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Dokumentenidentifikation DE69232001T2 06.06.2002
EP-Veröffentlichungsnummer 0517326
Titel Markierte Hapten-Analoge zur Verwendung in Immunoassays
Anmelder Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc., Rochester, N.Y., US
Erfinder Danielson, Susan Jean, Rochester, New York 14650-2201, US;
Brummond, Barbara A., Rochester, New York 14650-2201, US;
Oenick, Marsha D., Rochester, New York 14650-2201, US;
Ponticello, Ignazio S., Rochester, New York 14650-2201, US;
Hilborn, David Alan, Rochester, New York 14650-2201, US
Vertreter BOEHMERT & BOEHMERT, 80336 München
DE-Aktenzeichen 69232001
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, ES, FR, GB, GR, IT, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 02.06.1992
EP-Aktenzeichen 922015813
EP-Offenlegungsdatum 09.12.1992
EP date of grant 16.08.2001
Veröffentlichungstag im Patentblatt 06.06.2002
IPC-Hauptklasse G01N 33/94
IPC-Nebenklasse G01N 33/532   

Beschreibung[de]

Diese Erfindung betrifft die klinische Chemie, insbesondere Immuntests.

Immuntests, welche sich natürliche immunologische Reaktionen zunutze machen, haben weit verbreitete Anwendung als analytische Techniken in der klinischen Chemie gefunden. Aufgrund der Spezifität der Reaktionen sind sie besonders vorteilhaft zum Quantifizieren biologischer Analyte, die in sehr niedriger Konzentration in biologischen Flüssigkeiten vorhanden sind. Derartige Analyte schließen beispielsweise Antikörper, therapeutische Wirkstoffe, Narkotika, Enzyme, Hormone, Proteine usw. ein.

Bei kompetitiven Immun-Bindungstests wird ein markierter Ligand, einschließlich immunkompetenter Derivate und Analoga des Liganden, in Kompetition mit unmarkiertem Ligand bei der Reaktion mit einer festgesetzten Menge an dem entsprechenden bindenden Material (hier als ein Rezeptor bezeichnet) gebracht. Unbekannte Konzentrationen des Liganden können anhand des gemessenen Signals von entweder dem gebundenen oder ungebundenen (d. h. freien) markierten Liganden abgeleitet werden. Die Reaktion verläuft wie folgt:

Ligand + markierter Ligand + Rezeptor ?

Ligand-Rezeptor + markierter Ligand-Rezeptor.

Herkömmliche Markierungen schließen radioaktive Anhänge, Enzyme, Chromophore, Fluorophore, stabile freie Radikale und Enzym-Cofaktoren, Inhibitoren und allosterische Effektoren ein.

In Übereinstimmung mit dem vorangehend Ausgeführten kann ein Immuntest auf Arzneistoff-Derivate, wie etwa Phenobarbital und Phenytoin, im Serum auf der Kompetition eines Enzym-markierten Analogons eines solchen Arzneistoffs mit dem Arzneistoff im Patientenserum um die Bindungsstellen eines immobilisierten Antikörpers beruhen.

Spezifische Anforderungen an das markierte Arzneistoff-Hapten-Analogon (nachfolgend gelegentlich als LDH bezeichnet) beinhalten: 1) mindestens 65% des LDH können durch Überschuß an immobilisiertem Antikörper gebunden werden; 2) die Affinität von LDH zu dem immobilisierten Antikörper ist derart, daß Kompetition einer festgelegten Menge an LDH mit dem Arzneistoff in einem therapeutisch relevanten Konzentrationsbereich des Arzneistoffs auftritt; und 3) die Stabilität des LDH gegenüber einer Hydrolyse seiner Enzymmarkierung unter Lagerungsbedingungen.

Anforderungen, die an das Arzneistoff-Hapten-Analogon gestellt werden, beinhalten: 1) Zugänglichkeit des Analogons zu dem immobilisierten Antikörper nach Konjugation mit der Enzymmarkierung; 2) spezifische Erkennung des markierten Analogons durch den, gegen den Arzneistoff gerichteten Antikörper; und 3) ausreichende Reaktivität des Analogons mit der Enzymmarkierung, entweder direkt oder nach Aktivierung des Enzyms oder des Analogons unter Bedingungen, welche die Enzymaktivität nicht nachteilig beeinflussen.

Enzymmarkierungen, bei denen Glucoseoxidase (GOD) und alkalische Phosphatase (ALP) an Phenobarbital- und Phenytoin-Hapten-Analoga gekoppelt sind, wie in dem U.S.-Patent 4,752,568 offengelegt, liefern adäquate Enzym-markierte Analoga, um wirksame, kompetitive Immuntests in dem gewünschten Format durchzuführen.

Das Problem besteht darin, daß die markierten Phenobarbital- und Phenytoin-Analoga, die in dem oben genannten Patent offengelegt werden, zum Durchführen kompetitiver Immuntests unbefriedigend waren, wenn das Enzym Meerrettich-Peroxidase (horseradish peroxidase, HRP) als Markierung verwendet wurde. Die Kupplungsreaktionen zwischen derartigen Analoga und HRP verliefen sowohl langsam als auch unvollständig. Darüberhinaus wurden Phenobarbital- und Phenytoin-HRP-Markierungen sehr schwach gebunden, so daß sehr viel höhere Konzentrationen an Markierung oder Antikörper-Bindungsstellen benötigt würden, um ein lesbares Signal zu ergeben.

Das U.S.-Patent 4,244,939 legt Verbindungen offen, die als Tracer bei Radioimmuntests auf Barbiturate, bei denen eine Radiojod-markierte Gruppe an ein Pyrimidinring-Stickstoffatom des Barbiturats geknüpft ist, nützlich sind.

Die Beschreibung des Patents EP 0233690 beschreibt ein markiertes Hydantoin-Konjugat und seine Verwendung in analytischen Elementen und Immuntests. Die Markierung ist an die 3- Stickstoff-Position des Hydantoinrings über eine Verknüpfung, die sich von einer aliphatischen Monocarbonsäure mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen ableitet, gebunden.

Die Beschreibung des Patents DE 3205506 beschreibt eine Fluoreszenzmarkierung, die kovalent an Haptene gebunden ist.

Die vorliegende Erfindung stellt ein markiertes Arzneistoff-Analogon zur Verfügung, das folgendes aufweist:

(A) eine Enzymmarkierung;

(B) einen Arzneistoff-Kern, der aus einem Hydantoin-Kern oder einem Barbiturat-Kern ausgewählt ist; und

(C) eine verbindende Kette, welche die 3-Position des Arzneistoff-Hapten-Kerns mit der Markierung über eine Carbonylbrücke verbindet, wobei die verbindende Kette, ausgenommen die genannte Carbonylbrücke, 12 bis 40 Atome aufweist, bestehend aus:

(I) zwei oder mehr C-&sub1; bis C&sub1;&sub0;-Alkylengruppen;

wahlweise in Kombination mit

einer oder mehr Phenylengruppen, und/oder

ein oder mehr 5 bis 7-gliedrige heterozyklische Ringe, die in die verbindende Gruppe über Ring-Stickstoffatome eingebunden sind; oder

(II) eine C-&sub1; bis C&sub1;&sub0;-Alkylengruppe in Verbindung mit einer oder mehr Phenylengruppen und einem oder mehr 5 bis 7-gliedrigen heterozyklischen Ringen, die in die verbindende Gruppe über Ring-Stickstoffatome eingebunden sind;

wobei die genannten Gruppen und Ringe über chemische Gruppen aneinander gebunden sind, die ausgewählt sind aus:

(a) Estern, einschließlich Thioestern, -COZ-, wobei Z O oder S ist;

(b) Amiden, -CONH-;

(c) Heteroatomen, ausgewählt aus -O-, -S- und NR-; wobei R C&sub1;- bis C&sub6;-Alkyl (z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, usw.) repräsentiert; und

(d) Carbonyl.

Der heterozyklische Ring ist bevorzugterweise ausgewählt aus einem 1,4-Piperazinylen, 2,5- Dimethyl-1,4-piperazinylen; 1,3-Imidazolidinylen- und 1,3-Hexahydrodiazepinylen- Gruppen.

Die neuen Arzneistoff-Analoga (a) reagieren schneller und vollständiger mit HRP und anderen Ezymen, wie etwa GOD und ALP, als die oben erwähnten Analoga nach dem Stand der Technik, (b) bilden kovalente Bindungen mit solchen Enzymen ohne nachteiligen Effekt auf die Enzymaktivität, und (c) die resultierenden markierten Arzneistoff-Analoga werden leichter durch Antikörper gegen Hydantoine und Barbiturate erkannt und fester gebunden.

Die oben genannten, markierten Hydantoin- und Barbiturat-Derivate schließen solche ein, die der folgenden Struktur entsprechen:

(I)

wobei

A einen Hydantoin-Kern der folgenden Struktur

oder einen Barbiturat-Kern der folgenden Struktur

repräsentiert;

R¹ jeweils unabhängig Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, nicht- substituiertes oder substituiertes Phenyl repräsentiert;

R², R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; jeweils unabhängig C&sub1;-bis C&sub1;&sub0;-Alkylen oder solche Alkylen-Gruppen, die mit mindestens einer oder mehr Estergruppen unterbrochen sind, Amidgruppen, -O-, -S- oder -NR- repräsentiert;

R³ C&sub1;- bis C&sub3;-Alkylen repräsentiert;

Z -O-, -S- und -NR- repräsentiert, wobei R Wasserstoff oder C&sub1;- bis C&sub6;-Alkyl, z. B. Methyl, Propyl und Hexyl repräsentiert;

m 0, 1 oder 2 ist;

n 0, 1 oder 2 ist;

m + n > 0; und

die Gesamtzahl von Atomen, die von m, n und R² umfaßt sind, 12 bis 40 ist;

die Markierung LABEL ein Enzym ist;

und weiter vorausgesetzt, daß (i) mindestens eine der R¹-Gruppen substituiertes oder nicht- substituiertes Phenyl ist; (ii) einer von R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; Phenylen sein kann; und (iii) die Bestandteile von Struktur I, die in Klammern gesetzt sind, darin in jeder Reihenfolge auftreten können.

In Übereinstimmung mit den oben angegebenen Definitionen kann R¹ Wasserstoff, Methyl, Propyl, Hexyl, Decyl, nicht-substituiertes Phenyl oder Phenyl, das mit Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen substituiert ist, Nitro, Halogen, Cyano und Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, repräsentieren;

R², R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; können unabhängig voneinander Alkylen, ausgewählt aus Ethylen, Butylen, Pentylen, Octylen oder solch einem Alkylen, das mit mindestens einer oder mehr Estergruppen, Amidgruppen, -O-, -S- und -NR- unterbrochen ist, repräsentieren;

R³ repräsentiert Methylen, Ethylen oder Trimethylen;

Z repräsentiert jeweils unabhängig -O-, -S- oder -NR-, wobei R mindestens einen [Rest] aus Wasserstoff, Methyl, Propyl oder Hexyl repräsentiert; und

die Markierung LABEL repräsentiert ein Enzym.

Mindestens 65% der markierten Arzneistoff-Hapten-Analoga können durch einen Überschuß an immobilisierten Barbiturat- oder Hydantoin-Antikörpern gebunden werden. Die markierten Analoga mit erweiterten Linkern, insbesondere solchen, die Amidbindungen in der verbindenden Kette aufweisen, werden in ähnlicher Weise durch alle Typen von immobilisierten Antikörpern, die beim Umsetzen dieser Erfindung in die Praxis verwendet werden, gebunden. Auch sind die Derivate, die das Amid in dem erweiterten Linker haben, sehr stabil gegenüber Hydrolyse.

Die markierten Arzneistoff-Analoga werden aus neuen Arzneistoff-Hapten-Analoga, wie unten beschrieben, präpariert. Sie umfassen gewöhnlich:

(a) eine aktive Estergruppe, wie etwa ein Succinimidoxycarbonyl;

(b) einen Hydantoin- oder Barbiturat-Kern, und

(c) eine verbindende Kette, welche die aktive Estergruppe mit dem Hydantoin- oder Barbiturat-Kern verknüpft;

wobei die verbindende Kette der vorherigen Definition entspricht.

Genauer sind die bevorzugten neuen, aktiven Hydantoin-Ester solche, die mit der folgenden Struktur übereinstimmen:

wobei

A, R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6;, Z, m und n und die daran geknüpften Bedingungen der vorherigen Definition entsprechen, und

R&sup7; eine Ethylen- oder o-Phenylengruppe ist.

Hydantoin-Arzneistoff-Hapten-Analoga

Die neuen Hydantoin-Arzneistoff-Hapten-Analoga werden in der ebenfalls anhängigen Anmeldung EP-A-517 325 offenbart.

Mehrere Vorteile werden durch Verwendung der oben beschriebenen Hydantoin-Derivate verwirklicht. Erstens wurde gefunden, daß die aktiven Ester dieser Hydantoin-Derivate, die kurze verbindende Ketten zwischen dem Hydantoin-Kern und der aktiven Estergruppe aufweisen, mit HRP ausreichend reaktiv waren, um eine annehmbare Enzymmarkierung zur Verwendung mit einigen immobilisierten Antikörpern herzustellen. Derivate mit längeren Linker-Gruppen (R² plus die in Kammern gesetzten Gruppen) mit 8 bis 20 Atomen zwischen der aktiven Estergruppe und dem Hydantoin-Kern liefern Markierungen, die durch alle immobilisierten Antikörper, die getestet wurden, gebunden werden konnten. Verbindende Ketten, in denen Z jeweils -NR- ist, welches mit dem benachbarten Carbonyl eine Amidgruppe bildet, sind insofern besonders nützlich, als Hydantoin-Derivate, die solche Ketten enthalten, gegenüber einer Hydrolyse stärker resistent sind als Ketten, bei denen Z -O- oder -S- ist, so daß sich mit dem benachbarten Carbonyl eine Estergruppe bildet.

Vorbereitende Beispiele

Die Hydantoin-Analoga können gemäß den folgenden Präparationen hergestellt werden, bei denen Phenytoin-Analoga, eine Unterklasse von Hydantoin-Verbindungen, hergestellt werden.

1. Präparation von HD 1, 5,5-Diphenyl-3-{4-[2-(3- succinimidoxycarbonylpropionyloxy)ethylaminocarbonyl]butyl}hydantoin.

Schritt 1: Präparation von 5,5-Diphenyl-3-[4-(2-hydroxyethylaminocarbonyl)butyl]- hydantoin.

Teil A: Zunächst wird das Säurechlorid hergestellt.

Eine Mischung aus 3-(4-carboxybutyl)-5,5-diphenyl-2,4-imidazolidindion (3,52 g, 0,01 Mol), Thionylchlorid (20 ml), N,N-Dimethylformamid (2 Tropfen) und Chloroform (50 ml) wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde in einem Rotationsevaporator unter Vakuum entfernt, und dieses Produkt wurde direkt im nächsten Teil B eingesetzt.

Teil B: Das Säurechlorid wird mit Ethanolamin zur Reaktion gebracht.

Das Säurechlorid in Chloroform (50 ml) wurde tropfenweise im Verlauf von 15 Minuten zu einer Mischung aus Ethanolamin (1,2 g, 0,02 Mol) und Triethylamin (2,4 g, 0,024 Mol) in Chloroform (100 ml) gegeben. Die Mischung wurde dann 2 Stunden auf 60ºC erhitzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung würde dann mit 5% Salzsäure (2 · 100 ml) gewaschen, mit gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung (100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert, und das Lösungsmittel wurde in einem Rotationsevaporator entfernt. Das Filtrat wurde dann unter Verwendung einer Aluminiumoxid-Säule chromatographiert, um Material (3,0 g) zu liefern, das nach TLC einen Fleck zeigte. Dieses Material wurde dann direkt in die nächste Präparation eingesetzt.

Schritt 2: Präparation von 3-{4-[2-(3-Carboxypropionyloxy)ethylaminocarbonyl]-butyl}-5,5- diphenylhydantoin.

Die Hydroxy-Verbindung aus Schritt 1 (3,0 g, 0,0075 Mol), Bernsteinsäureanhydrid (1,0 g, 0,01 Mol) und Dimethylaminopyridin (0,9 g, 0,0075 Mol) in Chloroform (100 ml) wurden 4 Stunden bei 50-60ºC erhitzt und über das Wochenende auf Raumtemperatur abkühlengelassen.

Dichlormethan (300 ml) wurde zugesetzt, und die Mischung wurde mit 5% Salzsäure-Lösung (3 · 100 ml) gewaschen, mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung (100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel entfernt, um ein Material zu liefern, das nach TLC einen Fleck erbrachte.

Schritt 3: Präparation von HD 1: 5,5-Diphenyl-3-{4-[2-(3-succinimidoxycarbonylpropionyloxy)ethylaminocarbonyl]butyl}hydantoin.

Eine Mischung aus der Säure aus Schritt 2 (3,0 g, 0,006 Mol), N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (1,5 g, 0,007 Mol) und N-Hydroxysuccinimid (0,7 g, 0,006 Mol) in Chloroform (80 ml) wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde filtriert und das Filtrat wurde in einem Rotationsevaporator unter Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde dann unter Verwendung von Silika chromtographiert, um 1,3 g (40% Ausbeute) zu ergeben. Anal.kalk. für C&sub3;&sub0;H&sub3;&sub2;N&sub4;O&sub9;: C, 60,8; H, 5,44; N, 9,45. Gefunden: C, 59,6; H, 5,51; N, 8,91.

2. Präparation von HD 2: 5,5-Diphenyl-3-{4-[4-(3-succinimidoxycarbonylpropionyl)-1- piperazinylcarbonyl]butyl}-2,4-imidazolidindion.

Schritt 1: Präparation von 5,5-Diphenyl-3-(1-piperazinylcarbonylbutyl)hydantoin.

Teil A: Zunächst wurde 3-[4-(4-Benzyloxycarbonylpiperazinylcarbonyl)butyl]-5,5-diphenyl- 2,4-imidazolidindion präpariert.

Das Säurechlorid (0,01 Mol), hergestellt wie für die Präparation von HD 1 oben, Teil A, beschrieben, wurde tropfenweise im Verlauf von 15 Minuten zu einer Mischung aus Benzyl-1- piperazincarboxylat (2,4 g, 0,011 Mol) und Triethylamin (2,0 g, 0,02 Mol) in Chloroform (50 ml) gegeben. Diese Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, und Dichlormethan (300 ml) wurde zugesetzt. Die Mischung wurde mit 5% Salzsäure (2 · 100 ml) gewaschen, mit verdünnter Natriumcarbonat-Lösung (100 ml) gewaschen, mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung (100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat [Lösung] getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel in einem Rotationsevaporator unter Vakuum entfernt. Das Filtrat wurde dann chromatographiert, um ein Öl, 4,3 g (78% Ausbeute) zu ergeben, das direkt im nächsten Schritt eingesetzt wurde.

Teil B: das geschützte Amin aus Teil A (4,8 g, 0,008 Mol) und 30-35% Bromwasserstoff- Essigsäure-Lösung (25 ml) wurden 1,5 Stunden bei Raumtemperatur rührengelassen. Diese Mischung wurde dann in Diethylether (1 l) gegossen und das Öl, das sich abtrennte, wurde mit frischen Portionen von Ether (3 · 1 l) trituriert. Das Öl wurde in 10% wäßriger Natriumhydroxid-Lösung (pH = 14) gelöst, und die wäßrige Lösung wurde mit Dichlormethan (4 · 100 ml) extrahiert. Die vereinigte organische Lösung wurde mit gesättigter Natriumchlorid- Lösung (150 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel in einem Rotationsevaporator unter Vakuum entfernt. Das Filtrat verfestigte sich, um einen weißen Feststoff (2,6 g, 77% Ausbeute) zu ergeben. Dieses Material wurde direkt im nächsten Schritt eingesetzt.

Schritt 2: Präparation von 3-{4-[4-(3-Carboxypropionyl)-1-piperazinylcarbonyl]butyl}-5,5- diphenyl-2,4-imidazolidindion.

Eine Mischung des Amins aus Schritt 1 oben (2,1 g, 0,005 Mol) und Bernsteinsäureanhydrid (0,54 g, 0,0054 Mol) in Chloroform (15 ml) wurde 30 Minuten bei 50-60ºC erhitzt und 20 Stunden bei Umgebungstemperatur stehengelassen. Dichlormethan (150 ml) wurde zugesetzt, und die Mischung wurde mit 5% Salzsäure (2 · 10 ml), gesättigter Natriumchlorid-Lösung (100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel in einem Rotationsevaporator unter Vakuum entfernt, um einen weißen Feststoff, 2,5 g (95%) zu ergeben, welcher direkt im nächsten Schritt eingesetzt wurde.

Schritt 3: Präparation von HD 2: 5,5-Diphenyl-3-{4-[4-(3-sucinimidoxycarbonylpropionyl)- 1-piperazinylcarbonyl]butyl}-2,4-imidazolidindion.

Eine Mischung aus der Säure aus Schritt 2 (1,56 g, 0,003 Mol), N,N'- Dicyclohexylcarbodiimid (0,64 g, 0,003 Mol) und N-Hydroxysuccinimid (0,36 g, 0,003 Mol) in Chloroform (40 ml) wurde über das Wochenende bei Raumtemperatur gerührt. Die. Mischung wurde filtriert und das Lösungsmittel in einem Rotationsevaporator unter Vakuum aus dem Filtrat entfernt, um 1,9 g (100% Ausbeute) zu ergeben. Der Feststoff wurde chromatographiert, und die Produkt-Fraktion wurde in Dichlormethan (200 ml) gelöst, mit verdünnter Natriumcarbonat-Lösung (2 · 100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel in einem Rotationsevaporator entfernt, um einen weißen Feststoff zu ergeben, der nach TLC einen Fleck lieferte. Anal.kalk. für C&sub3;&sub2;H&sub3;&sub5;N&sub5;O&sub8;: C, 62,23; H, 5,71; N, 11,34. Gefunden: C, 59,07; H, 5,40; N, 10,45.

3. Präparation von HD 3, 5,5-Diphenyl-3-{4-[6-(3-succinimidoxycarbonylpropionamido)hexylaminocarbonyl]butyl}-2,4-imidazolidindion.

Schritt 1: Präparation von 3-[4-(6-Aminohexylaminocarbonyl)butyl}-5,5-diphenyl-2,4- imidazolidindion.

Teil A: Präparation von 3-[4-(6-Benzyloxycarbonylaminohexylaminocarbonyl)butyl]-5,5- diphenyl-2,4-imidazolidindion.

Das Säurechlorid, hergestellt als ein Intermediat bei der Präparation von HD 1, wurde mit N- Benzyloxycarbonyl-1,6-hexandiamin durch die in Schritt 1 der Präparation von HD 2 beschriebenen Verfahren behandelt, um 7,5 g, 85% Ausbeute, des geschützten Amins zu ergeben.

Teil B: Das geschützte Amin aus Teil A wurde mit Bromwasserstoffsäure-Essigsäure durch die Verfahren von Schritt 1, Teil B, der Präparation von HD 2 behandelt, um das freie Amin zu ergeben, das ohne Reinigung im Schritt 3 eingesetzt wurde.

Schritt 3: Präparation von 3-{4-[6-(3-Carboxypropionamido)hexylaminocarbonyl ]butyl)-5,5- diphenyl-2,4-imidazolidindion.

Diese Verbindung wurde unter Verwendung derselben Verfahren wie in Schritt 2 der Präparation von HD 2 hergestellt. Anal.kalk. für C&sub3;&sub0;H&sub3;&sub8;N&sub4;O&sub6;: C, 65,44; H, 6,96; N, 10,17. Gefunden: C, 63,26; H, 7,01; N, 9,39.

Schritt 4: Präparation von HD 3: 5,5-Diphenyl-3-{4-[6-(3- succinimidoxycarbonylpropionamido)hexylaminocarbonyl]butyl}-2,4-imidazolidindion.

Dieses Material wurde unter Verwendung der Verfahren von Schritt 3 bei der Präparation von HD 2 hergestellt, um 2,6 g (80% Ausbeute), Schmelzpunkt 133-134ºC, zu ergeben. Anal.kalk. für C&sub3;&sub4;H&sub4;&sub1;N&sub5;O&sub8;: C, 63,05; H, 6,38; N, 10.81. Gefunden: C, 62,91; H; 6,41; N, 10,69.

Barbiturat-Arzneistoff-Analoga

Die folgenden vorbereitenden Beispiele 4 bis 8 veranschaulichen die Präparation der Barbiturat-Arzneistoff-Hapten-Analoga für Phenobarbital. Die Analoga werden allgemein hergestellt durch (1) Kondensieren eines Barbiturat-Derivats, wie etwa Phenobarbital, mit einem omega- Haloalkancarbonsäureester, (2) Verseifen des Esters zu der korrespondierenden Säure, (3) Umsetzung der Säure zu dem korrespondierenden Säurechlorid und (4) Kondensation des Säurechlorids mit N-Hydroxysuccinimid oder, um die verbindende Kette weiter zu verlängern, mit einem Diamin, Diol oder Aminoalkohol, bei denen eine der Amino- oder Hydroxygruppen blockiert ist, (5) Entfernen der Blockierung, Kondensation mit einer Dicarbonsäure, wie etwa Bernsteinsäure, und dann Kondensation mit dem N-Hydroxysuccinimid, um das Analogon herzustellen.

Falls gewünscht, kann die Kondensation mit einem halb-blockierten Diamin, Diol oder Aminoalkohol und dann einer weiteren zweiwertigen. Säure ein oder zweimal mehr wiederholt werden, um die verbindende Kette weiter zu verlängern. Allerdings kann dasselbe durch weniger Schritte erreicht werden, indem längerkettige, zweiwertige Säuren, Diole, Diamine, Aminoalkohole oder Haloalkancarbonsäureester verwendet werden.

4. Präparation von PB 1: 5-Ethyl-5-phenyl-1-{4-[4-(3-Succinimidoxycarbonylpropionyl)-1- piperazinylcarbonyl]butyl}-2,4,6(1H,3H,5H)pyrimidintrion.

Schritt 1: Präparation von 5-Ethyl-6-hydroxy-3-(4-methoxycarbonylbutyl)-5-phenyl-2,4(3H, 5H)-pyrimidinedion.

Eine Mischung aus Phenobarbital (46,5 g, 0,2 Mol) und Tetrabutylammoniumhydroxid (500 ml, 0,2 Mol von 0,4 M in Wasser), in Dichlormethan (500 ml) wurde hergestellt, und Methyl- 5-bromvalerat (39,0 g, 0,2 Mol) wurde dazugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht (20 h) kräftig gerührt. Zu dieser Mischung wurde gesättigte Natriumchlorid-Lösung (100 ml) gegeben, die organische Phase wurde abgetrennt, und die wäßrige Lösung wurde mit Dichlormethan (2 · 10 ml) gewaschen. Die vereinigte organische Lösung wurde mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung (100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel entfernt.

Schritt 2: Präparation von 3-(4-Carboxybutyl)-5-ethyl-6-hydroxy-5-phenyl-2,4(3H,5H)- pyrimidindion.

Der 5-Ethyl-6-hydroxy-3-(4-methoxycarbonylbutyl)-5-phenyl-2,4(3H,5H)-pyrimidindionester (54,0 g, 0,1% Mol) aus Schritt 1 in Dioxan (500 ml), konzentrierte Salzsäure (55 ml) und Wasser (55 ml) wurden unter Rückflußbedingungen 4 Stunden und bei Raumtemperatur über Nacht erhitzt. Das Dioxan wurde unter reduziertem Druck entfernt, und gesättigte Natriumchlorid-Lösung (250 ml) und Dichlormethan (400 ml) würden zu dem Rückstand gegeben. Die organische Schicht wurde abgetrennt, und die wäßrige Lösung wurde mit Dichlormethan (3 · 150 ml) extrahiert. Die vereinigten organische Lösungen wurden mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung (200 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel entfernt. Zu dem Rückstand wurde Diethylether gegeben, und die Mischung wurde über das Wochenende in einen Gefrierschrank bei -16ºC gestellt und dann filtriert.

Schritt 3: Präparation von 1-(4-Chlorcarbonylbutyl)-5-ethyl-5-phenyl-2,4,6(1H,3H,5H)- pyrimidintrion.

Eine Mischung aus der Säure (6,6 g, 0,2 Mol) aus Präparation 2, Thionylchlorid (50 ml), N, N-Dimethylformamid (2 Tropfen) und Chloroform (80 ml) würde 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde in einem Rotationsevaporator unter Vakuum entfernt, und dieses Produkt wurde direkt im nächsten Schritt 4 eingesetzt.

Schritt 4: Präparation von 1-[4-(4-Benzyloxycarbonyl-1-piperazinylcarbonyl)butyl]-5-ethyl-5- phenyl-2,4,6(1H,3H,5H)-pyrimidintrion.

Das Säurechlorid aus Schritt 3 (0,2 Mol) in Chloroform (75 ml) wurde tropfenweise im Verlauf von 15 Minuten zu einer Mischung aus Benzyl-1-piperazincarboxylsäure (6,0 g, 0,030 Mol) und Triethylamin (4,0 g, 0,04 Mol) in Chloroform (100 ml) gegeben. Diese Mischung wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und Dichlormethan (300 ml) wurde dann zugesetzt. Die Mischung wurde mit 10% Salzsäure-Lösung (3 · 100 ml) gewaschen, mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung (100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel entfernt. Der Rückstand wurde dann an Siliciumdioxid chromatographiert, um einen Feststoff zu ergeben.

Schritt 5: Präparation von 5-Ethyl-5-phenyl-1-[4-(1-piperazinylcarbonyl)butyl]-2,4,6(1H,3H, 5H)-pyrimidintrion-Bromwasserstoff.

Das geschützte Amin aus Präparation 4 (6,5 g, 0,012 Mol) und 30-35% Bromwasserstoff- Essigsäure-Lösung (30 ml) wurden 1,5 Stunden bei Raumtemperatur rührengelassen. Die Mischung wurde dann in Ethylacetat (2 L) gegossen, 1 Stunde lang gerührt, filtriert und der Feststoff mit 500 ml Ethylacetat gewaschen.

Schritt 6: Präparation von 1-{4-[4-(3-Carboxypropionyl)-1-piperazinylcarbonyl]butyl}-5- ethyl-5-phenyl-2,4,6(1H,3H,5H)-pyrimidintrion.

Das Amin aus Schritt S (4,8 g, 0,01 Mol), Bernsteinsäureanhydrid (1,2 g, 0,012 Mol) und Triethylamin (2,2 g, 0,02 Mol) in Chloroform (150 ml) wurden 30 Minuten bei 50-60ºC (Heißwasser) erhitzt und 16 Stunden bei Umgebungstemperatur rührengelassen. Dichlormethan (200 ml) wurde zugesetzt, die Mischung wurde mit 10% Salzsäure-Lösung (3 · 100 ml), gesättigter Natriumchlorid-Lösung (100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel in einem Rotationsevaporator unter Vakuum entfernt, um einen weißen Feststoff, 3,3 g (66%) zu ergeben. Dieses Material wurde unter Verwendung einer Siliciumdioxid-Säule chromatographiert, um einen weißen Feststoff zu ergeben.

Schritt 7: Präparation von 5-Ethyl-5-phenyl-1-{4-[4-(3-Succinimidoxycarbonylpropionyl)-1- piperazinylcarbonyl]butyl}-2,4,6(1H,3H,5H)-pyrimidintrion.

Eine Mischung aus der Säure aus Schritt 6 (3,4 g, 0,007 Mol), N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (1,6 g, 0,008 Mol) und N-Hydroxysuccinimid (1,0 g, 0,008 Mol) in Chloroform (75 ml) wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde filtriert, und Ethylacetat (100 ml) wurde zugesetzt. Die organische Lösung wurde mit Wasser (2 · 100 ml), gesättigter Natriumchlorid-Lösung (50 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel in einem Rotationsevaporator unter Vakuum entfernt. Ein Teil des Feststoffs wurde chromatographiert, um einen weißen Feststoff zu ergeben.

5. Präparation von PB 3, 5-Ethyl-5-phenyl-1-{4-[2-(3-succinimidoxycarbonylpropionyloxy)ethylaminocarbonyl]butyl}-2,4,6(1H,3H,5H)-pyrimidintrion.

Schritt 1: Präparation von 5-Ethyl-1-[4-(2-hydroxyethylaminocarbonyl)butyl]-5-phenyl- 2,4,6(1H,3H,5H)pyrimidintrion.

Dieses Material wurde wie in Schritt 4 des vorbereitenden Beispiels 4, dargestellt, präpariert, abgesehen davon, daß 2-Hydroxyethylamin anstelle des Benzyl-1-piperazincarboxylats verwendet wurde.

Schritt 2: Präparation von 1-{4-[2-(3-Carboxypropionyloxy)ethylaminocarbonyl]butyl}-5- ethyl-5-phenyl-2,4,6(1H,3H,5H)-pyrimidintrion.

Eine Mischung aus dem Produkt aus Schritt 1 (2,9 g, 0,007 Mol), Bernsteinsäureanhydrid (0,7 g, 0,007 Mol) und Dimethylaminopyridin (0,9 g, 0,007 Mol) in Chloroform (100 ml) wurde 30 Minuten in heißem Wasser (50-60ºC) erhitzt und dann 3 Tag lang bei Raumtemperatur gerührt. Dichlormethan (300 ml) wurde zugesetzt, und die Mischung wurde mit 10% Salzsäure-Lösung (2 · 100 ml) gewaschen, mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung (100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel entfernt, was zu einem Öl führte, das direkt im nächsten Schritt eingesetzt wurde.

Schritt 3: Präparation von PB 3, 5-Ethyl-5-phenyl-1-{4-[2-(3-succinimidoxycarbonylpropionyloxy)ethylaminocarbonyl]butyl}-2,4,6(1H,3H,5H)-pyrimidintrion.

Dieses Material wurde unter Verwendung des in Schritt 7 des vorbereitenden Beispiels 4 dargestellten Verfahrens hergestellt, wobei von der Säure aus Schritt 2 dieses Beispiels ausgegangen wurde.

6. Präparation von PB 4, 5-Ethyl-5-phenyl-1-{4-[3-(3-succinimidoxycarbonylpropionamido)propylaminocarbonyl]butyl)-2,4,6(1H,3H,5H)-pyrimidinetrion.

Schritt 1: Präparation von 1-[4-(3-Benzyloxycarbonylaminopropylaminocarbonyl)butyl]-5- ethyl-5-phenyl-2,4,6(1H,3H,5H)-pyrimidinetrion.

Dieses Material wurde hergestellt, indem das in Schritt 4, vorbereitendes Beispiel 4, dargestellte Verfahren eingesetzt wurde, abgesehen davon, daß N-Benzyloxycarbonyl-1,3- propandiamin gegen das Benzyl-1-piperazincarboxylat ausgetauscht wurde, und das Rohmaterial wurde im nächsten Schritt eingesetzt.

Schritt 2: Präparation von 1-[4-(3-Aminopropylaminocarbonyl)butyl]-5-ethyl-5-phenyl- 2,4,6(1H,3H,5H)-pyrimidintrion-Hydrobromid.

Dieses Material wurde hergestellt wie in Schritt S, vorbereitendes Beispiel 4, dargestellt, abgesehen davon, daß von dem Amid aus Schritt 1 dieses Beispiels ausgegangen wurde, wodurch beim Gießen in Ethylether ein Öl geliefert wurde.

Schritt 3: Präparation von 1-{4-[3-(3-Carboxypropionamido)propylaminocarbonyl]butyl}-5- ethyl-5-phenyl-2,4,6(1H,3H,5H)pyrimidintrion.

Dieses Material wurde durch das Verfahren in Schritt 6, vorbereitendes Beispiel 4, hergestellt, abgesehen davon, daß von dem Amin aus Schritt 2 dieses Beispiels ausgegangen wurde, um die Säure zu liefern.

Schritt 4: Präparation von PB 4, 5-Ethyl-5-phenyl-1-{4-[3-(3-succinimidoxycarbonylpropionamido)propylaminocarboriyl]butyl}-2,4,6(1H,3H,5H)pyrimidintrion.

Dieses Material würde hergestellt, indem das Verfahren aus Schritt 7, vorbereitendes Beispiel 4, verwendet wurde, abgesehen davon, daß von der Säure aus Schritt 3 dieses Beispiels ausgegangen wurde.

7. Präparation von PB 5, 5-Ethyl-5-phenyl-1-{4-[6-(3-succinimidoxycärbonylpropionamido)hexylaminocarbonyl]butyl}-2,4,6(1H, 3H, 5H)-pyrimidintrion.

Diese Verbindung wurde durch die Abfolge von Reaktionen des vorbereitenden Beispiels 6 hergestellt, abgesehen davon, daß N-Benzyloxycarbonyl-1,6-hexandiamin gegen das Benzyloxycarbonyl-1,3-propandiamin in Schritt 1 und die entsprechenden Reaktionsprodukte danach in Schrift 2, 3 und 4 des vorbereitenden Beispiels 6 ausgetauscht wurden.

Markierte Arzneistoff-Hapten-Analoga

Wir haben neue markierte Arzneistoff-Hapten-Analoga der wie oben hergestellten Barbiturat- und Hydantoin-Analoga hergestellt, die bei kompetitiven Immuntests auf Barbiturate und Hydantoin-Arzneistoffe, insbesondere Phenobarbital und Phenytoin, nützlich sind. Die Markierungen sind solche, die bei Immuntests gewöhnlich verwendet werden, die eine Amino- oder Sulfhydryl-Gruppe aufweisen [und die] gewöhnlich mit Analyten oder Analytanaloga in kompetitiven Immuntests verwendet werden, wie etwa Enzyme, sichtbare Farbstoffe, Leucofarbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, radioaktiven Materialien, usw.

Geeignete Markierungen sind Enzyme, wie etwa Alkalische Phosphatase (ALP), Glucoseoxidase (GOD) und Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase, HRP) oder Amin- angereicherte Meerrettichperoxidase (AHRP).

Die markierten Arzneistoff-Hapten-Analoga werden mit einem neuen Verfahren hergestellt, das die folgenden Schritte umfaßt:

1) In-Kontakt-Bringen einer Markierung, die eine nucleophile Gruppe, wie etwa eine Amin- oder Sulfhydryl-Gruppe aufweist, mit einem Überschuß an einem Barbiturat- oder Hydantoin-Arzneistoff-Hapten-Analogon, wie oben beschrieben. Bevorzugterweise werden die Analoga und die Markierung in einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel, wie etwa N,N-Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid (DMSO), oder einer Mischung aus Lösungsmittel und Wasser (gepuffert) gelöst, bevor sie miteinander gemischt werden; und

2) Entfernen des unverbrauchten aktiven Esters und der Kondensationsnebenprodukte, bevorzugterweise durch Dialyse.

Die nachfolgend angeführten Beispiele veranschaulichen die Herstellung der neuen markierten Analoga dieser Erfindung. Die markierten Analoga wurden hergestellt, indem Phenytoin- und Phenobarbital-Arzneistoff-Hapten-Analoga verwendet wurden.

Markierte Hydantoin-Analoga Beispiel 1

Präparation eines, mit Amin angereicherter HRP markierten Hydantoins HD 1 (enthaltend einen erweiterten Linker, Markierung AHRP-HD 1, Markierung A).

HD 1 wurde in 1,452 ml trockenem DMF, das 10 mM 4'-Hydroxyacetanilid enthielt (DMF/4'-HA), gelöst. Amin-angereicherte HRP wurde hergestellt wie folgt. Trockene HRP wurde in 0,1 M MES Puffer, pH 5,5, gelöst, so daß sich eine Endkonzentration von 2,5 · 10&supmin;&sup6; Mol (100 mg) in 10 ml Puffer (MES = 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure) ergab. Die Proteinkonzentration wurde durch A&sub4;&sub0;&sub3;-Messung bestimmt, wobei der Umrechnungsfaktor A&sub4;&sub0;&sub3; 1 mg/ml = 2,24 verwendet wurde. Die HRP-Lösung wurde mit 1,5 · 10&supmin;³ Mol (275 mg) L-Lysin-Monohydrochlorid, gelöst in 10 ml 0,1 M MES-Puffer bei pH 5,5, zusammengebracht. Eine Lösung aus frisch hergestelltem 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid- Hydrochlorid (EDC, 5 · 10&supmin;&sup4; Mol, 960 ml) in MES-Puffer wurde zugesetzt. Der Behälter wurde mit einem Deckel verschlossen und [der Inhalt] über Nacht bei Raumtemperatur gemischt. Die Reaktion[smischung] wurde gegen 0,02 M MOPS-Puffer bei pH 7,0 (3 l bei 10ºC) dialysiert. Der. Dialysepuffer wurde dreimal gewechselt. MOPS = 3-(N- Morpholino)propansulfonsäure.

Vor der Reaktion wurde bei einer Probe der Amin-angereicherten HRP ein Pufferwechsel von MOPS-Puffer zu 0,1 M EPPS-Puffer, pH 8,0, vorgenommen, wobei "Centricells"- Zentrifugalultrafilter mit 30.000 NMWL (nominal molecular weight Limit cutoff, Ausschlußgrenze bei nominellem Molekulargewicht) verwendet wurden. Diese Probe wurde dann verdünnt, um eine Lösung mit einer Endkonzentration von 10 mg/ml zu erhalten.

Die Amin-angereicherte HRP (AHRP)(1 ml) wurde mit 500 ul einer 10 mM-Lösung von 4'- Hydroxyacetanilid in Dimethylformamid (DMF/4'-HA) unter Vortex-Mischen zusammengebracht und wurde dann in ein Wasserbad bei 42ºC getan. Eine HD 1-Lösung, hergestellt durch Lösen von 21 mg HD 1 in 1,452 ml trockener DMF/4'-HA-Lösung (500 ul), wurde tropfenweise zu dem AHRP unter Vortex-Mischen gegeben, so daß das molare Verhältnis von Phenytoin/HRP 50/1 betrug. Die Reaktion[smischung] wurde 1 Stunde in einem Wasserbad bei 42ºC unter sanftem Schütteln inkubiert.

Die Reaktion[smischung] wurde in einen "Spectrapor Nr. 2"-Dialyseschlauch getan, zusammen mit zusätzlichen 0,5 ml DMF/4'-HA/0,1 M EPPS (1 : 1), was verwendet wurden, um den Reaktionsbehälter zu spülen.

Die Reaktionsmischung wurde wie folgt dialysiert:

a) 1 l DMF/4'-HA/0,1 M EPPS, pH 8,0, (1 : 1), 1 Stunde bei 42ºC;

b) die Dialysebedingung a) wurde einmal wiederholt;

c) 2 l 0,1 M EPPS, pH 8,0, enthaltend 0,1% BSA, 15 Stunden bei 8ºC;

d) 2 l 0,1 M EPPS, pH 8,0, 3 Stunden bei 8ºC;

e) 3 l 0,04 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Hydrochlorid (Tris HCl)/0,15 M NaCl, pH 7,5, 3 Stunden bei 8ºC; und

f) die Dialysebedingung e) wurde einmal für 3 Stunden wiederholt;

Nach der Dialyse wurden 0,02% Merthiolat als ein Konservierungsstoff zugesetzt, und das AHRP-HD 1 wurde gekühlt gelagert.

Beispiel 2

Präparation eines, mit Amin angereicherter HRP markierten HD 2 (enthaltend einen erweiterten Linker mit einer Amidbindung, Markierung AHRP-HD 2, Markierung B).

HD 2 (15,5 mg) wurde in 1,031 ml trockenem DMF, das 10 mM 4'-Hydroxyacetanilid enthielt (DMF/4'-HA), gelöst.

Eine Lösung aus AHRP (10 mg/ml, /ml in 0,1 M EPPS, pH 8,0), hergestellt wie im Markierung-vorbereitenden Beispiel 1 beschrieben, wurde mit 500 ul DMF/4'-HA unter Vortex- Mischen zusammengebracht und wurde dann in ein Wasserbad bei 42ºC getan. Die oben beschriebene HD 2-Lösung (500 ul) wurde tropfenweise unter Vortex-Mischen zu der AHRP gegeben, so daß das molare Verhältnis 50/1 betrug. Die Reaktion[smischung] wurde 1 Stunde in einem Wasserbad bei 42ºC unter sanftem Schütteln inkubiert.

Das Reaktionsprodukt wurde in einen "Spectrapor Nr. 2"-Dialyseschlauch gebracht und wie folgt dialysiert:

a) 1 l DMF/4'-HA/0,1 M EPPS, pH 8,0 (1 : 1), 1 Stunde bei 42ºC;

b) die Dialysebedingung a) wurde einmal wiederholt;

c) 1,5 l 0,1 M EPPS, pH 8,0, enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin (bovine serum albumin, BSA), 1,5 Stunden bei 8ºC;

d) 1,5 l 0,1 M EPPS, pH 8,0, 18 Stunden bei 8ºC;

e) 1,5 l 0,04 M Tris HCl/0,15 M NaCl, pH 7,5, 2 Stunden bei 8ºC; und f) die Dialysebedingung e) wurde einmal für 4 Stunden wiederholt.

Nach der Dialyse wurden 0,02% Merthiolat als ein Konservierungsstoff zugesetzt. Das markierte Hydantoin-Derivat wurde in einem Kühlschrank gelagert.

Beispiel 3

Präparation von AHRP-HD 3 (enthaltend einen erweiterten Linker mit einer Amidbindung, Markierung AHRP-HD 3, Markierung C).

HD 3 (9,2 mg) wurde in 1 ml trockenem DMF, das 10 mM 4'-Hydroxyacetanilid enthielt (DMF/4'-HA), gelöst.

Eine Lösung von AHRP, hergestellt wie in Markierung-vorbereitendem Beispiel 1, wurde gegen 0,1 M EPPS-Puffer, pH 8,0, dialysiert. Die Endkonzentration wurde mit 5,71 mg/ml bestimmt.

Die AHRP (1 ml) wurde mit 500 ul DMF/4'-HA unter Vortex-Mischen zusammengebracht und wurde dann in ein Wasserbad bei 42ºC getan. Die oben beschriebene HD 3-Lösung (500 ul) wurde tropfenweise unter Vortex-Mischen zu der AHRP gegeben, so daß das molare Verhältnis von HD 3/AHRP 50/1 betrug. Die Reaktion[smischung] wurde 1 Stunde in einem Wasserbad bei 42ºC unter sanftem Schütteln inkubiert. Die Reaktion[smischung] würde in einen "Spectrapor Nr. 2"-Dialyseschlauch getan, gemeinsam mit zusätzlichen 0,5 ml DMF/4'- HA/0,1 M EPPS (1 : 1), was zum Spülen des Reaktionsbehälters verwendet wurden.

Die Reaktion[smischung] wurde wie folgt dialysiert:

a) 1 l DMF/4'-HA/0,1 M EPPS, pH 8,0, (1 : 1), 1 Stunde bei 42ºC;

b) die Dialysebedingung a) wurde einmal wiederholt;

c) 1,5 l 0,1 M EPPS, pH 8,0, enthaltend 0,1% BSA 15 Stunden bei 5ºC;

d) 1,5 l 0,1 M EPPS, pH 8,0, 8 Stunden;

e) 2 l 0,02 M 3-Morpholinopropansulfonsäure (MOPS), pH 7,0, 13 Stunden bei 5ºC; und

f) die Dialysebedingung e) wurde zweimal wiederholt.

Nach der Dialyse würde Merthiolat in einer Konzentration von 0,02% als ein Konservierungsstoff zugesetzt, und die Markierung wurde gekühlt gelagert.

Markierte Barbiturat-Arzneistoff-Hapten-Analoga

Die folgenden Beispiele demonstrieren die Herstellung von markierten Barbiturat- Arzneistoff-Hapten-Analoga.

Beispiel 4

Präparation von, mit Amin angereicherter HRP markiertem PB 2 (Markierung AHRP-PB 2, Markierung D).

PB 2 wurde in DMSO gelöst, um eine Lösung von 10,7 mg/ml (1,25 · 10&supmin;² M) zu liefern. Dann wurden 500 gl dieser Lösung tropfenweise zu einer Lösung aus Amin angereicherter HRP/DMSO (ähnlich hergestellt wie AHRP/DMF) unter Vortex-Mischen gegeben. Das molare Verhältnis von Phenobarbital/HRP betrug 50/1.

Die Inkubation wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur unter Schütteln mit 2400 Upm durchgeführt. Die Probe wurde in einen "Spectrapor Nr. 2"-Dialyseschlauch überführt, gemeinsam mit einem zusätzlichen 1 ml von Dialysat, [verwendet] zum Spülen des Reaktionsbehälters.

Die Markierung wurde in 0,02 M MOPS-Puffer, pH 7,0; bei 5-10ºC umdialysiert. Diese Dialysebedingung wurde dreimal mit jeweils 2-3 l Puffer wiederholt. Im Anschluß an die Dialyse wurden 0,02% Merthiolat als ein Konservierungsstoff zugesetzt, und die Markierung wurde gekühlt gelagert.

Beispiel 5

Präparation von Amin-angereicherte HRP-PB 3 (AHRP-PB 3, Markierung-E, enthaltend einen erweiterten Linker).

Amin-angereicherte HRP wurde einem Pufferwechsel von MOPS-Puffer zu 0,1 M EPPS- Puffer, pH 8,0, unterzogen, wobei ein "Centricell"-Zentrifugalultrafilter (30.000, Grenze für nominelles Molekulargewicht) verwendet wurde. Diese Probe wurde dann auf 4,6 ml, 0,743 mg/ ml verdünnt.

Ein ml von der HRP (1,85 · 10&supmin;&sup5; M) wurde in eine kleine Phiole (1,85 · 10&supmin;&sup5; M) gegeben. 500 ul Dimethylformamid, Aldrich 22,705-6, das 10 mM 4'-Hydroxyacetanilid enthielt (DMF- 4'/HA), wurden zu der Phiole gegeben, gevortext und [die Mischung] in ein Wasserbad bei 42ºC gestellt.

Zwischenzeitlich wurde PB-3 in DMF-4'/HA gelöst, um eine Lösung von 2,12 mg/ml (3,70 · 10&supmin;³ M) zu liefern. 500 ul dieser Lösung wurden der HRP/DMF-4'/HA-Lösung tropfenweise unter Vortex-Mischen zugegeben. Das molare Verhältnis von Phenobarbital/HRP betrug 100/1.

Die Inkubation wurde 1 Stunde bei 42ºC unter sanftem Schütteln in einem Wasserbad durchgeführt. Die Probe wurde in einen "Spectrapor Nr. 2"-Dialyseschlauch überführt, gemeinsam mit einem zusätzlichen 1 ml DMF-4'/HA/0.1 M EPPS (1 : 1), was verwendet wurde, um den Reaktionsbehälter zu spülen.

Die Reaktion[smischung] wurde wie folgt dialysiert:

a) 1 l DMF-4'/HA/0,1 M EPPS, pH 8,0 (1 : 1), 1 Stunde bei 42ºC;

b) die Dialysebedingung a) wurde einmal wiederholt;

c) 1,5 l 0,1 M EPPS, pH 8,0, enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin (bovine serum albumin, BSA), über Nacht bei 5ºC;

d) 1,5 l 0,1 M EPPS, pH 8,0, 8 Stunden bei 5ºC;

e) 2,0 l 0,02 M MOPS, pH 7,0, mindestens 8 Stunden bei 5ºC; und

f) die Dialysebedingung e) wurde zweimal wiederholt.

Im Anschluß an die Dialyse wurden 0,02% Merthiolat als ein Konservierungsstoff zugesetzt, und die Markierung wurde gekühlt gelagert.

Beispiel 6

Präparation eines Amin-angereicherte HRP-PB (Markierung AHRP-PB 1, Markierung F, ein aktiver Ester eines Phenobarbital-Hapten-Analogons, enthaltend einen erweiterten Linker mit einer Amidbindung)

Amin-angereicherte HRP wurde präpariert und ein Pufferwechsel zu 0,1 M EPPS-Puffer, pH 8,0, vorgenommen, um eine Lösung von 10 mg/ml (2,5 · 10&supmin;&sup4; M) zu ergeben. Die Markierung F wurde unter Verwendung von 5 ml (50 mg) Amin angereicherter HRP hergestellt. 2,5 ml DMSO wurden langsam unter Rühren auf einer magnetischen Rührplatte zugegeben. Die Lösung wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.

Zwischenzeitlich wurde PB 1 in DMSO gelöst, um eine Lösung von 14,9 mg/ml zu ergeben. 2,5 ml dieser Lösung wurden zu der HRP/DMSO-Lösung unter Rühren langsam zugegeben. Das molare Verhältnis von Phenobarbital/HRP betrug 50/l.

Die Inkubation wurde bei Raumtemperatur 5 Stunden unter Schütteln mit 2400 Upm durchgeführt. Die Probe wurde in einen "Spectropor Nr. 2"-Dialyseschlauch überführt, gemeinsam mit zusätzlichem Dialysat, [verwendet] zum Spülen des Reaktionsgefäßes. Die Markierung wurde in 0,02 M MOPS-Puffer, pH 7,0, bei 5-10ºC umdialysiert. Diese Dialysebedingung wurde dreimal mit jeweils 3 l Puffer wiederholt. Nach der Dialyse wurden 0,02% Merthiolat als ein Konservierungsstoff zugesetzt, und die Markierungen wurden gekühlt gelagert.

Immunkompetenz

Die folgenden Tests demonstrieren die Immunkompetenz der oben beschriebenen Markierungen 1-6.

Beispiel 7

Immunkompetenz der Markierung AHRP-HD 1 (Markierung A).

In diesem Beispiel wird die Fähigkeit mehrerer immobilisierter Antikörper (DilAs&sub8;, DilAs&sub9;, DilAs&sub1;&sub4;, DilAs&sub1;&sub6; und DilAs&sub2;&sub1;), AHRP-HD 1 (Markierung A) aus dem Markierungvorbereitenden Beispiel 1) zu binden, untersucht.

a) Proben von Polymer-Beads, wobei jede Probe einen der oben aufgeführten Typen von Antikörpern kovalent daran gebunden hätte, wurden unter Verwendung der in EP-A-323 692 beschriebenen Verfahren und Materialien hergestellt.

b) Die Fähigkeit der immobilisierten Antikörper, AHRP-HD 1 (Markierung A) zu binden, wurde wie folgt bestimmt:

Jede [Gruppe] von unterschiedlichen Antikörper-Beads wurde seriell mit PBS, das 1% BSA enthielt, verdünnt, um Konzentrationen an Antikörperbindungsstellen zwischen 500 und 0,50 nM zu ergeben. Die Bead-Verdünnungen wurden mit gleichen Volumina der Markierung bei 10 · 10&supmin;¹¹ M gemischt. Nach einer einstündigen Inkubation wurden die Beads durch Zentrifugation pelletiert. Eine Probe (100 ul) des Überstands wurde mit 100 ul Substrat (o- Phenylendiamin/H&sub2;O&sub2;) gemischt. Die Raten der Farbentwicklung bei 450 nm wurden mit denen von Standards verglichen, um die Menge an in Lösung verbliebener Phenytoin-HRP- Markierung zu berechnen. Die Menge an Markierung, die bei der höchsten getesteten Antikörperkonzentration (250 nM Bindungsstellen) an den immobilisierten Antikörper gebunden wurde, wird angegeben.

% Markierung, gebunden bei 250 nM Antikörper-Bindungsstellen Markierung A (erweiterter Linker)

DilAs&sub8; 93

DilAs&sub9; 94

DilAs&sub1;&sub4; 90

DilAs&sub1;&sub6; 96

DilAs&sub2;&sub1; 97

Diese Ergebnisse zeigen, daß diese Antikörper AHRP-HD 1-Markierungen (Markierung A) sehr gut erkennen.

Beispiel 8

Hydrolytische Stabilität von AHRP-HD 2 (Markierung B)

Dieses Beispiel veranschaulicht die hydrolytische Stabilität eines markierten Phenytoin- Derivats der Erfindung, das eine Amidbindung in der verbindenden Kette zwischen der Markierung und dem Phenytoin-Kern AHRP-HD 2 (Markierung B) aufweist.

Beads mit immobilisierten Kallestad-Antikörpern wurden hergestellt wie in EP-A-323 692 beschrieben.

AHRP-HD 2 (Markierung B) wurde in PBS, eingestellt auf pH 7,3 oder 8,5, das 1% BSA enthielt, auf 1 · 10&supmin;¹&sup0; M verdünnt. Die Markierung wurde 6 Tage bei Raumtemperatur inkubiert. Die Markierung wurde auf die Bindung durch immobilisierten Antikörper nach 2 Tagen und 6 Tagen folgendermaßen getestet:

Kallestad 52-2-Antikörper-Beads wurden seriell mit PBS, das 1% BSA enthielt, verdünnt, um Konzentrationen von Antikörperbindungsstellen zwischen 500 und 0,50 nM zu ergeben. Die Bead-Verdünnungen wurden mit gleichen Volumina von Markierungen bei 10 · 10&supmin;¹¹ M gemischt. Nach einer Stunde Inkubation wurden die Beads durch Zentrifugation pelletiert. Eine Probe (100 ul) des Überstands wurde mit 100 ul Substrat (o-Phenylendiamin/H&sub2;O&sub2;) gemischt. Die Raten wurden mit denen von Standards verglichen, um die Menge an in Lösung verbliebener Markierung zu berechnen. Die Menge an Markierung, die bei der höchsten getesteten Antikörper-Konzentration (250 nM Bindungsstellen) an den immobilisierten Antikörper gebunden wurde, wird dargestellt.

Prozent gebundene Markierung bei 250 nM Antikörperbindungsstellen

Die Ergebnisse zeigen, daß eine Bindung von AHRP-HD 2 (Markierung B), welche die Amidbindung in der verbindenden Kette enthält, über diese Zeitdauer nicht zu einer Degradation fährt. Dies zeigt an, daß die Markierung B einem Abbau durch Hydrolyse widerstehen wird. Eine derartige Hydrolyse könnte eine Verschiebung der Testantwort mit der Zeit verursachen.

Beispiel 9

Vergleich von Phenobarbital-HRP-Markierungen, hergestellt mit Valerat und erweiterten Linkem.

In diesem Beispiel wird die Fähigkeit mehrerer immobilisierter Antikörper (Kall 1571 und PbAs9), eine Markierung mit dem Valerat-Linker (Markierung D, AHRP-PB 2) zu binden, mit der, eine Markierung mit einem erweiterten Linker (Markierung F, AHRP-PB 1) zu binden, verglichen.

Proben von immobilisierten Antikörper-Beads wurden wie folgt präpariert:

Polymer-Beads (30 mg) [Poly(styrol-co-p-vinylbenzyl-2-chlorethylsulfon) (95 : 5, molares Verhältnis)] wurde in 1 ml Puffer (0,1 M EPPS, pH 8,5) dispergiert, und 0,3 mg Antikörper (Kall 1571 oder PbAs9) wurden zugegeben. Das Gesamtvolumen betrug 1,5 ml. Die Mischung wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur Kopf-über-Kopf rotierengelassen. Dann wurden 0,3 ml einer 10%igen Lösung von BSA zugesetzt, und die Überstände wurden entfernt und unter Verwendung eines anti-Maus-IgG auf nicht-gebundenen Antikörper analysiert. Die Menge an Antikörper, die an die Oberfläche gebunden war, wurde unter Verwendung eines ELISA berechnet. Die Pellets wurden dreimal mit PBS, pH 7,2, gewaschen, indem sie in dem Puffer resuspendiert und zentrifugiert wurden. Das letztmalige Wiederaufnehmen durch Dispersion erfolgte in 1,8 ml PBS; Merthiolat wurde in einer Konzentration von 0,02% zugegeben, und die Präparationen wurden bis zur Verwendung bei 4ºC gelagert.

Die Fähigkeit der immobilisierten Antikörper, die Markierung zu binden, wurde folgendermaßen bestimmt:

Jede [Gruppe] der unterschiedlichen Antikörper-Beads wurde seriell mit PBS, das 1% BSA enthielt, verdünnt, um Konzentrationen an Antikörper-Bindungsstellen zwischen 200 und 0,50 nM zu ergeben. Die Bead-Verdünnungen wurden mit gleichen Volumina an Phenobarbital-HRP-Markierungen bei 10 · 10&supmin;¹¹ M gemischt. Nach einer einstündigen Inkubation wurden die Beads durch Zentrifugation pelletiert. Eine Probe (100 ul) des Überstands wurde mit 100 ul Substrat (o-Phenylendiamin/H&sub2;O&sub2;) gemischt. Die Raten der Farbentwicklung bei 450 nm wurden mit denen von Standards verglichen, um die Menge an in Lösung verbliebener Phenobarbital-HRP-Markierung zu berechnen. Die Menge an Markierung, die bei der höchsten getesteten Antikörperkonzentration (100 um Bindungsstellen) an den immobilisierten Antikörper gebunden wurde, wird angegeben.

% Markieung, gebunden bei 100 nM Antikörper-Bindungsstellen

Diese Ergebnisse zeigen, daß bei diesen Antikörpern die Erkennung von Markierungen, die mit Haptenen mit der erweiterten Linker-Gruppe, die bei den, durch die Erfindung verfügbar gemachten markierten Arzneistoff-Hapten-Analoga verwendet werden, hergestellt werden, verbessert ist.


Anspruch[de]

1. Markierte Wirkstoff-Analoga, umfassend:

(A) eine Enzym-Markierung;

(B) einen Wirkstoffkern, ausgewählt aus einem Hydantoin- oder einem Barbiturat- Kern; und

(C) eine verbindende Kette, die die 3-Position des Wirkstoffkerns mit der Markierung über eine Carbonylbrücke verbindet; wobei die verbindende Kette, ausgenommen die Carbonylbrücke, 12 bis 40 Atome aufweist, bestehend aus:

(I) zwei oder mehr C&sub1;- bis C&sub1;&sub0;-Alkylengruppen; gegebenenfalls in Kombination mit einer oder mehreren Phenylengruppen, und/oder einem oder mehreren 5- bis 7-gliedrigen heterozyklischen Ringen, die in die verbindende Gruppe über Ring-Stickstoff-Atome eingebunden sind;

oder

(II) eine C&sub1;- bis C&sub1;&sub0;-Alkylengruppe in Kombination mit einer oder mehreren Phenylengruppen und einem oder mehreren 5- bis 7-gliedrigen heterozyklischen Ringen, die in die verbindende Gruppe über Ring- Stickstoff-Atome eingebunden sind;

wobei die Gruppen und Ringe miteinander über chemischen Gruppen verbunden sind, die ausgewählt sind aus

(a) Estern, (-COZ-), worin Z O oder S ist;

(b) Amiden, (-CONH-),

(c) Heteroatomen, ausgewählt aus -O-, -S-, und NR-; worin R C&sub1;- bis C&sub6;- Alkyl repräsentiert; und

(d) Carbonyl.

2. Markiertes Analogon nach Anspruch 1, wobei die verbindende Kette eine heterozyklische Gruppe beinhaltet, die aus 1,4-Piperazinylen-, 2,5-Dimethyl-1,4-piperazinylen, 1,3-Imidazolidinylen- und 1,3-Hexahydxodiazepinylen-Gruppen ausgewählt ist.

3. Markiertes Analogon nach Anspruch 1, entsprechend der Struktur:

(I)

worin

A einen Hydantoin-Kern der Struktur

oder einen Barbiturat-Kern der Struktur

repräsentiert;

worin R¹ unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl aus 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, nicht- substuiertes oder substituiertes Phenyl repräsentiert;

R², R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; unabhängig voneinander C&sub1;- bis C&sub1;&sub0;-Alkylen repräsentieren oder solche Alkylengruppen, die mit mindestens einer oder mehreren Estergruppen, Amidgruppen, -O-, -S- und -NR-, unterbrochen sind;

R³ C&sub1;- bis C&sub3;-Alkylen repräsentiert;

Z -O-, -S-, -NR- repräsentiert, worin R Wasserstoff oder C&sub1;- bis C&sub6;-Alkyl repräsentiert;

m ist 0, 1 oder 2;

n ist 0, 1 oder 2;

m + n > 0; und

die Gesamtzahl der Atome, die von m, n und R² umfaßt sind, 12 bis 40 beträgt;

LABEL ist ein Enzym;

und weiter vorausgesetzt, daß (i) mindestens eine der R¹-Gruppen substituiertes oder nicht- substituiertes Phenyl ist;

(ii) einer von R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; Phenylen sein kann; und

(iii) die eingeklammerten Komponenten von Struktur I in jeder Reihenfolge auftreten können.

4. Markiertes Analogon nach Anspruch 3, wobei:

R¹ unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl, Propyl, Hexyl, Dezyl, nicht- substituiertes Phenyl oder mit Alkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen substituiertes Phenyl, Nitro, Halogen, Cyano und Alkoxy von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen repräsentiert;

R², R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; unabhängig voneinander Alkylen repräsentiert, ausgewählt aus Ethylen, Trimethylen, Butylen, Pentylen, Octylen oder einem solchen Alkylen, das mit mindestens einer oder mehreren Estergruppen, Amidgruppen, -O-, -S- und -NR-, unterbrochen ist;

R³ Methylen, Ethylen oder Trimethylen repräsentiert;

Z -NR- repräsentiert, worin R Wasserstoff, Methyl, Propyl oder Hexyl repräsentiert; und

LABEL ein Enzym repräsentiert.

5. Markiertes Analogon nach Anspruch 1, wobei die Markierung aus Meerrettichperoxidase (HRP) oder Amin angereicherter Meerrettichperoxidase (AHRP) ausgewählt ist;

der Wirkstoffkern Phenytoin oder Phenobarbital ist und die verbindende Gruppe ausgewählt ist aus:

Tetramethylencarbonyliminohexamethyleniminocarbonylethylencarbonyl, Tetramethylencarbonyl-1,4-Piperazinylencarbonylethylencarbonyl, und Tetramethylencarbonyliminoethylenoxycarbonylethylencarbonyl.

6. Verfahren zur Herstellung der markierten Wirkstoff-Analoga nach einem der voranstehenden Ansprüche, umfassend die Schritte aus:

(1) In Kontakt bringen einer Markierung, die eine Amin- oder Sulfhydrylgruppe aufweist, mit einem Überschuß eines Wirkstoff-Analogons, das umfaßt:

(a) eine aktive Estergruppe wie etwa Succinimidoxycarbonyl;

(b) einen Wirkstoffkern, der ausgewählt ist aus einem Hydantoin-Kern oder einem Barbituratkern;

(c) eine verbindende Kette, die die aktive Estergruppe mit dem Hydantoin- oder Barbiturat-Kern verbindet;

wobei die verbindende Kette wie in Anspruch 1 definiert ist; und

(2) Entfernen des unverbrauchten aktiven Esters und der Kondensationsnebenprodukte, bevorzugt durch Dialyse.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Wirkstoff-Analogon und die Markierung in einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel oder einem Gemisch aus Lösungsmittel und Wasser gelöst werden, bevor sie miteinander in Kontakt gebracht werden.

8. Markiertes Wirkstoff-Analogon nach den Ansprüchen 1 bis 4, wobei die verbindende Kette 12 bis 18 Atome aufweist.

9. Markiertes Wirkstoff-Analogon nach den Ansprüchen 3, 4 oder 5, worin Z -NR- ist.







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