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Dokumentenidentifikation DE69706393T2 08.05.2002
EP-Veröffentlichungsnummer 0848041
Titel Farbstoffvorläufer aus Pflanzen der Medicagogattung, dessen Herstellung und Anwendung in der Herstellung von Farbstoffen
Anmelder L'Oréal S.A., Paris, FR
Erfinder Belcour-Castro, Beatrice, 37520 La Riche, FR;
Hussler, Georges, 93600 Aulnay-Sous-Bois, FR;
Bonnet, Anne, 75019 Paris, FR
Vertreter Schwabe, Sandmair, Marx, 81677 München
DE-Aktenzeichen 69706393
Vertragsstaaten DE, ES, FR, GB, IT
Sprache des Dokument FR
EP-Anmeldetag 10.12.1997
EP-Aktenzeichen 974029886
EP-Offenlegungsdatum 17.06.1998
EP date of grant 29.08.2001
Veröffentlichungstag im Patentblatt 08.05.2002
IPC-Hauptklasse C09B 61/00
IPC-Nebenklasse C09B 5/24   A61K 7/13  

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft einen Farbstoffvorläufer, der ausgehend von Zellen einer Pflanze der Gattung Medicago erhalten werden kann, wie auch das Verfahren der Herstellung dieses Farbstoffvorläufers und dessen Anwendung vom Erhalt von farbgebenden Produkten über Reaktion mit einem Chinon.

Man kennt zahlreiche farbgebende Produkte, die sich vom Chinon ableiten, wie auch deren Anwendung insbesondere zur Färbung von keratinischen Fasern, siehe beispielsweise die Patentanmeldung EP-A-0 560 683 und die in dieser Patentanmeldung zitierten Dokumente.

Das Dokument JP-06 040 884, dessen Zusammenfassung in der Datenbank WPI/DERWENT, AN 94-089 261 (1994) veröffentlicht ist, beschreibt Extrakte von Pflanzen der Gattung Medicago, die als kosmetische Bestandteile mit bleichender bzw. reinigender Wirkung verwendbar sind.

Man hat nun entdeckt, dass die Zellen von Pflanzen der Gattung Medicago, kultiviert in vitro in Anwesenheit von Lactose als Kohlenstoffsubstrat, Metaboliten enthalten, die mit den Chinonen reagieren, indem sie farbgebende Produkte erzeugen, und dass diese Metaboliten dann fehlen, wenn man Glukose als Kohlenstoffsubstrat verwendet.

Es sind diese Metaboliten, die die Farbstoffvorläufer der Erfindung darstellen. Man hat entdeckt, dass diese Farbstoffvorläufer gleichermaßen in den Pflanzen der Gattung Medicago vorhanden sind, die auf Erde oder unter Hydrokulturbedingungen kultiviert werden, jedoch in sehr viel geringerer Konzentration.

Die Erfindung betrifft eine Zubereitung, enthaltend mindestens einen Farbstoffvorläufer, dadurch gekennzeichnet, dass der Farbstoffvorläufer ein Produkt ist, das im natürlichen Zustand in den Zellen einer Pflanze von der Gattung Medicago vorhanden ist, in wässriger Lösung mit 1,4-Naphthochinon reagieren kann, indem er mindestens ein farbgebendes Produkt ergibt, und in der Zubereitung in mindestens teilweise gereinigtem Zustand vorhanden ist.

Der Ausdruck "mindestens teilweise gereinigtem Zustand" bedeutet hier, dass bezogen auf seinen natürlichen Zustand (Pflanze oder frische oder getrocknete Zellen) der Farbstoffvorläufer in der Zubereitung der Erfindung konzentriert und/oder von mindestens einem Teil der anderen Bestandteile der Pflanze befreit ist, und insbesondere von Bestandteilen mit einem Molekulargewicht oberhalb von 3500.

In den Zubereitungen der Erfindung ist der Farbstoffvorläufer im Allgemeinen in einer Konzentration oberhalb der Konzentration des Vorläufers in der Pflanze oder in den besagten Zellen im Trockenzustand vorhanden.

Man betrachtet eine Pflanze als im Trockenzustand, wenn ihr Gehalt an Wasser unterhalb von 10 Gew.-% liegt.

Die Erfindung betrifft gleichermaßen eine Zubereitung, in der der Vorläufer in einer Konzentration mindestens gleich derjenigen des Precursors in einer wässrigen Dispersion ist, enthaltend pro Liter der Dispersion 1 g (und insbesondere 2 g) an Trockenmaterial eines Zerkleinerungsgutes der Zellen der besagten Pflanze, wobei die Zellen des Zerkleinerungsgutes in vitro in einem Milieu kultiviert sind, enthaltend ausschließlich Lactose als Kohlenstoffquelle.

Die Farbstoffvorläufer, die Bestandteile der erfindungsgemäßen Zubereitung sind, sind insbesondere in den Pflanzen und in den in vitro kultivierten Zellen (beispielsweise unter den im Folgenden angegebenen Bedingungen) der folgenden Spezies vorhanden: Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago intermedia, Medicago media, Medicago varia und Medicago versicolor.

Die in vitro-Kultur dieser Pflanzen kann ausgehend von einem Explantat (beispielsweise ein Fragment eines Blattes oder den Cotyledonen) bewirkt werden.

Kulturmilieus oder Kulturmedien, die für die in vitro-Kultur von pflanzlichen Zellen angemessen sind, sind tatsächlich wohl bekannt. Diese Kulturmedien enthalten insbesondere Stickstoffquellen, Kohlenstoffquellen, Mikroelemente wie Vitamine in geringer Konzentration. Die aktuellen Kulturmedien leiten sich insbesondere von den theoretischen Grundlagen ab, wie sie von MURASHIGE und SKOOG definiert werden, seit der Entwicklung des Kulturmediums, das den Namen dieser Autoren trägt. Als Mikroelemente verwendet man im Allgemeinen diejenigen, die von Heller vorgeschlagen wurden: Mangan, Zink, Bor, Kupfer, Jod, Nickel, Aluminium wie auch Molybdän, Eisen und Kobalt. Als Kohlenstoffquelle verwendet man im allgemeinen Zucker, insbesondere Saccharose und Glukose, aber zum Erhalt der Farbstoffvorläufer der Erfindung ist es angemessen, diese Zucker mindestens teilweise durch andere Kohlenstoffquellen zu ersetzen, insbesondere durch Lactose. Die Ermittlung der Kohlenstoffquellen, die angemessen ist, kann über einfache Routineexperimente bestimmt werden, indem man in den kultivierten Zellen die Anwesenheit eines Farbstoffvorläufers ermittelt, wie er in der vorliegenden Anmeldung definiert ist. Unter den Vitaminen, welche das Wachstum der Zellen in Kultur fördern, sind insbesondere das Thiamin wie auch die Nicotinsäure und das Pyridoxin zu nennen. Man kann gleichermaßen des Calciumpanthotenat, das Biotin oder das Mesoinositol hinzugeben.

Das Kulturmedium kann gleichermaßen Aminosäuren, Proteinextrakte, organische Säuren usw. enthalten. Man kann gleichermaßen zum Kulturmilieu Wachstumsregulatoren wie die Naphthalinessigsäure (NES), das Kinetin (6-Furfurylaminopurin) usw. zugeben.

Die Zubereitungen des Farbstoffvorläufers der Erfindung sind insbesondere Lösungen (das heißt praktisch frei von nicht gelösten festen Produkten) oder die festen Produkte können ausgehend beispielsweise von diesen Lösungen über Verdampfung des oder der Lösungsmittel erhalten werden. Die durch Verdampfung des Lösungsmittels (insbesondere Wasser, niederes Alkanol und deren Mischungen) erhaltenen festen Rückstände sind praktisch vollständig in einem solchen Lösungsmittel löslich.

Die Erfindung betrifft gleichermaßen ein Verfahren der Herstellung einer Zubereitung, wie sie zuvor definiert ist.

Das Verfahren ist im Wesentlichen dadurch gekennzeichnet, dass man Pflanzen oder Teile von Pflanzen der Gattung Medicago oder Zellen einer Pflanze der Gattung Medicago, entstammend einer in vitro-Kultur, zerkleinert und dass man gemäß üblicher Fraktionierungsverfahren eine Fraktion vom erhaltenen Zerkleinerungsgut abtrennt, wobei diese Fraktion eine zumindest teilweise gereinigte Fraktion ist, die frei ist von Bestandteilen mit einem Molekulargewicht oberhalb von 3500. Zum Abtrennen der mindestens teilweise gereinigten Fraktion kann man beispielsweise gemäß zumindest einem der folgenden Verfahren vorgehen:

- Durchführen einer Filtration und Auffangen des Filtrats,

- Dekantieren oder Zentrifugieren und Aufsammeln einer Fraktion, enthaltend den Überstand,

- Extraktion mit einem Lösungsmittel.

Das für die Extraktion geeignete Lösungsmittel kann über einfache Routineexperimente bestimmt werden. Man kann insbesondere Wasser oder einen niederen Alkanol (beispielsweise Methanol oder Ethanol) verwenden. Man kann anschließend das Lösungsmittel verdampfen, um eine Zubereitung in Form eines Trockenextraktes zu erhalten: Man behandelt ein Zerkleinerungsgut, einen Extrakt, ein Filtrat oder einen so erhaltenen Überstand, auf diese Weise zum Eliminieren der Bestandteile mit einem Molekulargewicht oberhalb von 3500 und insbesondere oberhalb von 1500.

Gemäß einer speziellen Ausführungsform des Verfahrens der Herstellung der Zubereitung des Farbstoffvorläufers kultiviert man in vitro Zellen einer Pflanze der Gattung Medicago in einem Milieu, das eine geeignete Kohlenstoffquelle, beispielsweise Lactose, enthält, man zerkleinert die gebildete Biomasse und trennt und gewinnt wie zuvor eine Fraktion des Zerkleinerungsgutes ab, enthaltend den Farbstoffvorläufer in mindestens teilweise gereinigtem Zustand.

Es ist möglich, die Kultur in einem Milieu zu bewirken, enthaltend nur Lactose als Kohlenstoffquelle.

Die in vitro-Kultur kann im Licht bewirkt werden, aber sie wird vorzugsweise im Dunkeln bewirkt. Man arbeitet in nicht bewegtem bzw. geschütteltem Milieu oder vorzugsweise in geschütteltem bzw. gerührtem Milieu. Die Temperatur der Kultur kann beispielsweise von 20 bis 30ºC schwanken. Man sammelt die Biomasse nach ausreichender Kulturzeit, die insbesondere vom Volumen des verwendeten Fermenters abhängt. Im Falle einer kontinuierlichen Kultur kann man gleichermaßen in regelmäßigen Intervallen Entnahmen eines Teils der Biomasse vornehmen. In jedem Fall können die Kulturzeit oder die Intervalle zwischen zwei Entnahmen über Routineexperimente bestimmt werden.

Im Hinblick auf eine Anwendung der erfindungsgemäßen Zubereitungen umfasst das Verfahren der Herstellung dieser Zubereitungen somit einen Schritt der Zerkleinerung der Biomasse (Pflanzen, Pflanzenteile oder Zellen aus in vitro-Kulturen) gemäß herkömmlicher Verfahren. Man kann danach die Zubereitung mindestens teilweise reinigen, indem man alle oder einen Teil der anderen Bestandteile als die Farbstoffvorläufer entfernt, wie zuvor beschrieben. Beispielsweise kann man das Zerkleinerungsgut auf allen geeigneten Filtern filtrieren, einschließlich auf Filtern, die die Produkte mit Dimensionen oberhalb von etwa 0,2 um zurückhalten.

Man kann vorteilhafter Weise die Zubereitung der Erfindung (Filtrat, Überstand oder Extrakt) durch Passage durch eine Ultrafiltrationsmembran oder durch Dialyse reinigen, die diejenigen Bestandteile mit einem Molekulargewicht oberhalb einer vorbestimmten Schwelle, beispielsweise oberhalb von 3500 oder oberhalb von 1500 oder 1000 zurückhalten. In jedem dieser Fälle finden sich die Farbstoffvorläufer im Filtrat oder Dialysat.

Die Farbstoffvorläufer der Erfindung werden von den Membranen mit einer Ausschlussgrenze von 500 Dalton zurückgehalten. Deren Molekulargewicht ist somit zwischen 500 und 1000 Dalton.

Die Erfindung betrifft gleichermaßen ein Verfahren zum Erhalt eines farbgebenden Produktes, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Chinon mit einer Farbstoffvorläuferzubereitung, wie sie oben definiert ist, reagieren lässt, und dass man, falls gewünscht, ein farbgebendes Produkt, das aus dieser Reaktion hervorgeht, isoliert und/oder reinigt.

Die Auswahl der Chinone, die angemessen sind, kann über einfache Routineexperimente erzielt werden, indem man das zu betrachtende Chinon mit einer Zubereitung, enthaltend den wie oben definierten Farbstoffvorläufer, reagieren lässt. In der Tat führt die Reaktion zum Auftreten einer Färbung oder einer Modifikation der Färbung, ist das betrachtete Chinon in dem Verfahren zum Erhalt eines farbgebenden Produkts gemäß der Erfindung geeignet.

Gemäß einer speziellen Ausführungsform kann das Chinon insbesondere ausgewählt werden unter den 1,4-Benzochinonen, gegebenenfalls in mindestens einer der Positionen 2 und 3 substituiert, den 1,4-Naphthochinonen, gegebenenfalls in mindestens einer der Positionen 5, 6, 7 und 8 substituiert, und dem Diphenochinon.

Unter den gegebenenfalls substituierten 1,4-Benzochinonen sind insbesondere diejenigen zu nennen, die der Formel (I) entsprechen

worin R und R' unabhängig voneinander -H, Hydroxy, C&sub1;-C&sub4;-Alkyl, C&sub1;-C&sub4;-Alkoxy, Sulfonyl oder eine gegebenenfalls substituierte heterocyclische oder Arylgruppe darstellen. Die heterocyclische Gruppe ist beispielsweise eine gegebenenfalls substituierte Furanyl-, Pyranyl- oder Indolylgruppe, ggf. substituiert mit einer C&sub1;-C&sub4;-Alkyl- oder -Alkoxylgruppe. Die Arylgruppe ist beispielsweise eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe, insbesondere substituiert durch mindestens ein C&sub1;-C&sub4;-Alkyl oder -Alkoxy.

Unter den gegebenenfalls substituierten 1,4-Naphthochinen sind insbesondere diejenigen zu nennen, die der Formel (II) entsprechen

worin die Substituenten R&sub1; bis R&sub4; unabhängig voneinander wie R und R' oben definiert sind.

Die Chinone der Formeln (I) und (II) sind bekannt und können gemäß bekannten Verfahren hergestellt werden. Bestimmte geeignete Chinone, einschließlich der Verbindungen der Formeln (I) und (II) sind beispielsweise in den Dokumenten EP-376776 und "Dictionary of Natural Products on CD-ROM", CHAPMAN & HALL (London) 1996, beschrieben.

Man kann insbesondere ein Chinon verwenden, ausgewählt unter dem 1,4-Benzochinon, dem 2-Methyl-1,4-benzochinon, dem 2-(4-Methyl-2-furanyl)-1,4-benzochinon, dem 2- Hydroxy-1,4-benzochinon, dem 2-Phenyl-1,4-benzochinon, dem 1,4-Naphthochinon, dem 5-Hydroxy-1,4-naphthochinon, dem 5-Hydroxy-7-methyl-1,4-naphthochinon, dem 6- Methyl-1,4-naphthochinon und dem 5,8-Dihydroxy-1,4-naphthochinon.

Man kann gleichermaßen anderen Chinonderivate wie das Geogenin (oder Pleurotin) und das Juglon (Juglorin) verwenden.

Die Reaktion des Farbstoffvorläufers mit einem Chinon wird vorzugsweise in Lösung in einem geeigneten Lösungsmittel wie beispielsweise einem Alkohol oder einer Mischung von Wasser und Alkohol durchgeführt. Bei dem Alkohol kann es sich insbesondere um einen niederen Alkanol wie das Methanol handeln. Beispielsweise gibt man das Chinon in Form einer Lösung in einem Alkohol zu einer wässrigen Lösung, enthaltend den Farbstoffvorläufer, hinzu. Die Reaktion kann bei einer Temperatur von 20 bis etwa 100ºC und insbesondere von 30 bis etwa 80ºC bewirkt werden.

Die Farbstoffvorläufer der Erfindung können in den ganzen Pflanzen enthalten sein, kultiviert auf Erde oder in Hydrokultur. So liefert im Falle von Medicago sativa das Filtrat, das nach Passage eines Zerkleinerungsguts der gesamten Pflanze durch eine Membran mit einer Porosität von 0,2 um erhalten wird, Farbstoffvorläufer, die denjenigen ähneln, die in den in vitro kultivierten Zellen in Anwesenheit von Lactose erhalten werden, was beispielsweise über die HPLC-Analyse eines solchen Filtrats gezeigt wird. Gleichwohl sind im Falle der gesamten Pflanze diese Farbstoffvorläufer meistens nur in geringen Konzentrationen vorhanden, im Allgemeinen um ein hundertfaches geringer als die Konzentrationen, die in Zellen derselben Pflanze erhalten werden, kultiviert in vitro in Anwesenheit von Lactose als einziger Kohlenstoffquelle. Die Zubereitungen der Erfindung, wie sie oben definiert sind, sind insbesondere diejenigen, die die Farbstoffvorläufer in einer Konzentration enthalten von mindestens gleich derjenigen dieser Vorläufer in einer wässrigen Dispersion, enthaltend pro Liter der Dispersion 1 g (und insbesondere 2 g) an Trockenmaterie eines Zerkleinerungsgutes der Zellen der betrachteten Pflanze, wobei die Zellen des Zerkleinerungsgutes in einem Milieu kultiviert wurden, enthaltend einzig Lactose als Kohlenstoffquelle. Die so definierten Minimalkonzentrationen, die sehr leicht erzielt werden können, indem man als erstes Material Zellen nimmt, die in vitro in Anwesenheit einer Kohlenstoffquelle wie beispielsweise Lactose kultiviert sind, sind deutlich oberhalb von denjenigen, die in einer wässrigen Dispersion eines Zerkleinerungsgutes der gesamten Pflanze erhalten werden können.

Die Erfindung betrifft gleichermaßen ein farbgebendes Produkt, dadurch gekennzeichnet, dass es gemäß dem Verfahren, das hier beschrieben wurde, erhalten werden kann.

Unter den Farbstoffen sind insbesondere die Verbindungen A, B, C und D zu nennen, die im Folgenden im Experimentalteil beschrieben werden.

Unter den Farbstoffvorläufern, die in den Zubereitungen der Erfindung enthalten sind, sind insbesondere diejenigen zu nennen, die mit dem 1,4-Naphthochinon reagieren können, wobei sie mindestens eine der Verbindungen A, B, C und D ergeben.

Die gemäß der Erfindung erhaltenen farbgebenden Produkte sind allgemein in mindestens einem üblichen Lösungsmittel löslich, beispielsweise in den Alkoholen (insbesondere niederen Alkanolen wie Methanol oder Ethanol) und in den Mischungen von Wasser und einem Alkohol.

Diese farbgebenden Produkte können insbesondere in farbgebenden Zubereitungen wie Zubereitungen zum Färben von Textilfasern, einschließlich von Wolle, in Zubereitungen zum Färben von Haaren, in Zubereitungen von Nagellacken usw. verwendet werden. Derartige Zubereitungen sind Teil der Erfindung. Sie können gleichermaßen zum Verleihen einer bestimmten Färbung in flüssige Zubereitungen eingesetzt werden, wie den Zubereitungen zum Reinigen oder zur Pflege von Oberflächen (Boden, Mauer, Gläser).

Die Zubereitungen zum Färben der Erfindung können gemäß herkömmlicher Methoden hergestellt werden. Beispielsweise enthalten die Zubereitungen zum Färben für Haare, enthaltend die gemäß der Erfindung erhaltenen farbgebenden Produkte, mindestens ein geeignetes, in der Kosmetologie annehmbares Lösungsmittel, insbesondere Wasser, niedere Alkohole (beispielsweise C&sub1;-C&sub6;), die Alkylenglykole (wie Ethylenglykol oder Propylenglykol) usw.

Die gemäß der Erfindung erhaltenen farbgebenden Produkte sind in den Zubereitungen zum Färben für Haare in einer Konzentration zwischen im Allgemeinen 0,01 und 10 Gew. - und insbesondere 0,05 bis 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitung, vorhanden. Die Zubereitungen können gleichermaßen andere Farbstoffe enthalten, ausgewählt unter den üblichen Direktfarbstoffen, wie auch übliche Bestandteile, die in den Zubereitungen dieses Typs vorhanden sind, beispielsweise oberflächenaktive Mittel, Verdickungsmittel, Dispergiermittel, Konservierungsmittel, Treibmittel oder Quellmittel für Keratinfasern, Parfüme usw.

Die Zubereitungen zum Färben der Erfindung können insbesondere in Form von Lotionen, Gelen, Dispersionen, Emulsionen, Schäumen oder auch in Form von Zubereitungen, konditioniert für Aerosole, vorliegen.

Zum Färben der Haare mit den Zubereitungen zum Färben gemäß der Erfindung trägt man die Zubereitung auf die Haare auf und lässt in dem Fall, in dem die Zubereitung zum Ausspülen bestimmt ist, für eine Zeit im Allgemeinen zwischen 5 und 60 Minuten und insbesondere zwischen 10 und 30 Minuten wirken, wonach man die Haare spült. In dem Fall, in dem die Zubereitung nicht zum Ausspülen bestimmt ist, trägt man auf die Haare auf, anschließend trocknet man dieselben.

Die Zubereitungen für Nagellacke, enthaltend die gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen farbgebenden Produkte, werden auf übliche Weise hergestellt. Zusätzlich zu einem gemäß der Erfindung erhaltenen farbgebenden Produkt enthalten diese im Allgemeinen in einem Lösungsmittel oder einer Mischung von geeigneten Lösungsmitteln (insbesondere den Alkoholen wie den niederen Alkanolen oder Benzylalkohol, deren Acetaten oder auch Aceton oder die Glykole), ein filmbildendes Polymer (insbesondere Nitrozellulose, Ethylzellulose usw.), einen Weichmacher (beispielsweise Butylphthalat), der insbesondere die Geschmeidigkeit des abgeschiedenen Lackfilms fördert, und gegebenenfalls andere Farbstoffe oder Pigmente und Harze, die den Erhalt eines brillanten Lackes mit einer guten Haftung gestatten.

Die Färbezubereitungen der Erfindung können gleichermaßen in Färbeverfahren für Textilfasern wie beispielsweise Wolle über Imprägnation oder Eintauchen der Textilfasern oder des Gewebes mit einer Lösung oder Dispersion der farbgebenden Produkte, erhalten gemäß der Erfindung, verwendet werden, gegebenenfalls in Anwesenheit eines Ätzmittels, gemäß an sich bekannter Verfahren.

Diese Erfindung betrifft gleichermaßen eine Ausstattung (Kit), welcher die Herstellung einer farbgebenden Zubereitung gestattet. Dieser Kit umfasst in getrennten Behältern, deren Inhalte im Moment der Anwendung gemischt werden, mindestens einen Farbstoffvorläufer und mindestens ein Chinon, wobei der Vorläufer die folgenden Eigenschaften aufweist:

- er kommt im natürlichen Zustand in den Zellen einer Pflanze der Gattung Medicago vor,

- er kann mit dem besagten Chinon reagieren, wobei er mindestens ein farbgebendes Produkt ergibt.

In dem Kit der Erfindung kann der Farbstoffvorläufer in Lösung in einem Lösungsmittel wie den zuvor beschrieben für die Reaktion mit einem Chinon vorliegen. Der Farbstoffvorläufer kann gleichermaßen in Form eines Trockenextraktes oder des gereinigten Produkts vorliegen. Im letzteren Fall kann der Kit mindestens ein solches Lösungsmittel in einem getrennten Behälter enthalten, dessen Inhalt zum Lösen der Reaktanten (Farbstoffvorläufer und/oder Chinon) im Moment der Anwendung verwendet wird. Gleichermaßen kann das Chinon in Form des reinen Produkts oder in Form einer Lösung vorhanden sein.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.

BEISPIEL 1: in vitro-Kultur im Dunkeln in Anwesenheit von Lactose

Man kultiviert in flüssigem Medium unter aseptischen Bedingungen ein Cotyledonenbruchstück von Luzerne (var. Europe). Das Kulturmedium, das die Besonderheit aufweist, dass es Lactose als Kohlenstoffquelle enthält, hat die folgende Zusammensetzung:

Bestandteile Konzentrationen (mg.L&supmin;&sup7;)

KNO&sub3; 1900,000

NH&sub4;NO&sub3; 1650,000

KH&sub2;PO&sub4;, H&sub2;O 170,000

MgSO&sub4;, 7H&sub2;O 370,000

CaCl&sub2;, 2H&sub2;O 440,000

MnSO&sub4;, H&sub2;O 0,076

NiCl&sub2;, 6H&sub2;O 0,030

AlCl&sub3;, 6H&sub2;O 0,050

H&sub3;BO&sub3; 1,000

ZnSO&sub4;, 7H&sub2;O 1,000

CuSO&sub4;, 5H&sub2;O 0,030

KI 0,010

FeSO&sub4;, 7H&sub2;O 27,800

Na&sub2;EDTA 37,300

Calciumpanthotenat 1,000

Mesoinositol 100,000

Nicotinsäure 1,000

Pyridoxin 1,000

Thiamin 1,000

Biotin 0,010

Kinetin 0,100

Naphthalinessigsäure 0,100

Lactose 3 0000,0

Das Kulturmedium wird Zuvor für 20 Minuten bei 115ºC in einem Autoklaven sterilisiert.

Zur Pflege der Kultur sammelt man die Zellen über Filtration auf einem Blutex-Tuch von 50 um und inokuliert das jungfräuliche Kulturmedium in Erlenmeyer-Kolben von 1 Liter, enthaltend 400 ml Milieu mit 20 g der gesammelten Biomasse. Die Kultur wird bei 26ºC unter Lichtausschluss mit Schütteln bei 100 rpm gehalten. Der Ansatz ist wöchentlich.

BEISPIEL 2: Extraktion und Charakterisierung des Farbstoffvorläufers: Reaktion mit 1,4-Naphthochinon a) Erhalt des Farbstoffvorläufers in Form einer filtrierten Lösung

Die wie in Beispiel 1 kultivierten Zellen werden am Ende eines wöchentlichen Zyklus durch Filtration auf Blutex-Tuch 50 um gesammelt. Man führt 5 g der so gesammelten Frischmaterie in 15 cm³ einer bei pH 6,5 gepufferten Lösung ein.

Die Pufferlösung wird auf folgende Weise hergestellt: Man stellt eine Lösung A her, enthaltend 27,8 NaH&sub2;PO&sub4;, 2H&sub2;O in 1 Liter ultrareinem Wasser; man stellt eine Lösung B her, enthaltend 53,65 g NaH&sub2;PO&sub4;, 7H&sub2;O in 1 Liter ultrareinem Wasser; man mischt 171,25 ml der Lösung A mit 78,75 ml der Lösung B und 250 ml ultrareinem Wasser zum Erhalt von 500 ml der gepufferten Lösung.

Die Zellsuspension wird zerkleinert in einem Potter-Homogenisator. Die zerkleinerte Mischung wird auf einem Whatmann-Filter von 2,7 um filtriert, anschließend wird das erhaltene Filtrat auf einer Millipore 0,2 um Membran filtriert. Die Filtrationsoperationen werden bei 4ºC bewirkt.

b) Reaktion mit 1,4-Naphthochinon

Zu 5 cm³ des erhaltenen Filtrats fügt man 50 ul einer Lösung hinzu, enthaltend 12,5 g/l 1,4-Naphthochinon in Methanol. Man lässt die erhaltene Mischung für 90 Minuten bei 30 ºC inkubieren.

c) Extraktion des farbgebenden Produkts

Anschließend fügt man eine wässrige Lösung von 1 N Salzsäure bis zu einem pH von 2,5 hinzu und gibt Methylenchlorid hinzu, in einem Verhältnis von einem Volumen auf ein Volumen des Reaktionsmediums. Man rührt für eine Stunde mit einem Magnetrührer, zentrifugiert für 10 Minuten bei 10.000 UpM. Man trennt die organische Phase und die wässrige Phase. Man gibt zu der wässrigen Phase Ethylacetat hinzu (1 Volumen Ethylacetat auf 1 Volumen wässrige Phase). Man rührt für 1 Stunde, wonach man absetzen lässt und die organische und wässrige Phase trennt.

Die organischen Phasen werden wieder vereinigt und auf trockenem Natriumsulfat getrocknet. Das letztere wird anschließend über Filtration entfernt. Danach verdampft man die Lösungsmittel unter verringertem Druck bei 50ºC. Man erhält einen trockenen Rückstand.

d) Analyse des erhaltenen Extrakts

Der im vorstehenden Stadium erhaltene trockene Rückstand wird, gelöst in einer Mischung aus Methanol/Methylenchlorid (50 : 50 im Volumen), mittels DSC an Silizium (Dünnschichtchromatographie) analysiert. Man eluiert mit Methylenchlorid, enthaltend 1% Methanol.

Man beobachtet die Anwesenheit eines Produkts A, charakterisiert durch einen Rf = 0,88, und ein Produkt B, charakterisiert durch Rf = 0,85.

Der Extrakt wird gleichermaßen über HPLC charakterisiert mit einer Lichrosorb® RP- HPLC-Säule (Hersteller: MERCK). Das Elutionsmittel ist eine Mischung 60/40 (V/V) von Acetonitril und ultrareinem Wasser, angesäuert auf pH 3 mit Phosphorsäure. Auftrag: 1 cm³ pro Minute.

Man detektiert bei 490 nm. Die Produkte A und B sind jeweils durch Retentionszeiten von 22,7 und 13,8 Minuten gekennzeichnet.

Die DSC-Analyse (Eluat: Mischung aus Methylenchlorid/Methanol 98 : 2) des im vorstehenden Stadium erhaltenen Trockenrückstands in Lösung in einer Mischung aus Methylenchlorid/Methanol (50 : 50) gestattet zusätzlich die Isolierung einer Verbindung C mit violetter Farbe (Rf = 0,2).

Die DSC-Analyse (Eluat: Mischung Methylenchlorid/Heptan 85 : 15) des im vorstehenden Stadium erhaltenen Trockenrückstandes in Lösung in einer Mischung aus Methylenchlorid/Methanol (50 : 50 im Volumen) gestattet gleichermaßen die Isolierung einer Verbindung D mit gelber Farbe (Rf = 0,14).

Die Verbindungen A, B, C und D wurden durch Massenspektrometrie, ¹H-NMR, ¹³C-NMR und 2D¹H-¹³C-NMR sowie ¹H-¹&sup5;N-NMR charakterisiert.

Der Satz der Analysenergebnisse gestattet den Vorschlag der folgenden Strukturen:

Bei der Verbindung A handelt es sich somit um das 6,7,8,9-Tetrahydrodinaphtho[2,3- f:2',3'-h]-chinolein-5,10,11,16-tetraon, die Verbindung B ist das Dinaphtho[2,3-e:2',3'-g]- indolin-5,9,14,15-tetraon, die Verbindung C ist das 4b-Hydroxy-4b,4c,10a,10b,11,12,13- heptahydro-3-aza-anthra(1,4-defi-naphto[2',3'-p]-chrysen-5,10,14,19,20-pentaon und die Verbindung D ist das Dinaphtho[2,3-e:2',3'-g]-indol-5,14,15-trion.

In Lösung in Methylenchlorid haben die Verbindungen A, B und C eine rötliche Färbung und die Verbindung D eine gelbe Farbe.

In anderen Experimenten wurde das in Beispiel 2a) oben erhaltene Filtrat in einem Autoklaven für 30 Minuten bei 120ºC behandelt. Nach Zugabe von Naphthochinon und Inkubation, wie zuvor beschrieben, bilden sich die Verbindungen A und B nicht. Im Gegensatz, behindert eine Behandlung des Filtrats für 30 Minuten bei 80ºC den Erhalt der Produkte A und B nicht.

Wenn das wie zuvor erhaltene Filtrat zuvor mit einer Protease in einer Endkonzentration von 80 Einheiten für 15 Stunden bei 40ºC behandelt wird, beobachtet man die Bildung der Produkte A und B in detektierbarer Quantität nach Reaktion mit 1,4-Naphthochinon unter den zuvor beschriebenen Bedingungen.

In anderen Experimenten wurde das in Beispiel 2a) wie zuvor erhaltene Filtrat über verschiedene Membranen mit Ausschlussgrenzen von 3500, 1000 bzw. 500 Dalton realisiert. In jedem Fall wurde die Reaktion mit dem 1,4-Naphthochinon nach der Extraktion, wie zuvor beschrieben, ausgehend vom Retentat und dem Dialysat durchgeführt und man analysiert über DSC die erhaltenen Produkte, wobei man nach den Produkten A und B sucht.

Mit den Membranen mit einer Ausschlussgrenze von 3500 und 1000 Dalton werden die Produkte A und B in dem aus der Reaktion mit dem Dialysat erhaltenen Produkt detektiert. Mit der Membran mit einer Ausschlussgrenze von 500 Dalton finden sich die Produkte A und B in dem Produkt, das durch Reaktion mit dem Retentat erhalten wird.

Man kann hieraus schließen, dass die Farbstoffvorläufer, die im Filtrat vorhanden sind, die mit dem 1,4-Naphthochinon reagieren, ein Molekulargewicht zwischen 500 und 1000 Dalton aufweisen, und dass die Reaktion mit dem 1,4-Naphthochinon nicht enzymatischer Natur ist.

BEISPIEL 3: in vitro-Kultur unter Belichtung: Vergleich mit in Anwesenheit von Glukose kultivierten Zellen

Wenn die Kultur der Luzernezellen in demselben Medium wie in Beispiel 1 unter Beleuchtung (Fotoperiode von 16 Stunden) durchgeführt wird, erhält man gleichermaßen die Bildung der Produkte A und B nach Reaktion mit 1,4-Naphthochinon, wie in Beispiel 2 beschrieben.

Verschiedene analoge Tests zu denjenigen des Beispiels 2 wurden an Kulturen von Medicago sativa durchgeführt, kultiviert auf demselben Milieu wie dem beschriebenen, aber in Anwesenheit von Glukose als Kohlenstoffquelle anstelle von Lactose. Man erhält nach Reaktion mit 1,4-Naphthochinon keine Produkte A und B in detektierbarer Menge.

BEISPIEL 4: Reaktion mit p-Benzochünon

Man arbeitet auf analoge Weise, wie sie im Beispiel 2b) beschrieben ist, unter Ersatz von 1,4-Naphthochinon durch p-Benzochinon. Das erhaltene Reaktionsgemisch hat eine violette Färbung.

BEISPIEL 5: Reaktion mit Juglon

Man arbeitet auf analoge Weise zu der in Beispiel 2b) beschriebenen, unter Ersatz von 1,4- Naphthochinon durch 5-Hydroxy-1,4-naphthochinon (Juglon). Man erhält eine braune Färbung.

BEISPIEL 6: Reaktion mit Naphthazarin

Man arbeitet auf analoge Weise zu der im Beispiel 2b) beschriebenen, unter Ersatz von 1,4- Naphthochinon durch 5,8-Dihydroxy-1,4-naphthochinon (Naphthazarin). Man erhält eine zartrosa Färbung.

BEISPIEL 7: Untersuchung des Färbevermögens

Die Tests werden auf Haarpartien durchgeführt, die 90% natürlich weißer Haare enthalten.

Die Tests werden gleichermaßen auf denselben Haaren durchgeführt, die zuvor mit der Dauerwelle DULCIA 1® (Hersteller: L'OREAL) gewellt wurden.

Der in Beispiel 2c) oben erhaltene Extrakt wird in 95%igem Ethanol gelöst.

Zubereitung 1: Man gibt zu der ethanolischen Lösung ein gleiches Volumen Wasser hinzu, zu dem Zitronensäure bis zu einem pH 4 zugesetzt wurde.

Zubereitung 2: Man gibt zu der ethanolischen Lösung ein gleiches Volumen an Wasser hinzu, zu dem Monoethanolamin bis zu einem pH von 10,5 hinzugesetzt wurde.

Man taucht die Haarlocken von 2,1 g in die Zubereitung 1 oder 2. Man lässt für 30 Minuten bei 45ºC rühren, anschließend spült man die Locken und trocknet die Haare.

In allen Fällen erhält man eine Tabakfärbung, stärker ausgeprägt auf den dauergewellten Haaren.

BEISPIEL 8: Farbzubereitung für Haare

- Verbindung A 0,1 g

- Vinylacetat/Crotonsäure/Polyethylenglykol- Copolymer, vertrieben unter der Bezeichnung "Aristoflex A" von der Firma HOECHST 1,5 g

- Ethanol 40 g

- Triethanolamin ad pH = 7

- Wasser ad 100 g

Diese Lösung wird auf die weißen Haare aufgetragen. Die Haare werden anschließend in Form gelegt und getrocknet. Sie sind rot gefärbt.

Man erhält analoge Resultate, indem man die Verbindung A durch die Verbindung B oder C oder durch eine Mischung gleicher Mengen der Verbindungen A, B und C ersetzt.

BEISPIEL 9: Nagellackzubereitung

Man stellt eine Zubereitung für die Färbung der Nägel mit folgender Zusammensetzung (Gew.-%) her:

- Toluol 21,97

- Butylacetat 10

- Ethylacetat 10

- n-Propylacetat 10

- Isopropanol 25

- Nitrozellulose 9

- Dibutylphthalat 2

- Santolite 3

- Polyvinylbutyral 5

- Acetyltributylcitrat 3

- UV-Filter 0,5

- Farbstoff 0,53

Wenn es sich bei dem Farbstoff um die Verbindung A, B oder C handelt, erhält man einen Nagellack von rosa-roter Farbe. Mit der Verbindung D ist die Farbe des Lackes gelb.

BEISPIEL 10: Kit

Die Färbereaktion kann mit Hilfe eines Kits bewirkt werden, zusammengesetzt aus zwei Reagenzien:

- Ein Reagenz A besteht aus einem Glaskolben von 10 ml, enthaltend 50 ul einer methanolischen Lösung von 1,4-Naphthochinon mit 12,5 g/l,

- Ein Reagenz B besteht aus einem Glasflakon von 5 ml, enthaltend 5 ml des wie folgt hergestellten Reagenz: die Luzernezellen (5 g) werden zerkleinert in einem Puffer, wie er im Beispiel 1 beschrieben ist. Das erhaltene Milieu wird unter aseptischen Bedingungen auf einer Millipore-Membran von 2,5 u, filtriert. 5 ml dieser Mischung werden auf aseptische Weise in einen Glaskolben transferiert, der zuvor über Autoklavierung bei 120ºC für 30 Minuten sterilisiert wurde.

Diese beiden Reagenzien können so bei Raumtemperatur für einige Wochen konserviert werden.

Im Augenblick der Verwendung wird der Gehalt des Reagenz B in den das Reagenz A enthaltenen Kolben transferiert. Dieser wird anschließend in einem Wasserbad für 90 Minuten bei 30ºC zur Inkubation angeordnet, wobei die Bildung der recherchierten Farbstoffe erfolgt.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung, welche eine Farbstoffvorstufe enthält, dadurch gekennzeichnet, dass man Pflanzen oder Teile von Pflanzen der Gattung Medicago oder Zellen einer Pflanze der Gattung Medicago, entstammend einer in vitro-Kultur, zerkleinert und dass man gemäß üblicher Fraktionierungsverfahren eine zumindest teilweise gereinigte Fraktion, die frei ist von Bestandteilen mit einem Molekulargewicht oberhalb von 3500, abtrennt und sammelt, wobei die Fraktion in wässriger Lösung mit 1,4- Naphthochinon reagieren kann, um mindestens ein Farbstoffprodukt zu ergeben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, in dem zur Abtrennung der zumindest teilweise gereinigten Fraktion nach zumindest einem der folgenden Verfahren gearbeitet wird:

- Durchführung einer Filtration und Auffangen des Filtrats;

- Dekantieren oder Zentrifugieren und Sammeln des Überstands;

- Durchführung einer Extraktion mit einem Lösungsmittel, dann, falls gewünscht, Verdampfen des Lösungsmittels.

3. Verfahren nach Anspruch 2, in dem außerdem eine so erhaltene zerkleinerte Masse, einen erhaltenen Extrakt, ein erhaltenes Filtrat oder einen erhaltenen Überstand so behandelt, dass die Bestandteile mit einem Molekulargewicht oberhalb 1500 entfernt werden.

4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Zellen einer Pflanze der Gattung Medicago in vitro in einem Medium kultiviert werden, das eine geeignete Kohlenstoffquelle enthält, die gebildete Biomasse zerkleinert wird und die zumindest teilweise gereinigte Fraktion abgetrennt und gesammelt wird.

5. Verfahren nach dem vorstehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultur in einem Medium durchgeführt wird, das nur Lactose als Kohlenstoffquelle enthält.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultur in der Dunkelheit durchgeführt wird.

7. Zubereitung, enthaltend mindestens eine Farbstoffvorstufe, welche gemäß des Verfahrens nach einem der vorstehenden Ansprüche erhalten werden kann.

8. Zubereitung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass diese in Form einer Lösung oder in Form eines festen Produkts vorliegt, welches löslich ist in einem Lösungsmittel, ausgewählt unter Wasser, C&sub1;-C&sub6;-Alkanolen, Methylenchlorid, und Gemischen davon.

9. Zubereitung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorstufe in der Zubereitung in einer Konzentration oberhalb der Konzentration der Vorstufe in der Pflanze oder in den Zellen in getrocknetem Zustand vorliegt.

10. Zubereitung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Farbstoffvorstufe in der Zubereitung in einer Konzentration vorliegt, die mindestens derjenigen der Vorstufe in einer wässrigen Dispersion entspricht, welche pro Liter der Dispersion 1 g an Trockenmasse einer zerkleinerten Zellmasse der Pflanze enthält, wobei die Zellen der zerkleinerten Masse in vitro in einem Medium kultiviert wurden, welches nur Lactose als Kohlenstoffquelle enthält.

11. Zubereitung nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze ausgewählt wird unter Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago intermedia, Medicago media, Medicago varia und Medicago versicolor.

12. Zubereitung nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorstufe in der Lage ist; mit 1,4-Naphthochinon zu reagieren, um mindestens eines der folgenden Produkte zu ergeben:

- 6,7,8,9-Tetrahydrodinaphtho[2,3-f:2',3'-h]chinolin-5,10,11,16-tetraon,

- Dinaphtho[2,3-e:2',3'-g]indolin-5,9,14,15-tetraon,

- 4b-Hydroxy-4b,4c,10a,10b,11,12,13-heptahydro-3-aza-anthra[1,4-def]- naphtho[2',3'-p]chrysen-5,10,14,19,20-pentaon, und

- Dinaphtho[2,3-e:2',3'-g]indol-5,14,15-trion.

13. Verfahren zur Darstellung eines Farbstoffprodukts, dadurch gekennzeichnet, dass ein Chinon mit einer Zubereitung, wie sie in einem der Ansprüche 7 bis 12 deimiert ist, umgesetzt wird, und dass, falls gewünscht, ein aus dieser Reaktion entstandenes Farbstoffprodukt isoliert und/oder gereinigt wird.

14. Verfahren nach dem vorstehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Chinon unter den 1,4-Benzochinonen, die gegebenenfalls in zumindest einer der Stellungen 2 und 3 substituiert sind, unter den 1,4-Naphthochinonen, die gegebenenfalls zumindest in einer der Stellungen 5, 6, 7 und 8 substituiert sind, und dem Diphenochinon ausgewählt wird.

15. Verfahren nach dem vorstehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Chinon ein gegebenenfalls substituiertes 1,4-Benzochinon der Formel (I) oder ein gegebenenfalls substituiertes 1,4-Naphthochinon der Formel (II) ist:







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