhältlichen ergänzenden Enzymen inokuliert: Biopectinase 100L, Biopectinase 300L, Biopectinase OK70L, Lactase F, Alpha-Gal 600L, G- Zyme 6990, Quest Biolactase 30000, Novo Lactozyme 3000L, Maxilact L2000, Enzeco Fungal Lactase, Pfizer Neutral Lactase und Quest Neutral Lactase. Proben, die mit Alpha-Gal 600L, G-Zyme 6990, Biopectinase 100L, Biopectinase 300L, Biopectinase OK70L, Lactase F und Enzeco Fungal Lactase inokuliert werden, werden vor der Inokulation auf pH 4,5 pH-eingestellt. Proben, die mit Novo Lactozyme 3000L, Maxilact L2000, Pfizer Neutral Lactase, Quest Biolactase 30000 und Quest Neutral Lactase inokuliert werden, werden vor der Inokulation auf einen pH von 4,5 und 7,0 pH-eingestellt. Die Proben mit dem ergänzenden Enzym werden dann bei 50ºC inkubiert, außer der Lactase-F-Probe, die bei 35ºC inkubiert wird, und den Proben mit Biopectinase 300L und Biopectinase OK70L, die bei 40ºC inkubiert werden. Unterproben werden nach Zeitintervallen entnommen und auf Isoflavongehalt gemessen. Die nachstehende Tabelle 2 zeigt die Verteilung von Isoflavonen während des Verlaufs des Experiments.

TABELLE 2
TABELLE 2 (FORTSETZUNG)
TABELLE 2 (FORTSETZUNG)
TABELLE 2 (FORTSETZUNG)
TABELLE 2 (FORTSETZUNG)
TABELLE 2 (FORTSETZUNG)
TABELLE 2 (FORTSETZCING)
TABELLE 2 (FORTSETZUNG)
TABELLE 2 (FORTSETZUNG)
TABELLE 2 (FORTSETZUNG)
TABELLE 2 (PORTSETZLTNG)

Wie durch die Umwandlung von Genistin, Daidzin und Glycitin in Genistein, Daidzein bzw. Glycitein gezeigt ist, wird im wesentlichen vollständige Umwandlung der Isoflavon-Glucoside in Aglucon- Isoflavone erreicht. Die ergänzenden Enzyme vergrößern die Umwandlungsgeschwindigkeit bemerkenswert, wobei mit bestimmten ergänzenden Enzymen im wesentlichen vollständige Umwandlung innerhalb 1 Stunde bewirkt wird. Die bei pH 4,5 am wirksamsten gefundenen ergänzenden Enzyme sind Biopectinase 100L, Biopectinase 300L, Lactase F, Alpha-Gal 600L, G-Zyme G990, Quest Biolactase 30000 und Enzeco Fungal Lactase. Die bei pH 7,0 am wirksamsten gefundenen ergänzenden Enzyme sind Quest Biolactase 30000 und Quest Neutral Lactase.

BEISPIEL 3

In einem anderen Experiment wird ein Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial aus einer mit Aglucon-Isoflavon angereicherten Sojamolke gewonnen. Eine erste Probe von mit Aglucon-Isoflavon angereicherter Sojamolke, die 1000 g wiegt, die 30 mg Genistein, 37 mg Daidzein und 7 mg Glycitein enthält, wird durch Verdampfen über geringer Hitze auf 163 g eingeengt (Verhältnis der Einengung 1 : 6,1). Die eingeengte Molke wird erhitzt, um Proteinmaterial in der Molke zu koagulieren, und wird zentrifugiert, um das Molke-Proteinmaterial weiter einzuengen. 21 g Molke-Proteinmaterial, die 25 mg Genistein, 32 mg Daidzein und 6 mg Glycitein enthalten, werden aus der Molke abgetrennt. Das gewonnene Molke- Proteinmaterial enthält 82% des Genisteins, 88% des Daidzeins und 77% des Glyciteins in der vereinigten Molke und dem Molke-Proteinmaterial.

Eine zweite Probe der mit Aglucon-Isoflavon angereicherten Sojamolke, die 400 g wiegt und 12 mg Genistein, 15 mg Daidzein und 3 mg Glycitein enthält, wird erhitzt, um Proteinmaterial in der Molke zu koagulieren, ohne die Molke einzuengen. Das koagulierte Molke-Proteinmaterial und die Molke werden zentrifugiert, um das Molke-Proteinmaterial weiter einzuengen. 8,7 g Molke-Proteinmaterial werden gewonnen, die 5 mg Genistein, 7 mg Daidzein und 1 mg Glycitein enthalten. Das gewonnene Molke- Proteinmaterial enthält 44% des Genisteins, 47% des Daidzeins und 34% des Glyciteins in dem vereinigten Molke-Proteinmaterial und der Molke.

Vergleicht man die Molke-Proteinmaterialien der ersten und zweiten Probe, ist klar, daß das Einengen der mit Aglucon-Isoflavon angereicherten Molke vor dem Abtrennen des Molke-Proteinmaterials zu einer erhöhten Gewinnung der Aglucon-Isoflavone in dem Molke-Proteinmaterial führt.

BEISPIEL 4

In einem anderen Experiment wird ein Aglucon-Isoflavon-Material gewonnen, indem ein Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial mit einem wäßrigen Alkoholextrakt extrahiert wird und das Aglucon-Isoflavon-Material aus dem Extrakt ausgefällt wird.

Achthundereinundzwanzig Gramm Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial, die 86% Protein auf Trockenbasis, 4,7 g Genistein, 2,2 g Daidzein und 0,36 g Glycitein enthalten, werden bereitgestellt, indem die Isoflavon-Konjugate und Isoflavon-Glucoside in der Molke in Aglucon-Isoflavone umgewandelt werden und das Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial aus der Molke gewonnen wird. Das Aglucon- Isoflavon-Molke-Proteinmaterial wird mit 6360 g einer 80 : 20-Gewichtsprozent-Ethanol/Wasser-Lösung (7,7 : 1-Lösung/Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial) 45 Minuten bei 60ºC extrahiert. Nach der Extraktion wird die so erhaltene Aufschlämmung auf 25ºC abgekühlt und unter Vakuum über Whatman- Filterpapier Nr. 4 flltriert. Ein feuchter Kuchen, der 1584 g wiegt, der 798 g Feststoffe, 0,8 g Genistein, 0,4 g Daidzein und 0,02 g Glycitein enthält, wird zusammen mit 3397 g eines klaren Extrakts, die 23 g Feststoffe, 3,9 g Genistein, 1,8 g Daidzein und 0,34 g Glycitein enthalten, gewonnen.

Der Kuchen wird ein zweites Mal mit 2000 g einer 80 : 20-Gewichtsprozent-EthanollWasser- Lösung (2,3 : 1-Lösung/anfängliches Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial) für 5 Minuten bei 25ºC extrahiert. Nach der zweiten Extraktion wird die so erhaltene Aufschlämmung wieder über Whatman- Filterpapier Nr. 4 filtriert. Ein feuchter Kuchen, der 1542 g wiegt und 794 g Feststoffe, 0,3 g Genistein, 0,1 g Daidzein und 0,01 g Glycitein enthält, wird zusammen mit einen zweiten Extrakt gewonnen, der 2042 g wiegt und 4,0 g Feststoffe, 0,5 g Genistein, 0,3 g Daidzein und 0,01 g Glycitein enthält. Die Extrakte werden vereinigt und enthalten 94% des Genisteins und 95% des Daidzeins, die anfänglich in dem Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial waren.

Die Extrakte werden dann durch Verdampfen in einem Buchi-Verdampfer unter Vakuum bei 70ºC auf 1528 g (20% des ursprünglichen vereinigten Extraktvolumens) eingeengt. 6000 g deionisiertes Wasser werden zu dem eingeengten Extrakt (4 : 1-Wasser/Extrakt) hinzugefügt. Wenn das Wasser hinzugefügt wird, bilden sich weiße Isoflavonniederschläge. Die Aufschlämmung des Niederschlags wird für 45 Minuten auf 70ºC erwännt. Die Aufschlämmung wird dann fur 24 Stunden bei 4ºC gekühlt, um den Isoflavonniederschlägen zu erlauben, sich zu bilden und abzusetzen. 7300 g überstehende Flüssigkeit werden von dem Niederschlag abdekantiert, und die verbliebene Aufschlämmung wird zentrifugiert, um den Niederschlag zu gewinnen. Der gewonnene Niederschlag wird wiederum mit 600 g deionisiertem Wasser 15 Minuten bei 70ºC gewaschen. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren gewonnen und unter Vakuum bei 50ºC getrocknet.

Ein getrocknetes Aglucon-Isoflavon-Material, das 7,3 g wiegt und 49% Genistein, 19% Daidzein und 4% Glycitein enthält, wird gewonnen.

BEISPIEL 5

In einem anderen Experiment werden ein Material mit hohem Genisteingehalt und ein Material mit hohen Daidzeingehalt aus einem Aglucon-Isoflavon-Material durch Umkehrphasen-HPLC abgetrennt. Zwei Gramm Aglucon-Isoflavon-Material, das 55% Genistein, 21% Daidzein und 4% Glycitein auf Trockenbasis enthält, werden zu 1 Liter 50 : 50-Gewichtsprozent-Methanol/Wasser-Lösung hinzugegeben. Die Lösung wird durch ein Whatman-Filterpapier Nr. 5 und dann durch ein 0,45-um-Filter filtriert.

Die Lösung wird dann auf eine 25 cm lange HPLC-Säule von 2" Durchmesser aufgegeben, die mit Kromasil-Packungsmaterial (Kromasil C 18 16 um, 100-Å-Kügelchen) gepackt ist. Eine mobile Phase, die aus 50 : 50-Gewichtsprozent-Methanol/Wasser-Lösung besteht, wird dann mit einer Geschwindigkeit von 64 ml/Minute durch die Säule fließen gelassen. Das Erscheinen des Daidzeins, Glyciteins und Genisteins aus dem Ablauf der Säule wird durch UV-Absorption nachgewiesen. Daidzein wird in einer ersten Fraktion gesammelt, und Genistein wird in einer zweiten Fraktion gesammelt. Die Daidzein- und Genisteinfraktionen werden eingedampft, um den Alkohol zu entfernen, was die Materialien mit hohem Genistein- und hohem Daidzeingehalt in jeder entsprechenden Fraktion veranlaßt auszufallen. Die ausgefällten Materialien mit hohem Genistein- und hohem Daidzeingehalt werden durch Zentrifugieren gewonnen und in einem Vakuumofen getrocknet. Das gewonnene Material mit hohem Genisteingehalt enthält etwa 95% Genistein, und das gewonnene Material mit hohem Daidzeingehalt enthält etwa 45% Daidzein.

In den vorstehend beschriebenen Experimenten sind alle für 6"-OMal-Genistin, 6"-OAc-Genistin, 6"-OMal-Daidzin, 6"-OAc-Daidzin, 6"-OMal-Glycitin und Glycitein angegebenen Prozentgehalte berechnete Werte. Die angegebenen Prozentgehalte der Enzymkonzentration sind aus Gramm handelsüblicher Enzymzubereitung pro 100 Gramm Molkenfeststoffe oder pro 100 g Molke in jeder Probe berechnet.

Das folgende ist eine Beschreibung einer Methode zur Quantifizierung von Isoflavonen in Sojaprodukten. Die Isoflavone werden aus Sojaprodukten extrahiert, indem 0,75 Gramm einer Probe (sprühgetrocknetes oder fein gemahlenes Pulver) mit 50 ml 80/20-Methanol/Wasser-Lösungsmittel gemischt werden. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur mit einem Rundschüttler geschüttelt. Nach 2 Stunden werden die verbliebenen ungelösten Materialien durch Filtration durch Whatman- Filterpapier Nr. 42 entfernt. Fünf ml des Filtrats werden mit 4 ml Wasser und 1 ml Methanol verdünnt.

Die extrahierten Isoflavone werden durch HPLC (Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie) unter Verwendung einer Umkehrphasen-Säule Hewlett Packard C18 Hypersil abgetrennt. Die Isoflavone werden in die Säule eingespritzt und mit einem Lösungsmittel gradienteneluiert, wobei mit 88% Methanol, 10% Wasser und 2% Eisessig gestartet wird. Bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,4 ml/min werden alle Isoflavone - Genistin, 6"-O-Acetylgenistin, 6"-O-Malonylgenistin, Genistein, Daidzin, 6"-O-Acetyldaidzin, 6"-O-Malonyldaidzin, Daidzein, Glycitin, 6"-O-Malonylglycitin und Glycitein - klar getrennt. Der Nachweis der Peaks erfolgt durch UV-Absorption bei 260 nm. Die Identifizierung der Peaks wurde durch ein HPLC-Massenspektrometer durchgeführt.

Quantifizierung wird erreicht, indem reine Standards (Genistin, Genistein, Daidzin und Daidzein) verwendet werden, die von Indofine Chemical Company, Sommerville, N. J., gekauft wurden. Responsfaktoren (integrierte Fläche/Konzentration) werden für jede der vorstehenden Verbindungen berechnet und werden verwendet, um unbekannte Proben zu quantifizieren. Für die konjugierten Formen, für welche keine reinen Standards verfügbar sind, wird angenommen, daß die Responsfaktoren die des Elternmoleküls, aber korrigiert um den Unterschied im Molekulargewicht, sind. Es wird angenommen, daß der Responsfaktor für Glycitin der für Genistin, korrigiert um den Unterschied im Molekulargewicht, ist.

Diese Methode stellt die Mengen für jedes einzelne Isoflavon bereit. Zur Bequemlichkeit kann das Gesamtgenistein, das Gesamtdaidzein und das Gesamtglycitein berechnet werden und das Aggregatgewicht dieser Verbindungen darstellen, wenn alle konjugierten Formen in ihre entsprechenden unkonjugierten Formen umgewandelt sind. Diese Gesamtmengen können auch direkt durch eine Methode gemessen werden, die zur Umwandlung der unkonjugierten Formen saure Hydrolyse verwendet.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Herstellung einer mit Aglucon-Isoflavon angereicherten Pflanzenproteinmolke aus einer Isoflavon-Konjugate enthaltenden Pflanzenproteinmolke durch, in einem ersten Schritt, Behandeln der Pflanzenproteinmolke bei einer Temperatur und einem pH für eine Zeit, die ausreichend ist, um zumindest eine Mehrheit von Isoflavon-Konjugaten in Isoflavon-Glucoside umzuwandeln; und, in einem zweiten Schritt, Inkontaktbringen eines Enzyms mit den Isoflavon-Glucosiden bei einer Temperatur und einem pH für eine Zeit, die ausreichend ist, um zumindest eine Mehrheit der Isoflavon-Glucoside in Aglucon- Isoflavone umzuwandeln.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Enzym mit den Isoflavon-Glucosiden in der Pflanzenproteinmolke in Kontakt gebracht wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei dem die Pflanzenproteinmolke bei einem pH- Wert von 6 bis 13, 7 und bei einer Temperatur von 2ºC bis 121ºC behandelt wird, um die Isoflavon- Konjugate in Isoflavon-Glucoside umzuwandeln.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die Pflanzenproteinmolke bei einem pH-Wert von 9 bis 10 und bei einer Temperatur von 45ºC bis 73ºC behandelt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Zeit, um die Isoflavon-Konjugate in Isoflavon-Glucoside umzuwandeln, 4 Stunden bis 6 Stunden beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die Pflanzenproteinmolke bei einem pH-Wert von 10 bis 11 und bei einer Temperatur von 5ºC bis 50ºC behandelt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Zeit, um die Isoflavon-Konjugate in Isoflavon-Glucoside umzuwandeln, 0,5 Stunden bis 1 Stunde beträgt.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem mindestens 80% der Isoflavon- Konjugate in Isoflavon-Glucoside umgewandelt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem mindestens 90% der Isoflavon-Konjugate in Isoflavon- Glucoside umgewandelt werden.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Enzym bei einer Temperatur von 5ºC bis 75ºC und einem pH-Wert von 3 bis 9 mit den Isoflavon-Glucosiden in der Pflanzenproteinmolke in Kontakt gebracht wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das Enzym bei einer Temperatur von 35ºC bis 45ºC mit den Isoflavon-Glucosiden in der Pflanzenproteinmolke in Kontakt gebracht wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das Inkontaktbringen eines Enzyms mit den Isoflavon- Glucosiden in der Pflanzenproteinmolke das Hinzufügen einer wirksamen Menge eines ergänzenden Enzyms zu der Pflanzenproteinmolke umfaßt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem das ergänzende Enzym ein Saccharidase-Enzym umfaßt, das imstande ist, 1,4-Glucosid-Bindungen zu spalten.

14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem das ergänzende Enzym ein alpha-Glucosidase-Enzym, ein beta-Glucosidase-Enzym, ein beta-Galactosidase-Enzym, ein Glucoamylase-Enzym, ein Pectinase-Enzym oder eine Kombination von zwei oder mehreren davon ist.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem mindestens 80% der Isoflavon- Glucoside in Aglucon-Isoflavone umgewandelt werden.

16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem mindestens 90% der Isoflavon-Glucoside in Aglucon- Isoflavone umgewandelt werden.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Pflanzenproteinmolke Sojabohnenmolke umfaßt.

18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin umfassend die Gewinnung eines Protein und Aglucon-Isoflavone enthaltenden Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterials aus der mit Aglucon-Isoflavon angereicherten Pflanzenproteinmolke.

19. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem das Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial durch zumindest eines von Ultrafiltration, Hitzekoagulation und Entwässerung gewonnen wird.

20. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem das Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial durch Abkühlen der Pflanzenproteinmolke und Abtrennen des Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinniaterials aus der abgekühlten Molke gewonnen wird.

21. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem das Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterial aus eingeengter Pflanzenproteinmolke gewonnen wird.

22. Verfahren nach Anspruch 18, weiterhin umfassend:

a) Extrahieren des Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterials mit einem Extraktionsmittel in Form eines wäßrigen Alkohols, um einen mit Aglucon-Isoflavon angereicherten Extrakt herzustellen; und

b) Inkontaktbringen des Extrakts mit einem Adsorptionsmaterial für eine Zeit, die ausreichend ist, um ein Material mit hohem Genisteingehalt aus dem Extrakt abzutrennen.

23. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem das Inkontaktbringen des Extrakts mit einem Adsorptionsmaterial weiterhin das lösbare Binden von Genistein in dem Extrakt mit dem Adsorptionsmaterial umfaßt.

24. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem der Extrakt durch das Adsorptionsmaterial hindurch mit einem Eluenten eluiert wird, um ein Material mit hohem Genisteingehalt aus dem Extrakt abzutrennen.

25. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem das Material mit hohem Genisteingehalt mindestens 40% Genistein enthält.

26. Verfahren nach Anspruch 25, bei dem das Material mit hohem Genisteingehalt mindestens 90% Genistein enthält.

27. Verfahren nach Anspruch 18, weiterhin umfassend:

a) Extrahieren des Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterials mit einem Extraktionsmittel in Form eines wäßrigen Alkohols, um einen mit Aglucon-Isoflavon angereicherten Extrakt herzustellen; und

b) Inkontaktbringen des Extrakts mit einem Adsorptionsmaterial für eine Zeit, die ausreichend ist, um ein Material mit hohem Daidreingehalt aus dem Extrakt abzutrennen.

28. Verfahren nach Anspruch 27, bei dem das Inkontaktbringen des Extrakts mit einem Adsorptionsmaterial weiterhin das lösbare Binden von Daidzein in dem Extrakt mit dem Adsorptionsmaterial umfaßt.

29. Verfahren nach Anspruch 27, bei dem der Extrakt durch das Adsorptionsmaterial hindurch mit einem Eluenten eluiert wird, um ein Material mit hohem Daidzeingehalt aus dem Extrakt abzutrennen.

30. Verfahren nach Anspruch 27, bei dem das Material mit hohem Daidzeingehalt mindestens 40% Daidzein enthält.

31. Verfahren nach Anspruch 18, weiterhin umfassend:

a) Extrahieren des Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterials mit einem Extraktionsmittel in Form eines wäßrigen Alkohols, um einen mit Aglucon-Isoflavon angereicherten Extrakt herzustellen; und

b) Inkontaktbringen des Extrakts mit einem Adsorptionsmaterial für eine Zeit, die ausreichend ist, um ein Glycitein enthaltendes Material aus dem Extrakt abzutrennen.

32. Verfahren nach Anspruch 18, weiterhin umfassend:

a) Extrahieren des Aglucon-Isoflavon-Molke-Proteinmaterials mit einem Extraktionsmittel in Form eines wäßrigen Alkohols, um einen mit Aglucon-Isoflavon angereicherten Extrakt herzustellen;

b) Einengen des mit Aglucon-Isoflavon angereicherten Extrakts auf 15% bis 30% seines ursprünglichen Volumens; und

c) Ausfällen des Aglucon-Isoflavon-Materials durch Hinzufügen von Wasser zu dem Extrakt.

33. Verfahren nach Anspruch 32, bei dem Wasser zu dem Extrakt hinzugefügt wird, wobei ein Gewichtsverhältnis von Wasser zu Extrakt von 6 : 1 bis 8 : 1 vorliegt.

34. Verfahren nach Anspruch 32, weiterhin umfassend das Waschen des ausgefällten Aglucon- Isoflavon-Materials mit Wasser, wobei ein Gewichtsverhältnis von Wasser zu dem Aglucon-Isoflavon- Material von 0,8 : 1 bis 2 : 1 vorliegt.

35. Verfahren nach Anspruch 32, weiterhin umfassend das Abkühlen des Extrakts und des Wassers, um die Ausfällung des Aglucon-Isoflavon-Materials zu maximieren.

36. Verfahren nach Anspruch 32, weiterhin umfassend:

a) Solvatisieren des Aglucon-Isoflavon-Materials in einer Lösung in einem wäßrigen Alkohol; und

b) Inkontaktbringen der das solvatisierte Aglucon-Isoflavon-Material enthaltenden Lösung in einem wäßrigen Alkohol nut einem Adsorptionsmaterial für eine Zeit, die ausreichend ist, um ein Material mit hohem Genisteingehalt aus der Lösung in einem wäßrigen Alkohol abzutrennen.

37. Verfahren nach Anspruch 32, weiterhin umfassend:

a) Solvatisieren des Aglucon-Isoflavon-Materials in einer Lösung in einem wäßrigen Alkohol; und

b) Inkontaktbringen der das solvatisierte Aglucon-Isoflavon-Material enthaltenden Lösung in einem wäßrigen Alkohol mit einem Adsorptionsmaterial für eine Zeit, die ausreichend ist, um ein Material mit hohem Daidzeingehalt aus der Lösung in einem wäßrigen Alkohol abzutrennen.

38. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 37, bei dem das Extraktionsmittel in Form eines wäßrigen Alkohols 30% Alkohol bis 90% Alkohol einschließt.

39. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 37, bei dem das Extraktionsmittel in Form eines wäßrigen Alkohols einen pH-Wert von etwa dem isoelektrischen Punkt des Proteins in dem Aglucon- Isoflavon-Molke-Proteimuaterial hat.

40. Verfahren nach Anspruch 39, bei dem das Extraktionsmittel in Form eines wäßrigen Alkohols einen pH-Wert von 3 bis 6 hat.

41. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 37, bei dem das Aglucon-Isoflavon-Molke- Proteinmaterial mit dem Extraktionsmittel extrahiert wird, wobei ein Gewichtsverhältnis von Extraktionsmittel zu Molke-Proteinmaterial nicht etwa 11 : 1 überschreitet.

42. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 37, bei dem das Aglucon-Isoflavon-Molke- Proteinmaterial mit zwei Portionen des Extraktionsmittels in Form eines wäßrigen Alkohols extrahiert wird, wobei ein vereinigtes Gewichtsverhältnis der Portionen des Extraktionsmittels zu dem Molke- Proteinmaterial nicht ein Gesamtgewichtsverhältnis von etwa 11 : 1 überschreitet.

43. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 37, bei dem das Adsorptionsmaterial teilchenförmig ist.







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