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Dokumentenidentifikation DE10119972A1 23.05.2002
Titel Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Fettsäuresterylestern aus Dämpferdestillaten der Fettraffination und Tallöl
Anmelder Weber, Nikolaus, Dr., 48291 Telgte, DE;
Kumar, D., Dr., 48145 Münster, DE
Erfinder Weber, Nikolaus, Dr., 48291 Telgte, DE;
Kumar, D., Dr., 48145 Münster, DE
DE-Anmeldedatum 24.04.2001
DE-Aktenzeichen 10119972
Offenlegungstag 23.05.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 23.05.2002
IPC-Hauptklasse C12P 33/00
Zusammenfassung Die Erfindung beschreibt ein enzymatisches Verfahren zur Synthese von Fettsäure-sterylestern in hoher Ausbeute durch Umsetzung von den in Dämpferdestillaten der Fettraffination (Brüdenöl) oder in Rückständen der Papierherstellung (Tallöl) enthaltenen Fettsäuren oder Fettsäureestern mit den darin ebenfalls vorkommenden Sterinen, wobei die Reaktionspartner ohne Lösungsmittel in Gegenwart von Lipasen im Vakuum reagieren. Die entstandenen Fettsäure-sterylester werden durch Entsäuerung, Lösungsmittel-Fraktionierung oder chromatographische Verfahren gereinigt. Fettsäure-sterylester können als Nahrungsergänzungen und Pharmazeutika, als Flüssigkristalle in der Technik sowie als Bestandteile von Kosmetika Verwendung finden.

Beschreibung[de]

Die Erfindung ist charakterisiert durch die lösungsmittelfreie Umsetzung von Fettsäuren und Fettsäureestern mit Sterinen, die als Gemische in Dämpferdestillaten der Fettraffination (Brüdenölen) oder in Rückständen der Papierherstellung (Tallölen) vorliegen, wobei die Reaktionspartner ohne Lösungsmittel in Gegenwart von Lipasen im Vakuum zu Fettsäuresterylestern reagieren. Die entstandenen Fettsäure-sterylester werden durch Entsäuerung, Lösungsmittel-Fraktionierung und chromatographische Verfahren angereichert und gereinigt.

Bei der Raffination von Fetten und Ölen fallen Dämpferdestillate (Brüdenöle) als Nebenprodukte des Dämpfungsverfahrens (Desodorierung) an. Dämpferdestillate aus Pflanzenölen enthalten hauptsächlich freie Fettsäuren, Mono-, Di- und Triglyceride, Phytosterine und deren Fettsäureester sowie Tocopherole. Vor allem Phytosterine, deren Fettsäureester (Fettsäuresterylester) und Tocopherole sind von wirtschaftlichem Wert und werden aus den Dämpferdestillaten abgetrennt, wobei insbesondere physikalische (unterschiedliche Destillationsverfahren) und chemische Verfahren (Extraktion mit Lösungsmitteln, Derivatisierung) angewendet werden (vgl. Kim, S. K. und Rhee, J. S., 1982. Isolation and purification of tocopherols and sterols from soya oil deodorization. Korean Journal of Food Science and Technology 14, 174-178; Sheabar, F. Z. und Neeman, L, 1988. Separation and concentration of natural antioxidants from the rape of olives. Journal of the American Oil Chemists' Society 65, 990-993; Lee, H., Chung, B. H. und Park, Y. H., 1991. Concentration of tocopherols from soybean sludge by supercritical carbon dioxide. Journal of the American Oil Chemists' Society 68, 571-573). In jüngster Zeit sind auch verschiedene biochemische Verfahren, z. B. Lipase katalysierte Hydrolyse oder Umesterung, zur Gewinnung von Phytosterinen aus Dämpferdestillaten beschrieben worden (Ghosh, S. und Bhattacharyya, D. K., 1996. Isolation of tocopherol and sterol concentrate from sunflower oil deodorizer distillate. Journal of the American Oil Chemists' Society 73, 1271-1274; Ramamurthi, S. und McCurdy, A. R., 1993. Enzymatic pretreatment of deodorizer distillate for concentration of sterols and tocopherols. Journal of the American Oil Chemists' Society 70, 287-295; Ramamurthi, S., McCurdy, A. R. und Tyler, R. T., 1998. Deodorizer distillate: A valuable by-product In: Proceedings of the world conference on oilseed and edible oils processsing: Emerging technologies, current practices, quality control, technology transfer, and environmental issues, Vol. I [Koseoglu, S. S., Rhee, K. C. und Wilson, R. F., Eds.] S. 130-134, AOCS Press, Champaign; Shimada, Y., Nakai, S., Suenaga, M., T., Sugihara, A., Kitano, M. und Tominaga, Y., 2000. Facile purification of tocopherols from soybean oil deodorizer distillate in high yield using lipase. Journal of the American Oil Chemists' Society 77, 1009-1013; Daguet, D. und Coic, J.-P., 1999. Phytosterol extraction: State of the art. Oleagineux Corps Gras Lipides 6, 25-28). In diesen Verfahren werden die Phytosterylester der Dämpferdestillate in freie Phytosterine oder die freien Fettsäuren in Fettsäuremethylester überführt, um eine einfachere und preisgünstigere Trennung der kommerziell verwertbaren Komponenten der Dämpferdestillate, d. s. Phytosterine und Tocopherole, zu erreichen.

In ähnlicher Weise wird Tallöl, das als Nebenprodukt bei der Herstellung von Zellstoff durch Aufschluss von Harz reichen Holzarten nach dem Sulfatverfahren anfällt, als Ausgangsmaterial für die Gewinnung von Phytosterinen verwendet. Tallöl besteht hauptsächlich aus einem Gemisch von Fett- und Harzsäuren, unverseifbaren Anteilen sowie Fettsäure-sterylestern (Drew, J. und Propst, M., Hrsg., 1981. Tall oil. Pulp Chemical Association, New York; von Hellens, S., 1999. Benecol margarine enriched with stanol esters. Lipid Technology 11, 29-31).

Fettsäure-sterylester finden vielseitige Anwendung als Pharmazeutika, als Bestandteile von Kosmetika und als flüssigkristalline Verbindungen in der Technik (Koshiro, A., 1987. Cholesterol ester and its manufacture using microbial lipase. Japan. Kokai Tokkyo Koho 62 296 894 (Chemical Abstracts 110: 210969p, 1989]). In jüngster Zeit werden Fettsäureester der Phytosterine auch als Nahrungsergänzungen in Diätmargarinen verwendet, da sie den Blutcholesterin-Spiegel senken können (Miettinen, T., Vanhagen, H. und Wester, L, 1996. Use of stanol fatty acid ester for reducing serum cholesterol level. U. S. Patent 5 502 045; von Hellens, S., 1999. Benecol margarine enriched with stanol esters. Lipid Technology 11, 29-31; Wester, L, 2000. Cholesterol-lowering effect of plant sterols. European Journal of Lipid Science and Technology, 37-44).

In bisherigen chemischen Verfahren werden Phytosterine aus Dämpferdestillaten gewonnen, indem diese gewöhnlich einer alkalischen Verseifung unterworfen werden, um Fettsäuresterylester in freie Sterine zu überführen (Daguet, D. und CoYc, J.-P., 1999. Phytosterol extraction: State of the art. Oleagineux Corps Gras Lipides 6, 25-28). Die Reaktionsgemische wurden unter anderem durch technische Verfahren wie zum Beispiel Molekulardestillation, Lösungsmittel-Fraktionierung und Umkristallisation aus organischen Lösungsmitteln gereinigt. Das auf diese Weise gewonnene Gemisch von freien Phytosterinen diente in Veresterungs- oder Umesterungsverfahren zur Herstellung der entsprechenden Fettsäure-sterylester. Chemische Verfahren beruhen vor allem auf der Umesterung von Fettsäureestern mit Sterinen oder Reaktionen von Carbonsäurehalogeniden oder -anhydriden mit Hydroxy-Gruppen von Sterinen (Mahadevan, V. und Lundberg, W., 1962. Preparation of cholesterol esters of long-chain fatty acids and characterization of cholesteryl arachidonate. Journal of Lipid Research 3, 106-110;

Pinter, K. G., Hamilton, J. G. und Muldrey, J. E., I964. A method for rapid microsynthesis of radioactive cholesterol esters. Journal of Lipid Research 5, 273-274; Piretti, M. V. und Pagliuca, G., 1996. Synthesis of highly pure dolichyl and cholesteryl esters. Italian Journal of Biochemistry 45, 67-69). Phytosterine werden aus Tallöl-Seifen oder Destillationsrückständen des Tallöls durch Extraktion gewonnen, katalytisch hydriert und die resultierenden Phytostanole durch Umesterung mit Fettsäure-methylestern in Fettsäure-stanylester überführt (von Hellens, S., 1999. Benecol margarine enriched with stanol esters. Lipid Technology 11, 29-31).

Enzymatische Verfahren zur Herstellung von Fettsäure-sterylestern sind ebenfalls bekannt; sie gehen von Fettsäuren und Sterinen (Veresterung) bzw. Fettsäureestern und Sterinen (Umesterung) aus, die in Gegenwart von Lipasen als Biokatalysatoren umgesetzt werden. Bisherige Verfahren (Koshiro, A., 1987. Cholesterol ester and its manufacture using microbial lipase. Japan. Kokai Tokkyo Koho 62 296 894 [Chemical Abstracts 110, 210969p, 1989]; Kosugi, Y., Tanaka, H., Tomizuka, N., Akeboshi, K., Matsufune, Y. und Yoshikawa, S., 1989. Enzymic manufacture of sterol fatty acid esters. Japan. Kokai Tokkyo Koho 1 218 593 [Chemical Abstracts 113, 4707k, 1990]) beschreiben die Lipase katalysierte Veresterung von organischen Carbonsäuren mit Hydroxy-Gruppen von Sterinen, z. B. Cholesterin, in organischen Lösungsmitteln wie zum Beispiel Heptan, Methyl-tert.-butylether, Aceton und anderen, zum Teil unter Verwendung von Molekularsieb im Reaktionsansatz zur Entfernung des gebildeten Wassers oder Alkohols (Shimada, Y., Hirota, Y., Baba, T., Sugihara, A., Moriyama, S., Tominaga, Y. und Terai, T., 1999. Enzymatic synthesis of steryl esters of polyunsaturated fatty acids. Journal of the American Oil Chemists' Society 76, 713-716; Haraldsson, G. G., 1992. The application of lipases in organic synthesis. In: Supplement B: The chemistry of acid derivatives, Vol. 2 [Patai, S., Ed.] S. 1395-1473, John Wiley, Chichester; Kazlauskas, R. J. und Bomscheuer, U. T., 1998. Biotransformations with lipases. In: Biotechnology [Rehm, H.-J. und Reed, G., Eds.] 2nd edition, Vol. 8a: Biotransformations, S. 37-191, Wiley-VCH, Weinheim; Riva, S. und Klibanov, A. M., 1988. Enzymochemical regioselective oxidation of steroids without oxidoreductases, Journal of the American Chemical Society 110, 3291; Riva, S., Bovara, R., Ottolina, G., Secundo, F. und Carrea, G., 1989. Regioselective acylation of bile acid derivatives with Candida cylindracea lipase in anhydrous benzene. Journal of Organic Chemistry 54, 3161-3164; Faber, K. und Riva, S., 1992. Enzyme-catalyzed irreversible acyl transfer. Synthesis, 895-910).

Lipase katalysierte Veresterungs- und Umesterungsreaktionen im Vakuum zur Entfernung der flüchtigen Reaktionsprodukte sind kürzlich zur Herstellung von Fettsäure-sterylestern eingesetzt worden (Weber, N. und Mukherjee, K. D., Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Carbonsäure-sterylestern. Patentanmeldung DPMA-Az. 100 18 787.0 (15.04.00); Weber, N., Weitkamp, P. and Mukherjee, K. D., 2001. Fatty acid steryl, stanyl and steroid esters by esterification and transesterification in vacuo using Candida rugosa lipase as catalyst. Journal of Agricultural and Food Chemistry 49, 67-71).

Im Unterschied zu den bekannten, oben erwähnten Verfahren werden die im folgenden ausführlich beschriebenen enzymatischen Synthesen der Fettsäure-sterylester ausgehend von unbehandelten Nebenprodukten der Fettverarbeitung (Dämpferdestillate) und Papierherstellung (Tallöle) in Abwesenheit von Lösungsmitteln und Trockenmitteln wie z. B. Molekularsieb oder Natriumsulfat durchgeführt. Die Anwendung des Verfahrens auf behandeltes und/oder fraktioniertes Dämpferdestillat und Tallöl, die üblicherweise für technische Anwendungen hergestellt werden, als Ausgangsprodukte (Edukte) für die enzymkatalytische Veresterung und Umesterung von Fettsäure-sterylestern ist jedoch ebenfalls möglich. Dabei werden die Gemische der Reaktionspartner, d. s. Fettsäuren oder Fettsäureester und Phytosterine, wie sie in unbehandelten oder behandelten Dämpferdestillaten von Pflanzenölen oder in Tallölen aus der Papierverarbeitung sowie deren Fraktionen vorliegen, enzymkatalytisch in Gegenwart von Lipasen umgesetzt und das entstandene Wasser oder andere flüchtige Reaktionsprodukte im Vakuum aus dem Reaktionsgemisch entfernt. Über diese Lipase katalysierten Veresterungs- und Umesterungsreaktionen im Vakuum zur Herstellung von Fettsäure-sterylestern (Abb. 1) ausgehend von Gemischen aus Fettsäuren, Fettsäureestern (Mono-, Di-, Triglyceride) und Phytosterinen in Dämpferdestillaten und Tallölen mit anschließender Anreicherung und Reinigung der Fettsäure-sterylester durch Entsäuerung, Lösungsmittel-Fraktionierung und/oder chromatographische Verfahren ist bisher nichts bekannt. Abb. 1 Herstellung von Fettsäure-sterylestern, z. B. Fettsäure-sitosterylestern, durch Lipase katalysierte Veresterung und/oder Umesterung von den in Dämpferdestillaten und Tallölen enthaltenen Gemischen aus Fettsäuren, Fettsäureestern (z. B. Triglyceriden) und Phytosterinen (R = Alkylreste von Fettsäuren oder Fettsäureestern)



Phytosterine liegen in Dämpferdestillaten und Tallölen als natürliche Gemische beispielsweise von Sitosterin, Stigmasterin und Campesterin vor. Die Zusammensetzung der Phytosterine in Dämpferdestillaten oder Tallölen ist für jedes Produkt typisch; für Rapsöl ist zum Beispiel das Vorkommen von Brassicasterin kennzeichnend.

Bei den freien Fettsäuren handelt es sich um Gemische von Fettsäuren, wie sie in Dämpferdestillaten von Pflanzenölen und in Tallölen von Natur aus vorliegen mit einer für das jeweilige Produkt typischen Zusammensetzung.

Für die Lipase katalysierte Synthese von Fettsäure-sterylestern durch Umesterung stehen als Fettsäureester vor allem die in den Dämpferdestillaten von Pflanzenölen, z. B. Rapsöl, Sonnenblumenöl und Sojaöl, enthaltenen Mono-, Di- und Triglyceride zur Verfügung. Tallöle enthalten üblicherweise nur geringe Anteile Triglyceride. Die Umesterung (Alkoholyse) von Mono-, Di- und Triglyceriden mit Hydroxy-Gruppen von Phytosterinen benötigt im Gegensatz zur oben beschriebenen Veresterung von Fettsäuren grundsätzlich kein Vakuum, da kein Reaktionswasser gebildet wird. Dennoch erhöht sich auch hier die Ausbeute, wenn die Reaktion im Vakuum durchgeführt wird.

Für die Herstellung der Fettsäure-sterylester können alle bekannten Lipasen als Enzymkatalysatoren verwendet werden, vor allem Lipasen aus Mikroorganismen, wie z. B. aus Rhizopus arrhizus, Candida antarctica, Candida nigosa (= C. cylindracea), Rhizomucor miehei und Geotrichum candidum, Pankreaslipasen aus verschiedenen Tierspezies sowie Lipasen und Acylhydrolasen aus Pflanzen, wie z. B. Papaya, Raps, Rizinus, Kartoffel, Reis, Vernonia und Ananas.

Die Lipase katalysierten Synthesen von Fettsäure-sterylestern können bei unterschiedlichen Reaktionsbedingungen durchgeführt werden, die insbesondere von den ausgewählten Lipasen abhängen. Im allgemeinen werden Temperaturen zwischen 10 und 100°C angewendet, bevorzugt solche zwischen 30 und 80°C. Die molaren Verhältnisse zwischen den Reaktionspartnern, d. s. Fettsäuren oder Fettsäureester und Sterine sind in den Rohprodukten (Dämpferdestillate, Tallöle) vorgegeben. Sie können aber auch durch Zugabe weiterer Komponenten (freie Sterine, Fettsäuren, Fettsäureester) gezielt verändert werden und unterliegen ebenso wie die Anteile der zugesetzten Lipasen keinen Einschränkungen. Die Reaktionszeit ist ebenfalls nicht beschränkt. Rühren des Reaktionsgemisches und Erhöhung der Lipasemenge im Versuchsansatz steigern die Reaktionsgeschwindigkeit und beschleunigen damit die Bildung der Fettsäure-sterylester. Wiederholte Verwendung der in einem Reaktionsansatz benutzten Lipase in einem neuen Ansatz ist ohne nennenswerten Leistungsverlust des Biokatalysators möglich. Unterdrücke zwischen 900 mbar und 0,1 mbar können für die Reaktion verwendet werden; üblicherweise werden Drücke zwischen 200 mbar und 10 mbar eingehalten.

Die Reinigung der Fettsäure-sterylester kann auf unterschiedlichem Wege erfolgen. Üblicherweise wird der Enzymkatalysator nach der Umsetzung durch Zentrifugation oder Filtration vom Reaktionsgemisch abgetrennt bzw. das Reaktionsgemisch mit einem organischen, vorzugsweise apolaren Lösungsmittel extrahiert. Die Anreicherung und Reinigung der Fettsäuresterylester erfolgt zunächst durch Entfernung der freien Fettsäuren aus dem Reaktionsgemisch durch Extraktion mit der wässrigen Lösung einer starken anorganischen oder organischen Base, z. B. mit 5%iger wässriger Natriumcarbonat-Lösung (Entsäuerung). Alternativ können die freien Fettsäuren auch durch Destillation abgetrennt werden.

Anschließend wird eine Lösungsmittel-Fraktionierung in polaren aprotischen Lösungsmitteln und deren wässrigen Lösungen vorgenommen, bei der vorzugsweise die Fraktion der neutralen polareren Komponenten - wie etwa Triglyceride - von den Fettsäure-sterylestern abgetrennt wird. Zur Fraktionierung können beispielsweise mit Wasser mischbare polare organische Lösungsmittel wie Aceton, Methanol oder Ethanol eingesetzt werden, in denen die Rohprodukte oder Zwischenprodukte gelöst werden. Anschließend wird Phasentrennung durch Zugabe von Wasser und/oder Abkühlen eingeleitet. Alternativ ist die Anreicherung von Fettsäure-sterylestern durch Verteilung der Komponenten des Reaktionsgemisches zwischen apolaren organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Petrolether, Hexan oder iso-Hexan, und polaren aprotischen Lösungsmitteln oder deren wässrigen Lösungen möglich. Bei diesen Fraktionierungsverfahren reichern sich die apolaren Fettsäure-sterylester in den weniger polaren organischen Phasen, die polareren Bestandteile (z. B. Triglyceride) in den polaren, beispielsweise organisch-wässrigen Phasen an.

Alternativ können Reaktionsgemische oder mit Fettsäure-sterylestern angereicherte Fraktionen aus Entsäuerung oder Lösungsmittel-Fraktionierung chromatographisch angereichert und gereinigt werden. Die Gemische werden dazu an einer kurzen Säule gepackt mit einem Sorbens, vorzugsweise Kieselgel, adsorbiert und die Fettsäure-sterylester anschließend durch Elution mit Gemischen apolarer und wenig polarer, aprotischer organischer Lösungsmittel, z. B. iso-Hexan/Diethylether-Gemische, von Resten nicht umgesetzter Fettsäuren bzw. von Fettsäureestern sowie Phytosterinen abgetrennt.

Im Folgenden werden verschiedene Ausführungsbeispiele gegeben für die Herstellung von Fettsäure-sterylestern, die in beheizbaren Rührgefäßen unter Vakuum durchgeführt wird:

Beispiel 1 Charakterisierung von Dämpferdestillaten und Rohtallöl

Dämpferdestillate (Brüdenöle) und Rohtallöle werden dünnschicht- und gaschromatographisch analysiert und der Gehalt an freien Phytosterinen, Phytosterylestern, freien Fettsäuren und Triglyceriden bestimmt (Tabelle 1). Die Durchführung der dünnschichtchromatographischen und gaschromatographischen Analysen ist in Beispiel 2 beschrieben. Tabelle 1 Zusammensetzung von Dämpferdestillaten und Rohtallöl, die für die Lipase katalysierte Veresterung und Umesterung von den darin enthaltenen Fettsäuren, Fettsäureestern und Phytosterinen eingesetzt wurden



Beispiel 2 Analyse der Fettsäure-sterylester Dünnschichtchromatographie an Kieselgelschichten

Anteile von Dämpferdestillaten der Pflanzenöle und von Rohtallöl oder Anteile der Reaktionsgemische, gelöst in iso-Hexan/Diethylether, werden auf Kieselgel-Dünnschichtplatten (0,3 mm Schichtdicke) punkt- oder strichförmig aufgetragen. Die Platten werden in einem Gemisch von iso-Hexan/Diethylether (95 : 5, v/v) entwickelt und die verschiedenen Verbindungsklassen des Reaktionsansatzes getrennt. Durch Besprühen der Platten mit einer wässrigen Schwefelsäure-Lösung und anschließendes Erhitzen oder durch Bedampfen mit Jod werden die verschiedenen Verbindungsklassen dann sichtbar gemacht. Die Identifizierung der einzelnen Verbindungsklassen erfolgt durch Vergleich mit bekannten Standards. Die folgenden Rf-Werte werden für die verschiedenen Verbindungsklassen im Reaktionsgemisch unter Verwendung des obigen Laufmittels gefunden: Fettsäure-sterylester 0,6-0,7; Fettsäuremethylester 0,4-0,5; Triglyceride 0,3-0,35; Phytosterine 0,1-0,15; freie Fettsäuren und andere organische Carbonsäuren < 0,1.

Gaschromatographie (GC)

Anteile von Dämpferdestillaten der Pflanzenöle und von Rohtallöl oder Anteile der Reaktionsgemische werden in Diethylether suspendiert und die unlöslichen Bestandteile (z. B. Lipase-Katalysatoren) durch Zentrifugation und anschließende Filtration durch ein Spritzenfilter (Porengröße 0,35 µm) abgetrennt. Freie Fettsäuren im Reaktionsgemisch werden durch Derivatisierung mit Diazomethan in die entsprechenden Methylester überführt. Das resultierende Gemisch aus Fettsäure-methylestern, Phytosterinen und Fettsäure-sterylestern wird gaschromatographisch analysiert. Die Trennung an einer 0,1 µm Quadrex 400-1HT Hochtemperatur- Kapillarsäule, 15 m × 0,25 mm i. D. (Wasserstoff als Trägergas mit einer linearen Strömungsgeschwindigkeit von 25-35 cm/sec; Temperaturprogramm: 130°C [5 min isotherm] gefolgt von einem linearen Temperaturanstieg von 130 bis 180°C mit 5°C/min. anschließend mit 20°C/min auf 410°C [10 min isotherm]) liefert für die verschiedenen Verbindungen der Reaktionsgemische sowie Standards beispielsweise folgende Retentionszeiten (Rt): Palmitinsäure-methylester (1,0 min); Stearinsäure-methylester (1,7 min); Ölsäure-methylester (1,6 min), Linolsäure-methylester (1,4 min); Cholesterin (13,4 min); Campesterin (14,1 min); Stigmasterin (14,3 min); Sitosterin (15,4 min); Sitostanol (15,6 min); Myristinsäure-cholesterylester (19,7 min); Ölsäurecampesterylester (20,74 min); Ölsäure-stigmasterylester (20,77 min); Ölsäure-sitosterylester (20,95 min); Ölsäure-sitostanylester (21,0 min); Linolsäure-sitostanylester (20,95 min); Triolein (22,3).

Die Gaschromatogramme werden mit einem Hewlett-Packard GC ChemStation Programm ausgewertet und aus den Anteilen von freien Sterinen zu Fettsäure-sterylestern die Umsätze bestimmt, wobei die Summe der Anteile von freien Sterinen und Fettsäure-sterylestern als 100% angenommen wird. Beispiel 3 Edukt: 1 g Dämpferdestillat aus konventioneller Desodorierung von Rapsöl

Lipase: Candida rugosa Lipase, immobilisiert, 50 bzw. 100 mg

Temperatur: 40°C

Druck: 50 mbar

Dauer: 24 h

Analyse: Die Analyse des Produktes erfolgt durch GC wie in Beispiel 2 beschrieben.

Umsatz (GC): 87 bzw. 93% Fettsäure-sterylester (bezogen auf die gesamten freien Phytosterine; siehe Tabelle 2)

Reinheit (GC): ≥ 90%

Aufarbeitung des Reaktionsgemisches

Als Beispiel wird im Folgenden die Aufarbeitung des Reaktionsgemisches beschrieben, das bei der Lipase katalysierten Umsetzung eines nach konventioneller Desodorierung von Rapsöl anfallenden Dämpferdestillats erhalten wird.

Entsäuerung

Anteile überschüssiger freier Fettsäuren werden aus dem Reaktionsgemisch durch Entsäuerung mit verdünnter wässriger Natriumcarbonat-Lösung entfernt. Dazu wird das oben beschriebene Reaktionsgemisch aus der Lipase katalysierten Synthese von Fettsäuresterylestern zweimal mit 10 mL Diethylether extrahiert und der Lipasekatalysator jeweils durch Zentrifugation abgetrennt. Freie Fettsäuren werden aus der Etherlösung durch dreimalige Extraktion mit je 6 mL 5%iger wässriger Natriumcarbonat-Lösung und anschließendes Waschen mit 10 mL Wasser entfernt. Die Etherphase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, eingedampft und der Rückstand (350 mg) bei 50°C im Vakuum getrocknet. Ein Aliquot wird gaschromatographisch analysiert wie in Beispiel 2 beschrieben.

Lösungsmittel-Fraktionierung

Das entsäuerte Reaktionsgemisch (310 mg) wird unter Erwärmen auf 50°C in 2 mL wasserfreiem Aceton gelöst und tropfenweise unter Rühren mit 0,2 mL destilliertem Wasser versetzt. Nach dem Abkühlen auf +7°C wird das Aceton-Wasser- Gemisch zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Die untere pastöse Phase, welche die angereicherten Fettsäure-sterylester enthält, wird erneut in 2 mL Aceton gelöst und das Verfahren wiederholt. Nach drei Wiederholungen erhält man 90 mg Fettsäure-sterylester (Reinheit 89%) und nach Säulenchromatographie (analog wie unten beschrieben) 85 mg Fettsäure-sterylester (Reinheit 93%), deren Fettsäurezusammensetzung in Tabelle 3 beschrieben ist. Die vereinigten Aceton/Wasser-Gemische werden eingedampft und bei späteren Lösungsmittel-Fraktionierungen wieder verwendet.

Säulenchromatographie

Das entsäuerte Reaktionsgemisch (350 mg) wird in 3 mL iso- Hexan/Diethylether (9 : 1, v/v) gelöst und an einer kurzen Säule (20 × 1 cm i. D.) gepackt mit Kieselgel (Kieselgel 60, Merck) in iso-Hexan adsorbiert. Die Elution mit 30 mL iso- Hexan/Diethylether (95 : 5, v/v) ergibt 130 mg Fettsäure-sterylester (Reinheit 67%). Tabelle 2 Anteile von Phytosterinen und Fettsäure-sterylestern vor und nach der Veresterung und/oder Umesterung von Fettsäuren, Fettsäureestern und Phytosterinen in Dämpferdestillaten von Pflanzenölen unter Katalyse von Candida rugosa Lipase im Vakuuma



Tabelle 3 Fettsäuremuster von Fettsäure-sterylestern hergestellt durch Lipase katalysierte Veresterung und/oder Umesterung von Fettsäuren bzw. Fettsäureestern mit Phytosterinen im Dämpferdestillat von konventionell desodoriertem Rapsöl im Vergleich zum Fettsäuremuster der Gesamtlipide des Dämpferdestillats



Beispiel 4 Edukt: 1 g Dämpferdestillat aus der physikalischen Raffination von Rapsöl

Lipase: Candida rugosa Lipase, immobilisiert, 50 mg

Temperatur: 40°C

Druck: 50 mbar

Dauer: 18 Std.

Die Aufarbeitung des Produktes erfolgt wie in Beispiel 3, die Analyse durch GC wie in Beispiel 2 beschrieben.

Umsatz (GC): 73% Fettsäure-sterylester (bezogen auf die gesamten freien Phytosterine, siehe Tabelle 2) Beispiel 5 Edukt: 1 g Dämpferdestillat-Gemisch aus der physikalischen Raffination von Rapsöl und Sojaöl

Lipase: Candida rugosa Lipase, immobilisiert, 50 mg

Temperatur: 40°C

Druck: 30 mbar

Dauer: 18 Std.

Die Aufarbeitung des Produktes erfolgt wie in Beispiel 3, die Analyse durch GC wie in Beispiel 2 beschrieben.

Umsatz (GC): 93% Fettsäure-sterylester (bezogen auf die gesamten freien Phytosterine; siehe Tabelle 2)

Beispiel 6 Bleichung des Dämpferdestillats

10 g Dämpferdestillat werden intensiv mit 1 g Bleicherde Tonsil Optimum NFF vermischt und über einen Zeitraum von 30 Minuten unter Stickstoffatmosphäre auf 100°C erhitzt. Nach Zentrifugation und Dekantieren des noch heißen Produkts erhält man gebleichtes Dämpferdestillat (8,5 g), das für die Lipase katalysierte Veresterung und/oder Umesterung verwendet wird:

Edukt: 1 g gebleichtes Dämpferdestillat aus konventioneller Desodorierung von Rapsöl

Lipase: Candida rugosa Lipase, immobilisiert, 50 mg

Temperatur: 40°C

Druck: 20 mbar

Dauer: 24 h

Analyse: Die Analyse des Produktes erfolgt durch GC wie in Beispiel 2 beschrieben.

Umsatz (GC): 85% Fettsäure-sterylester (bezogen auf die gesamten freien Phytosterine) Beispiel 7 Edukt: 0,5 g Rohtallöl

Lipase: Candida rugosa Lipase, immobilisiert, 100 mg

Temperatur: 40°C

Druck: 30 mbar

Dauer: 24 Std. Tabelle 4 Anteile von Phytosterinen und Fettsäure-sterylestern vor und nach der Veresterung und/oder Umesterung von Fettsäuren, Fettsäureestern mit Phytosterinen in Rohtallöl unter Katalyse verschiedener Lipasen im Vakuuma



Die Aufarbeitung des Produktes erfolgt wie in Beispiel 3, die Analyse durch GC wie in Beispiel 2 beschrieben.

Umsatz (GC): 59% Fettsäure-sterylester (bezogen auf die gesamten freien Phytosterine, siehe Tabelle 4) Beispiel 8 Edukt: 0,5 g Rohtallöl

Lipase: Candida antarctica Lipase B, immobilisiert (Novozym 435®) 100 mg

Temperatur: 80°C

Druck: 30 mbar

Dauer: 24 Std.

Die Aufarbeitung des Produktes erfolgt wie in Beispiel 3, die Analyse durch GC wie in Beispiel 2 beschrieben.

Umsatz (GC): 34% Fettsäure-sterylester (bezogen auf die gesamten freien Phytosterine, siehe Tabelle 4) Beispiel 9 Edukt: 0,5 g Rohtallöl

Lipase: Rhizomucor miehei Lipase, immobilisiert (Lipozyme IM®), 100 mg

Temperatur: 80°C

Druck: 20 mbar

Dauer: 24 Std.

Die Aufarbeitung des Produktes erfolgt wie in Beispiel 3, die Analyse durch GC wie in Beispiel 2 beschrieben.

Umsatz (GC): 12% Fettsäure-sterylester (bezogen auf die gesamten freien Phytosterine, siehe Tabelle 4)

Beispiel 10

Die Bleichung von Rohtallöl wurde durchgeführt wie in Beispiel 6 für das Dämpferdestillat beschrieben.

Edukt: 0,5 g gebleichtes Rohtallöl

Lipase: Candida rugosa Lipase, immobilisiert, 100 mg

Temperatur: 40°C

Druck: 30 mbar

Dauer: 24 Std.

Die Aufarbeitung des Produktes erfolgt wie in Beispiel 3, die Analyse durch GC wie in Beispiel 2 beschrieben.

Umsatz (GC): 55% Fettsäure-sterylester (bezogen auf die gesamten freien Phytosterine)


Anspruch[de]
  1. 1. Enzymatisches Verfahren zur Synthese von Fettsäure-sterylestern, wobei in unbehandelten Dämpferdestillaten der Fettraffination (Brüdenöle) vorkommende Fettsäuren, Fettsäureester und Sterine unter Rühren in Gegenwart von Lipasen reagieren und entstehendes Reaktionswasser sowie flüchtige Nebenprodukte im Vakuum destillativ entfernt werden. Die entstandenen Fettsäure-sterylester werden durch Entsäuerung mit wässrigen Lösungen anorganischer oder organischer Basen und/oder Lösungsmittel-Fraktionierung mit Aceton, Methanol, Ethanol oder anderen polaren aprotischen Lösungsmitteln sowie deren wässrigen Lösungen angereichert und gereinigt.
  2. 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Lösungsmittel-Fraktionierung mit Petrolether, Hexan, iso-Hexan oder anderen apolaren Lösungsmitteln und polaren aprotischen Lösungsmitteln sowie deren wässrigen Lösungen durchgeführt wird.
  3. 3. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem sich an den Entsäuerungsprozess ein säulenchromatographisches Reinigungsverfahren anschließt.
  4. 4. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 3, bei dem Tallöle anstatt Dämpferdestillate der Fettraffination zur Gewinnung von Fettsäure-sterylestern eingesetzt werden.
  5. 5. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 4, bei dem Fraktionen von Dämpferdestillaten der Fettraffination oder von Tallölen statt unbehandelter Rohprodukte zur Gewinnung von Fettsäure-sterylestern eingesetzt werden.






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