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Dokumentenidentifikation DE10058379A1 06.06.2002
Titel Neuer Hefestamm für den Verzehr
Anmelder BioteCon Diagnostics GmbH, 10589 Berlin, DE
Erfinder Grabowski, Reiner, Dr., 37075 Göttingen, DE;
Braunschweiger, Manuela, 12163 Berlin, DE;
Gasch, Alexander, Dr., 65239 Hochheim, DE;
Berghof, Kornelia, Dr., 12355 Berlin, DE
Vertreter Grünecker, Kinkeldey, Stockmair & Schwanhäusser, 80538 München
DE-Anmeldedatum 24.11.2000
DE-Aktenzeichen 10058379
Offenlegungstag 06.06.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 06.06.2002
IPC-Hauptklasse C12N 1/19
IPC-Nebenklasse C12Q 1/68   C12Q 1/04   C12N 15/11   C07H 21/04   A61K 35/72   C12C 11/02   
IPC additional class // A21D 8/04(C12Q 1/68,C12R 1:645)(C12Q 1/04,C12R 1:645)  
Zusammenfassung Die Erfindung beinhaltet die Verwendung eines Hefestammes für den menschlichen oder tierischen Verzehr. Er kann als Gärgetränk, als Getränkesuspension, als Medikament oder als Komponente einer Backmischung verabreicht werden. Auch können Extrakte aus Zellen des Stammes verzehrt werden.

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Hefestamm mit verbesserten Eigenschaften für den menschlichen oder tierischen Verzehr sowie ein Verfahren zur Charakterisierung von Hefen.

Die Hefe Saccaromyces cerevisiae wurde schon in altertümlichen Zeiten zur Herstellung von Gärgetränken verwendet. Die bekanntesten durch Hefe fermentierten Getränke sind Bier und Wein. Als Bier im strengen Sinne kann das Bier, das nach dem im Jahre 1516 erlassene Reinheitsgebot gebraut wird, verstanden werden. Nach diesem darf zu Herstellung von "Bier" nur Gerste, Hopfen, Wasser und Saccharomyces cerevisiae verwendet werden.

Weltweit existiert eine Vielzahl von Bieren, die sich teilweise erheblich in den Zutaten unterscheiden. Die verwendeten Hefestämme gehören zwar in der Regel der Gattung Saccharomyces an, sie unterscheiden sich jedoch in ihren physiologischen Eigenschaften signifikant voneinander.

Erst in der Neuzeit wurde die Verwendung von Bakterien und Hefen auch als Probiotika populär. Probiotika sind lebende Mikroorganismen zur Nahrungsergänzung mit förderlichen Effekten auf den Wirtsorganismus z. B. durch Verbesserung des intestinalen, mikrobiologischen Gleichgewichts. In den letzten Jahren wurden vermehrt wissenschaftliche und medizinische Forschungen durchgeführt, in denen die essentielle Bedeutung der gastrointestinalen Mikroflora für die Gesundheit und die Widerstandskraft von Mensch und Tier herausgestellt wurde.

Probiotika sollten lebende Mikroorganismen sein, die bestimmte antagonistische Eigenschaften zur vorherrschenden Darmflora haben, so dass sie sich positiv in die natürliche Symbiose integrieren können. Als Probiotika verwendete Hefen können sich häufig in den Biofilm der Darmoberfläche einfügen und dann eine Schutzbarriere gegen potentielle Krankheitserreger bilden. Sie verhindern die Vermehrung und die Ansiedelung von mit der Nahrung aufgenommenen Bakterien. Clostridien, Enterobakterien oder Campylobacter, die Enterotoxine bilden können, werden durch eine gesunde Darmflora in ihrem Wachstum begrenzt.

Verschiedene Stämme der Gattung Saccharomyces werden in unterschiedlichen Bereichen der Medizin zu Therapiezwecken, zur Behandlung von Akne, zur Prophylaxe und Therapie von antibiotikainduzierter Diarrhoe und Reisediarrhoe eingesetzt. Allgemein läßt sich sagen, dass Saccharomyces cerevisiae als apathogener Keim sich in dem Wirt Mensch nicht vermehren oder permanent ansiedeln kann. Grampositive Keime, wie Laktobacillen werden durch den Vitamingehalt der Hefen synergistisch in ihrem Wachstum gefördert. Das Immunsystem wird durch die antigenen Eigenschaften der Hefezellen stimuliert. Die Aktivitäten darmassoziierter Dissaccharidasen, wie Saccharase, Lactase und Maltase werden gesteigert. Disaccharide werden gespalten und dann resorbiert. Ungespalten könnten sie in tiefere Darmabschnitte gelangen und zu Diarrhöen führen. Enteropathogene E. coli können mit ihren mannosesensitiven Oberflächenanhängseln an Hefezellen gebunden werden, so dass sie sich nicht an die Darmwand anheften können. Das Auskleiden des Darmepithels durch Hefen verhindert somit die Anheftung pathogener Keime. Außerdem werden durch den Vitamin B-Gehalt der Hefen positive Wirkungen auf die Haut hervorgerufen.

Insbesondere den Gefahren einer Diarrhoe kann Saccharomyces cerevisiae prophylaktisch vorbeugen. Eine Diarrhoe droht insbesondere, wenn die intestinale Darmflora nach Antibiotikagaben reduziert ist. Antibiotikaresistente E. coli können sich vermehren und als indirekte Folge der Zurückdrängung grampositiver Keime stärker in die oberen Darmabschnitte vordringen. Voraussetzung für ihre Pathogenität ist die Adhärenz an das Darmepithel, die durch bestimmte mikrobielle Pathogenitätsfaktoren ermöglicht wird. Eine Infektion kann je nach E. coli-Stamm sehr unterschiedliche Verläufe haben. Außer einer bakteriellen Enterokolitis und Diarrhoe können auch schwerere Krankheitsformen, wie das hämorrhagisch urämische Syndrom, hervorgerufen werden.

Eine weitere prophylaktische Applikation von S. cerevisiae besteht in der Anwendung gegen Candida albicans Mykosen. Durch orale Aufnahme von S. cerevisiae kann die intestinale Candida-Zellzahl reduziert werden.

Der vorliegenden Erfindung lag das technische Problem zugrunde, einen neuen Hefestamm anzugeben, der zum Verzehr durch Mensch bzw. Tier geeignet ist, wobei es zu einer möglichst geringen Beeinträchtigung des Geschmacks des hefehaltigen Mittels kommen soll. Ein weiteres technisches Problem bestand darin, ein Verfahren anzugeben, mit dem beliebige Hefestämme eindeutig voneinander unterscheidbar sind.

Das erste Problem wird erfindungsgemäß gelöst durch einen Hefestamm, der bei der molekulargenetischen Charaktisierung mittels PCR mit dem Primerpaar 3, umfassend SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6, mit dem Primerpaar 4 umfassend SEQ ID Nr. 7 und SEQ ID Nr. 8, mit dem Primerpaar 7, umfassend SEQ ID Nr. 13 und SEQ ID Nr. 14 und mit dem Primerpaar 9 umfassend SEQ ID Nr. 17 und SEQ ID Nr. 18, das in Fig. 1 gezeigte Bandenmuster liefert.

Das zweite Problem wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum Identifizieren und Charakterisieren von Hefen umfassend den Schritt: Durchführen einer PCR-Analyse des genetischen Materials der Hefe mit mindestens einem der Primerpaare 1 bis 13, vorzugsweise mit mindestens 4 verschiedenen Primerpaaren, ganz besonders bevorzugt mit sämtlichen Primerpaaren 1-13.

Der erfindungsgemäße Hefestamm läßt sich am besten charakterisieren und identifizieren anhand seines genetischen Fingerabdrucks, der mittels PCR und erfindungsgemäßer Primerkombinationen leicht erstellt werden kann. Zum Herstellen des genetischen Fingerabdrucks sind die Primerkombinationen 1 bis 13 in beliebigen Kombinationen miteinander verwendbar. Die detaillierteste Aussage wird natürlich erhalten, wenn sämtliche 13 Primerpaare zur Analyse des Hefegenoms eingesetzt werden. Ein besonders charakteristisches Muster liefert jedoch bereits die Kombination der Primerpaare 3, 4, 7 und 9. Das mit den verschiedenen Primerpaaren und Kombinationen an Primerpaaren erzeugte Muster stellt einen eindeutigen genetischen Fingerabdruck des jeweiligen Hefestamms dar und erlaubt selbst die Unterscheidung genetisch sehr eng verwandter Hefestämme. Ein besonders bevorzugter Stamm (Saccharomyces BCD Nr. 14143) wurde hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH unter der Hinterlegungsnummer DSM 13850. Hiervon abgeleitete Derivate sind ebenfalls besonders bevorzugt. Unter einem "Derivat" versteht man dabei einen Hefestamm, der sich von dem hinterlegten Stamm durch einen oder mehrere Nukleotidaustausche unterscheidet, wobei die wesentlichen Charakteristika beibehalten werden, insbesondere der genetische Fingerprint, wie er mit einer Kombination von Primerpaaren, z. B. der Primerpaare 3, 4, 7 und 9, besonders bevorzugt mit sämtlichen Primerpaaren 1-13, erhalten wird.

Als erfindungsgemäße Primer werden Primer mit einer der SEQ ID Nrn. 1-26, hiermit hybridisierende Sequenzen sowie zu diesen Sequenzen zu mindestens 80% Identität aufweisende Sequenzen angesehen. Dabei bedeutet "Hybridisieren", dass die hybridisierende Sequenz einen Grad an Identität zu der fraglichen Primersequenz aufweist, die es erlaubt, das auch in Anwesenheit weiterer Sequenzen nur die Primersequenz erkannt wird, wobei es im Bereich des fachmännischen Könnens liegt, die hierfür geeigneten Hybridisierungsbedingungen zu bestimmen. Bevorzugte Hybridisierungsbedingungen entsprechen denen des in den Beispielen angegebenen PCR-Programms bei Verwendung eines üblichen PCR-Puffers. "80% Identität" bedeutet, dass sich in der Referenzsequenz an 8 von 10 korrespondierenden Positionen das gleiche Nukleotid befindet wie in der vorgegebenen Sequenz ausgewählt aus SEQ ID Nrn. 1-26.

Die erfindungsgemäße Hefe ist besonders geeignet zum Herstellen von Mitteln, die für die Aufnahme durch Mensch oder Tier vorgesehen sind. Der Zusatz der erfindungsgemäßen Hefe führt zu praktisch keinerlei geschmacklicher Beeinträchtigung des aufzunehmenden Mittels.

Die erfindungsgemäße Hefe ist insbesondere geeignet als Bestandteil eines Medikamentes, eines Probiotikums, eines Gärgetränks, einer Suspension, eines Extrakts oder eines Gebäcks.

Als Gärgetränk kommen insbesondere in Betracht Bier, alkoholfreies Bier oder fermentierte Fruchtsäfte.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Hefe in lyophilisierter Form in das zu verabreichende Mittel eingebracht.

Das Mittel enthaltend die erfindungsgemäße Hefe wird vorzugsweise eingesetzt zur Behandlung von Diarrhoe, Colitis, Darminfektionen, Candida-Infektionen oder Hauterkrankungen.

Die erfindungsgemäßen Primer erlauben weiterhin ein Verfahren zum Identifizieren und Charakterisieren von Hefen, wobei das Verfahren beliebige Hefen anhand ihres genetischen Fingerabdrucks identifizieren kann, selbst wenn diese Hefen praktisch durch biochemische Parameter nicht mehr voneinander unterscheidbar sind. Zu dieser Charakterisierung/Identifizierung wird das Genom der fraglichen Hefe einer PCR-Analyse unterzogen, wobei mindestens eines der Primerpaare 1 bis 13 eingesetzt wird. Je mehr Primerpaare in Kombination zur Analyse des fraglichen Genoms eingesetzt werden, umso genauer und detaillierter wird der genetische Fingerabdruck von der fraglichen Hefe erhalten werden. Sind daher zwei vorgegebene Hefen dahingehend zu untersuchen, ob sie identisch oder verschieden voneinander sind, wird deren Genom mittels der erfindungsgemäßen Primerpaare untersucht, wobei so viele Kombinationen an Primerpaaren eingesetzt werden können, bis ein signifikanter Unterschied im Bandenmuster erhalten wird. In der Regel sind bereits vier verschiedene Primerpaare ausreichend, um einen wirklich einzigartigen genetischen Fingerabdruck abzuliefern. Eine besonders bevorzugte Kombination an Primerpaaren in dieser Hinsicht stellen die Primerpaare 3, 4, 7, und 9 dar.

Beim verabreichten Produkt kann die Formulierung lebende oder tote Hefezellen enthalten. Außerdem können die Hefezellen während des Produktionsprozesses abgetrennt werden, so dass lediglich ein Verzehr des vergorenen oder durch Hefeausscheidungen ergänzten Produktes erfolgt.

Ein bevorzugter Saccharomyces-Stamm, BCD genannt, kann einem Saft, Bier oder Weingetränk als probiotische Suspension beigegeben werden. Die Suspension kann auch einige Zeit inkubiert werden, um eine Vergärung herbeizuführen. Außerdem kann einem vergorenen Getränk sekundär der entstandene Alkohol entzogen werden, um z. B. ein alkoholfreies Bier oder einen alkoholfreien Wein zu erzeugen.

In einer Darreichungsform als Medikament für Tiere und Menschen kann Saccharomyces BCD als lyophilisierte Hefe verabreicht werden. In diesem Fall kann sie gegen Indikationen wie Diarrhoe, Colitis, Candida-Infektionen oder allgemeine Magen- und Darmstörungen eingesetzt werden. Des weiteren kann sie zur Verbesserung der Hautqualität verwendet werden.

Eine weitere Verwendung von Saccharomyces BCD besteht in der Beigabe zu Backmischungen für die Herstellung von Broten, Gebäcken, Dampfnudeln oder Ähnlichem.

Extrakte von Saccharomyces BCD können für jede der zuvor beschriebenen Anwendungen verwendet werden. In diesem Fall können einzelne Komponenten der Hefe in angereicherter oder gereinigter Form verabreicht werden.

Die folgenden Beispiele und die Figur erläutern die Erfindung.

Figurenbeschreibung

Die Charakterisierung vom Saccharomyces BCD mit Hilfe der PCR ist in Fig. 1 dargestellt. Es ist jeweils alternierend ein nahe verwandter Vergleichsstamm (links) und Saccharomyces BCD (rechts) aufgetragen. Die Pfeife kennzeichnen Unterschiede zwischen den Stämmen. Verwendet wurden die Primerpaare PP3, PP4, PP9, PP7.

Beispiele Identifizierung des Hefestammes

Bei Saccharomyces BCD handelt es sich um einen Stamm der Gattung Saccharomyces. Dieser ist auf der Grundlage eines molekularbiologischen Nachweisverfahrens eindeutig von anderen Saccharomyces-Stämmen, insbesondere von solchen der Spezies Saccharomyces cerevisiae unterscheidbar.

Die molekularbiologische Charakterisierung dieses Stammes ist nachfolgend beschrieben.

Die Hefe wird 2 Tage bei 30°C in einem Medium mit 2% Glukose gezogen. Aus je 2 ml Übernachtkultur wird die genomische DNA mit einem handelsüblichen Kit isoliert. Anschließend wird eine PCR wie folgt angesetzt:

2 µl genomische DNA

1/10 vol. 10 × konz. PCR-Puffer

2 mM MgCl2

0,2 mM dNTP

0,4 µmol je Primer (ein Primerpaar je Reaktion)

Taq 1,5 U Tabelle 1 verwendete Primerpaare



In dieser Tabelle sind die in den PCR-Reaktionen verwendeten Primerpaare zusammengefasst. Zur besseren Identifizierung kann ein Primer eines jeden Paares mit einem Farbstoff gekoppelt sein. PCR-Programm



6 µl des PCR-Produktes werden mit 3 µl Stoppuffer versetzt und 5 min bei 95°C denaturiert. 1,5 µl dieser Probe werden auf ein auf 50°C vortemperiertes Sequenziergel aufgetragen. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung wird das Bandenmuster analysiert. Die Bandenmuster sind charakteristisch für den Hefestamm. In mehr als 50 Experimenten konnten Unterschiede zwischen Hefestämmen immer problemlos nachgewiesen werden.

Das Bandenmuster ist charakterisiert durch die Zahl der Banden je Primerpaar und durch die Größe der Banden je Primerpaar. Vereinzelt kann auch ein Amplifikationsprodukt völlig fehlen. In Kombination mit verschiedenen Primerpaaren entsteht ein zweidimensionales Bandenmuster, dass einen unmittelbaren Vergleich zwischen verschiedenen Hefestämmen erlaubt. Tabelle 2 Erhaltene Bandenmuster mit verschiedenen Primern bei verschiedenenen Hefen



Gezeigt ist für die Hefen 9, 10. . .39 das Bandenmuster, das jeweils mit den Primerpaaren (PP) 3, 4, 7 und 9 erhalten wird. Keine 2 der getesteten Hefen ergeben das gleiche Bandenmuster für alle 4 Primerpaare. Die Ergebnisse zeigen die Auftrennung der PCR-Fragmente auf einem Sequenziergel, wobei die Trennung unter folgenden Bedingungen durchgeführt wurde: verwendet wurde ein DNA-Sequencer der Firma LI-COR (Lincoln, USA). Die PCR-Proben (markiert mit dem Farbstoff IRD 800) wurden über ein Acrylamidgel, das 0,25 mm dick und 50 cm lang ist über ca. 8 Stunden bei 1500 V gelektrophoretisch aufgetrennt. Dabei wurde einfach konzentrierter TBE- Puffer verwendet (45 mM Trisborat, 1 mM EDTA; Herstellung des 10-fach konzentrierten Puffers: 108 g Tris-Base, 55 g Borsäure und 40 ml 0,5 M EDTA pH8,0 ad 1 l H2O. Tabelle 3 Schematische Darstellung der Differenzierung von Hefen mittels der Primerpaare 1-13 aus obiger Tabelle



Mit A-M werden jeweils identische Bandenmuster bezeichnet; steht also bei zwei verschiedenen Hefen mit PP1 z. B. "E", besitzen die beiden Hefen mit diesem Primerpaar das gleiche Bandenmuster. Die Kombination dieser Muster charakterisiert die jeweiligen Stämme. Bemerkenswert ist, daß sich auch Saccharomyces cerevisiae-Stämme unterscheiden lassen, deren Anwendung als Brauhefe, Weinhefe etc. eigentlich identisch ist.

Die oben beschriebene PCR-Methode wurde verwendet, um Saccharomyces BCD zu charakterisieren und gegen eng verwandte Hefestämme abzugrenzen. Einige exemplarische Ergebnisse sind nachfolgend dargestellt: es ist zu erkennen, daß von den 4 gezeigten Primerpaaren zwei eindeutig unterschiedliche Bandenmuster ergeben (Fig. 1, durch Pfeile dargestellt). In der Fig. 1 ist dies Ergebnis noch einmal schematisch ausgewertet. Tabelle 4 Erhaltene Banden mit Primerpaaren 3, 4, 7, 9 bei BCD und einem Referenzstamm



Der Stamm Saccharomyces BCD (= Saccharomyces BCD Nr. 14143) ist bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig unter der Nummer hinterlegt DSM 13850 hinterlegt worden. In einem Vergleich mit mehr als 30 anderen Stämmen der Gattung Saccharomyces nach der oben dargestellten Methode weist Saccharomyces BCD einzigartige molekularbiologische Eigenschaften auf.

Kultivierung von Saccharomyces BCD

Der Stamm Saccharomyces BCD wurde 2%ig in DS-Medium für die Vorkultur inokuliert und 20 h bei 28°C und 120 Upm inkubiert. Zum Erntezeitpunkt hat die Kultur eine OD600 von ca. 25. DS-Medium Saccharose 50,00 g/l (NH4)2SO4 5,00 g/l Na-Glutamat 10,00 g/l (NH4)H2PO4 3,20 g/l KCl 1,50 g/l MgSO4 0,75 g/l CaCl2 0,10 g/l myo-Inosit 0,10 g/l Hefeextrakt 2,50 g/l

Außerdem wurden dem Medium Vitamine und Spurenelemente hinzugefügt.

Für eine Batch-Fermentation wurden 3 l Batch-Medium bis zu einer Anfangs-OD600 von 0,5 inokuliert, entsprechend 50-60 ml Vorkultur. Die Fermentation erfolgte in einem Gesamtvolumen von 3 l. Die Fermentation wird bei 25°C, pH 5,0, 1 vvm Belüftung und einer Rührerdrehzahl von 500-700 UpM für ca. 30 Stunden durchgeführt. Zu diesem Zeitpunkt liegt ein TS-Gehalt von ca. 16 g/l bzw. eine OD600 von 63 vor. Batch-Medium Saccharose 50,00 g/l (NH4)2SO4 5,28 g/l (NH4)H2PO4 0,70 g/l KCl 0,61 g/l MgSO4 0,32 g/l CaCl2 0,10 g/l myo-Inosit 0,10 g/l Hefeextrakt 2,50 g/l

Herstellung von Gärgtetränken

Die Hefe wurde Kirschsaft zugegeben. Anschließend wurde 2 Tage bei Raumtemperatur inkubiert. Der Geschmack wurde im Vergleich zu anderen Hefen getestet. Das Ergebnis ist in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst.





Fünfteilige Skala: sehr gut, gut, befriedigend, ausreichend, nicht ausreichend

* Als Geschmackskriterium diente das Urteil von 5-10 Probanden. In der Skalierung wurde ein bekömmliches Getränk, entsprechend bei Weingetränken einem Federweißen, mit sehr gut bewertet. Die Note "sehr gut" wurde nur vergeben, wenn die Kirschsaft-Geschmacksvarianten aufwies, die ihn deutlich über den Geschmack anderer Kirschsaftsorten stellten. Eine noch akzeptable Abweichung vom idealen Getränk in der Bekömmlichkeit (zu sauer, zu viel Gas, leichter Beigeschmack nach Kork etc.) wurde mit "gut" eingestuft, eine starke Abweichung (Getränk ist nicht mit Freude zu trinken) mit befriedigend. Ungenießbare Getränke und Übelkeit erregende Getränke hätten die Bewertung ausreichend bzw. nicht ausreichend erhalten.

Saccharomyces BCD wurde auch zur Herstellung von Kefir verwendet. Es stellte sich heraus, dass das Kefir-Produkt dem mit anderen Hefen hergestellten geschmacklich überlegen ist. Die nachfolgende Tabelle fasst die Ergebnisse zusammen:





Geschmacksnotenskala von 1 (sehr gut) bis 5 (nicht ausreichend) (Mittelwert der Beurteilung mehrerer Testpersonen). Als Geschmackskriterium diente das Urteil von 5-10 Probanden. In der Skalierung wurde ein bekömmlicher Kefir, vergleichbar einem frischen Joghurt mit sehr gut bewertet. Die Note 1 (sehr gut) wurde nur vergeben, wenn der Kefir Geschmacksvarianten aufwies, die ihn deutlich über den Geschmack anderer Kefirsorten stellten. Eine noch akzeptable Abweichung vom idealen Getränk in der Bekömmlichkeit (zu sauer, zu viel Gas, leichter bitterer Beigeschmack etc.) wurde mit gut (2) bewertet, eine starke Abweichung (Kefir ist nicht mit Freude zu trinken) mit befriedigend (3). Ungenießbare Getränke und Übelkeit erregende Getränke hätten die Bewertung ausreichend (4) bzw. nicht ausreichend (5) erhalten. Die Stämme A und B stammen aus der Stammsammlung von BioteCon Diagnostics. Sie stehen stellvertretend für viele weitere getestete Hefestämme.

Stabilität des lyophilisierten Saccharomyces BCD

Zur Verabreichung als Medikament kann es notwendig sein, die Hefe Saccharomyces BCD zu lyophilisieren. Nachfolgend wird eine experimentelle Reihe dargestellt, in der gezeigt wird, dass die Hefe in der Lage ist, den Prozess der Lyophilisierung quantitativ zu überleben. Insbesondere ist es möglich, den Stamm ausgehend von Hefemilch zu lyophilisieren.

Die nachfolgenden Fermentationsbedingungen führen zu hohen Lebendkeimzahlen und ermöglichen eine gute Überlebensrate bei der nachfolgenden Aufarbeitung.

Zur Vorkultivierung beträgt die Animpfmenge 2,5%, d. h. für die Kultivierung eines 5 m3-Fermenters ergibt sich folgende Anstell-Stufung: 3 l → 125 l → 5 m3 (Hauptkultur). Die Vorkulturstufen werden jeweils für 20 h bei 30°C als Batchansatz herangezogen.

Für die Hauptkultivierung erfolgt eine Batchfermentation für 25 h bei 30°C. Anschließend an diese Phase erfolgt eine Zufütterung von konzentrierter Saccharoselösung (20-25%ig) in weiteren 4-5 Stunden. Die Gesamtmenge beträgt etwas 10% des Gesamtvolumens der Fermentation.

Nach ca. 30 h Fermentationszeit werden im 5 m3 Fermenter 100 kg Hefe Trockensubstanz produziert. Dies entspricht einer zu lyophilisierenden Suspension mit ca. 20% TS-Gehalt von 500 kg Feuchtprodukt. Anzuchtmedium Saccharose 50,00 g/l MgSO4 × 7 H2O 0,25 g/l (NH4)H2PO4 0,25 g/l MgSO4 × 7 H2O 0,55 g/l NH4Cl 2,8 g/l meso-Inosit 0,08 g/l MgCl2 × 6 H2O 0,25 g/l CaCl2 × 2 H2O 0,10 g/l KH2PO4 2,00 g/l Na-Glutamat 10,00 g/l, Hefeextrakt 2,50 g/l

Zur Abtrennung der Biomasse wird die Kultursuspension (ca. 5 m3) zuerst zentrifugiert und der Kulturüberstand verworfen. Anschließend erfolgt eine Waschung der Biomasse mit Trinkwasser. Dieser Waschschritt wird mit etwa 15% Wasser bezogen auf die verarbeitete Hefesuspension angesetzt.

Zur Gefriertrocknung wird die gewaschene Feuchtbiomasse mit 20% Schutzmedium (bezogen auf die Trockensubstanz) versetzt. Das Schutzmedium wird je nach Feuchtigkeitsgehalt der separierten Hefe in fester Form als Pulver im Falle einer Hefemilch oder als 20%ige wässrige Lösung zur Resuspension einer stichfesten Hefemasse eingesetzt.

Der Einfriervorgang spielt eine entscheidende Rolle für die Vitalität der Hefezeilen. Ein langsames Einfrieren mit einer Temperaturänderung von 1°C/min führt zur optimalen Überlebensrate im Produkt. Es wird bei einer Temperatur zwischen -20 und -30°C lyophilisiert. Nach beendeter Lyophilisierung enthält das Produkt mindestens 2 × 1010 lebensfähige Hefezellen und hat einen Wassergehalt < 5%. Bei einer Suspension von 1,5 g Saccharomyces BCD in 5 ml Wasser wurde der eutektische Punkt mit -18°C bestimmt.

Nachfolgend sind die Überlebensraten des lyophilisierten Hefeproduktes bei Verwendung verschiedener Schutzmedien dargestellt.





Anwendung Gesundheit

Zur Anwendung als Probiotikum kann Saccharomyces BCD als Suspension eingenommen werden. In diesem Fall kann die Hefe in einem Getränk suspendiert werden. Es besteht auch die Möglichkeit das Getränk mit Hilfe der Hefe einige Tage zu fermentieren. Da in diesem Fall Alkohol erzeugt wird, kann auf diese Weise ein probiotisches Bier oder ein probiotischer Wein erzeugt werden. Außerdem kann diesen Alkoholgetränken sekundär der Alkohol entzogen werden, so das probiotische alkoholreduzierte oder alkoholfreie Gärgetränke entstehen.

Zur Verabreichung als Medikament kann Saccharomyces BCD lyophilisiert werden. In diesem Fall ist eine Aufnahme durch Menschen oder Tiere in hoher Zellzahl möglich. So wurde nach der Verabreichung von Saccharomyces BCD eine deutliche Reduktion von Diarrhoe bei Pferden festgestellt.

Weitere Applikationen bestehen in der Verwendung von Saccharomyces BCD als Komponente von gebackenen Lebensmitteln, wie Brot, Kuchen, Gebäck und ähnliches. Auch können Extrakte von dieser Hefe hergestellt werden. In diesem Fall können einzelne Komponenten angereichert oder isoliert werden, die verzehrt werden. SEQUENZPROTOKOLL




























Anspruch[de]
  1. 1. Hefestamm, der bei der molekulargenetischen Charakterisierung mittels PCR

    mit dem Primerpaar 3 umfassend SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6;

    mit dem Primerpaar 4 umfassend SEQ ID Nr. 7 und SEQ ID Nr. 8;

    mit dem Primerpaar 7 umfassend SEQ ID Nr. 13 und SEQ ID Nr. 14

    mit dem Primerpaar 9 umfassend SEQ ID Nr. 17 und SEQ ID Nr. 18,

    das in Fig. 1 gezeigte Bandenmuster liefert.
  2. 2. Hefestamm nach Anspruch 1, der das Bandenmuster nach PCR liefert, wie erhalten mit den Primerpaaren 1-13.
  3. 3. Hefestamm nach Anspruch 1 oder 2, mit der Hinterlegungsnummer DSM 13850 und hiervon abgeleitete Derivate.
  4. 4. Primer zur molekulargenetischen Charakterisierung von Hefen ausgewählt aus:

    einem der Primer mit einer der Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 1 bis 26,

    Sequenzen, die mit den genannten Primersequenzen hybridisieren, und

    Sequenzen, die zu mindestens 80% Identität zu einer der Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 1 bis 26 aufweisen.
  5. 5. Verwendung einer Hefe nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in Mitteln für die Aufnahme durch Tier- und/oder Mensch.
  6. 6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel ein Medikament, ein Probiotikum, ein Gärgetränk, eine Suspension, einen Extrakt oder Gebäck darstellt.
  7. 7. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Hefe in lyophylisierter Form einem Extrakt davon oder deren Kulturüberstand verabreicht wird.
  8. 8. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Behandlung von Diarrhoe, Colitis, Darminfektionen, Candida-Infektionen oder Hauterkrankungen eingesetzt wird.
  9. 9. Mittel enthaltend einen Hefestamm nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eine lyophilisierte Form davon oder Kulturüberstände oder einem Extrakt davon zur Verabreichung an Mensch und/oder Tier.
  10. 10. Verfahren zum Identifizieren und Charakterisieren von Hefe umfassend den Schritt:

    Durchführen einer PCR-Analyse des genetischen Materials der Hefe mit mindestens einem der Primerpaare 1-13, vorzugsweise mit mindestens 4 verschiedenen Primerpaaren, ganz besonders bevorzugt mit sämtlichen Primerpaaren 1-13.






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