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Dokumentenidentifikation DE69522984T2 25.04.2002
EP-Veröffentlichungsnummer 0676467
Titel Europäische Vakzinstämme des Fortplanzungs-Atmungs-Syndromsvirus des Schweins
Anmelder Akzo Nobel N.V., Arnheim/Arnhem, NL
Erfinder Visser, Nicolaas, NL-5831 RV Boxmeer, NL;
van Woensel, Petrus Alphonsus Maria, NL-5831 NL Boxmeer, NL;
Ohlinger, Volker, D-48239 Havixbeck, DE;
Weiland, Emilie, D-72119 Ammerbuch, DE
Vertreter WUESTHOFF & WUESTHOFF Patent- und Rechtsanwälte, 81541 München
DE-Aktenzeichen 69522984
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 07.04.1995
EP-Aktenzeichen 952008779
EP-Offenlegungsdatum 11.10.1995
EP date of grant 04.10.2001
Veröffentlichungstag im Patentblatt 25.04.2002
IPC-Hauptklasse C12N 7/00
IPC-Nebenklasse A61K 39/12   C07K 16/10   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung befasst sich mit europäischen Stämmen des Virus des Schweinereproduktions- und Respirationssyndroms (PRRS), mit Impfstoffen zum Schutz des Schweines vor PRRS, mit monoklonalen Antikörpern, die mit dem PRRS-Virus reagieren und mit monoklonalen Antikörpern, die insbesondere nicht mit den attenuierten Stämmen reagieren.

1987 wurde eine bis dahin unbekannte Erkrankung bei Schweinen in Nordamerika entdeckt, von wo sie sich später nach Kanada ausbreitete (Hill H.; In: Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee meeting, Oct. 6, 1990, Denver, Colorado, Livestock Conservation Institute, Madison, Wi, USA. Keffaber et al.; Am. Assoc. Swine Pract. Newsletter 1: 1-9 (1989)). Die Erkrankung, die dadurch gekennzeichnet war, dass sie Aborte als auch respiratorische Erkrankungen hervorrief, wurde zuerst Mysteriöse Schweineerkrankung (MSD) genannt. Heutzutage ist die Erkrankung in Amerika und Kanada auch als Schweineinfertilitäts- und Respirationssyndrom bekannt (SIRS).

Seit 1990 wird die Erkrankung auch in Europa vorgefunden, wo sie zuerst in Deutschland Ausbrüche hervorrief, gefolgt von Ausbrüchen in den Niederlanden und Belgien, und nun breitet sich die Erkrankung über ganz Europa aus. In Europa ist die Erkrankung allgemein bekannt als Schweinereproduktions- und Respirationssyndrom und als epidemisches Schweineabort- und Respirationssyndrom (PEARS).

Jetzt wird die Erkrankung weltweit als PRRS bezeichnet.

Die Patholgie ist nicht nur auf Aborte und respiratorische Erkrankungen beschränkt. Andere gewöhnlich oder gelegentlich auftretende Symptome, die im Zusammenhang mit der Erkrankung gesehen werden, sind: Nahrungskarenz, Anorexie, bläuliche Verfärbungen der Extremitäten und speziell der Ohren.

Ein kleiner umhüllter RNS-Virus ist nun als kausales Agenz der Erkrankung erkannt und der europäische Typ dieses Virus wurde von Wensvoort et al. (The Vet. Quaterly; 13: 121-130 (1991)) beschrieben. Die Verwandtschaft zum Lactatdehydro-genaseerhöhenden Virus (LDV) und zum Pferdearteriitis-Virus beschrieben Conzelmann et al. (Virology 193: 329-339 (1993)) und Meulenberg et al. (Virology 192: 62-72 (1993)), somit wurde der Virus in die Gruppe der Arteriviridae eingeteilt.

Ein Stamm dieses europäischen Typs, genannt "Lelystad-Virus", wurde im Institut Pasteur, Paris, Frankreich, unter der Nr. I- 1102, in Verbindung mit PCT WO 92/21375 durch das Central Veterinary Institut, Lelystad, Niederlande hinterlegt.

Ein anderer europäischer Stamm wurde in einer Internationalen Patentanmeldung WO 93/07898 beschrieben und wurde in der Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) des Institut Pasteur in Paris, Frankreich unter der Nr. I-1140 hinterlegt.

Dieser europäische Stamm wurde kürzlich von Conzelmann et al. beschrieben (Virology 193: 329-339 (1993)).

Der amerikanische Typ des Virus wurde von Benfield et al. beschrieben (J. Vet. Diagn. Invest. 4: 127-133 (1992)). Ein Stamm des amerikanischen Typs wurde beim ATCC unter der Nr. VR-2332 hinterlegt und ist in PCT WO 93/03760 und in der europäischen Patenanmeldung Nr. 0529584 erwähnt.

Eine wichtige Beobachtung wurde schon früh von Wensvoort et al. (J. Vet. Diagn. Invest. 4: 134-138 (1992), nachdem der Virus entdeckt worden ist, gemacht, als er den amerikanischen mit dem europäischen Stamm auf der Basis ihrer antigenen Eigenschaften verglich.

Er erstellte Seren gegen den amerikanischen Typ (d.h. der Stamm, der im amerikanischen ATCC VR-2332, wie oben erwähnt, hinterlegt wurde) sowie den europäischen Typ (d.h. der Stamm, der im Institut Pasteur, Paris, Frankreich, unter der Nr. I-1102 hinterlegt wurde) in verschiedenen Schweinen und verglich die Kreuzreaktivität des anti-europäischen (LV) und anti-amerikanischen (VR- 2332) Serum mit drei amerikanischen Virusisolaten und 4 europäischen Isolaten.

Wie Wensvoort et al. im J. Vet. Diagn. Invest 4: 134-138 (1992) offenbarte, reagieren Seren gegen PRRS-Viren des europäischen Serotyps signifikant geringer mit den amerikanischen Isolaten als mit den europäischen Isolaten.

Noch überraschender war, dass Seren, die gegen Viren des amerikanischen Serotyps gerichtet sind, weniger oder sogar überhaupt nicht mit europäischen Virusisolaten reagieren.

Wensvoort et al. (J. Vet. Diagn. Invest 4: 134-138 (1992)) zeigt auch die Reaktivität der Seren, die gegen europäische und amerikanische Isolate entwickelt wurden, gegen die zwei Referenzviren IP I-1102 (europäisch) und ATCC VR-2332 (amerikanisch). Diese Ergebnisse sind sogar noch beeindruckender: Seren, die gegen den europäischen Stamm entwickelt wurden, reagieren überhaupt nicht mit dem amerikanischen Stamm.

So wurde zum gegenwärtigen Zeitpunkt das erste Mal unzweifelhaft klar, dass zwei vollkommen unterschiedliche Serotypen des Virus existieren: der amerikanische und der europäische Serotyp.

Kürzlich zeigten Nelson et al. (74th Annual Meeting of the Conference of Research Workers in Animal Diseases, November 8-9, 1993) und Mardassi et al. (74th Annual Meeting of the Conference of Research Workers in Animal Diseases, November 8-9, 1993), dass es sehr einfach ist, zwischen den europäischen und amerikanischen Stämmen aufgrund ihrer serologischen Unterschiede unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die selektiv mit einem der zwei Serotypen reagieren, zu unterscheiden.

Nelson et al. (J. Clin. Microbiology 31: 3184-3189 (1993)) beschreiben die Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die gegen ein U.S. Isolat des PRRSV entwickelt wurden. Alle monoklonalen Antikörper, die in dieser Publikation genannt sind, reagieren mit dem mutmasslichen Neukleoprotein des Virus.

Die Schlussfolgerung ist, dass es einen ausgesprochenen Unterschied zwischen den amerikanischen und europäischen Isolaten auf der Grundlage ihrer Serotypen gibt. Es zeigt auch, dass es möglich ist, in einfacher Weise zwischen dem europäischen und amerikanischen Serotyp zu unterscheiden.

Zusätzlich zu den serologischen Unterschieden gibt es eine wachsende Anzahl von Beweisen für grosse Unterschiede in den Nukleinsäuresequenzen, wenn die Genome des europäischen und amerikanischen Serotyp verglichen werden.

Kürzlich wurden weitere Nukleinsäuresequenzdaten bekannt, unter denen verschiedene Gensequenzen von verschiedenen Isolaten sind. Nelson et al. (74th Annual Meeting of the Conference of Research Workers in Animal Diseases, November 8-9, 1993) konnte grosse Unterschiede in den Nukleotidsequenzen der Gene, die das Nukleotidprotein codieren, zwischen dem europäischen und amerikanischen Serotyp darstellen. Da das Nukleoprotein ein internes virales Protein ist, wird es nicht anfällig für selektiven Druck sein. So ist es verwunderlich diese Unterschiede zu finden. Nelson et al. verwendete diese Nukleotidsequenzunterschiede für einen auf PCR basierenden Test zur Unterscheidung zwischen dem europäischen und dem amerikanischen Stamm.

In einer anderen neueren Publikation verglich Katz et al. (74tn Annual Meeting of the Conference of Research Workers in Animal Diseases, November 8-9, 1993) die Sequenzen der Polymerasecodierenden Gene verschiedener Isolate. Es gibt im Allgemeinen fast oder gar keinen Evolutionsdruck auf Polymerase-Gene. Dies bewahrheitet sich auch bei den Polymerase-Genen z.B. der Stämme des amerikanischen Serotyps, welches durch die Tatsache, dass es eine 85-95%ige Homologie innerhalb der amerikanischen Gruppe gibt, verdeutlicht wird. Deshalb ist es überraschend, dass eine auf den Nukleinsäuren beruhende Homologie von nur 64-67% zwischen dem europäischen und dem amerikanischen Serotyp gefunden wurde.

Mardassi publizierte vergleichbare Ergebnisse an der oben erwähnten Konferenz, indem er zeigte, dass die 3'-terminalen 530 Nukleinsäuren des Quebec-PRRS-Referenzstamms und der europäischen Isolate nur eine Homologie von 59% zeigen.

Die Ergebnisse der oben erwähnten Publikationen machen es sehr wahrscheinlich, dass die amerikanischen und die europäischen Serotypen sich vor langer Zeit getrennt haben, welches dann leicht ihre genetischen Unterschiede und ihre nicht bestehende serologische Verwandtschaft erklären würde.

Schlussfolgerung; es gibt einen eindeutigen Unterschied zwischen den europäischen und amerikanischen Isolaten, beruhend auf ihrer Gesamtnukleinsäuresequenz sowie ihrem Serotyp. Es zeigt auch, dass es leicht möglich ist, den amerikanischen vom europäischen Serotyp zu unterscheiden.

Eine weitere Schlussfolgerung ist jedoch, dass es auf der Basis dieser Erkenntnisse unmöglich sein kann, einen universell anwendbaren attenuierten Stamm zu finden, der sowohl einen Schutz gegen Infektionen mit den Stämmen des amerikanischen Serotyps als auch den Stämmen des europäischen Serotyps bietet.

Ein abgeschwächter Stamm des amerikanischen Serotyps ist in der Europäischen Patentanmeldung 0529584 beschrieben worden. Dieser Stamm ist direkt aus dem hinterlegten amerikanischen VR-2332- Stamm gezüchtet.

Daher werden mit diesem Stamm geimpfte Tiere keine mit europäischen Stämmen reagierende Antikörper bilden.

Dieses zeigt eindeutig, dass für die Herstellung eines Impfstoffes gegen europäische Serotypen ein abgeschwächter Stamm des europäischen Serotyps erwünscht ist.

Die vorliegende Erfindung stellt zum ersten Mal einen abgeschwächten Stamm des europäischen Serotyps zur Verfügung.

Viren des europäischen Serotyps sind dadurch gekennzeichnet, dass sie in einem Immunoperoxidase-Monolayer-Test mit einer Reihe von Antiseren gegen den europäischen PRRS Virus LV (CDI-NL- 2.91; wie unter Nr. I-1102 im Institut Pasteur hinterlegt) mit hohen Titern reagieren, verglichen mit einer Reaktion mit einer Reihe von Antiseren gegen den amerikanischen PRRS-Virus SIRSV (ATCC VR-2332)

Wenn eine Reihe von Antiseren verwendet wird, die nach ungefähr 40 Tagen post infectionem und von verschiedenen Tieren gewonnen wurde, kann jeglicher Virus leicht nach seiner Zugehörigkeit zum europäischen oder amerikanischen Serotyp eingeteilt werden. Typischerweise ist die Reaktionsfähigkeit des europäischen Stammes gegenüber einer Reihe von Antiseren gegen andere europäische Stämme ungefähr 400 mal höher als mit einer Reihe von Antiseren gegen amerikanische Stämme. Wenn ein europäischer Stamm mit Antiseren gegen den hinterlegten europäischen Stamm I-1102 und den hinterlegten amerikanischen Stamm VR-2332 reagiert, wird typischerweise ein Unterschied in der Reaktionsfähigkeit von ca. 55 mal gefunden (Wensvoort et al., J. Vet. Diagn. Invest 4: 134-138 (1992)).

Die abgeschwächten Stämme gemäss vorliegender Erfindung reagieren mit monoklonalen Antikörpern, die durch das Hybridoma A27 hergestellt werden (im Institut Pasteur, Paris, Frankreich, unter der Nr. I-1401 hinterlegt). Diese Antikörper erkennen das Nukleoprotein der Stämme des europäischen Serotyps.

Abgeschwächte Stämme des europäischen Serotyps sind gefunden worden, aber diese besitzen noch eine inakzeptable hohe Virulenz, z.B. I-1389, wie in der vorliegenden Erfindung erwähnt.

Die überraschende Eigenschaft der Viren der vorliegenden Erfindung ist, dass sie nicht mehr virulent sind, jedoch in der Lage sind eine schützende Immunantwort zu induzieren. Diese Viren sind dadurch gekennzeichnet, dass sie nicht erkannt werden von monoklonalen Antikörpern, die durch das Hybridom A35(im Institut Pasteur, Paris, Frankreich, unter der Nr. I-1402 hinterlegt) hergestellt werden und mit ORF-4 der virulenten PRRS-Viren reagieren. (Die offenen Leseraster sind u.a. von Conzelmann et al. (Virology 193: 329-339 (1993) und Meulenberg et al. (Virology 192: 62-72 (1993)) beschrieben.

Beispiele der attenuierten Stämme des europäischen Serotyps mit einem A35&supmin; Serotyp gemäss vorliegender Erfindung sind die Virusstämme PRRS C und PRRS D, wie in der Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) des Institut Pasteur in Paris, Frankreich unter der Eingangsnr. I-1387 (Stamm D) und Nr. I-1388 (Stamm C) hinterlegt.

Diese zwei hinterlegten Stämme sind lediglich Beispiele der Stämme, die in der vorliegenden Erfindung ausgeführt sind.

Andere europäische PRRS-Virusstämme, die auch mit dem monoklonalen Antikörper A27 reagieren und mit A35 nicht reagieren, sind Teil dieser Erfindung.

Diese Stämme können zum Beispiel durch. Reihenuntersuchungen an PRRSV-infizierten Tieren, Isolation des PRRS-Virusstames und nachfolgender Testung der Reaktivität mit A35 sowie A27, nachgewiesen werden.

Ebenfalls Teil der Erfindung sind Virusstämme, die aus einem der hinterlegten Stämme gewonnen werden. Zum Beispiel können Stämme von einem der hinterlegten Stämme durch Übertragung eines der hinterlegten Stämme auf Zellen in einem geeigneten Kulturmedium gewonnen werden. Weitere Passagen können auch durch die Weitergabe eines der hinterlegten Stämme an ein Tier erreicht werden.

Ebenso sind in der vorliegenden Erfindung Impfstoffe eingeschlossen, die einen PRRS-Virusstamm der vorliegenden Erfindung umfassen.

Der erfindungsgemässe Virus kann in diesen Impfstoffen als attenuierter Lebendvirus vorhanden sein.

Ein Vorteil der Verwendung eines viralen Lebendimpfstoffes ist, dass nur eine begrenzte Anzahl von Viren verabreicht werden muss, da Lebendviren selbstreplizierend sind; typischerweise können 10-10&sup7; Partikel pro Dosis verwendet werden.

Ein weiterer Vorteil der viralen Lebendimpfstoffe ist, dass sie eine natürliche Infektion nachahmen und daher das Immunsystem auf eine natürliche Weise triggert.

Impfstoffe können auch unter Verwendung von erfindungsgemässen Viren in inaktivierter Form hergestellt werden.

Der Vorteil dieser Herangehensweise ist, dass ein inaktivierter Virus immer vollständig sicher ist, da er nie in die virulente Form zurückkehren kann.

Ein Impfstoff, der auf inaktivierten Viren basiert, könnte typischerweise das Äquivalent von vor Inaktivierung gemessenen 10³- 10¹&sup0; Lebendviruspartikeln beinhalten.

Allgemein kann die Inaktivierung durch chemische oder physikalische Massnahmen erreicht werden. Chemische Inaktivierung kamt durch Behandlung des Virus mit zum Beispiel Formaldehyd, β- Propiolacton, Ethylenimin oder einem Derivat davon und einem organischen Lösungsmittel (wie Tween®, Triton X®, Natriumdeoxycholaat, Sulphobetain oder Octyltrimethylammoniumsalze) erreicht werden.

Physikalische Massnahmen zur Virusinaktivierung sind z.B. Hitze und energiereiche Bestrahlung, z.B. UV-Licht, Röntgenbestrahlung oder gamma-Bestrahlung.

Der Impfstoff gemäss vorliegender Erfindung kann einen pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff umfassen. Ein möglicher Trägerstoff ist eine physiologische Kochsalzlösung. Ein anderer pharmazeutisch annehmbarer Trägerstoff ist zum Beispiel die Lösung, in der ein Hilfsstoff bereitgestellt wird.

Gewöhnlich ist ein Hilfsstoff und falls gewünscht ein oder mehrere Emulgatoren, wie Tween® und Span®, in dem lebenden oder inaktivierten erfindungsgemässen Impfstoff enthalten. Geeignete Hilfsstoffe sind zum Beispiel Vitamin-E-Säurelösung, Aluminiumhydroxid, -phosphat oder -oxid, (Mineral-)Ölemulsionen, so wie Bayol® und Marcol 52®, und Saponine. Einbau der Antigene in Iscoms ist auch ein möglicher Weg der Adjuvation.

Es ist vorteilhaft einen Stabilisator den lebenden oder inaktivierten Viren hinzuzufügen, insbesondere wenn eine trockene Mischung aus lebenden Viren durch Lyophilisierung hergestellt wird. Geeignete Stabilisatoren sind z.B. SPGA (Bovarnik et al., J. Bacteriology 59, 509,1950), Kohlenhydrate (wie Sorbitol, Mannitol, Trehalose, Stärke, Sucrose, Dextran oder Glucose), Proteine (wie Albumin oder Casein) oder Abbauprodukte davon und Puffer (wie Alkalimetallphosphate). Wenn gewünscht, können ein oder mehrere Inhaltsstoffe mit adjuvanter Aktivität, wie oben beschrieben, auch hinzugefügt werden.

Ein erfindungsgemässer Impfstoff kann durch intramuskuläre oder subkutane Injektion oder über eine intranasale, intratracheale, orale, kutane, perkutane oder intrakutane Gabe verabreicht werden.

Der erfindungsgemässe Impfstoff kann Schweinen, entsprechend der Impfanamnese der Säue, im Alter von 1, 5, 10 Wochen, vor der Paarung und/oder 4-6 Wochen vor dem Werfen (Wiederholungsimpfung) oder alle halbe Jahre an Eber (Auffrischung) verabreicht werden.

Impfstoffe gemäss der vorliegenden Erfindung könnten Kombinationen des PRRS-Bestandteil und eines oder mehrerer nichtverwandter Schweinepathogene enthalten, so wie Actinobacillus pleuropneumonia, Pseudorabiesvirus, Schweineinfluenzavirus, Schweineparvovirus, übertragbare Gastroenteritisvirus, Rotavirus, E.coli, Erysipelo rhusiopathiae, Pasteurella multocida und Bordetella bronchiseptica.

Obwohl der erfindungsgemässe Impfstoff von jedem PRRS- Virusisolat eines europäischen Serotyps gewonnen werden kann, wird der Impfstoff bevorzugt aus den PRRS-Stämmen C oder D gewonnen, die am Institut Pasteur in Paris, Frankreich, unter der Nr. I-1388 oder Nr. I-1387 hinterlegt sind.

Neben der Verwendung ganzer lebender oder inaktivierter Viruszpräparationen zu Impfzwecken, ist die Verwendung viraler Antigene für die Impfstoffherstellung möglich. Die Verwendung viraler Antigene, entweder als Rohzubereitung oder in einer gereinigteren Form, hat den Vorteil, dass unerwünschte oder unnötige Zusammensetzungen viralen oder zellulären Ursprungs entfernt werden können. Diese Herangehensweise führt zu Impfstoffen mit einer niedrigen unspezifischen antigenen Belastung und damit zu Impfungen ohne unerwünschte Nebenwirkungen.

Rohe Viruspräparationen können auf einer Anzahl von verschiedenen, im Stand der Technik bekannten Wege gereinigt werden, um ein oder mehrere virale Antigene auszuwählen. Reinigung kann durch Zentrifugation, molekulare Chromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Chromatographie über eine mit spezifischen Antikörpern beschichteten Säule, durch Gelelektrophorese etc. erfolgen.

Ein Verfahren zur Herstellung eines viralen PRRS-Antigens, das geeignet ist zum Einbau in einen erfindungsgemässen Impfstoffes, enthält folgende Schritte:

a) Beimpfung der suszeptiblen Gewebezellkultur mit dem PRRS- Virus,

b) Kultivierung der Zellen, und

c) Gewinnung des viralen Antigens aus der Kultur.

Vorzugsweise wird das PRRS-Virus in hohen Titern kultiviert, d.h. mindestend 106,0 TCID&sub5;&sub0;/ml.

Zur Herstellung der lebenden abgeschwächten Viren gemäss der Erfindung sind eine Anzahl von Verfahren für diese Aufgabe im Stand der Technik bekannt, z.B. die Adaptation des spezifischen PRRS-Virusisolates an ein Wachstum in embryonenhaltigen Eiern oder die Adaptation an eine Schweinegewebszellen enthaltende Kultur oder andere empfindliche Gewebezellen oder Eier, über die der Virus amplifipliziert und dann gewonnen wird, indem das Eimaterial oder die Flüssigkeit der Gewebszellenkultur und/oder Zellen gesammelt werden. Adaptation an ein Wachstum unter verschiedenen Temperaturen könnte auch Teil des Attenuationsprozesses sein.

Während der Gewinnung kann gegebenenfalls der Virusertrag durch Techniken erhöht werden, die die Freisetzung der infektiösen Teilchen aus dem Wachstumssubstrat, z.B. Sonikation, verbessern.

Virale Antigene können, um in einen erfindungsgemässen Impfstoff eingebaut zu werden, durch Wachstum des PRRS-Virus auf Makrophagen (alveoläre, peritoneale, periphere, aus dem Knochenmark oder aus anderen Geweben stammende) hergestellt werden. Auch sind andere Zellen mit makrophagenartigen Eigenschaften nützlich, wie Promonozyten, Monozyten, Hirngefässendothelialzellen und Mikrogliazellen. Die Makrophage oder die makrophagenartige Zelle kann aus SPF oder nicht-SPF Herkunft sein (z.B. von regulären kommerziellen Schweinen). In den letzteren Fällen sind Vorkehrungen gegen unerwünschten Kontaminationen zu treffen, z.B. durch die Verwendung von geeigneten Antibiotika in der Kultur.

Zudem können andere bekannte suszeptible Wirtszellen für diesen Zweck verwendet werden.

Ein anderes Set von Möglichkeiten, das zu einem sehr geeigneten Verfahren für ein Viruswachstum führt, ist die Einrichtung einer Makrophagenzellreihe. Vielerlei Möglichkeiten, die zu solchen wünschenswerten Makrophagenzellreihen führen können, werden unten ausgeführt.

Erreichen der Unsterblichkeit bei Makrophagen kann unter Verwendung eines konditionierten Mediums von L(929)Zellen, SK6-, ST-, Vero- oder BHK-Zellen erreicht werden. In diesen konditionierten Medien ist zumindest die Gegenwart von Lymphokinen, wie den Makrophagenkolonien-stimulierenden-Faktor (CSF), von Bedeutung (Stanley, E.R., Methods Enzymology 116, 564-587, 1985).

Zur Behandlung von Makrophagen jeglicher Herkunft mit Chemikalien zur Erlangung der Unsterblichkeit, kann z.B. β-Propiolacton, als Beispiel eines alkylierenden Agens, das den DNA-Metabolismus beeinflusst, verwendet werden (Logrippo, G.A. und Harman, F.W., J. Immunol. 75, 123-128, 1955).

Auch in die vorliegende Erfindung miteinbezogen sind monoklonale Antikörper, die von den Hybridoma A27 und A35 hergestellt werden, wie sie bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) des Institut Pasteur in Paris, Frankreich, unter der Nr. I-1401, bzw. Nr. I-1402, hinterlegt sind.

Antikörper, die mit der antigenen Determinante des PRRSV, die von den monoklonalen Antikörpern der hinterlegten Hybridoma erkannt werden, reagieren, sind auch Teil der Erfindung.

Beispiel 1 Isolation von PRRS-Virusstämmen

Schweine verschiedener europäischer Länder wurden regulär medizinisch erfasst und auf eine Serokonversion durch eine PRRS- Virusinfektion reihenuntersucht.

Tierseren, die in Begriff einer Serokonversion waren, wurden während und nach der Serokonversion als Quelle für den PRRS- Virus verwendet.

Viren der hinterlegten Stämme I-1387 und I-1388 wurden von Seren der nicht klinischen PRRS-Fälle wie folgt isoliert: für die Vermehrung der Seren wurden 24-stündige einschichtige Alveolarmakrophagen mit diesen Seren inkubiert.

Die Makrophagenzellkultur wurde durch eine Lungenlavage bei SPF- Schweinchen mit PBS gewonnen.

Die Makrophagen wurden gewaschen und auf RPM 1640-Medium, dem 10% fetales Kälberserum und Antibiotika zugefügt wurde, über 24 Stunden in einem 5% CO&sub2;-Inkubator inkubiert. Eine kleine Menge des Serums wurde den Makrophagen beigefügt. Nach einer Inkubation von einer Stunde bei 37ºC wurde ein neues Medium hinzugefügt und die infizierten Makrophagen bei 37ºC in CO&sub2;-Atmosphäre weiter inkubiert. Die totale zytopathische Wirkung wurde nach 2-3 Tagen erkennbar.

Der Virus kann auch von anderen Quellen isoliert werden, z.B. vom Herzen, von den Tonsillen, vom Gehirn und von der Leber infizierter Schweine.

Beispiel 2 Vermehrung des PRRS-Virus

Viren, die wie in Beispiel 1 isoliert wurden, wurden auf einschichtige 24-Stunden-Säugetierzellen überimpft. Nach einer Inkubation von 1 Stunde bei 37ºC wurde wieder das Medium hinzugefügt und die infizierten Zellen weiterhin bei 37ºC in CO&sub2;- Atmospäre inkubiert. Nach 2 Tagen wurden die ersten Zeichen von CPE sichtbar. Am Tag 3 zeigten die Zellen eine komplette Lysis, welches durch die Aufnahme von Trypanblau bestätigt wurde.

Lebende Zellen nehmen keine Trypanblaufärbung an, wie die nicht infizierten Kontrollmakrophagen. Die Ernte dieser ersten Passage wurde bei -70ºC gelagert. Weitere Passagen dieses Isolats wurden durch Inkubation von 1 ml vorverdünntem 1 : 10-1 : 100 Virus auf weiteren Makrophagenkulturen durchgeführt. Eine totale CPE wurde nach 2-3 Tagen Inkubation sichtbar. Proben dieser Isolate sind beim CNCM unter der Zugangsnr. I-1387 (Stamm D) und Nr. I-1388 (Stamm C) hinterlegt worden.

Das Verfahren zur Herstellung viraler PRRS-Antigene, wie oben beschrieben wurde, resultiert in der Fähigkeit die Viren in hohen Titern in vitro zu züchten.

Beispiel 3 Reaktionsfähigkeit der PRRS-Virusstämme mit monoklonalen Antikörpern

Dieses Verfahren wurde zur Überprüfung der Reaktionsfähigkeit der monoklonalen Antikörper A27 und A35 gegen die hinterlegten PRRS-Viren verwendet. Die monoklonalen Antikörper wurden 2-fach in Mikrotitrationsplatten, die mit dem PRRS-Virus infizierte Makrophagen enthalten, verdünnt. Nach der Inkubation mit FITC- konjugierten Antikörpern wurden die Wannen auf Fluoreszenz überprüft.

Der IFT-Test hat eine Abweichung von 2 (eine Verdünnungsstufe).

Herstellung des Testsystems:

Die Platten wurden mit 100 ul/Wanne Schweinealveolar-makrophagen in komplettem MEM ausgesät. Die Platten wurden im CO&sub2;-Inkubator inkubiert.

Nach mindestens einer Nacht und maximal 14 Tagen wurden die Wannen geleert. Die Wannen wurden mit 100 ul Virussuspension (10&sup5; TCID&sub5;&sub0;/ml, MOI 1 : 5) gefüllt. Die Platten wurden bei 37ºC im CO&sub2;- Inkubator für 24 (± 4) Stunden inkubiert, geleert und einmal mit Waschpuffer (PBS) gewaschen. Die Wannen wurden mit 100 ul kaltem (-70ºC) 96% Ethanol gefüllt und bei -70ºC gelagert.

Immunfluoreszenztestverfahren

Direkt vor der Verwendung wurden die Mikrotiterplatten geleert und zweimal mit Waschpuffer gewaschen. Monoklonale Antikörper wurden im Doppel (eine Säule mit infizierten Makrophagen und eine Säule mit nicht infizierten Makrophagen) der gewünschten Verdünnung in PBS-Puffer hinzugefügt. Sechs serielle Verdünnungen wurden in PBS-Puffer mit zweifachem Verdünnungsfaktor (100 ul Probe + 100 ul PBS-Puffer) durchgeführt. Nach den durchgeführten Verdünnungen beträgt das Volumen in den Wannen 100 ul. Nach 60 Minuten bei 37ºC wurden die Platten zweimal mit Waschpuffer gewaschen. Allen Platten wurde 50 ul Hasen anti-Maus-FITC (1 : 40) beigefügt. Nach 60 Minuten bei 37ºC wurden die Platten zweimal mit Waschpuffer gewaschen und 50 ul einer 50% Glycerol/PBS- Lösung mit einem pH von 9 zugefügt. Die Wannen wurden auf spezifische Fluoreszenz untersucht. Die Platten wurden bei 4ºC gelagert.

Der Titer wird als Wert der höchsten Verdünnung angegeben, bei der eine virusspezifische Fluoreszenz beobachtet wird. Der Test ist gültig, wenn die Negativkontrolle keine spezifische Fluoreszenz aufweist und die Positivkontrolle eine spezifische Fluoreszenz zeigt.

Alle Testproben, die eine spezifische Fluoreszenz zeigten, wurden als positiv betrachtet.

Tabelle 1

Wie aus Tabelle 1 ersichtlich reagierten die Stämme C (I-1388) und D (I-1387) nur mit dem monoklonalen Antikörper A27.

Im Gegensatz hierzu reagiert der europäische Stamm A (am Collection Nationale de Cultures de Microoganismes (CNCM) des Institut Pasteur in Paris, Frankreich, unter der Nr. I-1389 hinterlegt), welcher ein attenuierter Stamm ist und durch serielle Passagen von dem virulenten Stamm I-1140 hergeleitet ist, noch mit monoklonalen Antikörper gegen A27 sowie gegen A35.

Der hochvirulente Stamm vom Wildtyp, der in der Collection Nationale de Cultures de Microoragnismes (CNCM) des Institut Pasteur in Paris, Frankreich, unter der Nr. I-1140 am 6. September 1991 hinterlegt wurde, reagiert mit beiden monoklonalen Antikörpern.

Beispiel 4 Fehlende Pathogenität der attenuierten Stämme C und D

Es wurde ein Experiment durchgeführt um darzustellen, dass die A35&supmin; PRRS-Virustämme C und D für trächtige Säue und ihre Nachkommen nicht pathogen sind, im Gegensatz zum Wildtyp der A35&spplus;- Serotypen oder den attenuierten A35&spplus;-Serotypen.

Die Säue wurden am Tag 90 der Tragzeit mit dem lebenden PRRS- Stamm geimpft.

Es wurden keine Unterschiede zwischen der Anzahl toter Ferkel gefunden, die mit den Stämmen C und D geimpft wurden und den nicht infizierten Kontrollsäuen.

Jedoch unterschied sich die Anzahl toter Ferkel signifikant von den Säuen, die mit dem Virusstamm A (I-1389) oder dem Wildtyp des PRRS-Virusstamm I-1140 geimpft wurden.

Es wurden tragende Säue verwendet, die im Immunofluoreszenztest (IFT) negativ für PRRS waren und die wenigstens einmal vor dem Versuch geworfen hatten.

Getestete Isolate:

- Gruppe 1 PRRS-Virusstamm D

- Gruppe 2 PRRS-Virusstamm C

- Gruppe 3 PRRS-Virusstamm A

- Gruppe 4 PRRS-Wildtyp des Virus I-1140

- Gruppe 5 Kontrollen, Plazebo-Verdünnungsmittel

Virustitration

Die Infektiositätstiter der Teststämme A, C und D und des Wildtyps des Virus 110 wurden auf Makrophagen in Mikrotiterplatten bestimmt, wie sie bei Wensvoort et al., 1991, beschrieben wurden, und stellte sich als 6¹&sup0;log TCID&sub5;&sub0; pro Tier heraus.

Immunofluoreszenztest

Die Seren wurden auf Mikrotiterplatten mit (Ethanol-fixierten) infizierten Makrophagen verdünnt (angefangen mit einer Verdünnung von 1 : 10, Verdünnungsfaktor 2). Nach Inkubation mit dem anti-Schweine IgG-FiTC wurden die Wanne auf die spezifische Fluoreszenz untersucht.

Experimenteller Aufbau

Tragende Säue wurden am Tag 90 ihrer Tragzeit mit Teststämmen oder einem Plazebo geimpft. Am Tag der Geburt wurden Blut und Kolostrum genommen und am 8. Lebenstag nur Blut. Am Tag des Werfens wurde die Anzahl der Mumifizierten, der Totgeburten, der schwachen Ferkel, die in der ersten Lebenswoche starben, und die Anzahl der gesunden Ferkel aufgezeichnet.

ERGEBNISSE

Wie in Tabelle 2 ersichtlich war die Anzahl der toten Ferkel der mit dem Stamm C und D, 0% bzw. 19%, geimpften Säue kleiner als oder grob vergleichbar mit den normalen Reproduktionsergebnissen, die in der Plazebo-Kontrollgruppe 5 (14%) gefunden wurden. Im Gegensatz hierzu wurden 33% tote Tiere in der Gruppe gefunden, die mit dem attenuierten A35&spplus;- Virusstamm A geimpft wurden. Ca. 75% tote Tiere wurden in der Gruppe beobachtet, die mit dem A35&spplus;-Wildtyp des Virusstammes I-1140 geimpft wurde.

Diese Ergebnisse beweisen, dass der attenuierte europäische Impfstamm des A35&supmin;-Serotyps ein sicherer Impfstamm ist, der den A35&spplus;-Serotypstämmen überlegen ist.

Tabelle 2 Auswirkungen des PRRS-Virus auf die Würfe von geimpften Säuen

* Tote beinhalten Mumifizierte, Totgeburten und Ferkel, die innerhalb von 7 Tagen nach der Geburt starben.

Beispiel 5 Impfung von Mastschweinen mit dem attenuierten PRRS-Virus

In diesem Experiment soll die Effizienz eines PRRSV-Impfstoffes gegen eine PRRSV-Challenge bei Mastschweinen gezeigt werden. Drei Gruppen von Tieren wurden verwendet:

Die Tiere wurden im Alter von 4-5 Wochen geimpft.

Für die intramuskuläre Applikation (i.m.) wurde in gleichem Volumenverhältnis der PRRSV-Stamm D mit dem Adjuvanz Diluvac Forte® gemischt. Jedes Tier wurde mit 2 ml geimpft.

Für die intradermale Applikation (i.d.) wurde in gleichem Volumenverhältnis der PRRSV-Stamm D mit dem Adjuvanz Diluvac Forte® gemischt. Jedes Tier wurde mit 0,2 ml geimpft.

Die Tiere wurden 4 Wochen nach der Impfung gegenüber dem PRRSV- Isolat Nr. 2 exponiert. Jedes Tier wurde intranasal mit 1 ml pro Nasenloch exponiert. Der Schutz wurde anhand der aufgezeichneten Körpertemperatur und der Reisolation des Challengevirus gemessen.

Temperatur

Die Rektaltemperatur wurde einen Tag vor dem Challenge bis 7 Tage nach dem Challenge täglich einmal gemessen.

Abb. 1 zeigt den prozentualen Anteil der Tiere mit einer Temperatur von über 40,5ºC. Nur wenige Geimpfte (i.d. sowie i.m.) wurden fiebrig, während eine grosse Anzahl von Tieren aus der nicht geimpften Gruppe hohe Temperaturen entwickelten.

Reisolation des Expositionsvirus

Blutproben wurden am Ankunftstag und bis zur Exposition wöchentlich entnommen. Nach der Exposition wurden Blutproben 2, 4, 6, 10, 13 und 15 Tage post expositionem entnommen. Virustiter wurden in den Blutproben bestimmt. Der Virus konnte an mehreren Zeitpunkten von den meisten der Kontrollen reisoliert werden. Es ergab sich ein markanter Unterschied der PRRSV-Funde im Blut zwischen den geimpften Schweinen und den Kontrollen (Abb. 2).

Mikroorganismen

Die Mikroorganismen I-1387, I-1388, I-1401 und I-1402 sind am 23.12.93 bzw. 9.2.94 am CNCM des Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, Paris, Frankreich hinterlegt.

Legenden zu den Abbildungen

Abb. 1 Der prozentuale Anteil von Ferkeln pro Gruppe mit Fieber (Körpertemperatur über 40,5ºC), verzeichnet von einem Tag vor bis acht Tage nach Exposition.

Abb. 2 Der prozentuale Anteil von Ferkeln, die 4, 6 und 10 Tage nach Exposition einen positiven Virusnachweis aus dem Blut hatten.


Anspruch[de]

1. Virus des Schweinereproduktions- und Respirationssyndroms (PRRS) eines europäischen Serotyps, dadurch gekennzeichnet, dass es ein abgeschwächter Virus ist, der mit dem durch das Hybridom A27 hergestellten monoklonalen Antikörper A27 reagiert, der unter der Nr. I 1401 in der Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) des Institutes Pasteur hinterlegt ist, aber nicht mit dem durch das Hybridom A35 hergestellten monoklonalen Antikörper A35 reagiert, welcher im Institute Pasteur in Paris, Frankreich, unter der Nr. I 1402 hinterlegt ist.

2. Abgeschwächter PRRS Virus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Virus ein Virus mit einem weiteren Passageniveau der Stämme ist, die im Institute Pasteur in Paris, Frankreich, unter der Nr. I-1387 oder der Nr. I-1388 hinterlegt sind.

3. Abgeschwächter PRRS-Virus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er einer der Stämme ist, die im Institute Pasteur in Paris, Frankreich, unter der Nr. I-1388 oder der Nr. I-1387 hinterlegt sind.

4. Impfstoff zum Schutz von Schweinen vor dem Schweinereproduktions- und Respirationssyndrom (PRRS), einen lebenden Virus nach den Ansprüchen 1-3 und einen pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff umfassend.

5. Impfstoff nach Ansprüch 4, dadurch gekennzeichnet, dass er 10 -10&sup7; Viruspartikel umfasst.

6. Impfstoff zum Schutz der Schweine vor dem Schweine Reproduktions- und Respirationssyndrom (PRRS), den Virus nach den Ansprüchen 1-3 in inaktivierter Form und einen pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff umfassend.

7. Impfstoff nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Impfstoff das Äquivalent zu 10³-10¹&sup0; lebenden Viruspartikeln vor der Inaktivierung umfasst.

8. Impfstoff nach Anspruch 4-7, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Adjuvanz umfasst.

9. Monoklonale Antikörper, welcher gegen ein PRRSV antigene Determinante gerichtet ist, die durch das Hybridom A35 hergestellt wird, von welchem eine Probe im Institute Pasteur in Paris, Frankreich, unter der Nr. I-1402 gelagert ist.

10. Monoklonale Antikörper, welcher gegen eine PRRSV antigene Determinante gerichtet ist, die durch das Hybridom A27 hergestellt wird, von welchem eine Probe im Institute Pasteur in Paris, Frankreich, unter der Nr. I-1401 gelagert ist.







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