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Dokumentenidentifikation DE69331322T2 08.08.2002
EP-Veröffentlichungsnummer 0651789
Titel METHODE ZUR VERHINDERUNG VON ZOSTER UND LINDERUNG DER MIT VARICELLEA VERBUNDENEN POSTHERPETISCHEN NEURALGIE
Anmelder Merck & Co., Inc., Rahway, N.J., US
Erfinder CALANDRA, B., Gary, Blue Bell, US;
PROVOST, J., Philip, Lansdale, US;
LEVIN, J., Myron, Danver, US;
WHITE, C. Jo, Gwynedd, US
Vertreter Abitz & Partner, 81679 München
DE-Aktenzeichen 69331322
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 13.07.1993
EP-Aktenzeichen 939171500
WO-Anmeldetag 13.07.1993
PCT-Aktenzeichen PCT/US93/06581
WO-Veröffentlichungsnummer 0009402596
WO-Veröffentlichungsdatum 03.02.1994
EP-Offenlegungsdatum 10.05.1995
EP date of grant 12.12.2001
Veröffentlichungstag im Patentblatt 08.08.2002
IPC-Hauptklasse C12N 7/02
IPC-Nebenklasse C12N 7/04   C12N 7/06   C12N 7/08   C12P 21/02   A61K 39/25   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Post-Herpes-Neuralgie ist die vorherrschende Krankheit, die mit der Entwicklung von Herpes zoster, auch als Gürtelrose bekannt, assoziiert ist. Die Neuralgie dauert typischerweise ein bis sechs Monate und ist oft äußerst schmerzvoll.

In den letzten Jahren häuften sich Befunde, welche zeigen, daß Herpes zoster durch die Reaktivierung von latentem Varicella-Virus verursacht wird [Straus et al., Ann. Int. Med. (1988); 108, 221-237; Hyman et al., Lancet (1983); 2, 814-816; Gilden et al., Nature (1983); 306, 478-80; Croen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988); 85, 9773-9777; Mahalingham et al., New Eng. J. Med. (1990); 323, 627-631]. Die ursprüngliche Varicella-Infektion kann als Ergebnis von Windpocken in der Kindheit oder als Ergebnis einer Immunisierung mit einem Lebendvakzin von abgeschwächtem Varicella-Zoster-Virus zur Verhütung von Windpocken stattgefunden haben. In jedem Fall scheint das Virus im System des infizierten Individuums lang nach den Windpocken oder der Impfung zu verbleiben. Es scheint, daß der Ort der VZV-Latenz Nervenzellen in Spinalganglien sind.

Jahre nachdem VZV latent wurde, reaktiviert sich das Virus durch einen noch schlecht verstandenen Mechanismus. Nichtsdestoweniger führt die Reaktivierung von VZV und dessen anschließende Replikation zu Herpes zoster. Im Verlauf dieser Reaktivierung von VZV und im Anschluß daran entwickelt sich schwere Post-Herpes-Neuralgie.

Zahlreiche Berichte in der Literatur legten nahe, daß es eine Korrelation zwischen verringerter Immunkompetenz und Reaktivierung von Herpes zoster aus seinem latenten Zustand geben könnte. Vorschläge hinsichtlich des Mechanismus, durch den die Reaktivierung stattfindet, umfassen eine verringerte Immunität auf Zellbasis, wie z. B. die Verringerung der Anzahl der einen CD4&spplus;-Rezeptor tragenden Blut-T-Lymphozyten, welche für die Erkennung von Nicht-Selbst-Antigenen, die von MHC-Typ-II-Molekülen nach Phagozytose von VZV präsentiert werden, verantwortlich sind. Alternativ wurden auch die verringerten Niveaus von CD8&spplus;-T-Lymphozyten, verantwortlich für die Abtötung von Zellen, in denen MHC-Typ-I- Moleküle Nicht-Selbst-Antigene erkennen und präsentieren, als möglicher Mechanismus, der die VZV-Reaktivierung erlaubt, vorgeschlagen. Neumeyer et al. [N. E. J. Med., S. 1456, 29. Mai 1986) stellten eine Abnahme des Verhältnisses von CD4&spplus;/CD8&spplus; vor Zoster und eine anschließende Erhöhung des Verhältnisses nach Ende des klinischen Syndroms fest.

In einer Studie wurde ein Varicella-Vakzin älteren Versuchspersonen in einem Versuch verabreicht, deren CMI-Reaktionen auf VZV zu stimulieren. Die VZV-Immunisierung dieser seropositiven Personen wurde aufgrund der zuvor beschriebenen altersbezogenen Abnahme der VZV-spezifischen CMI [Miller AE, Neuroloqy (1980); 30, 582-587; Berger R, Florent G, Just M, Infect. Immun. (1981); 32, 24-27; Burke BL, Steele, RW, Beard OW, Arch. Intern. Med. (1982); 142, 291-293] und der Möglichkeit, daß die altersbezogene Reaktivierung von VZV (als Herpes zoster) eine Folge dieser Abnahme ist, unternommen. Dieses abgeschwächte Lebendvakzin wurde gut toleriert; es traten keine schwerwiegenden lokalen oder systemischen Reaktionen auf und die milden Reaktionen waren nicht sehr häufig. Eine systemische Ausbreitung des Vakzin-Virus, wie durch minimalen Hautausschlag manifestiert, trat gelegentlich auf (möglicherweise in 6/245 Injektionen). Obwohl dies von theoretischer Bedeutung bei älteren Patienten mit einer dokumentierten Verringerung spezifischer zellvermittelter Immunität ist, erwiesen sich die resultierenden Läsionen und Symptome als von keiner klinischen Bedeutung. Dies stimmt mit in Erzählungen wiedergegebenen Beobachtungen überein, daß seropositive Großeltern nach Exposition gegenüber Enkeln mit Varicella nicht infiziert sind.

Die Defizite bei der VZV-spezifischen Immunität bei älteren Personen treten im Kontext von allgemein verringerten CMI-Reaktionen auf. Diese werden in Assays von verzögerten Haut- Überempfindlichkeitsreaktionen [Goodwin JS, et al., Clin. Exp. Immunol. (1982); 48, 403- 410] und in in vitro-Proliferationsreaktionen von durch Mitogene stimulierten T-Lymphozyten [Hayward AR, et al., J. Clin. Immunol. (1987); 7, 174-178; Tice RR, et al., J. Exp. Med. (1979); 149, 1029-1041; Murasko DM, et al., Am. J. Med. (1986); 81, 612-618] nachgewiesen. Die meisten Studien dokumentieren eine normale T-Zellzahl, es gibt jedoch eine Abnahme der CD4&spplus;-Zellen [Nagel Je, et al., J. Immunol. (1981); 127, 2086-2088; Thompson JS, et al., J. Am. Gemate Soc. (1984); 32, 274-281]. Die Anzahl und Funktion der natürlichen Killerzellen sind bei diesen Patienten normal [Hayward AR, Herberger M, J. Clin. Immunol. (1987); 7, 174-178; Nagel Je, et al., J. Immunol. (1981); 127, 2086-2088]. Eine erhöhte Zellzykluszeit, wie in der Studie von Tice et al. postuliert, wäre eine mögliche Erklärung für den Verlust von CMI mit dem Alter [Tice RR, et al., J Exp. Med. (1979); 149, 1029-1041]. Jedoch favorisieren nachfolgende Studien keine Veränderung des Zellzyklus oder irgendeine Verringerung im Ausmaß der klonalen Expansion nach Antigenstimulation [Staiano- Coico L, et al., J. Immunol. (1984); 132, 1788-1792; Sohnie PG, et af., Clin. Exp. Immunol. (1982); 47, 138-146]. Stattdessen zeigen DNA-Analysen eine erhöhte Häufigkeit von DNA- Schäden, Schwesterchromatid-Austauschen und Zellverlust in mitogen-stimulierten Zellen von älteren Personen [Dutkowski RT, et al., Mutat. Res. (1985); 149, 505-512]. Verringerte Proliferationsreaktionen auf Mitogene sind nicht notwendigerweise von reduzierter IL2- oder IL2R-Synthese begleitet [Dutkowski RT, et al., Mutat. Res. (1985); 149, 505-512]. Der am stärksten übereinstimmende Defekt, der von Chopra et al. gefunden wurde, war eine erhöhte γ-Interferon-Produktion und ein verringertes Überleben von stimulierten Zellen, was die Verwendung eines Boosters stützt [Chopra RK, et al., Clin. Immunol. Immunopathol. (1989); 53, 297-308].

Andere Studien bei einer Population im vorgerückten Alter zeigten, daß die verringerte VZVspezifische Immunität, welche das erhöhte Auftreten von HZ bei älteren Personen begleitet, mindestens teilweise durch eine verringerte Häufigkeil von VZV-spezifischen CD4+-Zellen im Blut erklärt wird. Diese Patienten haben jedoch normale T-Zellzahlen und ihre NK- Zellaktivität wird als Reaktion auf VZV-Antigen aufrechterhalten, vorausgesetzt, daß ausreichend IL2 vorhanden ist [Hayward AR, et al., J Clin. Immunol. (1987); 7, 174-178]. Die Häufigkeit von T-Zellen, welche den Gedächtniszell-Phänotyp (CD45RO) exprimieren, nimmt mit dem Alter von einem Mittel von 43 + 17% mit 28 Jahren auf 65 + 14% mit 70 Jahren zu, so daß die Abnahme der VZV-spezifischen Immunität mit dem Alter nicht auf einen selektiven Verlust dieser Untergruppe zurückzuführen ist. CD45RO&spplus;-Zellen bilden mehr γ-Interferon als CD45RA&supmin;-Zellen, was mit den Ergebnissen von Chopra und Mitarbeitern korreliert.

Was immer der Mechanismus der Kontrolle oder Reaktivierung von Zoster ist, kein medizinischer Befund hat effektiv eine Verhinderung der Reaktivierung von Herpes zoster (Gürtelrose) oder Verringerung der Post-Herpes-Neuralgie demonstriert. Chemotherapeutische Mittel als Klasse waren bei der Behandlung dieses schmerzhaften Zustands äußerst unbefriedigend [Watson, C. P. N., Neurol. Clin., 7, 231-248 (1989); Straus et al., Ann. Int. Med. 108, 221-237 (1988)].

Starr et al., 'Immunization of healthy seropositive middle aged and elderly adults with varicella-zoster virus (VZV) vaccine' in "Programs and Abstracts of the Twenty-Seventh Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy", New York, NY, 4.-7. Oktober 1987, Seite 313, maßen eine Erhöhung des Niveaus von Antikörpern gegen VZV bis zu vier Monate nach der Impfung. Es gibt keine Offenbarung oder Erkenntnis, daß dies eine Verringung des Auftretens oder der Schwere von Post-Herpes-Neuralgie voraussagen könnte.

Hayward et al., J. Infectious Diseases, 163, 1991, 873-875, offenbaren die Messung von Antikörperniveaus und T-Zellreaktionen nach einer Impfung. Sie stellen fest, daß diese Messungen nicht mit einer Verringerung der Schwere oder des Auftretens von Post-Herpes- Neuralgie gleichzusetzen sind.

Diese Erfindung ist ein Verfahren zur Verringerung von Post-Herpes-Neuralgie und zur Verminderung oder Eliminierung einer Herpes-Zoster-Reaktivierung. Die Wirksamkeit des Verfahrens wird durch in vivo erhaltene positive Resultate demonstriert, bei denen das Niveau der VZV-spezifischen Lymphozyten zunimmt. Diese Erhöhung der Häufigkeit von Responderzellen (RZH), induziert durch Immunisierung gemäß dem Verfahren dieser Erfindung, ergibt einen Immunstatus in vivo, welcher den Krankheitszustand, einschließlich VZV-Reaktivierung und Post-Herpes-Neuralgie, widerspiegelt. Eine klinische Langzeituntersuchung auf breiter Basis an mehreren Zentren, bei der Risikopersonen lebendes abgeschwächtes oder abgetötetes VZV verabreicht wird, zeigt, daß eine Immunisierung gemäß dieser Erfindung zu einem signifikanten Schutz gegenüber VZV-Reaktivierung führt, oder, falls eine Reaktivierung eintritt, zu einer signifikanten Verringerung der Dauer oder Schwere der Post-Herpes-Neuralgie.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es wird ein Verfahren zur Linderung der Post-Herpes-Neuralgie und zur Verminderung oder Eliminierung einer Herpes-Zoster-Reaktivierung bei Risikopersonen beschrieben, bei dem eine VZV-Antigen-Stimulierung eingesetzt wird. Das VZV-Antigen ist ein lebendes abgeschwächtes VZV-Virus oder ein abgetötetes vollständiges VZV-Virus.

Risikopersonen sind diejenigen, welche Varicella (Windpocken), auch nur in subklinischer Form, hatten oder einem Varicella-Lebendvakzin ausgesetzt waren. Ein besonderes Risiko weisen ältere oder immungeschwächte Personen auf. Der Risikostatus kann durch positive Anti-VZV-Serumantikörper oder eine positive Reaktion auf einen VZV-Antigen-Hauttest bestätigt werden. Ein besonderes Indiz eines Risikostatus ist eine VZV-Responderzellhäufigkeit von weniger als 1 Responderzelle auf 68.000, während man einem geschützten Zustand nahekommt, wenn die RZH näher bei 1 Responderzelle auf 40.000 liegt.

Risikopersonen wird das VZV-Antigen in einer immunologisch wirksamen Menge verabreicht und sie werden hinsichtlich einer Rückkehr zum Risikostatus überprüft, zu welchem Zeitpunkt eine weitere Immunisierung vorgenommen werden kann.

Die Wirksamkeit des Verfahrens wird demonstriert durch positive Ergebnisse, die in einer klinischen Langzeituntersuchung auf breiter Basis an mehreren Zentren erhalten wurden.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

In dem Verfahren dieser Erfindung wird eine Person, die ein Risiko zur Entwicklung von Herpes zoster aufweist, mit einem VZV-Antigen immunisiert, um die Erhöhung von Anti- VZV-Immunreaktionen zu induzieren. Diese Immunisierung verringert die Schwere einer mit einer VZV-Reaktivierung assoziierten Post-Herpes-Neuralgie und verringert oder verhindert das Reaktivierungsereignis selbst.

Somit stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Varicella-Zoster-Virus (VZV) zur Herstellung eines Vakzins zur Immunisierung einer Person eines Alters von mehr als fünfzig, welche Varicella oder einem Varicella-Lebendvakzin ausgesetzt war, zur Verringerung von Post-Herpes-Neuralgie und zur Verminderung oder Eliminierung einer Herpes-Zoster-Reaktivierung bereit.

Vorzugsweise dient das Vakzin zur Verringerung der Dauer oder Schwere von Post-Herpes- Neuralgie.

Vorzugsweise ist das VZV der abgeschwächte Oka-Stamm.

Vorzugsweise erfolgt die Immunisierung subkutan. Vorzugsweise werden mindestens 1.000 plaquebildende Einheiten (PFU) zur Immunisierung eingesetzt.

Vorzugsweise ist der abgeschwächte Oka-Stamm des Varicella-Zoster-Virus vor der Immunisierung in einem lyophilisierten Zustand gelagert. Noch bevorzugter wird er vor der Immunisierung mit destilliertem Wasser aus dem lyophilisierten Zustand rekonstituiert.

Eine Risikoperson schließen jede Person über fünfzig ein, welche Windpocken, auch von subklinischer Schwere, erlebt hat, und jede, die eine Impfung mit lebendem Varicella- Zoster-Virus erhalten hat. Diejenigen aus dieser Klasse, welche ein besonderes Risiko aufweisen, sind Leute, welche aus diesem oder jenem Grunde immungeschwächt sind. Dies kann auf die Entwicklung einer erworbenen Immunschwächeerkrankung (z. B. AIDS, ARC) oder auf eine Chemotherapie oder andere immunsuppressive Therapie (z. B. Transplantatabstoßungs-Immunsuppression) zurückzuführen sein. Darüber hinaus nimmt das Auftreten von Zoster mit dem Alter zu. Bei Risikopersonen über 50 ist die Häufigkeit 2,5-5,0 Fälle/- 1000 Personen/Jahr. Im Alter von 80 steigt die Häufigkeit auf 5-10 Fälle/1000 Personen/- Jahr. Dieses erhöhte Risiko korreliert mit abnehmender zellvermittelter Immunität gegenüber VZV.

Zur Feststellung, ob jemand eine Risikoperson ist, ohne sich auf persönliche Akten oder die Erinnerung zu stützen, kann ein einfacher Hauttest wie im folgenden Beispielsabschnitt beschrieben durchgeführt werden. Ein weiteres Verfahren zur Feststellung eines Risikostatus beinhaltet eine serologische Beurteilung, beispielsweise durch einen Anti-VZV- Antikörper-ELISA-Assay. Ein noch weiteres Verfahren ist die Messung der VZV-spezifischen Responderzellhäufigkeit (RZH) und falls sie als etwa 1 auf 68.000 befunden wird, weist die Person mutmaßlich ein Risiko auf. Für die Zwecke dieser Erfindung kann jedoch jede beliebige Person in der Population als risikobehaftet betrachtet werden, nachdem es keine bekannten Nebenwirkungen irgendwelcher Bedeutung gibt, die mit einer erfindungsgemäßen breiten Immunisierung verbunden sind, vorausgesetzt, daß schwer immungeschwächte Personen, wie z. B. diejenigen, welche mit dem Human-Immunschwäche-Virus (HIV) infiziert sind oder ein erworbenes Immunschwächesyndrom (AIDS) im Vollbild aufweisen, nicht mit einem lebenden VZV-Antigen immunisiert werden.

Das VZV-Antigen kann ein lebendes abgeschwächtes VZV sein, das nach dem in US- Patent 3,985,615 (Takahashi) offenbarten Verfahren oder wie in den folgenden Beispielen offenbart hergestellt wurde. Die Lebensfähigkeit von lebendem abgeschwächtem Varicella kann in irgendeiner von einer Reihe bekannter Stabilisierungsformulierungen aufrechterhalten werden. Das abgeschwächte Oka-VZV ist bei der ATCC (Hinterlegungsnummer VR- 795) hinterlegt und ist auch im Handel als VARIVAX® von Merck & Co., Inc., vertrieben, im Handel erhältlich. Andere Stämme von VZV können eingesetzt werden, falls sie ausreichend abgeschwächt sind, um keine natürliche Erkrankung bei Personen zu verursachen, welche sich zum ersten Mal einer Impfung unterziehen mögen, oder können zur Produktion von Tod- oder Untereinheits-VZV-Antigenen eingesetzt werden.

Das VZV-Antigen kann ein inaktiviertes Virus sein. Dieses Material kann einfach nach einem so wenig subtilen Verfahren wie der Erhitzung eines Aliquots von lebendem VZV und Überprüfung der Anzahl der restlichen plaquebildenden Einheiten (PFU) durch einen geeigneten Assay hergestellt werden oder kann durch verfeinertere Techniken, wie z. B. Gammabestrahlung für bekannte Zeitspannen und Intensität, inaktiviert werden. Ein abgetötetes vollständiges Virus ist in der vorliegenden Erfindung als ebenso wirksam wie ein lebendes VZV nachweisbar und kann auf irgendeine geeignete Weise hergestellt werden, so lange die VZV-Antigen-Integrität aufrechterhalten wird. Die Erhöhungen der Anti- VZV-Responderzellhäufigkeiten sind gleich, wenn hitze-abgetötetes VZV in einer Dosis von etwa 10 ug oder mehr eingesetzt wird oder wenn etwa 1000 PFU von lebendem Virus verabreicht werden. Die Verwendung eines abgetöteten vollständigen VZV ist bevorzugt, insbesondere wenn der Empfänger stark immungeschwächt ist.

Bei dem Verfahren dieser Erfindung sind, welches Antigen auch immer gewählt wird, lebendes abgeschwächtes VZV oder inaktiviertes Virus, die folgenden Anzeichen einer immunologisch wirksamen Dosis und Wirksamkeit des Verfahrens von Nutzen:

1. Erhöhung der VZV-spezifischen Responderzellhäufigkeit um etwa 30% (RZH, siehe Beispiel unten).

2. Erhöhung der zytotoxischen Anti-VZV-T-Zellen (CTL), wie gemessen durch eine Erhöhung der VZV-spezifischen CD8&spplus;-Zellen (Killerzellen, siehe Beispiel unten).

3. Erhöhung der Anti-VZV-Helfer-T-Zellen, wie gemessen durch eine Erhöhung der VZV-spezifischen CD4+-Zellen (siehe Beispiel unten).

4. Erhöhung des Niveaus an Anti-VZV-spezifischen Antikörpern.

5. Erhöhung des Niveaus an Lymphokinen, wie z. B. Interferon oder Interleukin.

6. Verringerung der Dauer oder Schwere von Post-Herpes-Neuralgie bei einem Individuum für einen Zeitraum von weniger als einen Monat nach Entwicklung von Zoster.

7. Verringerung des Auftretens von Zoster auf ein statistisches Niveau, unterhalb des bei der allgemeinen Population von Individuen, die ein ähnliches Risiko aufweisen, festgestellten Auftretens.

Es gibt kein allgemein akzeptiertes in vitro-Verfahren zur quantitativen Bestimmung von zellvermittelten Immunreaktionen beim Menschen. Wir wählten Grenzverdünnungskulturen mit RZH-Analyse für diese Studie, da wir erwarteten, daß diese Vorgehensweise genauer als eine SI-Messung sein würde. Beide Analyseverfahren zeigten eine signifikante Stimulation der VZV-spezifischen Immunität nach der Immunisierung. Unsere Bevorzugung der RZH-Ergebnisse basiert auf der Beobachtung niedrigerer Standardabweichungen vom Mittel bei diesen Ergebnissen im Vergleich zu den SI-Ergebnissen. Dies könnte teilweise die Tatsache reflektieren, daß 196 Gewebekulturmulden analysiert werden, um eine RZH- Schätzung zu erhalten, im Vergleich zu den 6-8 Kulturmulden, die im allgemeinen zur Berechnung des SI-Werts eingesetzt werden. Nichtsdestoweniger können die Grenzverdünnungskulturen, die wir einsetzten, nur eine indirekte Abschätzung der Häufigkeit von Respondern ergeben. Der bei dieser Studie verwendete Nenner ist die Anzahl der aus einem Ficoll-Gradienten gewonnenen Zellen; von diesen gehört nur ein Viertel zu der CD4&spplus;- CD45RO&spplus;-Population, welche der Gedächtnis-Phänotyp ist, von dem die VZV-spezifisch reagierenden T-Zellen genommen werden [Beverly PCL, Curr. Top. Microbiol. Immunol.

(1990); 159, 111-112; Hayward A, Giller R, Levin M, Viral Immunol. (1989); 2, 175]. Es ist deshalb wahrscheinlich, daß unsere RZH-Abschätzung die Reaktion auf die Impfung unterschätzt. Nichtsdestoweniger ist der nach der Impfung erhaltene mittlere RZH-Wert (1/40.000) von derselben Größenordnung wie der nach HZ erreichte [Hayward A, Kevin M, Wolf W, Angelova G., J. Infect. Dis. (1991); 163, 873-875], wobei der Eintrag von endogen produziertem VZV-Antigen wahrscheinlich groß ist. Dieses nach Impfung erreichte Immunitätsniveau ist auch vergleichbar mit demjenigen von Personen eines Alters von 35 bis 45 Jahren ohne Symptome. Die Stimulation der Immunreaktion bei der vorliegenden Studie wurde 24 Monate lang mit einer vorausgesagten Halbwertszeit von 56 Monaten aufrechterhalten und war keine Funktion des Alters. Diese letztere Eigenschaft ist von Bedeutung, da die ältesten Personen am wahrscheinlichsten HZ entwickeln werden und dadurch die Hauptziele einer präventiven Vakzinstrategie wären.

Die RZH-Reaktion nach der Impfung korrelierte nicht mit der gegebenen Vakzindosis, die von 1.000-12.000 PFU variierte. Darüber hinaus wird die Anzahl der reagierenden Versuchspersonen durch die Gabe höherer Vakzindosen nicht erhöht. Dies könnten Hinweise auf eine Replikation des Vakzin-Virus in den Empfängern darstellen, so daß selbst die geringste verabreichte Dosis zu ausreichend VZV-Antigen für eine maximale Auswirkung auf die RZH führt. Alternativ kann der relativ große VZV-Antigengehalt der niedrigeren Dosen (1.000 PFU enthalten beispielsweise etwa 2 Einheiten VZV-Antigen) für eine maximale Immunisierung ausreichend sein. Nur γ-Interferon-Reaktionen von kultivierten Zellen korrelierten mit höherer Dosis oder einem geringeren Alter.

Die VZV-Vakzin-Wirkungen auf VZV-Antikörper waren von geringerer Größe und kürzerer Dauer als die Auswirkungen auf CMI. Dies ist wahrscheinlich für das Langzeitziel der Verhütung von HZ nicht kritisch, nachdem die Titer bekanntermaßen in 1 bis 2 Jahren nach HZ auf Grundlinienniveaus abnehmen (Hayward A, Kevin M, Wolf W, Angelova G, J. Infect. Dis. (1991); 163, 873-875] und die VZV-Antikörperniveaus nicht signifikant mit dem Alter abnehmen [Miller AE, Neurology. (1980); 30, 582-587; Gershon AA, Steinberg SP, Am. J. Med. Sci. (1981); 282 l, 12-17]. Die mittleren Vor-Vakzin-VZV-Antikörperniveaus in unseren Versuchspersonen der Studie, wie durch ELISA gemessen, waren vergleichbar mit denjenigen viel jüngerer erwachsener Kontrollen.

Die Post-Vakzin-Beurteilung der Immunreaktion beinhaltete eine Messung der γ-Interferonfreisetzung durch MNC, die VZV-Antigenen ausgesetzt waren. Diese wurde aufgrund des in vitro-Befunds, daß γ-Interferon durch natürliche Killerzellen sowie durch Antigen-spezifische T-Zellen gebildet wird [Hayward AR, et al., Pediatr. Res. (1986); 20, 398-401], als potentiell unabhängige Variable beurteilt. Natürliche Killerzellen und γ-Interferon tragen beide zur Einschränkung der Herpes-Virus-Replikation in vitro bei (Leibson PJ, et al., J. Virol. (1986); 57, 976-982]. Obwohl eine statistisch signifikante Erhöhung von in vitro-γ-Interferon 3 Monate nach der Immunisierung beobachtet wurde, waren die Standardfehler sehr groß. Eine γ-Interferon-Messung ist deshalb kein starkes Indiz für das Ergebnis der VZV- Immunisierung.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern.

BEISPIEL 1 Herstellung von abgeschwächtem VZV-Lebendvakzin A. VZV-Produktion:

Lebendes, abgeschwächtes Varicella-Zoster-Virus kann nach der Offenbarung des US- Patents 3,985,615 oder nach irgendeinem der anderen im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden.

8. Assay für die Bestimmung der VZV-Ausbeute:

Die Infektivitätstiter von Varicella-Zoster-Virus (VZV)-Präparationen wurden unter Anwendung des von Krah et al. [J. Virol. Methods, 1990, 27: 319-326] oder von Takahashi et al. [Postgrad Med. J. 61 (Suppl. 4) 736-741, (1985)] beschriebenen Agarose-Überschichtungs- oder Flüssigkeits-Überschichtungsverfahren abgeschätzt. Der Assay wird folgendermaßen durchgeführt:

MRC-5-Zellen werden in 60-mm-Gewebekulturplatten mit 6 · 105 Zellen in 5-ml-Volumina BME (Basal Medium Eagle mit Hank's ausgewogener Salzlösung) mit 100 mg/l Galactose, 50 ug/ml Neomycin, 2 mM L-Glutamin ausgesät und in einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre bei 35ºC inkubiert. Nach Inkubation für 24-48 Stunden erreichen die Zellen 50-80% Konfluenz. Das Wachstumsmedium wird durch Absaugen entfernt und die Zellen werden mit 100 ul VZV-Lösung, verdünnt in einem geeigneten Virus-Verdünnungsmittel, wie z. B. SPGA-Puffer oder flüssigem Erhaltungsmedium (LMM), infiziert. SPGA-Puffer enthält 7,5% (Gew./Vol.) Sucrose, 11 mM Kaliumphosphat, 0,1% (Gew.Nol.) Natriumglutamat und 1% Humanserumalbumin. Dem Virus wird die Anheftung für ≥1 Stunde bei 35ºC in einer 5%igen CO&sub2;- Atmosphäre gestattet. Die VZV-infizierten Zellkulturen werden dann mit 5 ml Agarose- Überschichtungsmedium (AOM) oder flüssigem Erhaltungsmedium (LMM) überschichtet. Agarose-Überschichtungsmedium ist eine Mischung von zwei Lösungen, flüssigem Überschichtungsmedium (LOM) und Agaroselösung. LOM enthält Minimal Essential Medium mit Earle's Salzen (MEM), 2% hitzeinaktiviertem fötalem Kalbsserum, 50 ug/ml Neomycinsulfat und 2 mM L-Glutamin. Agaroselösung wird hergestellt, indem 4,5 g Agarose niedriger Gelbildungstemperatur in 100 ml MEM für 15 Min. bei 121ºC erhitzt werden und der Lösung gestattet wird, auf 45ºC abzukühlen. AOM wird hergestellt durch Mischen eines Volumens Agaroselösung mit 4 Volumina eines 1,25 · Konzentrats von LOM bei 45ºC. Die Platten werden auf 23-25ºC abgekühlt, um dem AOM die Verfestigung zu gestatten. Die Kulturen werden inkubiert, um die Plaqueentwicklung zu erlauben. Nach 6-7 Tagen werden die Platten, die LOM erhielten, mit 5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) überschichtet und mit einer gläsernen Pasteurpipette eingeritzt, um die Agarose zu lockern und zu entfernen. Medium wird von den Platten, die LMM erhielten, abgesaugt und die Platten werden durch Anfärbung der Zellen mit einer Lösung von 0,2% (Gew./Vol.) Coomassie Blue R-250 in Ethanol-1% Essigsäure sichtbar gemacht. Die Plattenzahlen sind das Mittel von 4-5 Replikat-Platten und als plaquebildende Einheiten pro ml (PFU/ml) ausgedrückt.

BEISPIEL 2 Herstellung eines Vakzins von inaktiviertem VZV

Lebendes VZV, nach dem Verfahren von Beispiel 1 oder irgendeinem anderen Verfahren hergestellt, kann durch Inkubation eines Aliquots des Virus bei etwa 50ºC für etwa 5-15 Tage inaktiviert werden. Alternativ kann lebendes VZV inaktiviert werden durch Exposition gegenüber Gamma-Strahlung oder irgendein anderes Mittel zur Inaktivierung des Virus, solange die antigene Integrität des Virus nicht beeinträchtigt wird.

In einem Versuch wurde lebendes abgeschwächtes CR453 VARIVAX wie folgt inaktiviert:

Hitzeinaktivierungsverfahren: 500 Gefäße von Vakzin Lot CR 453 wurden als unrekonstituierte intakte Gefäße 12 Tage lang in einem Inkubator bei 50ºC erhitzt. Nach der Hitzebehandlung wurden alle 500 erhitzten Gefäße mit auffallenden, unauslöschbaren Dreiecken in roter Tinte in der Mitte eines jeden Gefäßetiketts markiert und bei -20ºC gelagert.

Analyse:

Restgehalt an infektiösem Varicella-Virus in erhitztem Vakzin: Die Bestimmung der Anzahl plaquebildender Einheiten wurde durchgeführt wie in Takahashi et al., Postgrad Med. J. 61 (Suppl. 4) 736-741 (1985), beschrieben. Insgesamt 5 ml rekonstituiertes Material aus 10 Gefäßen von erhitztem Vakzin wurden einem Assay unterworfen. Ein Wert von 2,4 plaquebildenden Einheiten pro ml wurde erhalten. Ein Standard-Assay von nicht erhitztem Vakzin ergab einen Wert von 3830 plaquebildenden Einheiten pro ml.

Varicella-Virus-Antigen gemäß Dot-Blot-Assay: Die Bestimmung der Virusantigenmenge wird durch Dot-Blot-Analyse oder wie in Beispiel 9 unten beschrieben durchgeführt. Das erhitzte Produkt wurde mittels Dot-Blot-Analyse abgeschätzt, 9,8 Einheiten Antigen pro ml zu enthalten. Das nicht erhitzte Standard-Vakzin, das gleichzeitig einem Assay unterworfen worden war, wurde abgeschätzt, 9,4 Einheiten Antigen pro ml zu enthalten.

Antigen-Analyse mittels Immunoblots: Ein experimentelles Western-Blot-Verfahren, nach Verfahren gestaltet, die für andere Agenzien eingesetzt worden waren, wurde dazu verwendet, die Antigene in erhitzten und normalen Vakzinen zu vergleichen. Die beiden Produkte schienen einander innerhalb der Grenzen der visuellen Betrachtung von Immunblots, die entweder mit einem humanen polyklonalen Antiserum oder einem monoklonalen Antikörper gegen virales Glycoprotein I reagiert hatten, sehr ähnlich zu sein.

Proben von vollständigem VZV, wie oben beschrieben inaktiviert, wurden als Immunogen eingesetzt, um zellvermittelte Immunreaktionen gegen Herpes zoster zu aktivieren. Gleiche Dosen, die etwa 10.000 PFU an lebendem oder abgetötetem VZV äquivalent waren, wurden Personen mit einem Risiko zur Entwicklung von Herpes zoster verabreicht. Die Antikörperreaktion (Ab) und die VZV-Responderzellhäufigkeit (RZH) vor und 3 Monate nach der Immunisierung ist im folgenden zusammengefaßt:

Diese Daten zeigen an, daß eine substantielle Erhöhung der Anti-VZV-Immunreaktionen erzielt wird, sei es, daß die Immunisierung mit lebenden oder abgetöteten VZV durchgeführt wird.

BEISPIEL 3 Herstellung von gereinigtem VZV-Untereinheits-Antigen

VZV kodiert für drei serologisch unterschiedliche Glycoprotein-Genprodukte, GA, GB und GC [Keller et al., J. Virol. 52, 293-297 (1984)], die kürzlich als GPIII, GPII bzw. GPI neu benannt wurden [Davison et al., J. Virol. 57, 1195-1197 (1986)]. Im wesentlichen homogene VZV-Glycoproteine können wie in Keller et al. [J. Virol. Methods 14, 177-188 (1986)] beschrieben hergestellt werden. In Kürze, 17 ug vollständiges VZV in vollständigem Freund- Adjuvans wurden eingesetzt, um Balb/c-Mäuse zu immunisieren, dem folgte ein intraperitonealer Booster von 25 mg ohne Adjuvans und später wurden weitere 25 ug VZV intravenös eingeführt. Drei Tage später wurden die Milzen entfernt und Milzzellen mit SP 2/0-Maus-Myelomzellen verschmolzen. Hybridom-Überstände wurden hinsichtlich monoklonaler Anti-VZV-Antikörper gescreent, die durch Grenzverdünnung und anschließende Expansion zur Aszitesbildung geklont wurden. Die monoklonalen Antikörper wurden gereinigt und die VZV-Glycoprotein-Spezifität durch Immunpräzipitation analysiert.

Affinitätsharz mit monoklonalem Antikörper definierter Spezifität wurde hergestellt durch Kopplung von 20 ug/g bromcyan-aktivierter SEPHAROSE 4B (Pharmacia). MRC-5-Zellen, infiziert mit VZV, wurden in 50 mM Tris, pH 7,5, 2% Triton X-100, 4 mM Phenylmethylsulfonylfluorid extrahiert. Die Zellextrakte wurden gegen phosphatgepufferte Salzlösung plus 0,05% Triton X-100 dialysiert. Spezifische Glycoproteine wurden dann isoliert durch Bindung von 20 ml Zellextrakt an 1 g mit monoklonalem Antikörper gekoppeltes Harz. Die Aufschlämmung wurde zentrifugiert, gewaschen und das spezifische, gebundene Glycoprotein mit 3 M KSCN eluiert. Das Eluat wurde gegen phosphatgepufferte Salzlösung, enthaltend 0,05% Triton X-100, dialysiert. Auf diese Weise wurden gereinigte gpl-, gpll- und gpIII-Glycoproteine erhalten.

Alternative Wege zur Erzeugung von im wesentlichen homogenen VZV-Glycoproteinen schließen die rekombinante Produktion spezieller VZV-Genprodukte ein. So können die Verfahren von Ellis et al. [J. Virol. 53, 81-88 (1985)] oder Keller et al. [Virology 152, 181-191 (1986)] angewandt werden.

BEISPIEL 4 Anti-VZV-Hauttest

Ein Varicella-Hauttest wird durchgeführt durch subkutane Einführung eines VZV-Antigens oder Kontrollantigens, gefolgt von der Feststellung erythematöser Veränderungen etwa 48 Stunden nach der Einführung des Antigens. Dementsprechend kann das Verfahren von Kamiga et al. [J. lnf. Dis. 136, 784-788 (1977)], Babu et al. [J. Clin. Microbiol. 25, 2193-496, (1987)] oder Lafussa et al. [J. Inf. Dis 152, 869-875 (1985)] eingesetzt werden, um den Hauttest durchzuführen. Alternativ könnte das inaktivierte Antigen, hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben, oder das gereinigte Antigen von Beispiel 3 eingesetzt werden, um das VZV- Antigen bereitzustellen. Auf jeden Fall wurde von Takahashi [Adv. Virus. Res 28, 285-356 (1987)] gezeigt, daß ein negativer Hauttest-Antigen-Assay eng mit der Anfälligkeit für eine Varicella-Infektion korreliert. Diesbezüglich sind VZV-Glycoproteine mit Molekulargewichten von 15.000 und 45.000, die mit zellvermittelter Immunität eng assoziiert sind, als Indikatoren der Anfälligkeit für eine Zoster-Reaktivierung bevorzugt.

BEISPIEL 5 Assay hinsichtlich der VZV-Responderzellhäufigkeit

VZV-Responderzellhäufigkeiten können nach im Stand der Technik bekannten Verfahren gemessen werden, beispielsweise wird eine Grenzverdünnungsanalyse von M. Zauderer [Handbook of Experimental Immunology, Band 2 - Cellular Immunology, Blackwell Scientific Publications, D. M. Weir et al. - Herausgeber, (1986) - Kapitel 65] beschrieben. Siehe auch die Offenbarung in Beispiel 7 unten, Abschnitt 5: "Bestimmung der Häufigkeit von mononukleären Blutzellen (MNc), welche als Reaktion auf VZV-Antigen proliferieren".

Nach dem Verfahren dieser Erfindung werden Niveaus von Responderzellen erzielt, die etwa 1 Responderzelle auf 40.000 nahekommen, welches dasselbe RZH-Niveau ist, wie es bei Personen nach Zoster gefunden wird.

BEISPIEL 6 Assay hinsichtlich des Niveaus an zytotoxischen Anti-VZV-T-Zellen

VZV-Zytotoxizitäts-Assay: Periphere Blutmonozyten (PBMN) werden abgetrennt und mit lebenden VZV in Mikromulden bei 10&sup4; Zellen/Mulde kultiviert. Nach 7 Tagen wird 1 Einheit IL2 jeder Mulde zugegeben und die Kultur 10 Tage lang fortgesetzt, zu welchem Zeitpunkt die Platten mit dem Auge überprüft werden, um Mulden mit Wachstum nachzuweisen. Blast-Zellen werden aus diesen Mulden gewonnen und mit dem homologen Antigen und autologen EBV-Zellen (mit 5000 r bestrahlt) und mit 10 E/ml IL2 für eine Woche klonaler Expansion erneut stimuliert. Die Verwendung von lebenden VZV, um in diesem Kontext zu stimulieren, beruht auf Befunden von Braciale und Mitarbeitern [Immunol. Rev., 98, 95 (1987)], daß ein Stimulus mit lebendem Virus erforderlich ist, um auf Klasse I beschränkte Reaktionen auszulösen, und von Daten [Arbeit et al., Intervirology 18, 56 (1982)], daß Monozyten durch VZV infizierbar sind, und dem Bedarf an autologen Zellen, die sowohl Klasse I als auch Klasse II für die Antigenpräsentation tragen.

Die Zellen aus Responder-Mulden werden auf MHC-Beschränkung getestet, hauptsächlich durch Inhibierung der Zytotoxizität (Gaston et al., lmmunocienetics 19, 475-486 (1984)]. T- Zellen werden mit 10&sup6;/ml suspendiert und 10&sup5; Zellen werden 5 · 10³ autologen oder nichtverwandten Zielen, vorinkubiert mit VZV, zugegeben. Die MHC-Beschränkung wird bestimmt durch (1) Phänotypenbestimmung eines Aliquots der Effektorzellen für CD4 und CD8 und (2) Zugabe von 1 ug/ml W6/32 (ATCC Hybridoma Bank HB 95, Antiklasse I) oder HB 55 (ATCC, Antiklasse II) zu den Zytotoxizitäts-Assays. Diese Antikörper sind geeignet, da sie die Entwicklung von auf Klasse I bzw. Klasse II beschränkten zytotoxischen Zellen in gemischter Lymphozytenkultur unterdrücken. &sup5;¹Cr-Freisetzung aus den Zielzellen wird nach 6 Stunden Inkubation gemessen.

Klasse I-MHC-beschränkte zytotoxische Zellen werden als durch W6/32 inhibierbar und CD8-Phänotyp identifiziert. Auf Klasse II beschränkte zytotoxische Zellen werden durch HB55 inhibiert und die Effektoren sind CD4. Die Ergebnisse von PBMN, die in unterschiedlichen Intervallen nach akuter VZV bei jungen Erwachsenen erhalten wurden, und vor und nach der OKA-Booster-Immunisierung werden verglichen.

BEISPIEL 7 Immunisierung von Erwachsenen mit einem Risiko zur Entwicklung von Herpes zoster 1. Population

Personen eines Alters von 55 bis 87 Jahren wurden geimpft, wenn sie eine Krankengeschichte von früherer Varicella besaßen, jedoch niemals HZ hatten. Ausgeschlossen waren diejenigen mit einer schwächenden oder immunsuppressiven Krankheit und diejenigen, welche eine immunsuppressive Therapie erhielten. Wir schlossen auch jeden aus, der ein anderes Vakzin innerhalb eines Monats vor der VZV-Impfung erhielt oder der erwartete, ein anderes Vakzin in dem Monat nach der VZV-Impfung zu erhalten, und Personen, welche eine Gammaglobulin-Therapie innerhalb von drei Monaten vor der VZV- Impfung erhielten.

2. Vakzin

Abgeschwächtes Lebendvakzin (Oka/Merck-Stamm) wurde bei -20ºC in lyophilisiertem Zustand gelagert und mit destilliertem Wasser auf einen Infektivitätstiter von 1140 pfu/0,5 ml (Lot CR 452) oder 3010 pfu/0,5 ml (Lot CR 320) rekonstituiert. Andere lebende abgeschwächte Varicella-Zoster-Viren können ebenfalls eingesetzt werden. Der bevorzugte Oka- Virus kann nach der Offenbarung von US-Patent 3,985,615 hergestellt werden.

3. Versuchsaufbau

Potentielle Impflinge wurden nach dem Alter in Gruppen eingeteilt (55-59; 60-64; 65-69; 70- 79; ≥80 Jahre alt). Die Personen in jeder Altersgruppe wurden zufällig eingeteilt, um eine von vier Vakzindosen subkutan zu erhalten: 3010 pfu, 6020 pfu, 12040 pfu oder 3010 pfu mit einer Booster-Dosis von 3010 pfu 3 Monate nach der ersten Dosis. Zusätzliche Personen eines Alters von 55-59 Jahren wurden zufällig ausgewählt, um 1140 pfu zu erhalten.

Blut wurde von den Impflingen zur immunologischen Beurteilung unmittelbar vor der Immunisierung und 3, 12 und 24 Monate nach der Immunisierung erhalten. Blut wurde auch drei Monate nach der Booster-Dosis erhalten.

Die Impflinge wurden bezüglich Vakzinreaktionen 42 Tage lang mit zweiwöchentlichen Telefonanrufen begleitet. Die Impflinge registrierten auch Zeichen und Symptome auf einer Impfberichtkarte. Sie maßen ihre Temperatur für 5 Tage nach der Impfung täglich und danach nur, wenn sie sich fiebrig fühlten. Diejenigen mit ungewöhnlichen Reaktionen wurden individuell beurteilt. Hautläsionen wurden hinsichtlich VZV kultiviert. Die Patienten wurden instruiert, anzurufen, wann immer sie annahmen, sie hätten HZ entwickelt. Darüber hinaus wurden sie während des ersten Jahres monatlich angerufen, um hinsichtlich HZ befragt zu werden, und sie wurden gleichermaßen am Ende des zweiten Jahres befragt. Hautläsionen oder Paarsyndrome, von denen angenommen wurde, daß sie HZ repräsentierten, wurden durch körperliche Untersuchung, Kultur von Läsionen hinsichtlich VZV und akute und konvaleszente (4-6 Wochen nach vermuteter HZ) VZV-spezifische immunologische Beurteilung untersucht.

4. Nachweis von IgG-Antikörper gegen VZV Antigen durch enzymgekoppelten Immunadsorptions-Assay (ELISA)

Die Reihen A bis D von IMMULON® 11-Platten (Dynatech, Alexandria, VA; Katalog-Nr. 011- 010-3450) wurden mit 0,1 ml VZV-Antigen und die Reihen E bis H mit Kontrollantigen (M. A. Bioproducts, Walkerville, MD; Katalog-Nr. 30-149 J für VZV-Antigen; 30-150 J für Kontrolle), 1 : 20 in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; 0,15 M, pH 7) über Nacht bei 4ºC verdünnt, beschichtet. Die Platten wurden in PBS gespült und mit 1 mg/ml Gelatine in PBS über Nacht blockiert. Patientenseren und positive Kontrollseren wurden Antigen- und Kontrollmulden in vierfachen Verdünnungen (beginnend mit 1 : 50) zugegeben und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Nachfolgende Inkubationen erfolgten mit Pe:oxidase-konjugiertem affinitätsgereinigtem Anti-Human-Ziegen-IgG (Tago, Burlingame, CA; Katalog-Nr. 2390), 1 : 2000 in PBS verdünnt, und mit ABTS-Substrat (Sigma, St. Louis, MO). Farbe wurde 30-60 Min. lang entwickelt und die OD auf einem DYNATECH-Plattenlesegerät mit ELISACALC-Software abgelesen. Die optischen Dichten der Kontrollmulden wurden von den VZV-Mulden subtrahiert. Ein Aliquot eines einzelnen positiven Referenzserums wurde in allen Platten laufen gelassen und eine Regressionslinie für 10 g (Verdünnung) gegen 10 g (OD) berechnet. Der VZV-Antikörper in den Untersuchungsproben wurde als Prozentsatz des Referenzserums ausgedrückt.

5. Bestimmung der Häufigkeit von mononukleären Blutzellen (MNC), welche als Reaktion auf VZV-Antigen proliferieren

MNC wurden von heparinbehandeltem Blut durch Ficoll-Hypaque-Zentrifugation abgetrennt, in Hank's ausgewogener Salzlösung gewaschen und in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit Antikörpern und 10% autologem Serum, kultiviert. Details der Grenzverdünnungskulturen, welche zur Bestimmung der Responderzellhäufigkeit (RZH) verwendet wurden, sind veröffentlicht [Feldman S. et al., Am. J. Dis. Child. 126, 178-184 (1973)]. In Kürze, 24 Replikat-Kulturen, enthaltend 100.000, 50.000, 25.000 und 12.500 MNC pro Mulde, wurden mit einer 1 : 200-Verdünnung von zellfreiem VZV-Antigen 10 Tage lang kultiviert und dann einem Bstündigen Puls mit 0,25 uCl [3H]-Thymidin (TRK 61, Radiochemical Centre, Amersham; 5 Ci/mMol) pro Mulde unterworfen. Parallele Kontrollkulturen waren identisch, mit der Ausnahme, daß sie mit einem verdünnten Kontrollantigen, hergestellt aus nichtinfizierten Zellen, stimuliert wurden. Responder-Mulden wurden definiert als diejenigen, welche mehr als den Mittelwert plus 3 Standardabweichungen der CpM der 24 parallelen Replikat-Kontrollkulturen aufwiesen. Die RZH wurde in einer Auftragung des Logarithmus des Prozentsatzes von Nicht-Responder-Mulden gegen die Zellzahl pro Mulde als derjenige Punkt interpoliert, an dem 37% der VZV-Antigen-stimulierten Mulden Nicht-Responder waren [Henry C, et al. in Mishell BB, Shiigi SM, Hrsg., Selected Methods in Cellular Immunology. San Francisco: Freeman Press, (1980)]. Die RZH wird ausgedrückt als die mittlere Anzahl der MNC, welche benötigt werden, um eine VZV-spezifische proliferierende Zelle nachzuweisen.

Bei 2% der Versuchspersonen erhöhte der CpM-Mittelwert in den unstimulierten Mulden, die 10&sup5; Zellen enthielten, fälschlich den Prozentsatz der Nicht-Responder-Mulden. Wir berechneten deshalb die RZH in dieser Untergruppe von Versuchspersonen aus den Datenpunkten bei 12.500, 25.000 und 50.000 Zellen pro Mulde. Das größere Vertrauen, welches auf Datenpunkte von niedrigeren Zellzahlen bei diesen Versuchspersonen gesetzt wurde, wird durch die größere Linearität der Datenpunkte gerechtfertigt.

Um einen Stimulationsindex von diesen Kulturen zu erhalten, wurde das arithmetische Mittel für die stimulierten und unstimulierten Mulden bestimmt und als stimulierte CpM/unstimulierte CpM ausgedrückt.

6. γ-Interferon-Produktion in VZV stimulierten MNC-Kulturen

Kulturen von 5 · 105 MNC in 0,5 ml wurden mit einer 1 : 20-Verdünnung von Kontroll- oder VZV-Antigen inkubiert. Nach 5 Tagen wurden die Überstände einem ELISA-Assay (Amgen, ABC 3.000; Thousand Oaks, CA) hinsichtlich γ-Interferon unterworfen. Die Ergebnisse sind als internationale Einheiten (IE)/ml ausgedrückt.

7. VZV-Isolierung

Die Isolierung von VZV aus Hautläsionen wurde durch Kultur in Humanembryo-Lungenfibroblasten (lokal abgeleitet; Passage 10 bis 20) nach Abkratzen von Papeln oder Vesikeln und intensivem Abtupfen der Basisfläche versucht. VZV wurde durch spezifische Immunfluoreszenz identifiziert.

8. Statistik

Einfache Vergleiche wurden mit Students-t-Tests bei einem Signifikanzniveau von 0,05 mit Bonferroni-Anpassung, wo dies angebracht war, durchgeführt. Die Auswirkungen von Geschlecht, Alter, Vakzindosis und Anzahl der Monate nach einer Immunisierung wurden durch Analyse wiederholter Messungen festgestellt [Laird NM, Ware JH, Biometrics (1982); 38, 963-974; Jennrich R, Schluchter MD, Biometrics (1986); 42, 805-820]. Zur Untersuchung der Dauer der Immunität wurden inverse polynome Modelle mit Hilfe eines nichtlinearen Analogons des Modells von Laird und Ware [NeIder JA, Biometrics (1966): 22; 128- 141; Hirst K, et al., Commun. Stat. (1991): B20] angepaßt.

ERGEBNISSE

Insgesamt 202 Personen wurden immunisiert. Das mittlere Alter der 138 weiblichen Impflinge betrug 65,8 ±7,3; das mittlere Alter der 64 männlichen Impflinge betrug 67,7 ±6,5 Jahre. 8 bis 15 Versuchspersonen in allen Dosiskategorien hatten ein Alter von ≥80 Jahren. Das Vakzin wurde im allgemeinen gut vertragen. Weniger als 25% der Impflinge wiesen lokale Reaktionen auf.

Tabelle 1. Lokale Reaktionen auf das Varicella-Vakzin bei älteren immunen Personen Reaktionen

¹ n = 202

² n = 43

Diese bestanden aus Erythemen, Schwellungen und/oder Empfindlichkeit. Die mittlere Dauer lokaler Reaktionen betrug 2,9 Tage für Erytheme, 2,9 Tage für Schwellungen und 3,6 Tage für die Empfindlichkeit. Diese Reaktionen waren weder häufiger noch schwerer bei Impflingen, die Booster-Dosen erhielten. Temperaturen von mehr als (100º F) 37ºC traten bei < 1% der Impflinge auf.

Tabelle 2. Beschwerden in den 6 Wochen nach dem Varicella-Vakzin bei älteren immunen Personen Häufigkeit Art

4% Kopfschmerzen

< 3% entzündete Augen, steifer Nacken, Myalgie-Anfall

< 2% Arthralgie, Bauchschmerzen

< 1% entzündeter Hals, Ohrschmerzen, geschwollene Drüsen, Übelkeit, Husten, Durchfall, Fieber (> 100º F) (> 37ºC).

Eine Vielfalt anderer milder Symptome trat bei ≤4% der Impflinge auf.

11 Patienten beklagten sich über einen Hautauschlag innerhalb von 40 Tagen nach der Impfung.

Tabelle 3. Hautauschlag nach Varicella-Vakzin für ältere immune Personen -- Früher Hautauschlag (< 40 Tage) --

¹Gesamtzahl der Injektionen = 245

²Zahlen in Klammern zeigen den Bereich der Anzahl der Läsionen an; unbekannt für einen Impfling

³ND = nicht durchgeführt

Zwei von diesen Personen wurden befunden, nur lokale erythematöse Reaktionen auf das Vakzin aufzuweisen. Sechs Personen hatten makulopapulöse Ausschläge, umfassend 1 bis 10 Läsionen, welche 3 bis 15 Tage nach der Immunisierung erschienen. VZV wurde von nur einem der fünf Patienten isoliert, deren Läsionen untersucht wurden. Dieses VZV erwies sich bei einer Restriktionsenzym-Analyse als Wildtyp.

Die Antikörperniveaus bei älteren Versuchspersonen lagen bei 85% eines Kontroll- Standardreferenzserums vor der Immunisierung. Nach der Verabreichung des Varicella- Vakzins waren die Antikörperniveaus 12 Monate lang signifikant höher (p < 0,001), nicht jedoch 24 Monate nach der Impfung (p = 0,100). Dosis, Geschlecht und Alter beeinflußten diese Reaktion nicht. Die in vitro-Produktion von γ-Interferon durch VZV-stimulierte T-Zellen war 3 und 6 Monate nach der Immunisierung ebenfalls signifikant höher (p < 0,001) (Fig. 2), diese Wirkung ging jedoch nach 12 Monaten verloren. Höhere Vakzindosen (p = 0,037) und jüngeres Alter (p = 0,023) waren mit höheren γ-Interferonreaktionen assoziiert.

Zellvermittelte Immunität

Zur Messung der zellvermittelten Immunität gegenüber VZV-Antigen nach einer Booster- Immunisierung wurden die MNC der Versuchspersonen unter Einsatz verschiedener Zellzahlen pro Mulde kultiviert. Diese Kulturen wurden als Grenzverdünnungskulturen analysiert, um eine Abschätzung der Häufigkeit von VZV-spezifischen T-Zellen im Blut (RZH) zu erhalten. Wir bedienten uns dieser Vorgehensweise, da wir erwarteten, es würde leichter sein, Datenpunkte über mehrere Jahre der Studie quantitativ zu bestimmen und zu vergleichen. Vor dem Erhalt des Vakzins hatten die Versuchspersonen einen mittleren RZH- Wert von 1 : 68.000 (d. h., eine VZV-spezifische proliferierende Zelle auf 68.000 periphere Blut-MNC). Dieser erhöhte sich auf 1 : 40.000 sechs Monate nach der Impfung und blieb für 24 Monate signifikant über den Vorimmunisierungsniveaus (Fig. 3) (p = < 0,001). Die Größe der mittleren Verbesserung der RZH ist wahrscheinlich eine Unterschätzung, da 33% der Impflinge, die weniger als eine Responderzelle auf 100.000 MNC vor der Impfung aufwiesen, in unserer Analyse als eine Responderzelle aufweisend eingeschlossen sind. Der Absolutwert der RZH 12 oder 24 Monate nach der Impfung war keine Funktion des Geschlechts, der verabreichten Dosis oder des Alters des Impflings. Jedoch war die inkrementale Verbesserung der RZH (d. h., die RZH nach 12 oder 24 Monaten minus der RZH vor der Impfung) bei älteren Personen größer (p < 0,05), was die relativ schlechten CMI-Werte (d. h., eine niedrigere RZH) bei älteren Personen vor der Immunisierung und die Tatsache, daß alle reagierenden Impflinge - unabhängig vom Alter - ähnliche Post-Vakzin- Niveaus erreichten, widerspiegelt. Ein invers polynomes Modell der Daten sagte voraus, daß die maximale RZH nach 6,34 Monaten erzielt wird, wobei die Hälfte dieser Wirkung 55,9 Monate anhält. Die Post-Vakzin-Immunität wurde mit der Rate von 309 ± 364 Zellen/Responderzelle/Monat verloren (95% Konfidenzintervall = 0-1047 Zellen). Die RZH korrelierte schlecht mit Antikörper- oder γ-Interferonreaktionen.

Es wurde festgestellt, daß eine Gruppe der Impflinge zu keiner Zeit nach der Impfung mehr als 1 RZH/10&sup5; MNC aufweisen konnte. Diese Nicht-Responder-Gruppe war bei allen Altersgruppen, mit Ausnahme von Impflingen eines Alters von mehr als 80 Jahren, von denen 5 aus 8 Nicht-Responder waren, ähnlich (8-20%). Es gab weder eine statistisch signifikante Korrelation zwischen dem Alter und einer Nicht-Reaktion, noch korrelierte die Nicht-Reaktion mit der Dosis des verabreichten Vakzins.

Die Erhöhung der VZV-Immunität wurde auch nachgewiesen, wenn die Daten als Stimulationsindex ausgedrückt wurden. Diese Ergebnisse wurden zur Analyse logarithmisch transformiert, da sie logarithmisch verteilt waren. Zu Beginn betrug der mittlere Stimulationsindex 3,44 (1 Standardabweichungsbereich 1,2-9,9); nach 3 Monaten 4,57 (1,6-12,8); nach 1 Jahr 4,85 (1,81-13,5) und nach 2 Jahren 4,58 (1,7-17,1).

Schutz vor HZ

Sieben Patienten wurden auf mögliche Herpes zoster (Tabelle 4) über zwei Jahre (entsprechend 400 Patientenjahre der Beobachtung) untersucht. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in der folgenden Tabelle 4 gezeigt:

Tabelle 4. Ausschlag und/oder Schmerz nach Varicella-Vakzin für ältere immune Personen

(2 Patienten);

nicht-dermatomal

¹ Monate nach der ersten Immunisierung

² zugeordnete Ursache auf Basis von klinischen, virologischen und immunologischen Daten

³ ND = nicht durchgeführt

Ein Patient ergab VZV in Kultur aus Hautläsionen. Drei andere hatten kompatible klinische Präsentationen, von denen zwei eine Verbesserung der konvaleszenten RZH aufwiesen, was eine kürzliche VZV-Infektion nahelegt. Ein Patient hatte eine vollständige immunologische Beurteilung und drei andere hatten keine immunologische Beurteilung, da deren Läsionen nicht auf VZV zurückzuführen waren. Nur zwei Verdachtsfälle hatten akute Schmerzen (jeweils vier Tage Dauer) und keiner hatte Schmerzen nach Heilung der Läsionen (Post-Herpes-Neuralgie).

BEISPIEL 8 Konkurrenz-ELISA zur quantitativen Bestimmung von VZV-Antigen:

Nachdem der VZV-Plaque-Assay zeitraubend ist, ist er für eine verfahrensbegleitende Kontrolle nicht besonders geeignet. Ein schneller VZV-Antigen-ELISA erlaubt die Messung von VZV-Antigenmengen, um eine Überwachung des Viruswachstums während der Herstellung von Varicella-Lebendvakzin zu ermöglichen. Darüber hinaus kann dieser Test eingesetzt werden, um VZV-Antigenmengen in geklärten, beschallten Vakzin-Volumina abzuschätzen, und potentiell, um Antigen in abgefüllten Gefäßen mit lyophilisiertem Vakzin zu messen. In Kürze, dieser Assay wird durch Inkubation von VZV-Antigen aus Testproben mit Anti-VZV-Serum in Lösung durchgeführt. Dem verbleibenden freien Antikörper wird erlaubt, an VZV-Antigen zu binden, das auf ELISA-Mikrotiterplatten immobilisiert ist. Die Menge an Antikörper, welche zur Bindung an die Platten imstande ist, ist umgekehrt proportional zur Menge an Antigen in der Testprobe. Die Antikörperbindung an die Platten wird quantitativ bestimmt durch Reaktion mit einem enzymgekoppelten Anti-Human- Antikörper und einem geeigneten Substrat, um ein gefärbtes Produkt zu ergeben, welches spektralphotometrisch quantitativ bestimmt wird.

Die VZV-Antigen-ELISA- und die VZV-Plaque-Assays sollten im allgemeinen korrelierende Daten liefern, es sollte jedoch berücksichtigt werden, daß der VZV-Antigen-Assay sowohl lebendes als auch nicht-lebendes VZV nachweist. Der Antigen-Assay ist auch insofern wertvoll, als er eine Bestimmung der gesamten Antigenfracht, die einem VZV-Vakzin- Empfänger verabreicht wird, ergibt.

Testverfahren:

1. ELISA-Platten werden mit Glycoproteinen (gps) aus VZV-infizierten oder nichtinfizierten MRC-5-Zellen beschichtet (Beispiel 3) und werden mit 1%igem Rinderserumalbumin ([Fraktion V, #A-9647, Sigma], 0,1% NaN&sub3;) überschichtet, um die unspezifische Adsorption von Antikörpern an die Platten zu verringern. Alternierende Reihen werden mit VZV oder Kontrollantigen beschichtet (d. h., die Reihen A, C, E und G erhalten VZV-gp und die Reihen B, D, F und H erhalten gp- Antigen von nichtinfizierten MRC-5).

2. Geklärtes (3250 g-Min.) Testantigen wird in Stabilisator in 12 · 75-mm-Röhrchen oder Mikroröhrchen verdünnt. Eine Virus-Antigen-Standardpräparation (26 Einheiten/ml VZV-Antigen gemäß Dot-Blot-Assay) wird 1 : 10 verdünnt und dann in Reihe 1 : 1,25-fach verdünnt, um Antigenkonzentrationen von 2,6, 2,1, 1,7, 1,3, 1, 1, 0,9 Einheiten/ml zu ergeben. Weitere Verdünnungen können eingeschlossen werden, um 0,7 und 0,5 Einheiten/ml Antigen z:u ergeben. Diese Verdünnungsreihe wird eingesetzt, um eine Standardkurve für die Messung von Antigenmengen in Testproben zu erstellen.

3. Ein Human-Anti-VZV-Serum wird in Stabilisator auf das Doppelte der gewünschten Endverdünnung verdünnt.

4. 300-ul-Volumina von verdünntem Antigen werden in Mikroröhrchen abgefüllt, mit 300 ul verdünntem Anti-VZV-Serum gemischt und bei 35ºC 15-22 Min. lang inkubiert. Eine Kontrolle schließt Human-Anti-VZV und Verdünnungsmittel (kein Antigen) ein.

5. Aliquots von 100 ul aus jeder Serum-Antigen-Mischung werden 2 Replikaten von mit VZV-Glycoprotein (VZV-gp) beschichteten Mulden und 2 mit MRC-5-gp beschichteten Mulden (4 Mulden pro Probe) zugegeben (z. B.: Probe 1 in Spalte 1, Reihen A, B, C und D; Probe 2 in Spalte 2, Reihen A, B, C und D; etc.).

6. Die Platten werden für 15 ±1 Minute(n) bei 35ºC inkubiert, um freiem Antikörper (nicht mit Antigen in Lösung komplexiert) die Bindung an Virus-Antigen, das auf den Platten immobilisiert ist, zu ermöglichen.

7. Ungebundener Antikörper wird durch Waschen entfernt und die Mulden erhalten einen mit alkalischer Phosphatase konjugierten Anti-Human-Ziegen-IgG, um gebundenen Human-Antikörper nachzuweisen.

8. Nach Inkubation für 15 ±1 Minute(n) bei 35ºC wird ungebundenes Konjugat durch Waschen entfernt. Gebundenes Konjugat wird durch Inkubation für 15 Min. bei 35ºC mit p-Nitrophenylphosphat-Substrat, gelöst in Diethanolamin-Puffer, nachgewiesen.

9. Nach Beendigung der Substratreaktion durch Zugabe von 50 ul/Mulde 3 M NaOH, wird die Farbentwicklung (OD bei 405 nm) quantitativ mit Hilfe eines Mikroplatten- Spektralphotometers bestimmt.

Testberechnungen und Interpretation:

1. Die jeweiligen Replikat-OD-Werte für die mit VZV und MRC-5 beschichteten Replikat-Mulden werden gemittelt. Die Erfahrung hat gezeigt, daß die MRC-5-OD zwischen verschiedenen Proben und Verdünnungen konsistent ist. Deshalb werden die MRC-5-Werte für die gesamte Platte gemittelt und verwendet, um die Korrektur bezüglich der unspezifischen Bindung des primären Antikörpers oder Konjugats an nicht-infizierte Zellextrakte vorzunehmen. Die gemittelte MRC-5-OD wird von den jeweiligen gemittelten VZV-OD-Werten abgezogen, um VZV-spezifische OD (ΔOD)- Werte zu ergeben.

2. Erstellung einer Standardkurve zur Messung von Antigenmengen: Die ΔOD-Werte der Standardkurve werden gegen die bekannten Antigenkonzentrationen aufgetragen (Einheiten VZV/ml). Die Daten werden in ein geeignetes Graphikprogramm (z. B. Cricket Graph Version 1.3, Cricket Software, Malvern, PA) eingegeben, der lineare Anteil der Kurve wird identifiziert (muß mindestens 4 Punkte einschließen) und die Kurvenanpassungsformel ("line fit formula") (y = a + bx) wird erhalten.

3. Berechnung von Antigenmengen aus Testproben: Die Werte für a und b sind durch die Kurvenanpassungsformel gegeben und y (ΔOD) ist bekannt. Die verbleibende Unbekannte, x, repräsentierend die Einheiten/ml Antigen, kann dann berechnet und um die Probenverdünnung korrigiert werden, um die Antigenkonzentration der unverdünnten Probe zu erhalten. Eine allgemeine Probenberechnung folgt:

Die angegebene Antigenkonzentration ist diejenige, welche mit der am wenigsten verdünnten Probe, die einen ΔOD-Wert innerhalb des linearen Anteils der Standardkurve ergibt, erhalten wird.

BEISPIEL 9 Klinische Studien:

Das Verfahren zum Testen der Wirksamkeit eines Anti-Zoster-Vakzins ist wie folgt:

a. Ein Vorimpfungswert der VZV-Responderzellhäufigkeit, Anti-VZV-Antikörper- und VZV-spezifischen zytotoxischen T-Zell-Niveaus aus einer Population von für Zoster anfälligen Erwachsenen wird erhalten;

b. Eine erste ausreichend große Population von für VZV anfälligen Erwachsenen wird mit einem lebenden oder inaktiviertem VZV-Vakzin geimpft und eine zweite ausreichend große Population (Kontrolle) ähnlicher Erwachsener wird mit dem VZV-Vakzin- Verdünnungsmittel minus lebendem oder inaktiviertem VZV geimpft;

c. Ein Nachimpfungswert für die Responderzellhäufigkeit, Anti-VZV-Antikörper und VZV- spezifischen zytotoxischen T-Zellen wird erhalten;

d. Die in (c) erhaltenen Werte werden mit den in (a) erhaltenen Werten verglichen, so daß eine etwa 30%ige Erhöhung der VZV-Responderzellhäufigkeit, eine Erhöhung der VZV-spezifischen Antikörper und eine Erhöhung der VZV-spezifischen T-Zellen innerhalb von 3 Monaten nach der Impfung eine Wirksamkeit als Anti-VZV-Vakzin anzeigt.


Anspruch[de]

1. Verwendung eines Varicella-Zoster-Virus (VZV) zur Herstellung eines Vakzins zur Immunisierung einer Person eines Afters von mehr als fünfzig, welche Varicella oder einem Varicella-Lebendvakzin ausgesetzt war, zur Verringerung von Post-Herpes- Neuralgie und zur Verminderung oder Eliminierung einer Herpes-Zoster- Reaktivierung.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Vakzin zur Verringerung der Dauer oder Schwere von Post-Herpes-Neuralgie bestimmt ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das VZV der abgeschwächte Oka- Stamm ist.

4. Verwendung nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Immunisierung subkutan erfolgt.

5. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei mindestens 1000 plaquebildende Einheiten (PFU) für eine solche Immmunisierung eingesetzt werden.

6. Verwendung nach Anspruch 3, wobei der abgeschwächte Oka-Stamm des Varicella- Zoster-Virus vor der Immunisierung in einem lyophilisierten Zustand gelagert wird.

7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei der abgeschwächte Oka-Stamm des Varicella- Zoster-Virus vor der Immunisierung mit destilliertem Wasser aus dem lyophilisierten Zustand rekonstituiert wird.







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