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Dokumentenidentifikation DE69707610T2 08.05.2002
EP-Veröffentlichungsnummer 0826677
Titel Calcium spezifische Diaza-18-kron-6-äther Chromoionophore
Anmelder Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc., Rochester, N.Y., US
Erfinder Weber, II, Wayne Woodrow, Honeoye Falls, US;
Messing, Calvin Roman, Spencerport, US;
Logan, Margaret Elizabeth, Rochester, US
Vertreter BOEHMERT & BOEHMERT, 80336 München
DE-Aktenzeichen 69707610
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 14.08.1997
EP-Aktenzeichen 973061781
EP-Offenlegungsdatum 04.03.1998
EP date of grant 24.10.2001
Veröffentlichungstag im Patentblatt 08.05.2002
IPC-Hauptklasse C07D 273/00  
IPC-Nebenklasse G01N 33/84   

Beschreibung[de]
GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der klinischen Chemie, insbesondere neue Verbindungen zur Verwendung in Kalziumtests sowie analytische Zusammensetzungen, Elemente und Verfahren zur Verwendung derselben.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Analytische Tests zur Bestimmung des Kalziumgehalts finden auf verschiedenen Gebieten Anwendung. Eine wichtige Anwendung ist das Gebiet der klinischen Chemie, wo die Messung von Kalziumkonzentiationen in biologischen Flüssigkeiten, wie etwa Serum, zu diagnostischen Zwecken als Hinweis auf bestimmte pathologische Zustände verwendet werden kann. Beispielsweise kann eine erhöhte Kalziumkonzentration im Serum ein Anzeichen für Störungen der parathyreoiden und thyreoiden Drüsen, bei Sarkoidose und bei etlichen metastasierenden Karzinomen sein. Hyperkalzämie steht auch im Zusammenhang mit Osteoporose, osteoplastischen Karzinomen, akuter Pankreatitis und Azidose.

Kalziumkonzentrationen können unter Verwendung einer Reihe von analytischen Methoden quantitativ bestimmt weiden. Im allgemeinen werden direkte colorimetrische Verfahren, an denen die Komplexierung eines Farbstoffe mit Kalziumionen beteiligt ist, gegenüber anderen, komplizierteren Methoden bevorzugt. Im colorimetrischen Test verursacht die Verbindung des Kalziumions mit einem Chromoionophor eine Verschiebung des Absorptiorisspektrums des Chromophors, die quantitativ bestimmt werden kann. Ein derartiger Farbstoff, der gewöhnlich für solche Zwecke verwendet wird, ist als Arsenazo III (2,2'-(1,8-Dihydroxy-3,6- disulfonaphthylen-2,7-bisazo)bisbenzolarsonsäure (siehe Anal.Chim.Acta, 71, 375 (1974)) bekannt. Obwohl dieser Farbstoff recht gut funktioniert, ist seine Verwendung im Großmaßstab aufgrund von Bedenken hinsichtlich der Umweltverträglichkeit begrenzt.

Die Verwendung von analytischen Trockenelementen mit Dünnfilm-Mehrschichtaufbau wie etwa jenen, beschrieben in den US-Patenten Nr. 3,992,158 von Przybylowicz et al. und 4,258,001 von Pierce et al. werden heute allgemein zur Durchführung von Tests im Bereich der klinischen Chemie verwendet. Diese Elemente weisen im allgemeinen eine poröse Verteilungsschicht und eine Reagenzschicht auf einem nicht-porösen Träger auf. Ein solches Element wurde zur Bestimmung von Kalziumionen entworfen und wird als "VITROS Clinical Chemistry Slide" durch Johnson & Johnson Clincal Diagnostics, Inc. (Rochester, N.Y.) vermarktet. Dieses Element verwendet den zuvor erwähnten Arsenazo-Farbstoff, der selektiv mit Kalzium komplexiert, um eine nachweisbare Farbänderung zu liefern. Wie bereits erwähnt, haben jedoch Bedenken hinsichtlich der Umweltverträglichkeit einen Bedarf für neue Kalzium-komplexierende Verbindungen nahegelegt, die in derartige analytische Trockenelemente eingearbeitet weiden können.

Kronenetherverbindungen, einschließlich Diaza-18-krone-6-Verbindungen, sind seit einer gewissen Zeit für ihre Kationen-komlexierenden Eigenschaften bekannt. Die Einführung eines Chromophors in einen Kronenether, der nach Komplexierung eines Kations mit dem Kronenether seine Farbe ändert, wurde beschrieben. Siehe z. B. Anal Leders, 10(13), 1115-1122 (1977). M. Shiga et al., Bunseki Kagaku, 32(9), E293-E300, (1983) legt bestimmte N,N-disubstituierte Diaza-18-krone-6-Verbindungen mit 2-Hydroxy-5-(nitrophenylazo)- ber-Cnromophorsubstituenten zur Verwendung als Chromoionophore bei Kalziumtests in Lösungen offen. Diese Verbindungen können jedoch bei Objektträger-Trockenelementen für chromogene Tests nicht verwendet werden, da es schwierig ist, sie in beschichtende Lösungen oder Dispersionen zum Auftragen als dünnfilmige Chromoionophorbeschichtungen einzuarbeiten. Weiterhin sind Photometer in kommerziellen Analysegeräten typischerweise mit Filtern zum Messen bei 600 nm oder darüber ausgestattet, um Interferenzen durch Bilirubin oder andere Proben- oder Testbestandteile, die unterhalb von 600 nm absorbieren, zu vermeiden. Die Dinitrophenylazo-Verbindung von Shiga et al. hat ein Absorptionsmaximum unterhalb des gewünschten Lesefensters, d h. ihre λmax betrag ungefähr 575 nm Katayama et aL, Analytical Chemica Ada, 204 (1988), 113-125, offenbart 18-Krone-6-Verbindungen mit 2-Hydroxy-5-(-4-nitrophenzylazo)benzyl-Substituenten.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung stellt neue Diaza-18-kone-6-Verbindungen der Formel I:

zur Verfügung, worin X eine Phenol-, Naphthol- oder Chinolinol-Einheit ist, die aus denen der Formeln ausgewählt ist:

R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff Halogen, Cyano, Nitro, (C&sub1;-C&sub6;)-Alkyl, (C&sub2;-C&sub8;)-Acyl, Acetamido, Mercapto, Alkyl oder Arylsulfonyl, Trifluormethyl, Aryl und substituiertem Aryl, worin die Aryl-Enheit ausgewählt ist aus Phenyl und Naphthyl und der Aryl-Substituent ausgewählt ist aus Halogen, Cyano, Nitro, (C&sub1;-C&sub6;)-Alkyl, (C&sub2;-C&sub8;)-Acyl, Phenyl, Acetamido, Mercapto, Alkyl- oder Arylsulfonyl und Trifluormethyl;

vorausgesetzt, daß, wenn R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub5; Wasserstoff sind und X Phenol ist, R&sub4; nicht Nitro ist; und vorausgesetzt, daß, wenn X Phenol und R&sub5; Wasserstoff ist, R&sub1; (oder R&sub2;) und R&sub4; nicht beide Nitro sind.

Verbindungen der obengenannten Formel sind als Chromoionophore zum Nachweis von Kalziumionen in Naß- oder Trockentests zweckmäßig, sind allerdings von besonderem Vorteil, wenn sie bei analytischen Trockenelementen mit Dünnfilm-Mehrschichtaufbau verwendet werden, da sie leicht in Kopplungslösungsmitteln dispergiert und einheitlich als ein Dünnfilm aufgetragen weiden können, um analytische Objektträger- Trockenelemente zur Bestimmung von Kalzium verfügbar zu machen. Die Verbindungen der oben aufgeführten Formel, die in den Positionen R&sub1;, R&sub2;, oder R&sub4; elektronenziehende Substituenten aufweisen, können bei einer Absorption von 600 nm oder darüber gemessen weiden, was besonders vorteilhaft bei solchen Testsystemen ist, bei denen bei niedrigeren Wellenlängen Interferenzen auftreten. Zur Verwendung in Dünnfilmtestsystemen, insbesondere dem oben erwähnten VITROS-Trockentestsystem, werden bevorzugterweise Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die, wenn sie Komplexe mit Kalziumionen gebildet haben, licht bei einer Wellenlänge von mehr als 560 nm, bevorzugt mehr als 580 nm, absorbieren, bevorzugt.

Dementsprechend stellt die Erfindung auch ein analytisches Element zur Bestimmung von Kalziumionen zur Verfügung das ein absorbierendes Trägermaterial umfaßt, welches die oben beschriebene Chromoionophorverbindung enthält.

Weiterhin wird ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Kalziumionen verfügbar gemacht, das folgendes umfaßt:

(a) In-Kontakt-Bringen einer flüssigen Probe, von der angenommen wird, daß sie Kalziumionen enthält, mit der oben beschriebenen Chromoionophorverbindung; und

(b) colorimetrisches Bestimmen der Quantität von in der Probe vorhandenem Kalzium durch Messen der Änderung der optischen Dichte, die aus der Komplexierung von Kalziumionen mit der Verbindung resultiert.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der Kalziumkonzentrationen, die in Serumproben unter Verwendung der analytischen Elemente der vorliegenden Erfindung ohne Zugabe von Zitrat gemessen wurden, und welche den systematischen Fehler anhand der vorhergesagten Kalziumkonzentrationen zeigt.

Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Kalziumkonzentrationen, die in Serumproben unter Verwendung der analytischen Elemente der vorliegenden Erfindung mit zugegebenem Zitat gemessen wurden, und welche den systematischen Fehler anhand der vorhergesagten Kalziumkonzentrationen zeigt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

Bezogen auf die oben dargestellte Beschreibung werden als Verbindungen der Formel I solche für analytische Objektträger-Trockenelemente mit Dünnfilm-Mehrschichtaufbau zur Verwendung bei Analysegeräten, die bei Wellenlängen von 580 nm oder darüber arbeiten, bevorzugt, bei denen X Phenol ist, R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff und einer elektronenziehenden Gruppe, ausgewählt aus Halogen, Cyano, Nitro, Acyl mit 2-8 Kohlenstoffatomen, Alkyl- oder Arylsulfonyl und Trifluormethyl, vorausgesetzt, daß mindestens einer der Reste R&sub1; und R&sub2; eine elektronenziehende Gruppe ist; R&sub3; ausgewählt ist aus Wasserstoff, Halogen, Cyano, Nitro, (C&sub1;-C&sub6;)-Alkyl, (C&sub2;-C&sub8;)-Acyl, Acetamido, Mercapto, Alkyl- oder Arylsulfonyl, Trifluormethyl, Aryl und substituiertes Aryl, wobei die Aryl-Einheit ausgewählt ist aus Phenyl und Naphthyl und der Aryl-Substituent ausgewählt ist aus Halogen, Cyano, Nitro, (C&sub1;-C&sub6;)-Alkyl, (C&sub2;-C&sub8;)-Acyl, Phenyl, Acetamido, Mercapto, Alkyl- oder Arylsulfonyl und Trifluormethyl; R&sub4; Nitro ist und R&sub5; Wasserstoff ist.

Besonders bevorzugt für derartige Zwecke sind Verbindungen, worin X Phenol ist R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff und einer elektronenziehenden Gruppe, ausgewählt aus Halogen, Cyano, Nitro, Acyl mit 2-8 Kohlenstoffatomen, Alkyl- oder Arylsulfonyl und Trifluormethyl, vorausgesetzt, daß mindestens eines: der Reste R&sub1; und R&sub2; eine elektronenziehende Gruppe ist; R&sub3;(C&sub1;-C&sub6;)-Alkyl ist; R&sub4; Nitro ist und R&sub5; Wasserstoff ist, vorausgesetzt, daß, wenn einer der Reste R&sub1; oder R&sub2; Trifluormethyl ist und der andere Wasserstoff ist, R&sub3; ebenfalls Wasserstoffsein kann.

Verbindungen der Formel I, die für derartige Zwecke besonders bevorzugt sind, sind solche, worin X Phenol ist, R&sub1; Trifluormethyl ist; R&sub2; und R&sub3; Wasserstoff sind und R&sub4; Nitro ist. In einer solchen Verbindung dient die Trifluormethylgruppe sowohl als hydrophobe Gruppe, um die Dispersionsfähigkeit in Kopplungslösungsmitteln zu verbessern, als auch als die elektronenziehende Gruppe, um hohe (maximale) Absorption bei 580 nm oder darüber verfügbar zu machen.

Die Verbindungen der Formel I, die Gegenstand dieser Erfindung sind, können aus leicht verfügbaren Ausgangsmaterialien in Verbindung mit den folgenden, allgemeinen Verfahren hergestellt werden, die in den Schemata I-II dargestellt sind:

SCHEMA I

Entsprechend Schema I wird eine 4,13-Diaza-18-krone-6-Verbindung der Formel l mit 2- Acetoxybenzylbromid in Gegenwart von N,N-Diisopropyl-N-ethylamin zur Reaktion gebracht, um die Benzylacetat-Verbindung von Formel 3 zu liefern. Die Behandlung mit einer schwachen Säure, wie etwa Essigsäure in H&sub2;O, führt zu dem 2-Hydroxybenzyl-Intermediat von Formel 4. Um die Verbindungen herzustellen, worin X eine Naphthol- oder Chinolin-Einheit ist, kann eine entsprechend substituierte Naphthyl- oder Chinolin- Verbindung für die Phenyl-Verbindung der oben dargestellten Formel 2 eingesetzt werden.

Gemäß Schema 2 wird eine substituierte Anilin-Verbindung der allgemeinen Formel 5 zunächst mit Natriumnitrit in Salzsäure zur Reaktion gebracht und dann mit Hexafluorphosphorsäure behandelt, um das Phenyldiazoniumhexafluorphosphat-Intermediat 6 zu bilden. Zwei Äquivalente des Intermediats 6 werden dann mit einem Äquivalent des Hydroxybenzyldiaza-18-krone-6-Intermediats 4 aus Schema I in einem geeigneten Lösungsmittel zur Reaktion gebracht, um die Endverbindung der Formel I zu liefern. Die in geeigneter Weise substituierte Naphthol- oder Chinolinol-Verbindung kann selbstverständlich statt des Hydroxylbenzyl-Intermediats 4 eingesetzt werden.

Die vorangehenden Reaktionen werden in einem Lösungsmittel, das für die verwendeten Reagenzien und Materialien geeignet und für die herbeigeführte Umsetzung zweckmäßig ist, durchgeführt Diejenigen, die sich auf dem Gebiet der organischen Synthese auskennen, werden verstehen, daß die verschiedenen Funktionalitäten, die das Molekül aufweist, mit den vorgeschlagenen chemischen Umsetzungen übereinstimmen müssen. Dies wird häufig eine Beurteilung, etwa der Reihenfolge von Syntheseschritten, des Schutzes von reaktiven Gruppen und der Auswahl von Reaktionsbedingungen erfordern. Reaktionsbedingungen, die mit den eingesetzten Substituenten vereinbar sind, werden einem Fachmann offensichtlich sein, ebenso wie die Auswahl der Schutzgruppen, wo sie benötigt werden.

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden neue Chromoionophor-Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt, die zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von Kalziumionen in wäßrigen Flüssigkeiten verwendet werden können Vorteilhafterweise können die Zusammensetzungen für analytische Verfahren zur Bestimmung von Kalziumkonzentrationen in biologischen Flüssigkeiten, wie etwa Vollblut, Plasma, Seren, Lymphe, Galle, Urin, Spinalflüssigkeit, Sputum, Schweiß, Stuhlausscheidungen und dergleichen verwendet werden. Flüssige Präparationen aus menschlichem oder tierischem Gewebe wie etwa Skelettmuskulatur, Herz, Niete, Lunge, Gehirn, Knochenmark, Haut und derartigem können ebenfalls gemäß der vorliegenden Erfindung auf Kalziumkonzentrationen hin getestet werden.

Wenn die Verbindungen der vorliegenden Erfindung zu den oben besprochenen Zwecken verwendet werden, weisen sie eine Reihe von Vorteilen gegenüber Zusammensetzungen nach dem Stand der Technik auf. Insbesondere kann der Farbstoff, der durch die Chromoionophorverbindungen der vorliegenden Erfindung bei Komplexierung mit Kalziumionen gebildet wird, im Absorptionsmaximum gemessen werden, was beste Leistung ermöglicht. Weiterhin kann ein breiterer Bereich von Kalziumkonzentrationen ohne Verdünnung gemessen werden und, wie bereits erwähnt, können die Verbindungen leicht in Kopplungslösungsmitteln dispergiert und einheitlich als ein dünner Film aufgetragen werden, um analytische Objektträger-Trockenelemente verfügbar zu machen. Schließlich sind die Verbindungen leicht zu synthetisieren und benötigen keine toxischen Schwermetalle.

Die Verbindungen können für Tests in Lösungen oder bei analytischen Trockenelementen verwendet werden. Wenn sie bei Tests in Lösungen verwendet werden, werden die Verbindungen in einer geeigneten Pufferlösung gelöst, so daß der pH-Wert ungefähr 6 bis 9 beträgt. Die wäßrige Zusammensetzung für einen Test in Lösung enthält gewöhnlich ungefähr 50 und, bevorzugt, ungefähr 100 bis ungefähr 300 umolar kalziumkomplexierende Verbindung der Erfindung. Der Test wird ausgeführt, indem die Chromoionophorverbindung der Erfindung mit einer Probe einer Flüssigkeit, von der angenommen wird, daß sie ionisches Kalzium enthält, kurzzeitig vermischt wird. Die Konzentration von Kalziumionen wird dann durch Messung der Änderung in der optischen Dichte (d. h., der Verschiebung der spektralen Absorption), welche durch die Komplexierung der Verbindung mit Kalziumionen verursacht wird, bei der entsprechenden Wellenlänge unter Verwendung einer zum colorimetrischen Nachweis geeigneten Ausrüstung bestimmt Vorteilhafterweise können die Verbindungen insbesondere zur Verwendung in Dünnfilm-Ausführungsformen danach ausgewählt werden, daß sie nach Komplexierung bei einer Wellenlänge von oder von 600 nm ungefähr 600 nm absorbieren.

Die Chromoionophorverbindungen der Erfindung können ebenfalls in analytischen Trockenelementen verwendet werden. Das einfachste Element kann aus einem absorbierenden Trägermaterial, beispielsweise einem dünnen Blatt eines selbsttragenden absorbierenden oder saugfähigen Materials, wie etwa Filterpapier oder Streifen, welche die komplexierende Verbindung dieser Erfindung enthalten, aufgebaut sein. Das Element kann in zwei oder mehrere diskrete Zonen unterteilt sein, wobei verschiedene Reagenzien in verschiedene Zonen des Trägermaterials eingearbeitet sind. Derartige Elemente sind nach dem Stand der Technik als Teststreifen, diagnostische Elemente, Tauchstäbchen, diagnostische Agenzien und derartiges bekannt.

Die Chromoionophorverbindungen der vorliegenden Erfindung sind besonders nützlich, wenn sie in analytischen Trockenelementen verwendet werden. Bei solchen Elementen werden die Verbindungen im allgemeinen in ein geeignetes Trägermaterial eingearbeitet oder darauf geschichtet. Alternativ kann die Verbindung während eines Tests auf das Element gegeben werden. Das analytische Trockenelement kann vielfach beschichtet sein und kann durch Techniken, die auf dem Gebiet der analytischen Trockenelemente wohlbekannt sind, hergestellt weiden. Beispielsweise werden derartige Elemente und Verfahren zu ihrer Herstellung im US- Patent Nr. 4357363 offenbart. In einer Ausführungsform beinhaltet das Element eine Verteilungsschicht, eine Unterschicht, eine Gelatine-/Pufferschicht und eine Reagenzschicht, welche die Verbindung und Puffer enthält. Alle die vorangehend genannten Schichten sind auf einen Träger geschichtet.

Andere Ausführungsformen sind ebenfalls bekannt, beispielsweise enthält eine Ausführungsform eine kombinierte Reagenz-/Verteilungsschicht zusammen mit einer Unterschicht, die mindestens zwei unterschiedliche Zonen auf weist. In dieses Element ist der Puffer in die Verteilungsschicht eingearbeitet, entweder durch Beschichtung des gesamten Elements oder durch Untermischen von Puffer in die Verteilungsschicht mittels einer Kugelmühle, bevor die Beschichtung erfolgt.

In allen Ausführungsformen stehen die Schichten allgemein in Fließkontakt miteinander, was bedeutet, daß Flüssigkeiten zwischen übereinandergeschichteten Bereichen benachbarter Zonen transportiert werden können. Mit anderen Worten, wem das Element mit einer wäßrigen Flüssigkeit in Kontakt gebracht wird, werden alle difiüsionsfähigen Reagenzien der analytischen Zusammensetzung dieser Erfindung und die diffusionsfähigen Bestandteile der wäßrigen Flüssigkeit miteinander gemischt, um eine homogene Mischung zu bilden.

Geeignete Verteilungsschichten können durch Verwendung von Fasermaterialien, entweder vermischt mit einem geeigneten Bindematerial oder in einem Gewebe verwebt, wie im US-Patent Nr. 4292,272 von Katajima et al. beschrieben, von polymeren Zusammensetzungen oder partikulären Materialien, beispielsweise einem Blush-Polymer wie in dem US-Patent Nr. 3,992,158 offengelegt, Kügelchen, die mit oder ohne bindende Adhäsive aneinander gebunden sind, wie im US-Patent Nr. 4258,001 von Pierce et al. beschrieben, hergestellt werden. Besonders zweckmäßige Verteilungsschichten umfassen Bariumsulfat oder Titandioxid. Da die Probe im allgemeinen direkt auf die Verteilungsschicht gegeben wird, ist es wünschenswert, daß die Verteilungsschicht isotropisch porös ist, was bedeutet, daß die Porosität in jeder Richtung in der Schicht dieselbe ist, wie dies durch untereinander verbundene Räume oder Poren zwischen Partikeln, Fasern oder Polymersträngen verursacht wird.

Die Elemente können auch einen oder mehrere andere Zusätze, die gewöhnlich in die Elemente aufgrund verschiedener Vorteile bei Herstellung und Funktion eingebracht werden, enthalten. Derartige Zusätze beinhalten oberflächenaktive Substanzen, Puffer, bakteriostatische Mittel, Lösungsmittel, Härter und andere Materialien, die auf dem Fachgebiet bekannt sind.

Die Schichten können auf transparente (d. h. strahlungsdurchlässige) Träger, wie etwa Poly(thylenterephthalat), geschichtet sein. Andere Träger sind im Fachgebiet bestens bekannt. In den Elementen ist die Chromoionophorverbindung dieser Erfindung im allgemeinen in einer oder mehreren Zonen in einem Umfang von mindestens ungefähr 0,10 und bevorzugt von ungefähr 0,10 bis ungefähr 1,5 g/m² vorhanden. Andere Reagenzien und Materialien sind in Mengen vorhanden, die demjenigen, der auf dem Fachgebiet arbeitet, bekannt sind.

Die Elemente der Erfindung können auf verschiedene Weise gestaltet sein, einschließlich langgestreckten Streifen jeder gewünschten Breite, Blättern, Objektträgern oder Chips.

Die Elemente können in manuell ausgeführten oder automatisierten Testtechniken verwendet werden. Im allgemeinen wird bei Verwendung der Trockenelemente die Kalziumionenbestimmung durchgeführt, indem das Element von einer Spenderrolle, aus einem Chippäckchen oder einer anderen Quelle entnommen und in physischen Kontakt mit der Probe (z. B. von 1 ul bis zu 200 ml) der zu untersuchenden Flüssigkeit gebracht wird, so daß die Probe und die Reagenzien innerhalb des Elements vermischt werden. Ein derartiger Kontakt kann auf jede geeignete Weise erreicht werden, beispielsweise durch Eintunken oder Untertauchen des Elements in der Probe oder, bevorzugt, durch Betropfen des Elements von Hand oder maschinell mit einem Tropfen der Probe mit einem geeigneten Dispenser.

Nach dem Probenauftrag wird das Element bei einer Temperatur im Bereich von 15º bis 50ºC, bevorzugt 20º bis 40ºC und besonders bevorzugt 25º bis 37ºC für einen Zeitraum von bis zu ungefähr 5 Minuten inkubiert, um die Farbentwicklung zu unterstützen. Inkubation bedeutet, daß die Reagenzien für das vorgeschriebene Zeitintervall bei der gewünschten Temperatur miteinander in Kontakt gehalten werden, bevor oder während Farbmessungen vorgenommen werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform können zufallsbedingte Abweichungen vermieden werden, indem Zitrat (oder Zitronensäure) zu der oben beschriebenen Testzusammensetzung oder zu der zu testenden Probe gegeben wird. In jedem Fall ist das Zitrat (oder die Zitronensäure) in Konzentrationen im Bereich von 1 bis 200 mM, bevorzugter 10 bis 100 mM, vorhanden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Test unter Verwendung eines Dünnfilmelements wie oben beschrieben durchgeführt, wobei das Element Zitrat oder Zitronensäure in einer oder mehreren Schichten des Testelements enthält, wobei der aufgetragene Bereich von Zitrat oder Zitronensäure 0,1 bis 20 mmol/cm² entspricht. Ein stärker bevorzugter Bereich ist 1 bis 10 mmol/cm². Bevorzugterweise wird das Zitrat oder die Zitronensäure in die Verteilungsschicht während des Beschichtungsverfahrens eingearbeitet Die Einbeziehung von Zitrat oder Zitronensäure in die Tests unter Verwendung der Chromoionophorverbindungen der vorliegenden Erfindung wirkt sich günstig auf die zufallsbedingten Abweichungen aus. Nutzen kann aus dem erweiterten dynamischen Bereich der Chromoionophore und der Möglichkeit, colorimetrische Meßwerte nahe oder über 600 nm zu erhalten, gezogen werden.

Die nachfolgenden Beispiele beschreiben ausführlich die chemische Synthese von repräsentativen Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Die beschriebenen Verfahren dienen der Veranschaulichung, und die Erfindung soll nicht als auf chemische Reaktionen und Bedingungen, die sie darstellen, beschränkt aufgefaßt werden. Es wurde kein Versuch unternommen, die in diesen Reaktionen erzielten Ausbeuten zu optimieren, und es wird einer Fachperson offensichtlich sein, daß Veränderungen der Reaktionszeiten, Temperaturen, Lösungsmittel und/oder Reagenzien die Ausbeuten steigern könnten.

BEISPIEL 1 7,16-Bis[2-hydroxy-5-(4-nitro-2-trifluormethylphenylazo)benzyl]-7,16-diazo- 1,4,10.,13-tetraoxacyclooctadecan Teil A Präparation von 7,16-Bis(2-hydroxybenzyl)-7,16-diazo-1,4,10,13-tetraoxacycloocta-decan

7,16-Diazo-1,4,10,13-tetraoxacyclooctadecan(13 g, 0,05 Mol) wurden zu Acetonitril (l 50 ml) gemeinsam mit 2-Acetoxybenzylbromid (0,12 Mol) und N,N-Diisopropyl-N-ethylamin (0,25 Mol) gegeben. Die Mischung wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gehalten und das Lösungsmittel wurde entfernt, bis sich eine Paste bildete. Die Paste wurde in Wasser gelöst und die Lösung zweimal mit Dichlormethan extrahiert. Die Extrakte wurden getrocknet und lieferten 25 g eines dickflüssigen Öls. Das Öl wurde in einem Gemisch aus 100 ml Methanol, 10 ml Wasser und 1 ml Essigsäure gelöst und die Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Die Mischung wurde gekühlt, und beim Kratzen des Behälters mit einem Rührstab formten sich weiße Kristalle. Diethylether wurde zugegeben und das Produkt durch Filtration getrennt und getrocknet:

Teil B. Präparation von 4-Nitro-2-trifluormethylphenyldiazoniumhexafluorphosphat

Eine Lösung aus Natriumnitrit (10 g) in 20 ml Wasser wurde auf Eis zu einer Suspension aus 4- Nitrotrifluormethylanilin (20,6 g) und konzentrierter Salzsäure gegeben. Nachdem die Zugabe abgeschlossen war, wurde das Gemisch 1 Stunde lang gerührt und dann mit 15 ml einer 60%igen Hexafluorphosphorsäure behandelt, wodurch ein festes Präzipitat erzeugt wurde. Wasser wurde zugegeben, das Produkt durch Filtration gewonnen, das Präzipitat wurde mit Wasser gewaschen und luftgetrocknet, um 27 g (75%) Ausbeute zu ergeben.

Teil C. Präparation der Verbindung der Überschrift

Eine Lösung aus 1,5g der Diazoniumverbindung, hergestellt wie in Teil B beschrieben, in 30 ml Ethylacetat wurde unter Rühren während eines Zeitraums von 10 Minuten zu einer Suspension aus 900 mg des in Teil A präparierten Bisphenols in 75 ml Ethylacetat gegeben. Unverzüglich bildete sich Farbstoff und die Mischung wurde weitere 1 0 Minuten gerührt, dann eine Stunde lang gekühlt, das Produkt durch Filtration gewonnen, mit Diethylether gewaschen und getrocknet Ausbeute: 1,0 g. Elementaranalyse Berechnet (mit 2HPF&sub6;): C, 40,0; H, 3,7; N, 9,3; F, 28,5; P, 5,2. Gefunden: C, 36,83; H, 3,75; N, 8,47.

BEISPIEL 2 7,16-Bis[2-hydroxy-5-(2-metylsulfonyl-4-nitrophenylazo)benzyl]-7,16- diazo-1,4,10,13-tetraoxacyclooctadecan

Eine Lösung aus 2-Methylsulfonyl-4-nitrophenyldiazoniumhexafluorphosphat , hergestellt durch die in Beispiel 1, Teil B, dargestellten Verfahren mit der Ausnahme, daß 2-Methylsulfonyl-4-nitroanilin anstelle des 4- Nitro-2-trifluormethylanilin (1,7 g 4,5 mMol) verwendet wurde, in Acetonitril (50 ml) wurde langsam über einen Zeitraum von 15 Minuten zu 7,16-Bis(2-hydroxybenzyl)-7,16-diazo-1,4,10,13-tetraoxacyclooctadecan (1,0 g, 2,11 mMol), hergestellt wie in Beispiel 1, Teil A, beschrieben, in 100 ml Acetonitril gegeben, 3 Stunden lang auf 0ºC gekühlt, und das Lösungsmittel wurde durch Evaporation entfernt. Der Rückstand wurde mit Wasser gewaschen und durch Erwärmen in einem Gemisch aus Ethanol und verdünnter wäßriger Natriumhydroxidlösung gelöst. Die Mischung wurde gekühlt, und das Produkt wurde durch Zugabe von Essigsäure gefallt, durch Filtration gewonnen, zunächst mit Isopropylalkohol, dann mit Edier gewaschen. Ein kleiner Teil wurde in N,N- Dimethylformamid gelöst, durch Zugabe von Ethanol gefällt, luftgetrocknet, dann 10 Minuten bei 90ºC weiter getrocknet und getestet.

BEISPIEL 3 Trockentest auf Kalziumionen

Ein analytisches Element der vorliegenden Erfindung wurde in dem nachfolgend dargestellten Format hergestellt und zurechtgeschnitten und als Objektträger für Kalziumtests aufgebaut

Verteilungsschicht

Unterschicht

Gelatine-/Pufferschicht

Reagenzschicht

Träger

Um das analytische Element mit der oben dargestellten Anordnung herzustellen, wurde eine Farbstoffdispersion aus 1% Chromoionophor aus Beispiel 1,5% Tricresylphosphat-Kopplungslösung, 0,6% des Alkanol XC Natriumalkyl-naphthalinsulfonat-Tensids und 6% Gelatine durch Standardmethoden zur Herstellung photographischer Kopplungsdispersionen unter Einbeziehung des Untermahlens von Farbstoff Lösungsmittel und Tensiden zu einer einheitlichen, stabilen Dispersion mit gewünschter Partikelgröße hergestellt.

Diese Farbstoffdispersion wurde dann mit der nachfolgenden Schichtzusammensetzung auf einen Poly(ethylenterephthalar)-Träger geschichtet:

Reagenzschicht 1 : 0,25 g/m² Farbstoff in Form einer Dispersion, 10,0 g/m² Gelatine und 0,025 mol/m² TRIS-Puffer(2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol-Puffer, eingestellt auf pH 7,7 bei 37ºC).

Gelatine-/Pufferschicht 2 : 0,035 mol/m² TRß (Mischung eingestellt auf pH 7,7 bei 37ºC)in 10,0 g/m² Gelatine, quervernetzt mit 0,5 g/m² Bis(vinylsulfonylmethyl)ether.

Unterschicht 3: 0,39 g/m² Poly(N-isopropylacrylamid).

Verteilungsschicht 4: TiO&sub2; Verteilungsschicht mit der folgenden Zusammensetzung:

67,2 g/m² Titandioxid

9,8 g/m² Zelluloseacetat

1,8 g/m² Triton X-405 (Octylphenoxypolyetoxyethanol, nicht-ionisches Tensid)

0,9 g/m² Brij 78 (Polyoxyethylen (20) Stearylether, nicht-ionisches Tensid)

1,8 g/m² Estane 5715, ein Polyurethan-Elastomer, vertrieben durch B.f. Goodrich.

Dieses Element wurde verwendet, um Kalziumkonzentrationen in 50 Patientenseren im Bereich von Kalziumkonzentrationen zwischen 1,57 bis 16,5 mg/dl, 3-feche Bestimmungen pro Serumprobe, zu bestimmen. Die Reflexionsdichte, hervorgehend aus der Komplexierung der Kalziumionen mit den Chromoionophorverbindungen der vorliegenden Erfindung, wurde bei 600 nm gemessen, wobei ein kommerziell verfügbares Johnson & Johnson VITROS Analysegerät für Objektträger verwendet wurde. Die mit dem oben beschriebenen analytischen Element experimentell bestimmten Kalziumkonzentrationen korrelierten mit denen, die in denselben Serumproben unter Verwendung kommerziell verfügbarer analytischer Elemente zur Bestimmung von Kalzium gemessen wurden.

BEISPIEL 4 Trockentest auf Kalziumionen

Ein analytisches Element der vorliegenden Erfindung wurde mit der in Beispiel 3 beschriebenen Anordnung mit und ohne Zitronensäure, zugegeben zu der TiO&sub2;-Verteilungsschicht in einer Konzentration von 2,0 mMol/m², hergestellt. Diese Beschichtungen wurden verwendet, um die Kalziumspiegel in Proben von 50 Patientenseren zu analysieren, wobei die Reflexionsdichten des entwickelten Farbstoffe bei einer Wellenlänge von 600 nm gemessen wurden. Die Referenzwerte (bestimmt durch Atomabsorptionsspektroskopie) für das Serum wurden verwendet, um jede Beschichtung zu kalibrieren; dann wurde die Kalziumkonzentration jedes Serums aus der entsprechenden Kalibrierungskurve abgelesen. Der systematische Fehler wurde als Differenz zwischen dem Wert, der mit der Beschichtung ermittelt wurde, und dem Referenzwert berechnet. Die Summe der Abweichungen im Quadrat wurde unter Verwendung folgender Formel berechnet:

Abweichungssumme im Quadrat = Σ(vorausgesagte Konzentration - Referenzkonzentration)² und ergab 4,07 (kein Zitrat) und 1,69 (plus Zitrat). Die individuelle Probenabweichung wird in Fig. 1 (kein Zitrat) und Fig. 2 (plus Zitrat) dargestellt gezeigt. Die Elemente, die Zitronensäure in der Verteilungsschicht enthielten, wiesen eindeutig signifikant geringere Abweichungen, als die entsprechenden Elemente ohne Zitronensäure auf.

Die Erfindung wunde ausführlich unter besonderer Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen davon beschrieben, es versteht sich jedoch, daß Änderungen und Modifikationen in Einklang mit dem Geist und dem Ziel der Erfindung herbeigeführt weiden können.


Anspruch[de]

1. Verbindung gemäß Formel I:

worin X eine Phenol-, Naphthol- oder Chinolinol-Einheit ist, ausgewählt aus denen der Formeln:

R&sub1;, R&sub5;, R&sub5;, R&sub1; und R&sub5; sind unabhängig voneinander ausgewählt aus Wasserstoff Halo, Cyano, Nitro, (C&sub1;- C&sub6;)-Alkyl, (C&sub2;-C&sub8;)Acyl, Acetamido, Mercapto, Alkyl- oder Arylsulfonyl, Trifluormethyl, Aryl und substituiertem Aryl, worin die Aryleinheit ausgewählt ist aus Phenyl und Naphthyl und der Arylsubstituent ausgewählt ist aus Halo, Cyano, Nitro, (C&sub1;-C&sub6;)-Alkyl, (C&sub2;-C&sub8;)-Acyl, Phenyl, Acetamido, Mercapto, Alkyl- oder Arylsulfonyl und Trifluormethyl;

vorausgesetzt, daß wenn R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub5; Wasserstoff sind und X Phenol ist, R&sub4; nicht Nitro ist; und vorausgesetzt, daß wenn X Phenol und R&sub5; Wasserstoff ist, R&sub1; (oder R&sub2;) und R&sub4; nicht beide Nitro sind;

wobei die Verbindung gemäß Formel I ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge größer als ungefähr 580 nm aufweist, wenn sie mit Kalziumion komplexiert ist, und in organischen Kupplungslösemitteln ist.

2. Verbindung nach Anspruch, worin X Phenol ist, R&sub1;, und R&sub2; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff und einer Elektronen langenden Gruppe ausgewählt aus Halo, Cyano, Nitro, Acyl von 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkyl- oder Arylsulfonyl und Trifluormethyl, vorausgesetzt, daß mindestens einer von R&sub1; und R&sub2; eine Elektronen fangende Gruppe ist; R&sub5; ausgewählt ist aus Wasserstoff Halo, Cyano, Nitro, (C&sub1;-C&sub6;)-Alkyl, (C&sub2;-C&sub8;)-Acyl, Acetamido, Mercapto, Alkyl- oder Arylsulfonyl, Trifluormethyl, Aryl und substituiertem Aryl, wobei die Aryleinhek ausgewählt ist aus Phenyl und Naphthyl und der Arylsubstituent ausgewählt ist aus Halo, Cyano, Nitro, (C&sub1;-C&sub6;)-Alkyl,(C&sub2;-C&sub8;)-Acyl , Phenyl, Acetamido, Mercapto, Alkyl- oder Arylsulfonyl und Trifluormethyl; R&sub4; ist Nitro und R&sub5; ist Wasserstoff

3. Verbindung nach Anspruch 1, worin X Phenol ist, R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff und einer Elektronen langenden Gruppe ausgewählt aus Hab, Cyano, Nitro, Acyl von 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkyl- oder Arylsulfonyl und Trifluormethyl, vorausgesetzt, daß mindestens einer von R&sub1; und Ra eine Elektronen fangende Gruppe ist; R&sub1; ist Nitro, R&sub5; ist Wasserstoff und R&sub3; ist eine (C&sub1;-C&sub6;)- Alkylgruppe, vorausgesetzt, daß wenn einer von R&sub1; oder R&sub2; Trifluormethyi und der andere Wasserstoff ist, R&sub5; auch Wasserstoff sein kann.

4. Verbindung nach Anspruch 1, worin X Phenol ist, R&sub1; Trifluormethyl ist; R&sub2;, R&sub3; und R&sub5; Wasserstoff sind und R&sub4; Nitro ist.

5. Wässrige Zusammensetzung, gepuffert auf einen pH-Wert von ungefähr 6 bis ungefähr 9, die eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.

6. Analytisches Element Bestimmung von Kalziumionen, umfassend ein Absorbierendes Trägermaterial, das eine Verbindung gemäß Formel I, definiert in einem der Ansprüche 1 bis 4, enthält.

7. Analytisches Element Bestimmung von Kalziumionen, umfassend einen nicht-porösen Halter mit einer Reagenzzone und einer porösen Verteilungszone darauf, wobei das Element in mindestens einer der Zonen eine Verbindung gemäß Formel I, definiert in einem der Ansprüche 1 bis 4, enthält.

8. Element nach Anspruch 7, wobei die Zonen übereinander angeordnete Schichten sind.

9. Element nach Anspruch 7, wobei die Verbindung gemäß Formel I in der Reagenzzone vorliegt.

10. Element nach Anspruch 7, das zusätzlich 1 bis 200 mM Zitrat oder Zitronensäure enthält.

11. Element nach Anspruch 10, wobei das Zitrat oder die Zitronensäure in einer Konzentration von 0,1 bis 20 mmol/m² in der Verteilungszone enthalten ist.

12. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Kalziumionen, umfassend:

(a) In Kontakt Bringen einer flüssigen Probe, von der angenommen wird, daß sie Kalziumionen enthält, mit eine Chromionophor-Verbindung gemäß Formel I, definiert in einem der Ansprüche 1 bis 4; und

(b) Colometrisches Bestimmen der Quantität von in der Probe vorhandenem Kalzium durch Messen der Änderung der optischen Dichte, die das Ergebnis der Komplexierung von Kalziumionen mit der Verbindung gemäß Formel I ist

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Chromionophor-Verbindung in einem analytischen Trockenelement zur Bestimmung von Kalziumionen, das einen nicht-porösen Halter mit einer Reagenzzone und einer porösen Verteilungszone darauf umfaßt, enthalten ist

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Verteilungszone 0,1 bis 20 mmol/m² Zitrat oder Zitronensäure enthält.







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