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Dokumentenidentifikation DE69615772T2 01.08.2002
EP-Veröffentlichungsnummer 0760394
Titel Milder Newcastle-Krankheitsimpfstoff
Anmelder Akzo Nobel N.V., Arnheim/Arnhem, NL
Erfinder Schrier, Carla Christina, 5831 MR Boxmeer, NL
Vertreter WUESTHOFF & WUESTHOFF Patent- und Rechtsanwälte, 81541 München
DE-Aktenzeichen 69615772
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 30.07.1996
EP-Aktenzeichen 962021572
EP-Offenlegungsdatum 05.03.1997
EP date of grant 10.10.2001
Veröffentlichungstag im Patentblatt 01.08.2002
IPC-Hauptklasse C12N 7/00
IPC-Nebenklasse A61K 39/17   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft einen milden Newcastle Disease Virus (NDV)-Stamm und einen Impfstoff zur Verwendung zum Schutz von Geflügel gegen die Newcastle-Krankheit, welcher den genannten NDV-Stamm umfasst.

Die Newcastle-Krankheit ist eine virale Infektionskrankheit von Geflügel mit, einer breiten geographischen Verteilung, welche grosse wirtschaftliche Verluste in der Geflügelindustrie verursacht. Das Newcastle Disease Virus (NDV) ist das etiologische Agens dieser Krankheit und stellt das Prototypvirus des Genus Paramyxovirus dar. Die Newcastle-Krankheit ist deswegen kompliziert, weil verschiedene Isolate und Stämme des Virus enorme Variationen der Schwere der Krankheit verursachen können. Allgemein kann gesagt werden, dass, je jünger das Huhn, desto akuter und schwerer die Erkrankung. Die Infektion kann entweder durch Inhalation oder durch Nahrungsaufnahme erfolgen und die infektiöse Form des Virus breitet sich von einem Vogel zum anderen aus.

Wie oben angemerkt, sind verschiedene Pathogenitätstypen von NDV identifiziert worden, d.h. velogene, mesogene und lentogene Viren. Obwohl diese Bezeichnungen von Labortests herrühren, die sowohl in vivo und in vitro durchgeführt wurde, werden diese Bezeichnungen nun allgemein verwendet, um Viren mit niedriger, mässiger oder hoher Virulenz für Hühner zu beschreiben. Die neurotrope velogene Form der Krankheit wird durch hoch-pathogene NDV- Stämme verursacht und ist durch einen plötzlichen Ausbruch schwerer respiratorischer Symptome, gefolgt von neurologischen Symptomen gekennzeichnet. In den misten Fällen überleben die infizierten Tiere nicht. Viszerotrope velogene NDV-Stämme sind hoch-pathogen und verursachen eine hohe Mortalität und ernste Läsionen im Gastrointestinaltrakt. Mesogene NDV-Stämme verursachen gewöhnlich eine ernste respiratorische Erkrankung in voll empfänglichen Vögeln und in ausgewachsenen Vögeln einen bemerkenswerten Rückgang der Eiproduktion. Lentogene NDV-Stämme verursachen im allgemeinen eine milde Erkrankung, die durch respiratorische Symptome gekennzeichnet ist, insbesondere bei jungen, voll empfänglichen Vögeln.

Um die auf die Newcastle Krankheit (ND) zurückzuführenden wirtschaftlichen Verluste in der kommerziellen Geflügelindustrie zu reduzieren, wurden Hühner gegen ND geimpft. Lebende Impfstoffe, die von lentogenen und mesogenen Stämmen stammten, wurde routinemässig verwendet, wobei sich die mesogenen Stämmen nur für eine zweite Impfung eigneten. Allerdings besteht auch in der lentogenen Gruppe bezüglich der Virulenz der Viren eine beachtliche Bandbreite. NDV-Stämme, die als Lebendvakzine verwendet werden, schliessen V4, Hitchner, B1, F, La Sota (lentogen) und Stamm H, Mukteswar, Komarov und Roakin (mesogen) ein. Der Hauptvorteil der lebenden ND-Impfstoffe ist der, dass diese durch billige Massenapplikationstechniken wie in Form von Spray und Trinkwasser verabreicht werden können. Diese Impfstoffe können jedoch ernste Impfreaktionen, insbesondere nach einer Sprayimpfung im Respirationstrakt, hervorrufen. Aus diesem Grund ist es wichtig einen ausserordentlich milden Virus zur Impfung, insbesondere für eine Erstimpfung, zu verwenden, als ein Ergebnis davon sind jedoch gewöhnlich mehrfache Impfdurchführungen notwendig.

Ältere Vögel werden im allgemeinen inaktivierte Impfstoffe durch Injektion verabreicht. Meistens enthalten diese Impfstoffe das abgetötete Virus mit einem Adjuvansträger, wie beispielsweise Aluminiumhydroxid oder einer Wasser-in-Öl-Emulsion gemischt. Viren, die für die Herstellung von Öl-Emulsions-Impfstoffen verwendet werden, schliessen Ulster, 2C, Hitchner B1, La Sota, Roakin und verschiedene virulente Viren ein (D.J. Alexander, in Diseases of the Poultry, 9. Ausgabe 1991, Hrsg. Calnek et al., Iowa State University Press, Ames, Iowa, 496-519).

Da die allgemein verwendeten Lebend-Stämme von NDV, Hitchner B1 und La Sota, immer noch milde respiratorische Impfreaktionen hervorrufen, besteht ein Bedarf an noch milderen NDV- Impfstämmen, die keine (respiratorischen) Impfreaktionen in geimpften Tieren hervorrufen, aber dennoch eine solide Immunität gegen diese Krankheit hervorrufen. Verschiedene solcher Stämme wurden im Stand der Technik beschrieben. US-Patent Nr. 5,250,298 (University of Delaware) offenbart eine lebende, Kälteadaptierte Temperatur-empfindliche Mutante des Hitchner-B1- Elternstammes, als CaTs bezeichnet. US-Patent Nr. 5,149,530 (Duphar Int. Res. B. V.) beschreibt den von dem Ulster 2C stammenden NDW-Stamm. Darüber hinaus wird im US-Patent Nr. 5,188,502 (University of Georgia Research Foundation, Inc.) ein natürlich abgeschwächter NDV-Stamm offenbart, der aus dem Intestinaltrakt eines Truthahns isoliert wurde und keine Symptome einer respiratorischen Erkrankung zeigt.

Gemäss einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein neuer als C2 bezeichneter Stamm zur Verfügung gestellt, der bei dem CNCM des Institute Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, Paris, Frankreich, unter der Nummer I-1614 am 26. Juli 1995 hinterlegt wurde. Der erfindungsgemässe Virusstamm unterscheidet sich von den bestehenden NDV (Impf-)Stämmen und verursacht keine Impfreaktionen, weder im Respirationstrakt noch in anderen Organen und ist dennoch in der Lage eine solide Immunantwort zu induzieren.

Das in Beispiel 1 beschriebene Experiment zeigt die Unterschiede zwischen dem beanspruchten NDV-Stamm und den bestehenden NDV- Impfstämmen zusätzlich zu den vorteilhaften Impfeigenschaften des beanspruchten Stamms.

Ein anderer Aspekt dieser Erfindung ist ein Impfstoff zur Verwendung zum Schutz von Geflügel gegen ND, der den neuen obengenannten NDV C2-Stamm zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.

Das Virus des NDV C2-Stammes kann als lebendes oder inaktiviertes Virus in den Impfstoff eingebracht werden.

Das Virus es NDV C2-Stammes umfasst sowohl Viren, die von dem hinterlegten Stamm stammen, als auch solche Virusnachkommen, die von dem hinterlegten NDV C2-Stamm durch serielle Passagen, zum Beispiel in embryonierten Eiern oder in einer Zellkultur, stammen.

NDV-Viren des C2-Stammes, die in einen erfindungsgemässen Impfstoff eingebracht werden sollen, können mittels herkömmlicher Verfahren erhalten werden. Kurz gesagt, wird ein suszeptibles Substrat mit NDV C2-Viren inokuliert und solange vermehrt bis sich das Virus zu dem gewünschten Titer repliziert hat, wonach das NDV-enthaltene Material geerntet wird.

Jedes Substrat, das in der Lage ist, die Replikation des ND- Virus zu unterstützen, kann einschliesslich primärer (aviärer) Zellkulturen, wie beispielsweise Hühnerembryo-Fibroblasten (CEF) oder Hühnernierenzellen (CK- oder Säugetierzellen, wie die VERO- Zelllinie oder die Baby-Hamster-Nierenzelllinie, können verwendet werden.

Vorzugsweise werden die NDV C2-Viren in embryonierten Hühnereiern vermehrt.

Das Substrat auf dem diese ND-Viren vermehrt werden, besteht insbesondere aus SPF-Embryoeiern. Die embryonierten Eier können zum Beispiel mit 0,2 ml enthaltender Allantoisflüssigkeit angeimpft werden, die mindestens 102,0 EID&sub5;&sub0; pro Ei enthalten. Vorzugsweise werden 9-12 Tage alte embryonierte Eier mit 105,0 EID&sub5;&sub0; angeimpft und anschliessend 2-4 Tage bei 37ºC inkubiert. Nach 2- 4 Tagen kann das ND-Virusprodukt vorzugsweise durch Sammeln der Allantoisflüssigkeit geerntet werden. Die Flüssigkeit kann danach 10 Minuten bei 2500 g zentrifugiert werden, wonach der Überstand durch einen Filter (100 um) zentrifugiert wird.

Der das lebende Virus enthaltende erfindungsgemässe Impfstoff kann in Form einer Suspension oder in lyophilisierter Form hergestellt und vermarktet werden und enthält pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Streckmittel, die gewöhnlich für solche Zusammensetzungen verwendet werden. Trägerstoffe schliessen Stabilisatoren, Konservierungsmittel und Puffer ein. Geeignete Stabilisatoren sind zum Beispiel SPGA, Kohlehydrate wie Sorbit, Mannit, Stärke, Saccharose, Dextran, Glutamat oder Glukose), Proteine (wie getrocknetes Milchserum, Albumin oder Casein) oder Abbauprodukte davon. Geeignete Puffer sind zum Beispiel Alkalimetallphosphate. Geeignete Konservierungsmittel sind Thimerosal, Merthiolat und Gentamicin. Verdünnungsmittel schliessen Wasser, wässrige Puffer (gepufferte Salzlösung) und Polyole (wie Glycerol) ein.

Falls gewünscht, können die erfindungsgemässen Lebendvakzine ein Adjuvans enthalten.

Obwohl die Injektion des erfindungsgemässen Lebendimpfstoffs möglich ist, wird er vorzugsweise mittels kostengünstigen Massenapplikationstechniken verabreicht, die allgemein für NDV- Impfungen angewendet werden. Diese Techniken schliessen Trinkwasser- und Sprayimpfung ein. Aufgrund der ausserordentlich milden Eigenschaften des vorliegenden Impfvirus, wird insbesondere eine Sprayimpfung in Betracht gezogen.

Bei einer Verabreichung über den Trinkwasserweg ist es gewöhnlich so, dass den Tieren während 2 bis Stunden Wasser entzogen wird, bevor ihnen das den Impfstoff enthaltende Trinkwasser vorgesetzt wird und es ist wichtig, dass genügend Trinkraum vorhanden ist, so dass alle Vögel gleichmässig trinken können. Der Impfstoff wird in frischem Trinkwasser in einer Konzentration verabreicht, die so kalkuliert ist, dass jeder Vogel eine ausreichende Dosis erhält.

Um eine dramatische Reduktion des zur Verfügung stehenden Impfvirus durch Anwesenheit von kleinen Mengen Chlor, Eisen, Zink oder Kupfer im Trinkwasser zu verhindern, wird vorzugsweise ein Schutzmittel wie Magermilch (Puder) zu dem den Impfstoff enthaltenden Wasser gegeben.

Das Sprayverfahren, das gewöhnliche Spray- und Aerosolverabreichung umfasst, schliesst die Verabreichung des ND-Virus- Lebendimpfstoffs eingebaut in kleine flüssige Partikel ein. Bei dem gewöhnlichen Sprayverfahren haben die Partikel gewöhnlich eine Tropfengrösse von 10 bis 100 Mikron und bei dem Aerosolverabreichungsverfahren von sind die Tröpfchen gewöhnlich in einem Bereich von < 1 bis 50 Mikron.

Um eine Inaktivierung des Lebendvirusimpfstoffs aufgrund einer erhöhten Konzentration von gelösten Salzen als ein Ergebnis der Austrocknung der (Leitungs-)Wasserpartikel zu verhindern, können kleine Mengen eines Proteinschutzmittels, wie beispielsweise Magermilch, Magermilchpulver oder Gelatine zu der wässrigen Phase gegeben werden.

Zu der Herstellung von kleinen Partikeln können herkömmliche Sprayvorrichtungen und Aerosolgeneratoren wie beispielsweise die kommerziell erhältlichen Sprayvorrichtungen für Tornistersprays, Brütsprays und atomisierte Sprays verwendet werden. Auch die Trinkwasserverabreichung kann unter Verwendung herkömmlicher Vorrichtungen durchgeführt werden. Einzelheiten die herkömmliche Spray-/Aerosol- und Trinkwasserverabreichung betreffend kann dem "Compendium, Administration of Poultry Vaccines" entnommen werden, das von dem Gesundheitsdienst von Pluimvee, Doorn, Niederlande, von Eck et al., VI-VII, 1988 herausgegeben wurde.

Alternative Verfahren zur Verabreichung von Lebendimpfstoffen schliessen eine Verabreichung mittels Augentropfen- und Schnabeleintauchens ein.

In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Impfstoff zur Verfügung gestellt, der das ND-Virus des C2-Stamms in einer inaktivierten Form umfasst. Der Hauptvorteil eines inaktivierten Impfstoffs sind die ausserordentlichen hohen Mengen an schützenden Antikörpern von langer Dauer, die erreicht werden können.

Das Ziel der Inaktivierung der ND-Viren, die nach dem Vermehrungsschritt geerntet werden, ist die Eliminierung der Virusreproduktion. Im allgemeinen kann dies durch chemische oder physikalische Mittel erreicht werden. Chemische Inaktivierung kann durch Behandlung des Virus zum Beispiel mit Enzymen, Formaldehyd, β-Propiolacton, Ethylenimin oder eine Derivat davon bewirkt werden. Falls notwendig, kann die Inaktivierungskomponente später neutralisiert werden. Mit Formaldehyd inaktiviertes Material kann zum Beispiel mit Thiosulphat oder Natriummetabisulfit neutralisiert werden. Physikalische Inaktivierung kann vorzugsweise durchgeführt werden, in dem das Virus energiereicher Strahlung, wie UV-Licht, Röntgenstrahlen oder γ-Strahlung unterzogen wird. Falls erwünscht, kann der pH nach der Behandlung auf einen Wert von 7 zurückgebracht werden.

Ein das inaktivierte Virus enthaltender Impfstoff kann zum Beispiel einen oder mehrere der oben genannten pharmazeutisch annehmbaren, für diesen Zweck geeigneten Trägerstoffe oder Verdünnungsmittel umfassen.

Vorzugsweise umfasst ein erfindungsgemässer inaktivierter Impfstoff eine oder mehrere Verbindungen mit Adjuvans-Aktivität. Für diesen Zweck geeignete Verbindungen schliessen Aluminiumhydroxid, -phosphat oder -oxid, Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl- Emulsionen auf einem Mineralöl basierend wie beispielsweise Bayol F® oder Marcol 52® oder ein Pflanzenöl wie Vitamin E- Acetat und Saponine.

Der erfindungsgemässe Impfstoff umfasst eine wirksame Dosis der NDV C2-Viren als aktive Komponente, d.h. eine Menge an immunisierendem NDV-Material, dass eine Immunität in geimpften Vögeln gegen eine Challenge-Impfung mit einem virulenten Virus. Immunität wird hierin als Induktion eines signifikant höheren Schutzniveaus in einer Vogelpopulation nach der Impfung im Vergleich zu einer ungeimpften Gruppe definiert.

Typischerweise kann der erfindungsgemässe Impfstoff in einer Dosis von 103,0 bis 108,0 infektiöse Embryonaldosen (EID&sub5;&sub0;) pro Tier, vorzugsweise in einer Dosis zwischen 105,0 bis 107,0 EID&sub5;&sub0; verabreicht werden.

Inaktivierte Impfstoffe können das antigene Äquivalent von 104,0 bis 109,0 EID&sub5;&sub0; pro Tier, vorzugsweise zwischen 106,0 bis 108,0 EID&sub5;&sub0; pro Tier enthalten.

Inaktivierte Impfstoffe können parenteral, z.B. intramuskulär oder subkutan verabreicht werden.

Obwohl der erfindunggemässe Impfstoff wirksam in Hühnern angewendet wird, können auch andere Geflügelarten wie Truthähne, Perlhühner und Rebhühner erfolgreich mit dem Impfstoff geimpft werden. Hühner schliessen Fleischhühner, Reproduktionsherden und Legeherden ein.

Aufgrund der milden Eigenschaften des NDV C2-Virus kann der erfindungsgemässe Impfstoff den Vögeln Direkt nach dem Schlüpfen verabreicht werden, d.h. im Alter von einem Tag. Der Impfstoff kann als eine Primärimpfung erfolgen, wenn erwünscht von einer oder mehreren Zweitimpfungen (Booster-Impfungen) mit dem gleichen oder einem verschiedenen Impfstoff. Um das erwünschte Schutzniveau ohne ernste Impfreaktionen zu erreichen, ist der erfindungsgemässe Impfstoff insbesondere zum Einbau in Impfprogramme geeignet, die die aufeinanderfolgende Verwendung von Viren mit fortschreitender Virulenz einschliessen, wie beispielsweise Clone 30®, La Sota, Hitchner B1 oder Programme, die mit der Verabreichung eines milden Lebendvirusimpfstoffs beginnen, gefolgt von der Verabreichung eines inaktivierten Impfstoffs. Als ein Beispiel können Fleischhähnchen im Alter von einem Tag geimpft werden, gefolgt von einer zweiten Immunisierung nach 14 bis 21 Tagen. Lege- oder Reproduktionsherden können nach 1 bis 10 Tagen geimpft werde, gefolgt von Booster-Impfungen nach 26 bis 38 Tagen und 10 bis 12 Wochen.

Die Erfindung schliesst auch Kombinationsimpfstoffe ein, die ausser dem NDV C2-Stamm einen oder mehrere Immunogene umfassen, die von anderen, für Geflügel infektiöse Krankheitserregern stammen.

Vorzugsweise enthält der Kombinationsimpfstoff zusätzlich einen oder mehrere Impfstoffstämme des Infektiösen Bronchitis Virus (IBV), dem Infektiösen Bursa-Krankheitsvirus (IBDV), dem Hühner- Anämie-Agens (CAA) oder einem Reovirus.

Eine ausführliche Beschreibung aller Aspekte der NDV-Impfung und Impfstoffherstellung ist von Allan et al., FAO Animal Production and Health Series No. 10, FAO, Rom, 1978; Cross G.M. in D.J. Alexander (Hrsg), Newcastle Disease, 333-346, Kluwer Akad. Publ., Boston, 1988 und Meulemans, in D.J Alexander (Hrsg.) supra 318-332.

Beispiel 1 Sicherheit des NDV C2-Impfstoffs

1.1. Der Vergleich bezüglich der Atemwegsreaktionen auf die lentogenen Stämme Hitchner B1 und C2 wurde unter standardisierten Bedingungen durchgeführt (von Eck, J.H.H. et al., Avian Pathology 20, 497-507, 1991), die auf dem Körpergewicht, der Mortalitätsrate und der Empfänglichkeit für eine Colibazillose basieren, die auf der Aerosol-Verabreichung des Impfstoffs und anschliessender intratrachealer Inokulation von virulenten E. coli- Bazillen (Stamm 506; O780K80).

Experimentelles Vorgehen

Die respiratorische Reaktion von SPF-WL-Hennen auf den NDV Hitchner B1-Stamm wurde mit der respiratorischen Reaktion auf den NDV C2-Stamm verglichen.

Tag 0: Schlüpfen der Hühner: SPF-WL Hühner (Intervet, Boxmeer). In dem Experiment wurden nur Hennen verwendet.

Tag 1: Die Vögel wurden einzeln gewogen. Drei Gruppen, deren durchschnittliches Körpergewicht sich nicht signifikant unterschied, wurden gebildet. Jede Gruppe bestand aus 30 bis 34 Hühnern. Die Gruppengrösse, bezüglich nichtspezifischer Mortalität ist in Tabelle 1 dargestellt. Zwei Gruppen von Hühnern wurden einem standardisierten Aerosol eines der NDV-Stämme ausgesetzt, während die dritte Gruppe ein Aerosol aus Pepton (Placebo-Gruppe) erhielt. Sofort nach deren Aerosol-Aussetzung wurden die Gruppen getrennt in gleichen Negativ-Druck-Isolatoren untergebracht.

Tag 8: Die überlebenden Vögel wurden einzeln gewogen. Anschliessend wurden Hühner intratracheal mit virulenten E. coli-Bakterien inokuliert.

Tag 15: Die überlebenden Vögel aller Gruppen wurden nochmals einzeln gewogen, getötet und die Coli-Bazillus-Läsionen bewertet.

Die Hühner wurden täglich angeschaut und eine makroskopische Untersuchen an allen toten Hühnern durchgeführt. Besondere Aufmerksamkeit galt dem Respirationstrakt und Läsionen, die Coli- Bazillen zurückzuführen waren. Coli-Bazillus-Läsionen wurden in den folgenden Organen festgestellt. Im thorakalen Luftsack, Perikard und in der Leber. Die maximale Bewertung pro Vogel betrug 12. Bewertungen geringerer Läsionen wurden pro Gruppe kalkuliert.

Der Impfstoffreaktionsindex (VRI) basiert auf dem durch die Impfung verursachten Gewichtsverlust. Der VRI bewegt sich im Bereich von 0 bis VRIs wurden über die Zeiträume von Tag 1 bis 8 (VRI 1) und Tag 1 bis 15 (VRI 2) kalkuliert. VRI 1 stellt die eine Wachstumsunterdrückung und Mortalität induzierende Potenz des Impfstoffs dar, während VRI 2 darüberhinaus die erhöhte Anfälligkeit auf Coli-Bazillose reflektiert.

Ergebnisse Klinische Untersuchung

Weder die Hühner der Pepton-Gruppe zeigten während der ersten 8 Tage des Experiments klinische Krankheitszeichen, noch die Vögel, die mit NDV C2 geimpft wurde. Bei den Vögeln, die dem NDV Hitchner B1-Impfstoff ausgesetzt wurden, wurde zwei oder drei Tage nach der Aussetzung eine ausserordentlich ernste Reaktion des Respirationssystems beobachte. Alle Vögel zeigten Atmen mit offenem Mund, das in Luftschnappen mit ausgestrecktem Hals wechselte.

Zwei Tage nach der Inokulation mit E. coli wurde in den überlebenden Vögeln, die mit NDV Hitchner B1 geimpft worden waren, pumpendes Atmen beobachte. In der Gruppe, die dem NDV C2-Stamm ausgesetzt worden war, zeigten nur wenige Vögel milde respiratorische Zeichen nach der E. coli-Inokulation.

Mortalität, Körpergewicht und Anzahl der Läsionen

Die spezifische Mortalität, das Körpergewicht und Anzahl der Läsionen sind in Tabelle 1 dargestellt. In der mit dem Hitchner B1-Stamm geimpften Gruppe starben 63% der Vögel in den ersten 8 Tagen nach Aerosol-Aussetzung und 91% der verbliebenen Vögel starben nach der intratrachealen Inokulation mit E. coli, während keiner der Vögel in der mit dem NDV C2-Stamm inokulierten Vögel und der Pepton-Gruppe starb.

In der mit dem NDV-Hitchner B1-Stamm geimpften Gruppe wurden negative Effekte bezüglich des Körpergewichts sowohl im Alter von 8 als auch von 15 Tagen beobachtet und die mittlere Anzahl der Läsionen und der Prozentsatz der Hühner mit Coli-Bazillus- Läsionen wurden beobachte, obwohl nur noch ein überlebendes Huhn im Alter von 15 Tagen untersucht werden konnte.

Die NDV C2-Impfung hatte keine oder fast keine Wirkung auf das Körpergewicht im Alter von 8 Tagen als auch im Alter von 15 Tagen, noch zeigten sie Anzeichen und Ernsthaftigkeit von E. coli- Bazillus-Läsionen.

Impfstoffreaktionsindex

Die VR-Indices sind in Tabelle 2 dargestellt. In den mit NDV C2 geimpften Gruppen waren sowohl der VRI 1 als auch der VRI 2 sehr niedrig.

Auf der anderen Seite waren der VRI 1 und der VRI 2 der mit Hitchner B1 geimpften Gruppe extrem hoch.

Der NDV C2-Stamm ist bezüglich Reaktionen des Respirationstraktes als sicher anzusehen. Selbst in Hühnern, in denen der NDV Hitchner B1-Stamm ernste respiratorische Zustände und eine hohe Suszeptibilität auf Coli-Bazillose verursachte, induzierte der NDV C2-Stamm so gut wie überhaupt keine gegenteilige Reaktion.

Tabelle 1: Impfstoffreaktion und Seroresponse von 1 Tag alten SPF-WL Hühnern, die Aerosolen¹ lebender Newcastle Virus- Stämmen ausgesetzt wurden und im Alter von 8 Tagen intratracheal mit dem E. coli-Stamm 506² inokuliert wurden.

1 = Zeit der Aussetzung = 30 Minuten

2 = E. coli-Dosis: 10&sup4; Bazillen in 0,2 ml Phosphat gepufferter Salzlösung pro Huhn

3 = S.A. = Standardabweichung

4 = Coli-Bazillus-Läsionen, die sich auf lebende Hühner beziehen

5 = mittlerer Log2 Haemagglutinationsinhibitionstiter gegen das Newcastle Disease Virus

6 = Placebo-Gruppe: im Alter von einem Tag einem Peptonaerosol ausgesetzt und intratracheal mit dem E. coli-Stamm 506 im Alter von 8 Tagen inokuliert

7 = Wert von nur einem Huhn genommen

Tabelle 2:

Beispiel 2: Virusidentifikation 2.1: Elutionszeit

Die Fähigkeit von NDV rote Blutkörperchen zu agglutinieren (RCBs), ist auf die Bindung des HN-Proteins an Rezeptoren auf der Oberfläche der RBCs zurückzuführen. Das Enzym Neuraminidase ist ebenfalls Teil des HN-Moleküls und ist bei allen Mitgliedern des Paramyxovirusgenus vertreten. Die Elutionsrate von Hühner- RBCs, die durch NDV agglutiniert wurden, ist eine Verfahren, das zur breiten Gruppierung von NDV-Isolaten als schnelle oder langsame "Ablöser" angewendet wurde (Spalatin, J. et al., Avian Diseases 14, 542-549, 1970).

Die Elutionsrate von Hühner-RCBs, die entweder durch den Hitchner B1-Stamm., den NDV C2-Stamm oder den CaTs-Stamm agglutiniert worden waren, wurde bestimmt. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:

Tabelle 3: RBC-Elution Virus Elutionsrate (in Stunden)

Hitchner B1 < 7 schneller Ablöser

CaTs < 7 schneller Ablöser

NDW > 24 langsamer Ablöser

C2 > 24 langsamer Ablöser

2.2. Reaktion mit monoklonalen Antikörpern

Monoklonale Antikörper sind gewöhnlich gegen sehr kleine Bereiche (als Epitope bezeichnet) auf einem Antigen gerichtet und daher hochspezifisch. Diese Spezifität kann genutzt werden, um Ähnlichkeiten oder Unterschiede zwischen Viren zu zeigen, die auf deren Fähigkeit mit dem Antikörper zu reagieren, basieren. Die Reaktionsfähigkeit eines gut charakterisierten monoklonalen Antikörpers von NDV AVS-1 mit verschiedenen NDV-Stämmen wurde unter Anwendung des Haemagglutinationsinhibitionstest evaluiert. Der HI-Test wurde in Mikrotiterplatten unter Verwendung von 8 HAUs pro Vertiefung gemäss Standardverfahren durchgeführt. Srinivasappa et al. haben in Avian Diseases 30: 526-567, 1986, für den monoklonalen Antikörper AVS-1 gezeigt, dass dieser im HI-Test ganz spezifisch und sehr stark mit den kommerziellen Impfstämmen Hitchner B1 und La Sota reagiert.

Tabelle 4: HI-Tests

* Die Ergebnisse stellen Wiederholungstetsts dar und sind als log2 ausgedrückt.

Von den Tabellen 3 und 4 kann der Schluss gezogen werde, dass der NDV C2-Stamm andere Eigenschaften als der CaTs-, der Hitchner B1- und der NDW-Stamm haben.

Beispiel 3 Wirksamkeit des NDV C2-Impfstoffs

NDV C2-Virus wurde verdünnt, so dass er ungefähr 3-4 log EID50 Virus pro 0,1 ml enthielt und wurde in 200 10 bis 12 Tage alte SPF-Embryonen inokuliert. Vier Tage nach der Infektion wurden die Embryos durchleuchtet und alle lebenden Embryos wurden 2 Stunden bei 4ºC inkubiert. Dann wurde die Allantoisflüssigkeit geerntet. Insgesamt wurden 1340 ml Allantoisflüssigkeit mit 660 ml eines Stabilisators gemischt. Dies wurde 15 Minuten gemischt und in 10 ml fassende Glassgefässe, 2 ml pro Gefäss gegeben. Die Gefässe wurden dann den gefriergetrocknet.

Um die Immunogenität des Impfstoffs zu bestimmen, wurde eine Augentropfen (A) und eine Sprayimmunisierung (B) unter Verwendung von einem Tage alten SPF-Hühnern durchgeführt. Siehe Tabelle 5 und 7 bezüglich des Impf- und Impfwiederholungsprotokolls. Der virulente NDV-Stamm Texas-GB wurde für einen Challenge 28 Tage nach der Impfung verwendet. Alle Hühner wurden auf Anzeichen einer NDV-Infektion hin beobachtet. Solche Anzeichnen schliessen nervöses Zittern, Lähmung oder Tod ein. Alle Hühner, die ein oder mehrere dieser Anzeichen zeigten, wurden als nicht geschützt betrachtet. A. Wirksamkeit der Augentropfen-Impfung

Tabelle 5: Impfungs- und Challengeprotokoll
Tabelle 6: Challenge-Ergebnisse
B. Wirksamkeit der Sprayimpfung
Tabelle 7: Impf- und Challengeprotokoll
Tabelle 8: Challenge-Ergebnisse

Von den mit NDV C2 geimpften Hühnern zeigte keines (Augentropfenimpfung) oder nur eines von 32 Hühnern (Sprayinfektion) Zeichen einer Texas-GB-Infektion. Alle der nicht-infizierten Kontrollhühner zeigten Anzeichen einer Texas-GB-Infektion.


Anspruch[de]

1. Virus des NDV C2-Stammes, der am CNCM des Institute Pasteur, Paris, Frankreich, unter der Nummer I-1614 hinterlegt ist.

2. Impfstoff zum Schutz von Geflügel vor der Newcastle- Erkrankung, umfassend einen Virus des NDV C2-Stammes, der am CNCM des Institute Pasteur, Paris, Frankreich, unter der Nummer I-1614 hinterlegt ist, sowie einen pharmeuzeutisch annehmbaren Trägerstoff oder ein pharmazeutisch annehmbares Streckmittel.

3. Impfstoff nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Virus in lebendiger Form vorliegt.

4. Impfstoff nach den Ansprüchen 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass er 103,0-108,0 EID&sub5;&sub0; pro Tier umfasst.

5. Impfstoff nach den Ansprüchen 2-4, dadurch gekennzeichnet, dass der Impfstoff zusätzlich einen Impfstoff umfasst, der von einem oder mehreren anderen auf Geflügel übertragbaren Krankheitserregern stammt.

6. Impfstoff nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der andere Krankheitserreger aus der Gruppe, bestehend aus IBV, IBDV, CAA Virus und dem Reovirus, ausgewählt ist.

7. Verfahren zur Herstellung von Viren nach Anspruch 1, die Schritte umfassend:

a. Beimpfen einer empfindlichen Trägersubstanz mit dem Virus,

b. Vermehren des ND Virus und

c. Ernten des NDV enthaltenden Materials

8. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zum Schutz des Geflügels vor der ND, umfassend das Zusammenbringen des geernteten NDV-Materials, welches durch das Verfahren nach Anspruch 7 gewonnenen wird, mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff oder Streckmittel.







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