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Dokumentenidentifikation DE69429625T2 12.09.2002
EP-Veröffentlichungsnummer 0714444
Titel DÄMPFUNG EINES IMMUNDOMINANTEN EPITOPS EINES ANTIGENS ZUR VERWENDUNG FÜR PFLANZEN, TIERISCHE UND MENSCHLICHE IMPSTOFFE UND IMMUNTHERAPIEN
Anmelder The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services, Rockville, Md., US
Erfinder GARRITY, R., Robert, Middletown, US;
NARA, L., Peter, Frederick, US;
GOUDSMIT, Jaap, NL-1105 A2 Amsterdam, NL
Vertreter Dr. Weber, Dipl.-Phys. Seiffert, Dr. Lieke, 65183 Wiesbaden
DE-Aktenzeichen 69429625
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 19.08.1994
EP-Aktenzeichen 949259378
WO-Anmeldetag 19.08.1994
PCT-Aktenzeichen PCT/US94/09336
WO-Veröffentlichungsnummer 0009506124
WO-Veröffentlichungsdatum 02.03.1995
EP-Offenlegungsdatum 05.06.1996
EP date of grant 09.01.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.09.2002
IPC-Hauptklasse C12N 15/48
IPC-Nebenklasse C12N 15/44   A61K 39/21   A61K 39/145   

Beschreibung[de]
Erfindungsbereich

Die vorliegende Erfindung betrifft die Manipulation von Immunantworten. Spezifischer wird die Immundämpfung genutzt, um Immuneffektorantworten auf vorher inaktive oder relativ nicht immunogene Epitope auf krankheitsassoziierte Antigene zu konzentrieren.

Hintergründe der Erfindung

Krankheitserreger wie etwa die Viren, Bakterien, mehrzelligen Parasiten und die menschlichen Krebse haben ausgefeilte Strategien entwickelt, um die Immunantwort des Wirtes zu besiegen. Solche Strategien erschweren oft die Versuche, erfolgreiche Impfstoffe gegen viele Krankheitserreger zu entwickeln.

Bestimmte Parasiten haben ein intrazelluläres Habitat entwickelt, das den Parasiten hilft, die Wirkungen der Antikörper zu vermeiden. Weitere Parasiten, wie die afrikanischen Trypanosomen, benutzen ein Antigenvariation genanntes Verfahren, um den Charakter ihres Oberflächenmantels zu verändern. Andere Krankheitserreger haben Wege entwickelt, um die Immunantwort des Wirtes zu unterdrücken, indem sie lymphozytotoxische Faktoren freilassen.

Entsprechend einer weiteren Strategie zeigt der Krankheitserreger ein immundominantes Epitop, das sich einer strukturellen Variation oder einer Antigendrift unterzieht. Frühzeitig neutralisierende Antikörper- und/oder zytotoxische T-Lymphozyten-Antworten (CTL), die gegen diese Epitope erhoben werden, sind ein Versuch des Immunsystems des Wirtes, den Titer des dominanten Phänotyps des Krankheitserregers zu reduzieren. Es gibt jedoch eine Verzögerungsperiode zwischen dem Zeitpunkt der Infektion und dem Erscheinen und der Wirkung dieser Immunantworten. Außerdem resultieren Antigendriften des immundominanten Epitops daraus, dass diese frühzeitig neutralisierenden Antikörper oder CTL- Antworten unwirksam gegen den Krankheitserreger werden.

Das humane Immundefizienzvirus-1 (HIV-1) hat eine schlaue Strategie entwickelt, die es dazu benutzt, dem humanen Immunsystem zu entkommen und es somit zu zerstören. Bislang führte keiner der Ansätze, einen Impfstoff zu entwickeln, zum Erfolg. Einer der Ansätze zu einer Impfstoffproduktion konzentrierte sich auf HIV-1 gp120/160. Neutralisierende Antikörper können gegen den dominanten V3- Bereich von gp120/160 erhoben werden. Diese neutralisierenden Antikörper sind jedoch unwirksam, was die Verhinderung eines weiteren Wachstums von HIV-1 in vivo betrifft. Haigwood et al., AIDS Research and Human Retroviruses 6: 855-69 (1990), produzierten ein gp120/160 Immungen, welches den dominanten V3-Bereich nicht beherbergte, indem es die Aminosäuren, die den V3-Bereich enthielten, deletierte. Dieses konstruierte Protein wurde in einer nicht glykosylierten Form in Hefe produziert, denaturiert und dazu benutzt, um Versuchstiere zu immunisieren. Dieser Ansatz scheiterte darin, eine mehr konservierte neutralisierende Antwort zu entlocken.

Das Hämagglutininantigen (HA) des Influenza-Virus liefert ein weiteres Beispiel eines erregerkodierten immundominanten Antigens, das Antigendriften unterworfen ist. In der Tat entspricht die Veränderung der HA- Antigenstruktur dem Auftreten periodischer epidemischer Atmungskrankheiten, die durch dieses Virus verursacht werden. Unter experimentellen Bedingungen haben die Selektionsdrücke, die durch die Propagation des Virus in der Anwesenheit von neutralisierenden Antikörpern aufgezwängt werden, zum Auftreten von resistenten Varianten geführt. In einem Beispiel hat die Mutation von HA1 (D zu N) auf Position 63 zur Schaffung eines drei-Aminosäurenmusters geführt, das zur Übereinstimmung N-X-S/T passt. Dieses Muster dient als Signal für eine N-gebundene Addition von Oligosacchariden bei Proteinen, die durch das endoplasmatische Retikulum und die Golgi durchgehen. Die Anwesenheit von überzähligen Carbohydraten blockierte die Interaktion zwischen dem HA-Protein und dem neutralisierenden Antikörper. Dies wurde durch den Befund bestätigt, dass die Propagation dieses Mutanten in Anwesenheit von Tunicamycin, einem Hemmer der N- gebundenen Glykosylation, die Antikörperbindung wieder herstellte. Also kann eine post-translationelle Modifizierung eines viral kodierten Epitops mit der Bindung neutralisierender Antikörper interferieren.

Gething et al., U.S. Patent Nr. 5,041,376, enthüllen ein Verfahren, um Proteinepitope zu schützen, indem N- gebundene Oligosaccharidenseitenketten durch die Verwendung der oligonukleotiden Mutagenese aufgenommen werden. Die in Betracht gezogene Verwendung der N-gebundenen Proteinmodifizierungen ist eine Verlängerung der Antigenzirkulationszeit durch Verringerung der Immunogenität.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Impfstoff, der einem humanen Subjekt verabreicht werden kann, um in diesem Subjekt einen Immunschutz gegen HIV-1 zu verursachen. Dieser Impfstoff umfasst eine modifizierte Form von HIV-1 gp120/160, in der die V3-Schleife des gp120/160 immungedämpft ist, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Vorzugsweise weist die V3-Schleife im Impfstoff eine modifizierte Sequenz an Aminosäuren auf, die ein oder mehrere N-gebundene Glykosylationssignale enthält, die in der ursprünglichen V3-Schleife nicht vorhanden sind.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Impfstoff, der einem Säugetier verabreicht werden kann, um in dem Säugetier einen Immunschutz gegen einen Krankheitserreger zu verursachen, in dem der Krankheitserreger ein Antigen mit einem immundominanten Epitop umfasst. Dieser Impfstoff umfasst eine modifizierte Form des Antigens, in dem das immundominante Epitop immungedämpft ist und einen pharmazeutisch annehmbarer Träger. Vorzugsweise umfasst der Träger einen pharmazeutisch annehmbaren Salinpuffer. Das immundominante Epitop kann zum beispiel durch die Addition eines Karbohydratanteils immungedämpft werden. Wenn das immundominante Epitop eine Vielfalt an Aminosäuren umfasst, kann das Epitop jedoch durch eine Veränderung dieser Aminosäuren immungedämpft werden. In dieser Ausführungsform kann die Veränderung eine Aminosäurensubstitution umfassen und die Vielfalt an Aminosäuren kann durch eine andere Vielfalt an Aminosäuren substituiert werden, die durch humanen B-Zellen toleriert werden. Die andere Vielfalt an Aminosäuren kann zum Beispiel ein humanes lineares B-Zellen Epitop umfassen. Die Vielfalt an Aminosäuren kann auch eine ursprüngliche Ladung aufweisen, so dass die Veränderung in einer Veränderung der ursprünglichen Ladung resultiert. Die Veränderung kann außerdem die Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren aus der Vielfalt umfassen.

In einer anderen Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung enthält das immundominante Epitop eine Bindungsstelle für zumindest ein weiteres Molekül, und der Impfstoff enthält zusätzlich zumindest ein anderes Molekül, das irreversibel an das Epitop gebunden ist. Das andere Molekül kann zum Beispiel einen Antikörper umfassen, der gegen das Epitop gerichtet ist. Das Epitop in dieser Ausführungsform kann auch einen Rezeptor enthalten und das andere Molekül kann einen Ligand für den Rezeptor umfassen. In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das immundominante Epitop ein Epitop gegen welches das Säugetier neutralisierende Antikörper erheben kann. Ein solches immundominantes Epitop kann eine Vielfalt an Aminosäuren umfassen, und die Vielfalt an Aminosäuren kann verändert werden, ohne die Überlebensfähigkeit des Krankheitserregers zu beeinflussen, wobei es der Vielfalt an Aminosäuren ermöglicht wird, sich durch einen genetischen Drift über eine Vielzahl von Generationen des Krankheitserregers zu verändern.

Der Impfstoff der vorliegenden Erfindung kann einen Immunschutz gegen mehrere Krankheitserreger, einschließlich gegen Pilze, Protozoen, Bakterien und Viren, wie Influenza- und HIV-Virus geben. In einer Ausführungsform ist der Krankheitserreger HIV-1 und das immundominante Epitop die V3-Schleife von HIV-1 gp120/160. Das Epitop kann zusätzlich eine Vielfalt an Aminosäuren umfassen, die verändert worden sind, um zusätzliche N- gebundene Glykosylationssignale zu enthalten.

Noch ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist ein Verfahren, um ein Säugetier gegen einen Krankheitserreger zu immunisieren, der ein ursprüngliches Antigen mit einem immundominanten Epitop umfasst. Dieses Verfahren besteht darin, einem Säugetier einen Impfstoff zu verabreichen, der eine modifizierte Form eines solchen ursprünglichen Antigens, in dem das immundominante Epitop immungedämpft ist, umfasst. Vorzugsweise wird dem Säugetier bei diesem Verfahren das ursprüngliche Antigen verabreicht, bevor der Impfstoff verabreicht wird. Wenn ein solches ursprüngliches Antigen verabreicht wird, wird dem Säugetier vorzugsweise auch einen Vektor verabreicht, der das ursprüngliche Antigen kodiert und im Säugetier exprimiert.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, um einen Impfstoff zu machen, der dem Säugetier verabreicht werden kann, um einen Immunschutz gegen Krankheitserreger, die ein Antigen mit einem ursprünglich immundominanten Epitop umfassen, zu verursachen. Das Antigen umfasst auch eine Vielfalt an Aminosäuren, einschließlich einer Teilmenge an Aminosäuren die das ursprüngliche immundominante Epitop umfasst. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte: 1) das Erzielen einer Polynukleotidensequenz, welche die Vielfalt an Aminosäuren kodiert, einschließlich der Teilmenge an Aminosäuren die das ursprünglich immundominante Epitop enthält; 2) das Modifizieren der Polynukleotidensequenz, um ein modifiziertes immundominantes Epitop zu kodieren, das eine andere Teilmenge an Aminosäuren umfasst, als die des ursprünglich immundominanten Epitops; 3) das Exprimieren der Polynukleotidensequenz als Ergebnis des Modifizierungsschrittes, wodurch ein modifiziertes Antigen produziert wird, welches das modifizierte immundominante Epitop enthält, wobei das modifizierte immundominante Epitop im Vergleich zu dem ursprünglich immundominanten Epitop immungedämpft ist; und 4) das Formulieren einer Impfstoffkomposition, die das modifizierte Antigen und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.

In diesem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann der Modifizierungsschritt die Produktion einer modifizierten Polynukleotidensequenz umfassen, welche zumindest eine Aminosäurensubstitution im ursprünglich immundominanten Epitop kodiert. Diese modifizierte Polynukleotidensequenz kann zum Beispiel ein modifiziertes immundominantes Epitop kodieren, das von humanen B-Zellen toleriert wird. Das modifizierte immundominante Epitop kann zum Beispiel ein humanes lineares B-Zellen Epitop sein. In dem Modifizierungsschritt kann die Teilmenge an Aminosäuren, welche das ursprünglich immundominante Epitop umfasst, eine ursprüngliche Ladung aufweisen und der Modifizierungsschritt kann eine modifizierte Polynukleotidensequenz produzieren, die ein modifiziertes immundominantes Epitop kodiert, das eine andere Ladung aufweist, als die ursprüngliche Ladung. In einer anderen Ausführungsform kann der Modifizierungsschritt die Produktion einer modifizierten Polynukleotidensequenz umfassen, die zumindest eine Aminosäurendeletion in das ursprünglich immundominante Epitop kodiert.

Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist ein Verfahren, um einen Impfstoff zu machen, der humanen Subjekten verabreicht werden kann, um in besagtem Subjekt einen Immunschutz gegen HIV-1 zu verursachen. Dieses Verfahren umfasst das Erhalten von einem HIV-1 gp120/160 Antigen; das Behandeln von diesem HIV-1 gp120/160 Antigen durch die Exposition gegenüber Thrombin, um das gp120/160 Antigen zu spalten; und das Formulieren einer Impfstoffkomposition, die das mit Thrombin behandelte Antigen und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. Vorzugsweise bleibt dabei die 9238 Stelle vom benutzten gp120/160 Antigen während des Behandlungsschrittes des Verfahrens intakt.

Noch ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist ein Verfahren, um einen Impfstoff zu machen, der humanen Subjekten verabreicht werden kann, um im Säugetier einen Immunschutz gegen HIV-1 zu verursachen. Dieses Verfahren umfasst das Erhalten von einem HIV-1 gp120/160 Antigen; das Behandeln von diesem HIV-1 gp120/160 Antigen durch die Exposition gegenüber Thrombin, um das gp120/160 Antigen zu spalten; und das Formulieren einer Impfstoffkomposition, die das mit Thrombin behandelte Antigen und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 ist ein schematisches Diagramm von pJJ25 Plasmid.

Fig. 2 ist ein schematisches Diagramm von pMCII Plasmid.

Fig. 3 ist ein schematisches Diagramm von pSC65 Plasmid.

Fig. 4 ist ein schematisches Diagramm von pJJ5 Plasmid.

Fig. 5 ist ein schematisches Diagramm von pSC59 Plasmid.

Fig. 6 ist ein schematisches Diagramm der HXB2 V3- Schleife des gp120/160 Hüllproteins. Der Austausch von Aminosäuren durch gezielte Mutagenese wird illustriert. Die verschiedenen Mutanten werden als 1 (RIR); 2 (RGP); 3 (FVT); 4 (NMR) bezeichnet. Alle hier gezeigten Mutationen sind entworfen worden, um Übereinstimmungsmuster zu generieren, die die N-gebundene Glykosylation von Proteinen auf exozytotischen Weg durchführen.

Fig. 7 zeigt die Primärsequenz des HXB2-V3-Bereichs, die Epitopziele der Antikörperreagenzien, die genutzt wurden, um die Antigenität des rekombinanten Hüllproteins zu bewerten und eine aus der Western-Blot-Analyse abgeleitete Zusammenfassung der Antikörper-bindungsdaten. Ein "+" zeigt eine Antikörperreagensfärbung an und "-" zeigt keine erkennbare Färbung.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung A. Definition der Begriffe

Der Begriff "Immunschutz", wie hierin verwendet, bezeichnet die Fähigkeit, einer Infektion vorzubeugen und/oder einen Schutz, eine Prävention oder eine Abschwächung einer durch einen Erreger verursachten Krankheit zu erreichen.

"Immundominantes Epitop" bedeutet das Epitop auf einem Antigen, das selektiv eine Immunantwort in einem Wirtorganismus zu einer erheblichen Exklusion anderer Epitope dieses Antigens verursacht.

"Ein Epitop zu immundämpfen" bedeutet das Epitop zu modifizieren, um das Immunsystem des Wirtorganismus erheblich davon abzuhalten, Antikörper gegen dieses Epitop zu produzieren. Immundämpfen bedeutet jedoch nicht das Epitop vollständig zu entfernen.

Der begriff "gp120/160", wie hierin benutzt, bezieht sich auf das Gen, welches das an die Membran gebundene gp 160 und das hieraus abgeleitete freie gp120 kodiert, sowie auf eines der beiden Genprodukte.

Weitere Begriffe werden erklärt, sobald sie in Verbindung mit dieser detaillierten Beschreibung der Erfindung benutzt werden.

B. Verwendete rekombinante Plasmide

Verschiedene Plasmide werden hierin in Verbindung mit spezifischen Beispielen von Verfahren beschrieben, um diese Erfindung zu machen und zu nutzen. DeJong et al., in Vaccines 92, Modern Approaches to new Vaccines Including the Prevention of AIDS, Chanock et al., eds. New York (1992), verwendeten die rekombinanten Plasmide pJJ25 und pMC, um das Subklonieren einer Region, das den dritten hypervariablen Bereich (V3-Schleife) von HXB2, HIV-1 gp120/160 enthielt, zu vereinfachen. Das rekombinante Plasmid pJJ25 trägt ein Ncol zum BamHI HXB2-ähnlichen Fragment (nts 5675-8478), das eine schmale Pvull-Xbal Stuffer-Insertion enthält. Das rekombinante Plasmid pMCII trägt eine komplette Länge von infektiösen HXB2-ähnlichen Genomen. Der Expressionsvektor pSC65, beschrieben in Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley- Interscience Supplement 15 (1992), Abs. 16.17.2, trägt einen früh-späten super Vaccinia-Promotor mit nebeneinander gestellten Abwärtssubklonierungsstellen in der Mitte eines intakten Thymidinkinase-Gens. Modifiziertes pGEM-1 (Promega Corps., Madison, WI) wurde als direkter Empfänger für den Austausch der V3-Schleife verwendet. Das Plasmid pJJ5 ist ein völliger molekularer Klon von HXB2 ohne das NcoI- BamHI Fragment (nts 5674-8474 der Los Alamos Nomenklatur). Das pSC59 Plasmid ist das verwandte Plasmid, welches in der Konstruktion von pSC65 verwendet wurde.

Die HXB2-Sequenz, einschließlich einer umfassenden Restriktionskarte, kann in GenBank unter Accession Nr. K03455 lokalisiert werden. Weitere Sequenzdaten, die die Pvull und Xbal Schnittstellen zeigen, können in GenBank unter Accession Nr. M17449 gefunden werden.

C. Einschleusung

Wir haben entdeckt, dass das Immundämpfen eines immundominanten Antigenepitops zur Produktion von Antikörpern mit hohem Titer gegen nicht dominante Epitope dieses Antigens in einem Wirtorganismus führen kann. Solche immungedämpfte Antigene können als wirksame Impfungen gegen Organismen, die ein Antigen mit einem hoch variablen immundominanten Epitop aufweisen, wie HIV und Influenza- Virus, Lentiviren und andere Viren, dienen.

In einer beispielhaften Anwendung unserer Entdeckung haben wir entdeckt, dass rekombinante gp120/160 Proteine des humanen Immundefizienzvirus-1 (HIV-1), welche ein überzähliges N-gebundenes Carbohydrat im immundominanten V3- Bereich aufweisen, neue Antigeneigenschaften vorweisen. Darunter findet man die Unfähigkeit, Antikörper zu binden, die Wildtypen des V3 Epitops erkennen. Wir haben ebenfalls entdeckt, dass die Anwesenheit dieses Anteils an überzähligen Carbohydraten die infektiöse Lebensfähigkeit des HIV-1 rekombinanten Virus nicht gefährdet. Wir haben außerdem entdeckt, dass Versuchstiere, die mit einem rekombinanten Virus, der die Expression eines gp120/160- Protein-V3-Mutanten mit überzähligen N-gebundenen Carbohydratanteilen leitet, immunisiert worden sind, hohe Antikörpertiter zeigten, die die Infektion durch einen HIV- 1-Wildtyp in vitro neutralisieren. Demnach veranlasst die Immundämpfung des immundominanten Epitops innerhalb des V3- Bereichs von gp120/160 die Immunantwort dazu, sich auf andere neutralisierende Epitope, die im gleichen Antigen lokalisiert sind, zu konzentrieren.

D. Identifizierung des Organismus

Die Techniken dieser Erfindung können verwendet werden, um wirksame Impfstoffe gegen eine große Anzahl von beziehungslosen Krankheitserregern zu entwickeln. Die Erfindung wird am geeignetesten bei Erregern angewendet, die eine strategie entwickelt haben, um die Immunantwort des Wirtes zu vereiteln, indem sie ein immundominantes Epitop haben, das ein hohes Antigendriftniveau zeigt. Solch ein immundominantes Epitop nimmt in der Regel die Form einer Vielfalt an Aminosäuren an, die verändert werden kann, ohne die Lebensfähigkeit des Erregers zu beeinflussen. Beispiele eines solchen immundominanten Epitops sind der V3-Bereich des HIV-1 gp120/160 und HA des Influenza-Virus. Andere Epitope, die eine Immundominanz aufweisen könnten, sind die, die dafür bekannt sind, dass sie im Laufe der Infektion sehr stark variieren, wie das Oberflächenantigen der afrikanischen Trypanosome.

E. Identifizierung des immundominanten Epitops

Die Impfstoffe dieser Erfindung werden zuerst durch die Identifikation des immundominanten Epitops in einem Krankheitserreger gebildet. Ein Antigen, das ein immundominantes Epitop tragen könnte, kann identifiziert werden, indem Antigene auf der Oberfläche des Erregers ausgewählt werden. Zum Beispiel besitzen die meisten einfachen Organismen, wie Pilze, Bakterien und Viren ein oder zwei Proteine, die auf der Oberfläche des Erregers exponiert sind. Diese Oberflächenproteine tragen höchst wahrscheinlich das geeignete Antigen. Die Proteine tragen am wahrscheinlichsten ein immundominantes Epitop, das mit Hilfe einer Western-Analyse identifiziert werden kann, bei dieser Analyse werden Totalproteine auf einem Gel durchgeführt gegen ein Serum aus einem mit dem Erreger infizierten Organismus. Die gebundenen Antikörper aus dem Serum werden durch gekennzeichnete Anti-Antikörper identifiziert, wie in einer der bekannten ELISA-Techniken.

Das immundominante Epitop kann durch die Bewertung des Serums eines mit dem Erreger infizierten Wirtsorganismus identifiziert werden. Das Serum wird in bezug auf seinen Inhalt an Antikörpern, welche an die identifizierten Antigene binden, die eine Immunantwort im Wirtsorganismus verursachen könnten, bewertet. Wenn ein immundominantes Epitop in diesen Antigenen vorhanden ist, werden erheblich viele Antikörper im Serum an das immundominante Epitop binden, bei keiner oder schwacher Bindung an die anderen Epitopen, die im Antigen vorhanden sind.

Als Identifizierungsbeispiel eines immundominanten Epitops wurde der V3-Bereich des HIV-1 gp120/160 durch andere als das immundominante HIV-1-Epitop identifiziert, durch Peptidscanning in einer Vergleichsanalyse. Es wurden Antisera erhalten, die das Virus in vitro neutralisierten. Eine Serie von überlappenden Peptiden wurde aus gp120/160 vorbereitet. Überschüsse jedes dieser Peptide wurden fortlaufend dem Serum hinzugefügt. Jede Serumprobe wurde auf ihre neutralisierende Wirkung auf HIV-1 getestet. Man fand heraus, dass Peptide aus dem V3-Bereich von gp120/160 die neutralisierende Wirkung des Serums stark beseitigen.

F. Immundämpfung eines immundominanten Epitops

Nachdem ein immundominantes Epitop identifiziert worden ist, wird das immundominante Epitop immungedämpft. Die Immundämpfung kann anhand einer der verschiedenen Techniken, wie sie weiter unten beschrieben sind, durchgeführt werden.

Einschleusung von N-gebundenen Carbohydraten

Immundominante Epitope können durch die Einschleusung von N-gebundenen Carbohydratresten immungedämpft werden. Dies kann bei Peptidepitopen durch eine gezielte Mutagenese des Gens, welches das Epitop kodiert, um zusätzliche N- gebundene Glykosylationssignale zu enthalten, leicht erreicht werden.

Die Anwesenheit von N-gebundenen Carbohydraten (CHO) wird durch die primäre Aminosäurensequenz des Polypeptids bestimmt. Es wird angenommen, dass eine Triplett-Sequenz von Aminosäuren, bestehend aus Asparagin, gefolgt durch irgendeine Aminosäure und endend mit Serin oder Threonin (N-X-S/T), wobei X irgendeine Aminosäure außer Prolin- oder Aspartinsäure ist, als Signal für N-gebundene CHO-Additionen wirkt. Es wird angenommen, dass die Addition von komplexen Carbohydraten wie solche, die bei N-gebundenen Sequenzen genutzt werden, die Fähigkeit des Immunsystems, Antikörper an dieser Stelle zu erheben, verringert oder dämpft. Dies ist für bestimmte N-gebundene Bereiche des Hemagglutinin-Influenza-Proteins vorgeschlagen worden. Wiley et al. Nature, 289: 373-387 (1981). Bei der Influenza schützen die CHO-Additionen die Viren vor dem Immunangriff. Deswegen kann die Kenntnis der primären Aminosäurensequenz eines bestimmten krankheitserregenden glykoproteins, wie Proteine die durch das Immunsystem gesehen werden, dazu benutzt werden, um die Einschleusung oder die Deletion dieser N-gebundenen Sequenzen über molekulare Manipulation Stellen-gerichtet zu handhaben. Die Einschleusung dieser N- gebundenen Stellen ist dazu bestimmt, B-Zellen an einer Antwort auf diese Sequenzen zu hindern.

Als Beispiel für die Immundämpfung eines Epitops durch eine N-gebundene Carbohydrat-Addition, kann die immundominante HIV-1 gp120/160-V3-Schleife wie in Beispiel 1 durch eine PCR gezielte Mutagenese immungedämpft werden.

Beispiel 1 Gezielte PCR-Mutagenese

N-gebundene Glykosylationsübereinstimmungsstellen (z. B. Aminosäuren NXT oder NXS) wurden mit dem Haguchi Verfahren, PCR Protocols, S. 177-183, Academic Press, San Diego, CA (1990) - durch Bezugnahme hierin integriert -, in die V3- Schleife über gezielte PCR-Mutagenese eingeschleust. Kurz, komplementäre Primerpaare, die exakte V3-Sequenzen und die gewünschte N-gebundene Mutation trugen, wurden synthetisiert. Zwei teilweise komplementäre Hälften der V3- Region von pMC wurden durch PCR verstärkt. Reaktion 1 enthält einen 5'-Primer, der eine einzige, natürlich vorkommende Pvull-Stelle (nts 7082-7087) überlappte, die genau proximal zu dem V3-N-terminalen Cystein ist, und einen 3'-Primer einschließlich einer N-gebundenen inframe Mutation. Reaktion 2 enthielt ein 5' umgekehrtes Komplement zu dem 3'-Primer, der in Reaktion 1 verwendet wurde, und einen 3'-Primer, der eine inaktive Xbal-Mutation, genau proximal zu dem C-terminalen Cystein der V3-Schleife (nts 7223-7228) überlappte und enthielt. Beide Reaktionen waren Elektrophoresen auf Agarose, ausgeschnitten aus dem Gel, und die Gelscheiben wurden 15' lang in einer 1.5 ml Costar-Röhre (Amicon) zentrifugiert. Drei ul aus den Reaktionen 1 und 2, 5' V3 Pvull-Primer aus der Reaktion 1, und 3'V3 Xbal Primer aus der Reaktion 2 wurden als Substrate und Primers in einer dritten PCR-Verstärkung verwendet. Das resultierende verstärkte Produkt enthielt eine Pvull zu Xbal-V3-Schleife, die Fragmente enthielt, welche die gewünschte N-gebundene Kombination trugen. Einzelne Mutanten wurden als Substrate für die Verstärkung von nachfolgenden Kombinationen von V3 N-gebundenen Mutanten benutzt.

Fig. 6 zeigt die Aminosäurensequenz der V3-Region von gp120/160 (SEQ ID NO.1) und die vier N-gebundenen Glykosylationsstellen, die entsprechend der Ausführungsform dieser Erfindung in dieser Region eingeschleust worden sind. Diese mutierten Stellen werden der Einfachheit halber hierin als Mutant 1, 2, 3 und 4 erwähnt. Tabelle 1 zeigt die benutzten PCR-primers entsprechend der Ausführungsform dieser Erfindung, um die gewünschten N-gebundenen Glykosylationssignale für einzelne und verschiedene multiple Mutanten einzuschleusen. Tabelle 1 zeigt ebenfalls PCR- Primers für Notl-Stellen, wie hierin woanders beschrieben.

Tabelle 1

Die mutagenisierten Polynukleotide von Beispiel 1 können in ein Kassettensystem für einen einfachen Transfer in geeignete Expressionsvektoren, wie in Beispiel 2 eingeschleust werden.

Beispiel 2 Konstruktion einer pGEM 120-Kassette

Zwei Plasmidzwischenkassetten wurden konstruiert, um den Transfer der modifizierten V3-Bereiche zu vereinfachen. Dies war notwendig, da der Vaccinia-Expressionsvektor pSC65 inhärente Pvull- und Xbal-Stellen aufweist, die diesen für einen V3 Pvull-Xbal-Transfer verbieten. Eine Sall-Notl- Polybindung wurde in ein Sall-Pvull aufgespaltenes pGEM-1 einligiert. Die gp120/160-Sequenz von pJJ25 wurde durch die Verwendung von einem 5'-Sall-Primer, der das Startkodon von gp160 überspannte und von einem3'-Primer, der ein in-frame Stoppkodon an der 120/41 Schnittstelle sowie eine Notl- Stelle genau proximal zum Stoppkodon enthält, verstärkt. Das PCR-Produkt wurde mit Sall und Notl aufgespalten und in ein Sall-Notl modifiziertes pGEM-1 subkloniert. Die V3 minus gp120/160 Hülle wurde sequenziert und man fand heraus, dass sie, verglichen mit der veröffentlichten HXB2-Sequenz, zwei inaktive Veränderungen und zwei Aminosäurenänderungen aufwiesen. Ratner et al. AIDS Res. Hum. Retroviruses 7: 615 (1991). Dieser Vektor pGEM-B2-120 wurde verwendet, um die Pvull-Xbal aufgespaltene N-Bindung modifizierter V3-Fragmenten anzunehmen, sowie zum endgültigen Transfer des modifizierten gp120/160 in ein Vacciniaexpressionsvektor.

Ein weiteres Verfahren, um einen neuen N-gebundenes Glykosylationssignalmuster zu konstruieren, wird hierunter in Beispiel 3 gezeigt.

Beispiel 3 Verfahren, um Nukleinsäurensequenzen zu konstruieren, die HIV-1 gp120/160-Proteine kodieren, welche N-gebundene Glykosylationssignalmuster tragen.

Ein Polymerase-Ketten-Reaktion-Protokoll (PCR- Protokoll) für gezielte Mutagenese wurde verwendet, um N- gebundene Glykosylationssignalmuster in den Teil des HXB2, HIV-1 Genoms einzuführen, das mit dem dritten hypervariablen Bereich (der V3-Schleife) von gp120/160 übereinstimmt. Das pMCII-Plasmid, das eine volle Länge des infektiösen HXB2- ähnlichen Genoms trägt, wurde als Matrize für die PCR- Mutagenese verwendet. Komplementäre synthetische Oligonukleotidenprimerpaare, die Fehlpaarungen tragen, die dazu bestimmt sind, die gewünschten N-gebundenen Mutationen einzuführen, wurden durch Operon Technology Inc. synthetisiert. Zwei teilweise komplementäre Hälften der V3- Region des pMCII-Plasmids wurden durch PCR entsprechend den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen verstärkt.

Beispiel 3 weiter oben illustriert wie die Gensequenz, welche den V3-Bereich von gp120/160 kodiert, verändert werden kann, um neue N-gebundene Glykosylationssignalmuster zu kodieren. Die wesentlichen Komponenten dieses Ansatzes beinhalten die Verwendung eines auf PCR basierenden Mutageneseprotokolls und die Verwendung von Plasmidkassetten, die im V3-Bereich mutierten Polynukleotidensequenzen als Restriktionsfragmente erhalten können.

Primers für PCR wurden so konzipiert und synthetisiert, dass die drei Kodons, die die Triplett-Sequenz von Aminosäuren innerhalb des V3-Bereichs von gp120/160 kodieren, ausgelassen wurden. Diese Primers wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben, hauptsächlich verwendet, um gp120/160 Kassetten zu produzieren, die alle gp120/160 Kodierungssequenzen bis auf die RIR Aminosäurensequenz, die im Wildtyp vorhanden ist, aufweisen. Wir haben den gleichen Ansatz, der vorher beschrieben worden ist, verwendet, um diese Modifizierungen in rekombinante Vaccinia- Virusexpressionskonstruktionen zu integrieren. Diese Konstruktionen wurden dann dazu genutzt, um in Kulturen wachsende Zellen zu infizieren, um rekombinante gp120/160 Glykoproteine, die kleine Deletionen innerhalb des V3- Bereichs aufweisen, zu produzieren. Die selben Viruskonstruktionen wurden verwendet, um Versuchstiere zu infizieren, so dass eine Immunantwort auf diese rekombinante gp120/160 Glykoproteine provoziert wird.

Beispiel 4 Verfahren, um einen Plasmidvektor zu konstruieren, der benutzt werden kann, um Wildtypen und modifizierte DNA Fragmente, die den V3-Bereich von gp120/160 kodieren, anzunehmen.

Ein modifizierter Plasmidvektor wurde konstruiert, um Subklonierungsmanipulationen, die Pvull zu Xbal-DNA Fragmente, welche den V3-Bereich von gp120/160, wie beschrieben in Beispiel ?, betreffen, zu vereinfachen. Die Verwendung dieses modifizierten Plasmids ist notwendig, weil das pSC65-Vaccinia-Expressionsplasmid, das schließlich genutzt werden würde, um die modifizierten DNA Fragmente, wie in Beispiel 3 präpariert, zu empfangen, ungewünschte Pvull und Xball-Restriktionsstellen beherbergt. Somit kann das pSC65-Plasmid nicht so geschnitten werden - nur mit Pvull und Xbal -, um die mutierte V3-Sequenz wie ein Pvull- Xbal-Restriktionsfragment entsprechend zu empfangen. Der modifizierte Plasmidvektor wurde in zwei Schritten wie folgt präpariert. PGEM1 Plasmid (Promega) wurde mit Sall und Pvull gespaltet. Das Vektor-enthaltende Fragment wurde dann in ein synthetische Sall-Notl-Polybindungsoligonukleotide einligiert. Eine weitere Manipulation wurde auf pJJ25- Plasmid ausgeführt, das ein Ncol zu BamHI HXB2-ähnliches Fragment beherbergt, das eine kleine Pvull-Xbal Insertion enthält. Die gp120/160 Sequenz von pJJ25 wurde mit Hilfe eines 5'-Sall-Primers verstärkt, der den translationellen Startkodon von gp160 verstärkte, und eines 3'-Primers, der einen in-frame Stoppkodon an der gp120/160 Schnittstelle sowie eine Notl-Stelle genau proximal vom Stoppkodon enthielt. Dieses PCR Produkt wurde mit Sall und Notl aufgespalten und in die Sall-Notl Stelle des modifizierten pGEM1 Plasmids subkloniert. Dieses Plasmid, genannt pGEM-B2-120, wurde verwendet, um Pvull-Xbal DNA Fragmente, welche die in der V3 Region modifizierten DNA Sequenzen tragen, präpariert wie im Beispiel 3 weiter oben, anzunehmen. Das ermöglicht dann die Excision der kompletten gp120/160 Kodierungssequenz von mutierten Konstruktionen, die modifizierte Pvull-Xbal Inserts enthalten, als ein Sall- Notl Fragment.

Beispiel 5 Konstruktion von Plasmiden, die mit dem V3-Bereich übereinstimmende Wildtypen und modifizierte DNA Fragmente, annehmen und die gesamte Länge des Hüllgens (gp120/41) rekonstruieren werden.

Um V3-Region gezielte Mutanten wie die, die im Beispiel 3 beschrieben werden, in den Kontext der gp160 Gensequenz einzugliedern, wurde das pGEM-B2-120 Plasmid modifiziert, um zusätzliche gp160 Kodierungssequenzen zu enthalten. Dies wurde erzielt, indem ein neues Plasmid geschaffen wurde, in dem das Xbal-Notl Fragment des pGEM-B2-120 Plasmids durch ein größeres Xbal-Notl Fragment ersetzt wurde, welches DNA- Sequenzen enthielt, die sich abwärts der 120/41 Schnittstelle und in der gp160 Kodierungssequenz befinden. Um dies zu tun, wurde das pMCII Plasmid als Matrize für ein PCR benutzt, in dem der 5'-Primer eine inaktive Xbal Stelle auf nts 7223-7228 und der 3'-Primer eine Notl- Restriktionsstelle genau abwärts des gp120/160 Stoppkodons einschleuste. Das 1 kb Amplifikationsprodukt wurde dann für das kleinere Xbal-Notl Fragment des pGEM-B2-120 Plasmids ausgetauscht, um ein neues Plasmid zu schaffen, genannt pGEM-B2-160. Indem das pGEM-B2-160 Plasmid mit Pvull und Xbal gespaltet und das Stuffer-Fragment entfernt wurde, war es also möglich, Pvull-Xbal-DNA Fragmente einzuschleusen, die mutierte Sequenzen des V3-Bereichs trugen, wie in Beispiel 4 beschrieben.

Das nächste Beispiel zeigt, dass die Mutanten exprimiert werden können.

Beispiel 6 Verfahren, um einen Vektor zu konstruieren, der die Expression der N-gebundenen gp120/160 mutierten Proteine in HeLa-Zellen leitet.

Mutierte Hüllgensegmente wurden in einen pSC65 Vacciniaexpressionsvektor subkloniert, der durch die Einschleusung einer synthetische Sall-Notl-Polybindung in die Sall-Smal-Stelle des Plasmids verändert worden war. Dieses Plasmid beherbergt einen synthetischen früh-spät Promotor und eine Kopie des innerhalb eines TK-Gens lokalisierten Lac Z Gens.

Die Auswahl von rekombinanten Vacciniaviren ist durch Earl und Moss (Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience. Supplement 15, Units 16.15-16.18) beschrieben worden, - durch Bezugnahme hierin integriert. Kurz, 1 · 10&sup6; CV-1 Zellen werden mit dem viralen Vacciniastamm WR auf ein MOl von 0.05 infiziert. Diese Zellen werden zwei Stunden nach der Infektion mit 10 bis 20 ug der Vacciniaexpressionsplasmide, die die N-gebundene modifizierte HIV-1 Hülle enthalten, transfektiert. Die infizierten Zellen werden pelletiert, erneut in 0.5 ml MEM Suspension gelegt, 3 · gefroren und aufgetaut und fortlaufend verdünnt, um einzelne Plaques durch nachfolgende Infektion von humanen TK-HeLa-Zellen zu geben. Diese Zellen werden von weichem Agar in einem Medium, das 0.25 ug/ml Brom-deoxy-uridin enthält, überzogen und für 48 Stunden inkubiert. Eine zweite weiche Agerlage, das Plaquemedium, 1/200 Vol. 4%Xgal (Boehringer Mannheim) und 1/100 Vol. 10 mg/ml Neutralrot werden aufgetragen. Nach der Inkubation über Nacht werden die rekombinanten Kandidaten (d. h. TK- blaue Plaques) ausgewählt, erneut in eine 0.5 ml MEM Suspension gelegt und gehen durch zwei zusätzliche Plaquereinigungsrunden. Virale DNA werden sequenziert, um die Anwesenheit der N-gebundenen Mutation zu bestätigen.

Die Überprüfung des rekombinanten Virus, das gp120 oder gp120/41 exprimiert, wurde wie folgt beurteilt. Zellenimmunofluoreszenz mit HIV-1 Poolsera und ein zweites FITC-konjungiertes anti-humanes IgG wurden verwendet, um die Anwesenheit von Membran-gebundenem gp120/160/41 (d. h. 160 Expressionskonstruktionen) zu erkennen. Ein ELISA mit Antigenerfassung mit Hilfe von Ab am Carboxyende des gp120, HIV-1 humane Poolsera und FITC-konjungiertes anti-humanes IgG wurden verwendet, um sekretiertes gp120 oder sowohl gp120/160 als auch gp120/41 exprimierendes virus zu identifizieren. Zusätzlich wurde die Anwesenheit von gp120/160 oder gp120/160/41 durch Western Blot bestätigt. N- gebundene modifizierte V3-Proteine werden charakterisiert aufgrund ihrer Fähigkeit, das zelluläre und lösliche CD4 zu binden, 0.5ß, eine Batterie von diagnostischen V3- Antikörpern und anti-gp 31.

Wir haben die Glykosylationsstatus der mutierten gp120/160 Proteine entsprechend den in den zwei Beispielen beschriebenen Verfahren überprüft.

Beispiel 7 Verfahren, um den N-gebundenen Glykosylationsstatus der gp120/120 Proteine, die mutierte V3-Bereiche aufweisen, zu überprüfen

Rekombinante gp120/160 Proteine, die Kandidat für eine post-translationelle Addition von N-gebundenen Oligosacchariden sind, wurden auf die Anwesenheit von überzähligen Carbohydratanteilen getestet. Die gp120/160 Proteine in Lysaten von SupT1-Zellen, die mit einem rekombinanten Vacciniavirus infiziert waren (Beispiel 6), wurden zuerst durch Lentil-Lectin-Affinität angereichert und dann einer Teilspaltung über V8 Protease unterworfen. Die Spaltungsprodukte wurden dann auf ein 4-20% Polyacrylamidgel in Anwesenheit von SDS elektrophoresiert, ein Western-Blot ausgeführt und mit einem V3 spezifischen Antikörper visualisiert. Das Peptidfragment, das aus einem Protein, das den Wildtyp des V3-Bereichs aufwies, abgeleitet war, migrierte mit einem offenbaren Molekulargewicht von ca. 69 Kda. Man erwartet, dass nicht glykosylierte Mutanten eine ähnliche Mobilität zeigen. Die Anwesenheit von Carbohydratanteilen verspätet die Migration des Proteinfragments durch eine Masse, die etwa 2Kda in dieser Analyse entspricht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Mutanten 1 (RIR) und 2 (RGP) eine ähnliche Mobilität aufweisen, verglichen mit dem Wildtyp des V3-Peptidfragments. Umgekehrt zeigen die Mutanten 3(FVT) und 4 (NMR) eine leicht verzögerte Mobilität beim Western-Blot. Diese Ergebnisse stimmen mit der Anwesenheit eines überzähligen Carbohydratanteils im V3-Bereich der Mutanten 3 und 4 überein. Außerdem wird dieser Aufwärtsshift in der Molekülmasse der Peptidfragmente, die von Mutanten 3 und 4 abgeleitet werden, aufgehoben, wenn die Proteinproben mit einer Glykosidase vorbehandelt werden. Dieses Schema beweist überzeugend, dass zwei der mutierten V3-Bereiche neue Glykosylationsmodifizierungen tragen.

Beispiel 8 Verfahren, um die funktionelle Integrität von Rekombinanten gp120/160 zu überprüfen

Wir nutzten die Tatsache, dass ursprüngliches gp120/160 an der Targetzellenbindung und Eintritt teilnimmt, um Tests zu entwickeln, die die funktionelle Integrität der rekombinanten gp120/160 Moleküle beurteilen. Wir haben die rekombinanten HIV-1 gp160 N-gebundenen Mutanten in Zellen exprimiert. Mit einem ELISA-Assay wurde die Interaktion zwischen diesen mutierten Proteinen und einem löslichen CD4- Rezeptormolekül getestet. Für jedes rekombinante Protein wurden gp120/160 Konzentrationen durch ein ELISA Antigenerfassungsprotokoll bestimmt, das ein Antikörper an der C-Endung von gp160 (International Enzymes Inc., Fallbrook CA) verwendete und die Erfassung über lösliches CD4 ausführte. Der CD4 Bindungsindex wurde berechnet, indem das oberste Verhältnis zwischen ([gp160durch C- Endungserfassung]/[gp160 durch CD4-Erfassung] genommen wurde und durch das für den Wildtyp bestimmte Verhältnis dividiert wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 aufgezeigt.

Tabelle 2 V3 spezifische Antikörper ELISA

Relative Bindung von Antikörpern an mutierte Proteine verglichen mit dem Wildtyp-Protein wird wie folgt berechnet

+++> 90%, ++50-90%, + 10-49, -1-9, keine Bindung.

Die in der Tabelle 2 vorgestellten Ergebnisse beweisen, dass alle Proteine, die die N-gebundenen gezielten Mutationen beherbergten, CD4 banden. In dieser Tabelle sind alle Ergebnisse auf das Bindungsniveau, das für den Wildtyp des gp160 Glykoproteins festgestellt wird, normalisiert. Der Mutant in Position 3 zeigte die größte Reduktion in der CD4- Bindung. Alle anderen Mutanten befinden sich ziemlich nahe am Niveau, das für den Wildtyp des Hüllproteins festgestellt worden ist. Diese Ergebnisse veranlasste eine Untersuchung der funktionellen Integrität der Mutanten mit Hilfe einer unabhängigen Beurteilungsmöglichkeit.

Wir analysierten die funktionelle Integrität der N- gebundenen gp120/160 Mutanten weiter, indem wir die Lebensfähigkeit der rekombinanten HIV-1 Genome, die die N- gebundenen Mutationen im V3-Bereich des gp120/160 Hüllgens beherbergten, testeten. Alle N-gebundenen Mutationen wurden in Plasmide eingeschleust, die die kompletten HIV-1-Genome trugen. Diese potentiell infektiösen molekularen Klone wurden in SupT1-Zellen transfektiert. Die infektiöse Lebensfähigkeit wurde durch die Überwachung der p24- Expression bestimmt. Nach der anfänglichen p24-Spitze wurden zellfreie Supernatanten auf nicht infizierte SupT1 transferiert und erneut auf p24 und syncytiale Produktion überwacht. Alle vier einzelnen Mutanten sind lebensfähig. Die Inkorporation von multiplen Glykosylationssignalen in die V3-Schleife von gp120/160 machte alle Viruskonstruktionen lebensunfähig. Also unterbricht die Anwesenheit eines einzigen Glykosylationssignalmusters im V3-Bereich des gp120/160 Proteins nicht die gp120/160 Konformation so sehr, dass es die Lebensfähigkeit des Virus kompromittiert.

Beispiel 9 Verfahren, um zu überprüfen, ob gp120/160 Proteine, die mutierte V3-Bereiche tragen, veränderte Antigeneigenschaften aufweisen

Ein Western-Blot-Protokoll wurde benutzt, um das Antigenprofil der mutierten gp120/160 Proteine zu beurteilen. Die Gruppe von Antikörperreagenzien, die verschiedene Epitope innerhalb des Wildtyps vom HIV-1-V3- Bereich erkennen, sind auf der rechten Seite der Fig. 7 aufgelistet. Die Antigenziele dieser Reagenzien sind im unteren Diagramm der V3 Aminosäurensequenz dargestellt und beinhalten eine oder mehrere Stellen innerhalb des V3- Bereichs, die durch gezielte Mutagenese, wie in dem Beispiel 3 beschrieben, verändert worden sind.

Fig. 7 zeigt, dass Mutant 1 : 2 : 3 : 4 durch keinen der Antikörper erkannt worden ist. Andere einzelne und multiple Mutanten zeigten unterschiedliche Reaktionen auf die verschiedenen Antikörper. Der anti-gp41 Antikörper verband sich mit allen Mutanten. Also bestätigt das vorherige Beispiel, dass die Addition von N-gebundenen Glykosylationssignalen die Fähigkeit der Antikörper, sich an einem immundominanten Epitop zu binden ändern kann.

Primitive HeLa-Zellen-Lysate, die mit der rekombinanten Vacciniaviruskonstruktion infiziert worden sind (Beispiel 6), wurden für unsere Antikörperstudie als Quelle für Wildtyp- und mutierte gp120/160 Proteinen verwendet. Glykoproteine mit hohen Mannosegehalten wurden durch Affinitätschromatographie angereichert, mit Hilfe einer Lentil-Lectin-Sephrosesäule. Gebundene Glykoproteine wurden mit α-methyl-D-Mannose aus der Säule entzogen. Diese Proteine wurden dann durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese in Anwesenheit von SDS auseinandergespalten und einem Western-Blot unterworfen. Diese Blots wurden dann mit den verschiedenen Antikörperreagenzien untersucht, um Anwesenheit oder Abwesenheit der verschiedenen Antigenziele, die in dem Wildtyp der gp120/160 Molekülen gefunden werden, zu bestimmen. Eine gleichförmige Probenladung wurde durch die vergleichbare anti-gp41 Färbungsintensität für alle Proben bestätigt. Das Fehlen einer Färbung bei irgendeinem der anti-V3-Reagenzien muss deswegen von der Unfähigkeit des Antikörpers, das rekombinante Ziel zu erkennen, stammen, eher als von irgendeinem Ladungsartefakt.

Die Anwesenheit des Epitops, das durch einen besonderen Antikörperreagens erkannt wird, wird durch eine gefärbte Bande auf dem Western-Blot angezeigt. Der positive gp 120/160 Kontrollwildtyp wird wie erwartet von allen V3 spezifischen Antikörpern gebunden. Umgekehrt ist der Antigencharakter des Mutanten 1 : 2 : 3 : 4 ziemlich anders als der des Wildtyp-Hüllproteins. Dieser Mutant weist keines der Wildtypepitopen auf, die durch unsere Gruppe von Antikörperreagenzien entdeckt werden kann. Diese Ergebnisse bestätigen die Wirksamkeit unseres Ansatzes, um die Antigenstruktur des gp120/160 Moleküls zu verändern.

Änderung der ursprünglichen Ladung

Ein weiteres Verfahren, um ein immundominantes Epitop zu immundämpfen, ist die ursprüngliche Ladung des Epitops zu verändern. Dies kann durch gezielte Mutagenese des Gens, welches das immundominante Epitop kodiert, erfolgen. Zum Beispiel können Kodone, die die Ladung von Aminosäuren spezifizieren, so verändert werden, dass sie entweder eine Aminosäure mit umgekehrter Ladung oder eine nicht polare Aminosäure kodieren. Ähnlicherweise kann ein Kodon, das eine nicht polare Aminosäure kodiert, in eine polare Aminosäure mit entweder positiver oder negativer Ladung verändert werden.

Der Ansatz der Beispiele, die hier oben in Verbindung mit den N-gebundenen Glykosylationssignale beschrieben wurden, ist allgemein genug, so dass entsprechend ausgewählte PCR-Primers verwendet werden können, um etliche Mutationen in den V3-Kodierteil der gp120/160 Gensequenz einschleusen zu können. Die Aminosäuren, die zur allgemeinen positiven Nettoladung des V3-Bereichs beitragen, können durch andere Aminosäuren ersetzt werden, die entweder ungeladene oder Säureseitenketten haben. Als besonderes Beispiel ist bei dem RIR gezielten Mutanten (Fig. 6) die Ersetzung von zwei positiv geladenen Argininresten durch ungeladene Asparagin- und Serinreste beteiligt.

Antikörpermaskierung und Immunkonzentrierung

Noch ein weiterer Ansatz zur Re-Konzentration der Immunantwort weg vom immundominanten Epitop beteiligt die Antikörpermaskierung durch die Anteilbindung an diesem Epitop. Antikörper, die irreversibel an verwandte Antigenbereiche gebunden sind, können Zielepitope maskieren und verhindern, dass sie von B-Zellen gesehen werden. Eine Immunantwort kann mit einer solchen Strategie auf einen konservierteren Bereich, z. B. den gp120/160/CD4 Bereich, konzentriert werden. Zum Beispiel können V3 spezifische Antikörper irreversibel kreuzverbunden werden und das Komplex als Immungen vorgestellt werden. Zusätzlich kann irreversibel an gp120/160 gebundenes sDC4 als Start-Immungen benutzt werden. Antisera, die zu diesem Komplex erhoben werden, können irreversibel an gp120/160 gebunden werden. Dies umfasst eine Batterie von Antikörpern, die gegen nicht CD4-Bindungsbereiche auf dem Molekül erhoben werden. Dieser Komplex kann nun als ein Immungen vorgestellt werden, um Antikörper gegen den CD4-Bindungsbereich zu erheben.

Antikörper oder andere Ligande, die irreversibel an verwandte Antigenbereiche gebunden sind, können die gebundenen Epitope vor der Immunüberwachung maskieren. Mit dieser Strategie kann man die Konzentration der Immunantwort weg von einem immundominanten Epitop wie die V3-Schleife von gp120/160 auf einen konservierteren Bereich des Moleküls, z. B. den gp120/160/CD4 Bindungsbereich, leiten.

Antikörper, Antikörperfragmente, Antikörperanaloge oder andere Liganden, die irreversibel an verwandte Antigenbereiche gebunden werden können, können die gebundenen Epitope vor der Immunüberwachung maskieren. Man kann eine Immunantwort weg von einem immundominanten Epitop wie die V3-Schleife von gp120/160 auf konserviertere Bereiche des Moleküls, wie den gp120/160/CD4 Bindungsbereich, konzentrieren, indem eine auf die Produktion und die Verwendung von maskierten Immungenen basierende Strategie genutzt wird.

Beispiel 10 Verfahren, um ein immundominates Epitop durch die irreversible Bindung eines zweiten Moleküls auf diesen Antigenbereich zu maskieren

Ein maskiertes Immungen für HIV-1gp120 wird wie folgt geschaffen. Zuerst wird eine Lentil Lectin Sepharose Chromatographie durchgeführt, um gp120 aus den Supernatanten aus den HeLa-Zellekulturen, die mit dem HIV-1 Wildtyp infiziert worden sind, anzureichern. Stellen-spezifische monoklonale Antikörper, die Epitope innerhalb der V3- Schleife erkennen, werden dann ausgewählt. Der 0.5β genannte Antikörper bindet ein Epitop innerhalb der V3-Schleife, das mindestens 14 Aminosäuren umfasst. Passend gepufferte Lösungen des 0.5β-Antikörpers und das teilweise gereinigte gp120 werden dann kombiniert und kreuzverbunden nach dem Verfahren von Titus et al., J. Immunol., 138: 4018-4022 (1987), - durch Bezugnahme hierin integriert. Nach einer geeigneten Reaktionszeit wird die Probe verdünnt und die Reaktionsprodukte werden durch Gelfiltrationschromatographie getrennt. Die Säulenfraktion, die aus dem chemisch kreuzverbundenen Paar gp120/0.5β besteht, wird isoliert und gegen eine geeignete Pufferlösung auf saliner Basis dialysiert. Der kreuzverbundene Komplex kann dann mit Hilfe eines geeigneten Adjuvans in einem standard Immunprotokoll verwendet werden.

Initiationsphase und Ankurbelung mit maskierten Decotopen

Ein weiterer Ansatz für die Immundämpfung besteht darin, eine Primärimmunisierung zum ursprünglichen Antigen durchzuführen, zum Beispiel Tiere mit der ursprünglichen HIV-1 Hülle durch eine Infektion mit passend veränderten rekombinaten Vaccinia. Die Tiere können dann mit V3 verändertem gp120/160 verstärkt werden, um Sekundärantworten auf andere Epitope zu leiten.

Einschleusen von tolerierten Sequenzen

Ein anderer Ansatz, der genutzt werden kann, um die immundominanten Epitope, die durch Erreger kodiert werden, zu immundämpfen, ist die Sequenz an Aminosäuren dieser Antigenregion mit einem Proteinmuster, das durch das humane Immunsystem toleriert wird, zu ersetzen. Zum Beispiel, kann die ursprüngliche Sequenz an Aminosäuren in der V3-Schleife durch eine Sequenz ersetzt werden, die von humanen B-Zellen toleriert wird. Dies würde per Definition irgendein lineares humanes B-Zellen-Epitope einschließen. Ziel dieses Ansatzes ist eine mutierte Form des Erregerantigens zu schaffen, indem ein Segment des Erregerantigens durch eine Sequenz an Aminosäuren ersetzt wird, die einen humanen Charakter aufweist. So wird das humane Immunsystem daran gehindert, eine starke Immunreaktion gegen diese Region des Erregerantigens, das andernfalls als dominantes Epitop dienen würde, zu erheben.

Beispiel 11 Konstruktion eines rekombinanten Vacciniavirusvektors, der gp120/160 Protein exprimiert, in dem die V3-Schleife durch ein toleriertes humanes Epitop ersetzt wird.

Ein chimärisches immungedämpftes Antigen in dem der immundominante Bereich des ursprünglichen Antigens durch eine tolerierte humane Sequenz ersetzt wird, wird wie folgt konstruiert. Wir beginnen mit der Isolierung eines DNA-Restriktionsfragments, das eine Aminosäurenstrecke kodiert, die einem Polypeptid entspricht, auf dem das humane Immunsystem normalerweise nicht antwortet. Die Sequenz an Aminosäuren des humanen IgM CH&sub3; Bereichs wird dazu genutzt. Die komplette Sequenz an Aminosäuren dieses Bereiches kann in Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1991) erhalten werden. Das DNA-Restriktionsfragment wird isoliert aus einem Nukleosäurenklon, wenn geeignete Restriktionsstellen verfügbar sind. Als Alternative kann ein PCR-Protokoll genutzt werden, um geeignete Restriktionsstellen in solch eine Nukleosäurensequenz einzuschleusen. Ein solches DNA-Fragment wird dann in pGEM-B2-120 und pGEM B2-160 Plasmide einligiert, die wir vorher in dieser Anwendung beschrieben haben. Es wird besonders darauf geachtet, die translationellen Leserahmen des gp120/160 sowie die transplantierten humanen Antigensequenzen zu schützen. Somit werden modifizierte gp120 und gp160 Genkassetten geschaffen, die Ersetzungen der tolerierten humanen Sequenz anstelle des Wildtyp-V3-Bereichs tragen. Das Sal-Notl-Restriktionsfragment von diesen Kassetten wird dann in die modifizierten pSC65 Vacciniavektoren transferiert (beschrieben in Beispiel 6). Diese Gensequenzen werden danach in lebensfähige Viruskonstruktionen entsprechend Standardtechniken integriert.

Obwohl die folgenden Verfahren auf unseren Meerschweinen als Versuchstiere ausgeführt worden sind, können Fachkräfte einfach einen ähnlichen Ansatz humanen Subjekten anpassen.

Thrombinspaltung

Thrombin spaltet nur HX10 gp120/160 in zwei Fragmente, geschnitten zwischen den Aminosäuren R und A in der V3- Schleife. Clemets et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 7: 3- 16 (1991). Neutralisierende Antikörper (110.5 0.5 B), deren Bindungsbereich die oberen Aminosäuren einschließt, werden sich nicht an der aufgespaltenen Schleife binden. Andere V3- Bindungsantikörper, deren Erkennungssequenz linear intakt geblieben ist, binden noch die gespaltene Schleife (9284). Trotzdem spaltet eine längere Behandlung mit Thrombin Sekundärstellen, was die 9238-Stelle schadet, so wie andere mögliche Spaltstellen anderswo verursacht. Eine kontrollierte Spaltung mit Thrombin wird also einiges der Neutralisierungsantigenität des V3-Epitops entfernen.

Deletion

Das HIV-1-Hüllgen ist in fünf hypervariablen (V) Hauptregionen gruppiert, die zwischen fünf konstanten Bereichen (C) verteilt sind, und die Muster C1-V1-V2-C2-V3- C3-V4-C4-V5-C5 ergeben. Coffin vermutete, dass die variablen Bereiche in einer solchen Art vorhanden sein könnten, dass Schleifen in der gp120/160 Struktur vorkommen können, ohne die strukturelle und funktionelle Natur des Moleküls zu beeinflussen. Dies impliziert, dass sich gp120/160 unabhängig von der Sequenzheterogenität in den variablen Bereichen an CD4 bindet. Der variable Bereich von gp120/160 könnte zusätzlich für die zwischen Virusstämmen vorhandene Antigenvariation verantwortlich sein, indem er die Immunantwort von den mehr konservierten Bereichen wegleitet. Um diese Hypothese zu testen, haben Haigwood et al., Supra, systematisch alle variablen Regionen von SF gp120/160 deletiert und diese deletierten Proteine in Hefe exprimiert. Sie vermuteten, dass die Nutzung dieser Deletanten als Immungene mehr konservierte Epitope demaskieren könnte. Diese Studien erfolgten mit denaturierten, nicht glykosylierten und in Hefe exprimierten Versionen und es gelang ihnen nicht, eine mehr konservierte Antwort zu entlocken. Außerdem bindet keine der Deletionsvarianten, die in dieser Studie getestet wurden, an CD4. Dies kann auf die Notwendigkeit hinweisen, das Hüllglykoprotein in einem ursprünglichen Zustand halten zu müssen, um die Immungenizität zum gp120/160/CD4 Bindungsbereich zu behalten, wie von den Autoren suggeriert, oder die glykosylierte Version ist in einer nicht ursprünglichen Konformation. Unabhängige Arbeiten von anderen suggerieren, dass die hypervariablen Regionen von gp120/160 für die CD4- Bindung nicht notwendig sind, da Proteine von deletierten Mutanten, die variable Bereiche V1, V2 und V3 entfernen, immer noch mit großer Affinität an CD4 binden. Obwohl die Bindung zu CD4 anscheinend ununterbrochen war, bindet dieses deletierte Protein, das immer noch die V4 und V5 hypervariablen Bereiche trug, die für eine CD4 Bindung erforderlich sind, keine go Antisera gegen gp120/160 erhoben. Dies ist überraschend, da Chang berichtete, dass Antikörper mit schwacher Affinität zum gp120/160/CD4 Bindungsbereich erhoben werden. Diese Daten suggerieren daher, dass V4 und V5 entweder nicht immunogene Bereiche sind, oder wahrscheinlicher, dass die ursprüngliche Konformation dieses Proteins durch die Deletion verändert worden ist, und die Immunsera das deletierte Protein nicht erkennen können. Ungeachtet dessen, birgt die Nutzung als Immungen bestimmte Versprechen, da die Immunantwort auf einen potentiell konservierteren gp120/160/CD4 Bindungsbereich geleitet werden kann.

G. Impfstoffe

Wie aus der vorherigen Besprechung von verschiedenen Immundämpfungstechniken bewusst geworden ist, haben wir als Modelsystem für unseren Impfungsansatz die Immundämpfung der immundominaten V3-Schleife von HIV-1 gp120/160 benutzt. Jedoch, und dies wird von einer Fachmann bereitwillig geschätzt werden, kann dieser Ansatz einfach auf andere Erreger angewendet werden, entsprechend den Mitteilungen, die hierin bekannt gegeben worden sind. Passend dazu wird hierunter die Entwicklung einer wirksamen Impfungsformulation und eines Protokolls hierunter in Verbindung mit einem HIV-1 Impstoff beschrieben. Diese Beschreibung wird nur als ein Beispiel vorgetragen, sie beschränkt die Anwendung der Erfindung nicht auf irgendeinen besonderen Erreger.

Der wirksamste Entwurf eines HIV-1 Impfstoffes wird die wenigen kritischen Eigenschaften des Virus nutzen, die es zu einem solch erfolgreichen Erreger gemacht haben. Den HIV-1- Virus zuerst davon abzuhalten, das Immunsystem zu täuschen, bedeutet in dieser Hinsicht einen bedeutenden Fortschritt. Dementsprechend haben wir einen gp120/160 Immungen produziert, in dem das immundominante Epitop immungedämpft worden ist.

Die Überlebensstrategie, die der HIV-1 Erreger anscheinend angenommen hat, hängt teilweise vom Vorzeigen eines dominanten, viral kodierten Epitops ab, das Antigenvariationen unterworfen ist.

Im Laufe der HIV-1 Infektion, bietet die Verzögerungsperiode zwischen Zeitpunkt der Infektion und Auftreten der Immunantwort dem Virus die Möglichkeit seine Genome durch die Nutzung eines Fehlers der Neigung zur umgekehrten Transcriptase zu replizieren. Dies wiederum erlaubt das Aufkommen einer Subpopulation von nahverwandten aber neutralisationsresistenten Varianten. Diese Varianten entkommen nicht nur den Wirkungen der neutralisierenden Antikörper, sondern, als Ergebnis ihrer Antigenähnlichkeit zum verwandten Virus, stimulieren die anfänglichen Immunantwort weiter, auch wenn der Antigencharakter des Decotops verändert worden ist. Schlusswirkung dieses Phänomens ist in eine gerichtete, immunostimulierende Antworte einzuschließen, die über Kreuzreaktivität, weiterhin Immuneffektorantworten zum frühesten viralen Phänotyp produziert. Also funktioniert ein immundominantes Decotop so, dass es das Immunsystem weg von einer Antwort auf mehr konservierte und potentiell breiter neutralisierende Bereiche anlockt. Diese Strategie ist für die weitere Pathogenese bei HIV-1 kritisch.

Der dritte hypervariable Bereich (V3) des gp120/160 Hüllglykoproteins stellt ein immundominantes Epitop von HIV- 1 dar, welches das Hauptziel für neutralisierende Antikörper ist. Trotz des variablen Charakters weist dieser Bereich einige konservierte strukturellen Eigenschaften auf. Die V3- Schleife besteht typischerweise aus 35 Aminosäuren in der Länge und wird durch 2 Cysteinreste gebunden, von denen man annimmt, dass sie eine Disulfidbrücke bilden. Die V3- Schleife hat eine gesamtpositive Ladung und hat ein von dem Computer vorhergesagte B-turn Beta-Faltblattstruktur in dem, was als Apex der Schleife gilt.

Ein Vergleich der Proteinsequenzen für verschiedene isolierte HIV-1 weist darauf hin, dass der Virus eine sehr hohe Variabilität der Sequenz an Aminosäuren im V3-Bereich von gp120/160 tolerieren kann. Diese Fähigkeit der immundominanten Epitopen des Virus, Sequenzänderungen zu tolerieren, ohne die Lebensfähigkeit zu gefährden, hängt direkt mit der Flucht des neutralisierenden Phänotyps zusammen. Antikörper, die verschiedene V3-Bereiche erkennen, zeigen eine Typspezifizität gegenüber dem Immunisierungsbereich. Zum Beispiel, gelingt es Antikörper, die gegen V3-Peptide einer gegebenen Art erhoben worden sind, diese Art zu neutralisieren, aber in vielen Fällen gelingt es ihnen nicht, Viren, die alternative V3-Epitope aufweisen, zu neutralisieren. Obwohl verschiedene V3 spezifische Antikörper später im Verlauf der Infektion erscheinen, erreichen diese nicht den hohen Titer, der die V3 spezifische Antikörper in den frühen Phasen der Infektion charakterisierte. Dementsprechend kann diese späte humorale und/oder zell-vermittelte Antwort gegen die varianten V3- Epitope unzureichend sein, um die verwandte virale Population unter Kontrolle zu halten.

Es ist höchst unwahrscheinlich, dass alle gp120/160 Strukturen so plastisch sind, wie der V3-Bereich. Funktionelle Erfordernisse des gp120/160 Moleküls, dazu gehört die Fähigkeit Zielzellenbindung und Eintritt ausführen zu können, werden wohl strukturelle Zwänge aufdrängen. Der CD4 Bindungsbereich von gp120/160 ist ein Beispiel für eine Stelle, die wahrscheinlich einen strengen Strukturbehalt zeigen wird. Antikörper sind bei AIDS Patienten isoliert worden, die zeigen, dass der gp120/160/CD4 Bindungsbereich immunogen ist. Trotz dieser Tatsache weisen die Antikörper zum gp120/160/CD4 Bindungsbereich einen erheblich geringeren Titer auf, was anti-V3 Antikörper betrifft. Die Hypothese ist also haltbar, dass HIV-1 einen Teil seines genomischen Inhalts in eine Strategie investiert hat, die die Immunantwort des Wirtes auf ein Lock-Epitop leitet und weg von strukturell besser konservierten funktionellen Bereichen.

Im Gegensatz zu der Immunantwort, die gegen ein variables Regionepitop wie V3 erhoben wird, haben wir entdeckt, dass eine Antwort auf besser konservierte Epitope wahrscheinlich erheblich die Disseminierung des Virus beschränkt. Der größte Teil der neutralisierenden Antwort auf HIV-1 ist gegen den V3-Bereich und dem CD4 Bindungsbereich gerichtet. Bis heute konnten Impfstoffversuche nur ähnlichen Herausforderungen standhalten. Dies suggeriert deutlich, dass die Immunantwort auf ein dominantes variables Epitop gerichtet ist, welches zwischen der Struktur der Immunisierungsart und der des Challenge-Virus unterscheidet. Der wahrscheinlichste Kandidat für dieses variable Epitop ist V3 auf gp120/160 Molekül.

Also kann unser Verfahren genutzt werden, um die starke humorale und/oder zell-vermittelte Immunantwort zu mildern, die in der Regel gegen den immundominanten V3-Bereich des gp120 Hüllglykoproteins von isolierten HIV-1 Wildtypen gerichtet ist. Unser Ansatz umfasst die Modifizierung der Antigenstruktur des V3-bereichs, um seine Immunogenität zu reduzieren. Ziel dieses Ansatzes ist es die humorale Immunantwort gegen andere Epitope des gp120/160 Moleküls zu verstärken.

B-Zellen antworten auf Antigene über einne T-Zellen abhängigen oder einen T-Zellen unabhängigen Weg. In beiden Fällen resultiert die anfängliche Interaktion zwischen B- Zellenrezeptor und verwandtem Antigenepitop in der Proliferation und klonalen Expansion, der Affinitätsreifung der Antikörper und schließlich in einer Antikörperproduktion mit hoher Affinität und hoher Spezifizität. Wir schlagen vor, die anfängliche Interaktion zwischen dem gp120/160-V3- Epitop und seinem verwandten B-Zellklon zu blockieren. Jedoch zur gleichen Zeit bestehen andere B-Zellenepitope zu gp120/160, diejenigen deren strukturelle Integrität V3 spezifisch ist für eine klonale Expansion, und die Expansion, die Affinitätsreifung und die spezifische Antikörperproduktion zu anderen B-Zellenepitope auf dem Molekül ermöglichen.

Ein Verfahren, um die Expression des rekombinanten gp120/160 Proteinmoleküls in Säugetierzellen zu erreichen, benutzt ein Vacciniavirusexpressionssystem, wie hier oben in Beispiel 6 beschrieben. Unter den Merkmalen dieses Expressionssystems findet sich die Tatsache, dass rekombinante Proteine in Milligrammmengen produziert werden können. Diese Proteine sind dann für biochemische Studien sowie für die Verwendung als Immungene verfügbar.

Wir sehen die Nutzung von immungedämpften Epitopen als eine neue Impfstoffstrategie voraus. Da verschiedene Immunisierungswege selektiv bestimmte Zweige des Immunsystems stimulieren können, können individuelle Impfstoffe basierend auf der hier oben beschriebenen Technologie verschiedene Verabreichungswege erfordern. Zum Beispiel kann ein Impfstoffabgabesystem, in dem die Produktion von neutralisierenden Antikörpern verstärkt wird, nicht das geeignete Verfahren sein, wenn der betroffene Erreger am besten durch eine zelluläre Immunantwort bekämpft wird. Dies impliziert, dass eine Reihe von Abgabesystemen für jede neue Anwendung dieser Impstofftechnologie getestet werden sollten. Mögliche Verabreichungswege des Immungens umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein: Inokulierung durch Augentropfen oder Spray, durch Nasenspray oder Aerosolinhalation, durch Ingestion, durch subkutane, intradermale oder intramuskuläre Injektion, durch Infektion mit rekombinanten Virusvektoren oder durch Injektion nackter DNA, die die Genexpression leitet, sobald sie in den Wirtszellen inkorporiert wird. Das folgende Beispiel illustriert einen der Wege, der bei rekombinanten Vacciniaviren und gereinigten rekombinanten Proteinuntereinheiten für humane Impfungsprotokoll genutzt werden könnte. Dieses Beispiel soll nicht bedeuten, dass es die einzige Möglichkeit ist, Menschen und andere Säugetiere mit rekombinanten Agenten, die auf immungedämpften, dominanten Epitopen basieren, zu impfen.

Beispiel 12 Verwendung von rekombinanten Viren und gp120/160 tragenden modifizierten V3-Bereichen als Immungene in einem Impfungsprotokoll

Humanen Subjekten mit dem Risiko einer Exposition zu HIV-1 wurde subkutan 10&sup7; - 10¹&sup0; pfu von dem lebendigen rekombinanten Vacciniavirus (Beispiel 6) injiziert, das in HeLa-Zellen propagiert worden war und danach durch Sucrosedichtegradientbanding gereinigt. Die Viruspräparationen wurden umfassend gegen kalte isotonische Salinpuffer dialysiert, bevor sie getitert wurden. Eine zweite Injektion des gleichen lebendigen Virus wurde 4 Wochen später verabreicht. Diese Injektion erfolgte an der gleichen Stelle wie bei der ersten Inokulierung. Eine UntereinheitsAnkurbelung von dem gereinigten rekombinanten gp120/160 Protein wurde dann gegeben, um die Produktion von neutralisierenden Antikörpern zu verstärken, wie beschrieben durch Hu et al., AIDS Research and Human Retroviruses 7: 615 (1991), - durch Bezugnahme hierin integriert. Zusätzlich zu einer rohen Reinigung der rekombinanten Glykoproteine durch Lentil-Lectin-Affinitätschromatographie, wurden die injizierten Proteine ebenfalls durch Affinitätschromatographie mit Hilfe eines immobilisierten anti-gp41 monoklonalen Antikörpers fast bis zur Homogenität gereinigt. Die Untereinheitproteine, die gegen kalte Phosphatsalinpuffer dialysiert worden waren, wurden auf eine Endkonzentration von 10-1000 ug/200 ul verdünnt, und intramuskulär entweder mit komplettem Freunds oder ISCOM (Morein, Immunol. Lett. 25: 281-83 (1992)) Adjuvans zusammen injiziert. Die Entwicklung von neutralisierenden Antikörpertitern wurde durch das Verfahren von Nara et al. (AIDS Res. Human Retroviruses 3: 283-302 (1987) untersucht.

Obwohl die folgenden Verfahren auf unseren Meerschweinen als Versuchstiere ausgeführt worden sind, kann ein ähnlicher Ansatz für humane Subjekte angewandt werden.

Beispiel 13 Entwicklung eines Impfungsprotokolls, das rekombinante Vacciniaviren verwendet und Aufspüren einer humoralen Immunantwort

Wir haben routinemäßig zwei Impfungsprotokollteile verwendet, die eine HIV-1 neutralisierende Antikörperantwort in Versuchstieren entlocken. Wir haben zuerst den Meerschweinen subkutan 10&sup7;-10&sup8; Plaque-bildende Einheiten (pfu) vom lebendigen rekombinanten gp120/160 injiziert, der Vacciniaviren exprimiert. Etwa vier Wochen später erfolgte eine zweite Injektion des lebendigen Virus. Die Wirksamkeit dieser Infektion wird durch leichte Läsionen an der Injektionsstelle bewiesen. Danach haben wir den Tieren eine einzige Ankurbelung des Untereinheit-Immungens gegeben, indem wir 10 ug von Lentil Lectin Sepharose gereinigte Wildtypproteine oder rekombinante gp120/160 Proteine injiziert haben.

Wir haben die humorale Immunantwort so weit wie eine Serumprobe verdünnt werden kann quantifiziert und neutralisierten immer noch 90% einer in vitro Infektion von HIV-1 Wildtyp-Zellen. Tabelle 3 gibt die Serumtiter von Meerschweinchenpaaren, die mit dem rekombinanten Vacciniavirus, das die gezielte Mutation aufweist, (Fig. 6) infiziert worden waren.

Tabelle 3 Virusneutralisierungstest

Antiserum Neutralisierungstiter

WT > 32

32

1 32

8

2 8

> 32

3 16

32

4 32

32

1 : 3 32

32

1 : 4 8

8

2 : 4 > 32

> 32

1 : 2 : 4 8

> 32

1 : 2 : 3 : 4 8

> 32

Vacciniavirus Keine Wirkung

Kontrolle Keine Wirkung

Serumproben wurden zwei Wochen nach der Infektion gezogen und getitert. Während eine Infizierung der Versuchstiere mit einer Vacciniakontrolle es nicht schaffte, Antikörper zu entlocken, die die HIV-1 Infektion in vitro neutralisierten, entlockte die Infektion mit rekombinantem Virus 1 : 2 : 3 : 4 neutralisierende Antikörpertiter, die in einem Tier mäßig waren und in dem anderen Tier unserer positiven Kontrolle gleich waren. Das Ergebnis ist bedeutend angesichts der Tatsache, dass frühere Ergebnisse bewiesen, dass der mutierte V3-Bereich des 1 : 2 : 3 : 4 Rekombinanten verglichen mit dem Wildtyp ein total anderes Antigenprofil aufweist. Wegen der schwachen Antigenbeziehung zwischen Wildtyp und dem 1 : 2 : 3 : 4 gp120/160 Mutanten, stimmen die in Tabelle 3 dargestellten Ergebnisse mit einem Szenario überein, in dem die humorale Immunantwort gegen den immungedämpften Mutanten weg von der immundominanten V3- Schleife zu mehr konservierteren Epitopen, die sowohl auf dem Wildtyp als auf den mutierten gp120 Molekülen vorhanden sind, umgeleitet worden ist.


Anspruch[de]

1. Impfstoff, der einem Säugetier verabreicht werden kann, um in diesem Säugetier einen Immunschutz gegen einen Krankheitserreger zu verursachen, wobei besagter Krankheitserreger ein Antigen mit einem immundominanten Epitop umfasst, wobei besagter Impfstoff eine modifizierte Form dieses Antigens enthält, in welchem das besagte immundominante Epitop immungedämpft ist, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

2. Impfstoff nach Anspruch 1, der zusätzlich das Antigen mit einem immundominanten Epitop oder einem Vektor, der besagtes Antigen mit einem immundominanten Epitop kodiert und besagtes Antigen mit einem immundominanten Epitop in diesem Säugetier exprimiert, umfasst.

3. Impfstoff nach Anspruch 1, der einem humanen Subjekt verabreicht werden kann, um einen Immunschutz in besagtem Subjekt gegen HIV-1 zu verursachen, wobei besagter Impfstoff eine modifizierte Form von HIV-1 gp120/160 umfasst, in dem die V3-Schleife von besagtem gp120/160 immungedämpft ist, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger für die Verabreichung an besagtes Subjekt.

4. Impfstoff nach Anspruch 3, in dem die V3-Schleife eine modifizierte Sequenz an Aminosäuren aufweist, welche eines oder mehrere N-gebundene Glykosylationssignale umfasst, die nicht in der ursprünglichen V3-Schleife vorhanden sind.

5. Impfstoff nach Anspruch 1, in dem besagter Träger einen pharmazeutisch annehmbaren Salinpuffer umfasst.

6. Impfstoff nach Anspruch 1, in dem besagtes immundominante Epitop durch die Addition eines Karbohydratanteils zu besagtem Epitop immungedämpft ist.

7. Impfstoff nach Anspruch 1, in dem besagtes immundominante Epitop eine Vielfalt an Aminosäuren umfasst, und in dem besagtes Epitop durch eine Veränderung dieser Aminosäuren immungedämpft ist.

8. Impfstoff nach Anspruch 7, in dem die Veränderung eine Aminosäurensubstitution enthält.

9. Impfstoff nach Anspruch 8, in dem die besagte Vielfalt an Aminosäuren durch eine andere Vielfalt an Aminosäuren substituiert wird, die durch humane B-Zellen toleriert werden.

10. Impfstoff nach Anspruch 9, in dem die besagte andere Vielfalt an Aminosäuren ein humanes lineares B-Zellen Epitop umfasst.

11. Impfstoff nach Anspruch 7, in dem die besagte Vielfalt an Aminosäuren eine ursprüngliche Ladung aufweist und die besagte Veränderung in einer Veränderung dieser ursprünglichen Ladung resultiert.

12. Impfstoff nach Anspruch 7, in dem die besagte Veränderung die Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren aus besagter Vielfalt umfasst.

13. Impfstoff nach Anspruch 1, in dem das besagte immundominante Epitop eine Bindungsstelle für zumindest ein weiteres Molekül enthält, und in dem der besagte Impfstoff zusätzlich zumindest ein besagtes anderes Molekül umfasst, das irreversibel an das Epitop gebunden ist.

14. Impfstoff nach Anspruch 13, in dem das besagte weitere Molekül einen Antikörper gegen besagten Epitop umfasst.

15. Impfstoff nach Anspruch 13, in dem besagtes Epitop einen Rezeptor und besagtes weitere Molekül einen Ligand für besagten Rezeptor enthält.

16. Impfstoff nach Anspruch 1, in dem das besagte immundominante Epitop ein Epitop ist, gegen welches das besagte Säugetier neutralisierende Antikörper erheben kann.

17. Impfstoff nach Anspruch 1, in dem das besagte immundominante Epitop eine Vielfalt an Aminosäuren enthält, und in dem besagte Vielfalt an Aminosäuren verändert werden kann, ohne die Überlebenskapazität von besagtem Krankheitserreger zu beeinflussen, dabei der besagten Vielfalt an Aminosäuren ermöglichend, sich durch einen genetischen Drift über eine Vielzahl von Generationen des besagten Krankheitserreger zu verändern.

18. Impfstoff nach Anspruch 1, in dem besagter Krankheitserreger ausgewählt wird aus einer Gruppe bestehend aus Viren, Pilzen, Protozoen und Bakterien.

19. Impfstoff nach Anspruch 18, in dem der Krankheitserreger der Influenza-Virus ist.

20. Impfstoff nach Anspruch 1, in dem der Krankheitserreger HIV-1 ist, und besagtes immundominante Epitop die V3- Schleife von HIV-1 gp120/160 ist.

21. Impfstoff nach Anspruch 20, in dem besagtes immundominante Epitop eine Vielfalt an Aminosäuren umfasst, die verändert worden sind, um die zusätzlichen N-gebundenen Glykosylationssignale zu enthalten.

22. Verfahren, um einen Impfstoff zu produzieren, der einem Säugetier verabreicht werden kann, um einen Immunschutz gegen einen Krankheitserreger zu verursachen, wobei der besagte Krankheitserreger ein Antigen mit einem ursprünglich immundominanten Epitop umfasst, wobei das besagte Antigen eine Vielfalt an Aminosäuren enthält, einschließlich einer Teilmenge an Aminosäuren, die besagtes ursprünglich immundominante Epitop enthalten, wobei das Verfahren umfasst:

das Erzielen einer Polynukleotidensequenz, welche besagte Vielfalt an Aminosäuren kodiert, einschließlich besagter Teilmenge von Aminosäuren, die besagtes ursprünglich immundominante Epitop enthält;

das Modifizieren besagter Polynukleotidensequenz, um ein modifiziertes immundominantes Epitop zu kodieren, das eine andere Teilmenge von Aminosäuren umfasst, als besagtes ursprüngliche immundominante Epitop;

das Exprimieren der Polynukleotidensequenz als Ergebnis des Modifizierungsschrittes, wodurch ein modifiziertes Antigen produziert wird, welches das besagte modifizierte immundominante Epitop enthält, wobei besagtes modifizierte immundominante Epitop im Vergleich zu dem ursprünglich immundominanten Epitop immungedämpft ist; und

das Formulieren einer Impfstoffkomposition, die besagtes modifizierte Antigen und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält,

23. Verfahren nach Anspruch 22, in welchem der Modifizierungsschritt die Produktion einer modifizierten Polynukleotidensequenz umfasst, die zumindest eine Aminosäurensubstitution in besagtem immundominanten Epitop kodiert.

24. Verfahren nach Anspruch 23, in dem besagte modifizierte Polynukleotidensequenz ein modifiziertes immundominantes Epitop, das durch humane B-Zellen toleriert wird, kodiert.

25. Verfahren nach Anspruch 24, in dem besagtes modifizierte immundominante Epitop ein humanes lineares B-Zellen Epitop ist.

26. Verfahren nach Anspruch 23, in dem die besagte Teilmenge an Aminosäuren, welche besagtes ursprünglich immundominante Epitop umfasst, eine ursprüngliche Ladung aufweist und der Modifizierungsschritt eine modifizierte Polynukleotidensequenz produziert, die ein modifiziertes immundominantes Epitop kodiert, das eine andere Ladung aufweist, als die besagte ursprüngliche Ladung.

27. Verfahren nach Anspruch 22, in welchem der Modifizierungsschritt die Produktion einer modifizierten Polynukleotidensequenz umfasst, die zumindest eine Aminosäurendeletion in dem besagten ursprünglichen immundominanten Epitop kodiert.

28. Verfahren nach Anspruch 22, um einen Impfstoff zu produzieren, der humanen Subjekten verabreicht werden kann, um in den besagten Subjekten einen Immunschutz gegen HIV-1 zu verursachen, wobei besagtes Verfahren umfasst:

das Erzielen eines HIV-1 gp120/160 Antigens;

das Behandeln des besagten HIV-1 gp120/160 Antigens durch die Exposition gegenüber Thrombin, um das besagte gp120/160 Antigen zu spalten; und das Formulieren einer Impfstoffkomposition, die das mit Thrombin behandelte Antigen und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.

29. Verfahren nach Anspruch 28, in welchem die 9238 Stelle von gp120/160 während des Behandlungsschrittes intakt bleibt.







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