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Dokumentenidentifikation DE10053553C2 19.09.2002
Titel Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen
Anmelder BAG Biologische Analysensystem GmbH, 35423 Lich, DE
Erfinder Ellinger, Klaus, Dr., 35423 Lich, DE;
Griwatz, Cord, Dr., 35410 Hungen, DE
Vertreter Luderschmidt, Schüler & Partner, 65189 Wiesbaden
DE-Anmeldedatum 28.10.2000
DE-Aktenzeichen 10053553
Offenlegungstag 23.05.2002
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 19.09.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 19.09.2002
IPC-Hauptklasse G01N 30/00
IPC-Nebenklasse B01D 15/08   G01N 33/50   C12M 1/34   C12Q 1/68   G01N 33/543   
Zusammenfassung Offenbart wird ein Trägermaterial, das zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen homogen an- und/oder durchströmbar ist, mit mindestens einer daran immobilisierten Biomolekül-Sonde, dadurch gekennzeichnet, daß es erhältlich ist durch ein Verfahren, bei dem man
(1) das Trägermaterial mit einem Mantel-Molekül anströmend, durchströmend oder im Batch-Verfahren belädt, wobei das Mantel-Molekül entweder direkt an das Trägermaterial unspezifisch oder mittelbar an mindestens eine an das Trägermaterial gebundene Komponente seinerseits unspezifisch oder spezifisch gebunden und als Umhüllung um das Trägermaterial fixiert ist, und
(2) ein Vernetzungsreagenz und die Biomolekül-Sonden zugibt, wobei die Biomelekül-Sonden auf der Oberfläche des umhüllenden Mantel-Moleküls unspezifisch oder spezifisch gebunden werden.
Weiterhin werden Verfahren zur Herstellung eines Trägermaterial, Verfahren zum Anreichern von Biomolekülen, Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen sowie eine Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen mit mindestens einem Trägermaterial, mindestens ein Hilfsreagenz zum Nachweis von Biomolekülen und einem oder mehreren Auffangbehältern oder einer oder mehreren Saugvorrichtungen beschrieben.

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Trägermaterial, ein Verfahren zu seiner Herstellung, seine Verwendung sowie eine Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Trägermaterial zum Nachweis von Biomolekülen, das auch zum Anreichern von Biomolekülen einsetzbar ist.

Verschiedene Vorrichtungen und Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen sind bereits bekannt. Der Nachweis kann beispielsweise über die Gel- Elektrophorese erfolgen. Sie ermöglicht die Auftrennung von Biomolekülen, wie beispielsweise Nukleinsäuren im elektrischen Feld. Eine anschließende Visualisierung kann mittels DNA-Farbstoff, wie beispielsweise Ethidiumbromid oder Silbernitrat, Fluoreszenz- oder Radioaktivmarkierung erfolgen. Dieses Verfahren ist sehr zeitintensiv und gerätelastig. Weiterhin sind die Visualisierungsreagenzien i. a. toxisch und umweltbelastend, so daß eine Versuchsdurchführung für ungeschultes Personal gefährlich und die Abfallentsorgung problematisch ist. Der Einsatz eines UV-Illuminators ist bei DNA-/RNA-Fluoreszenzfarbstoffen notwendig.

Ein weiteres bekanntes Verfahren beruht auf der PCR-/DNA-ELISA- Technologie, bei welchem an Kunststoffoberflächen immobilisierte Sondenmoleküle, wie DNA, RNA, cDNA oder Oligonukleotide, mit komplementären Sequenzabschnitten eines spezifischen Amplifikats hybridisieren. Die Immobilisierung kann durch kovalente Anbindung der Sondenmoleküle an die Kunststoffoberfläche erfolgen, die dafür jedoch reaktive Gruppen, wie NH2, COOH, OH, SH und SiO2-Gruppen, aufweisen muß. Diese können durch eine Niederdruck-Plasmabehandlung im Vakuum eingeführt werden. Dabei können dem Plasma direkt zugängliche Oberflächen modifiziert werden. Oberflächen im Inneren eines Trägermaterials, wie sie beispielsweise in Kunststoffritten vorliegen, können jedoch nur schwer modifiziert werden.

Mit Hilfe von Vernetzungsreagenzien, z. B. bi- und multifunktionellen Crosslinkern, können aktive Biomoleküle mittels Crosslinker an Plasmabehandelte Kunststoffoberflächen kovalent gebunden werden. Nachteilig an diesem Verfahren ist die eingeschränkte räumliche Beweglichkeit der Sondenmoleküle, die zu einer geringeren Empfindlichkeit des Systems führen kann. Weiterhin ist die Sonden-Belegungsdichte nicht bekannt.

Die Immobilisierung kann auch auf adsorptive Weise erfolgen, wie beispielsweise in WO 97/49992 beschrieben. Nachteilig an diesem Verfahren sind die vielen erforderlichen Arbeitsschritte, insbesondere Waschschritte und Ausklopfen der Kavitäten, und der notwendige Einsatz eines Platereaders. Weiterhin besteht die Gefahr, daß Sonden-Moleküle während der Beladung oder der Versuchsdurchführung eluiert werden. Daher ist auch die Sonden- Belegungsdichte dieser Systeme geringer. Ebenfalls nachteilig ist die nicht zielgerichtete Orientierung der Sonde, die die Empfindlichkeit des Nachweissystems einschränkt.

Ein bekanntes Verfahren zum Anreichern von Biomolekülen ist die magnetische Separation. Dabei werden paramagnetische Partikel eingesetzt, an die die zu trennenden Biomoleküle beispielsweise durch Wechselwirkung mit einem Sondenmolekül spezifisch gebunden sind. Die gewünschten Biomoleküle werden unter Verwendung eines Magnetfeldes abgetrennt. Nachteilig an diesem Verfahren ist der erforderliche komplexe apparative Aufbau.

Eine weitere Möglichkeit zur Anreicherung von Biomolekülen bietet die Affinitätschromatographie. Sie beruht auf der spezifischen und reversiblen Adsorption eines Biomoleküls aus einer komplexen Mischung an einer individuellen, matrixgebundenen Sonde. Die Elution des adsorbierten Biomoleküls wird dann entweder durch kompetitive Verdrängung aus der Bindung oder durch einen Konformationswechsel aufgrund einer Änderung der Lösungsmittelumgebung erreicht, beispielsweise durch Variation des pH-Wertes oder der Ionenstärke. In der Regel sind affinitätschromatograpische Verfahren sehr zeitintensiv und für gelegentliche Anreicherungsversuche wenig geeignet.

In Anbetracht des hierin vorstehend zitierten und diskutierten Standes der Technik lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Trägermaterial anzugeben, welches die Detektion und die Anreicherung von Biomolekülen auf einfache Art und Weise ermöglicht.

Insbesondere war es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Trägermaterial anzugeben, das einen schnellen Nachweis und eine schnelle Anreicherung von Biomolekülen erlaubt.

Eine der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand darin, ein Trägermaterial zur Verfügung zu stellen, das aufgrund einer geringeren Anzahl von Verfahrensschritten weniger kontaminationsanfällig ist.

Eine weitere Aufgabe ist darin zu erblicken, ein Trägermaterial bereitzustellen, das auch bei kleinen Probenzahlen eine kostengünstige Anreicherung von Biomolekülen ermöglicht.

Noch eine Aufgabe, welche der Erfindung zugrundeliegt, besteht darin, daß ein Trägermaterial zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen zu finden ist, das auch einen schnellen und kostengünstigen Nachweis der abgetrennten Biomoleküle ermöglicht.

Eine der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe war auch, ein Verfahren zur Herstellung von Trägermaterialien zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen anzugeben, welches einfach, schnell und kostengünstig durchführbar ist.

Ein weitere Aufgabe der Erfindung war schließlich auch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Anreicherung von Biomolekülen, welches einfach, schnell und kostengünstig durchführbar ist.

Darüber bestand eine Aufgabe darin, ein Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen anzugeben, das ebenfalls einfach, schnell und kostengünstig durchführbar ist.

Diese und nicht näher genannte weitere Aufgaben, die sich jedoch wie selbstverständlich oder in naheliegender Weise aus der einleitenden Erörterung des Standes der Technik ergeben, beziehungsweise ableiten lassen, werden im Hinblick auf das Trägermaterial im Rahmen der Erfindung durch ein Trägermaterial nach Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Trägermaterials werden in den auf Anspruch 1 direkt oder indirekt rückbezogenen Ansprüchen unter Schutz gestellt.

Dadurch, daß man ein Trägermaterial, welches zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen homogen an- und/oder durchströmbar ist, mit mindestens einer daran immobilisierten Biomolekül-Sonde, zur Verfügung stellt, wobei sich das Trägermaterial dadurch auszeichnet, daß es erhältlich ist durch ein Verfahren, bei dem man

  • 1. das Trägermaterial mit einem Mantel-Molekül anströmend, durchströmend oder im Batch-Verfahren belädt, wobei das Mantel- Molekül entweder direkt an das Trägermaterial unspezifisch oder mittelbar an mindestens eine an das Trägermaterial gebundene Komponente seinerseits unspezifisch oder spezifisch gebunden und als Umhüllung um das Trägermaterial fixiert ist, und
  • 2. ein Vernetzungsreagenz und die Biomolekül-Sonden zugibt, wobei die Biomolekül-Sonden auf der Oberfläche des umhüllenden Mantel- Moleküls unspezifisch oder spezifisch gebunden werden,
gelingt es auf nicht ohne weiteres vorhersehbare Weise eine Reihe von Vorteilen zu erzielen. Hierzu gehören unter anderem:

  • - Durch das umhüllende Mantel-Molekül werden auf der Oberfläche des Trägermaterials reaktive Gruppen für eine kovalente Bindung von Biomolekülen, wie Nukleinsäuren, Proteine, Polypeptide, Allergene, Zucker, Polysaccharide, Antigene, Antikörper etc. bereitgestellt.
  • - Die flexible und variable Gestalt des umhüllenden Mantel-Moleküls erlaubt eine erhöhte räumliche Beweglichkeit der gekoppelten Biomolekül-Sonden und bietet somit verbesserte Hybridisierungs- und Bindungsmöglichkeiten von DNA-Sonde und Target-DNA-Molekül bzw. Antigen-Antikörper-Komplexen.
  • - Erfindungsgemäß kann eine hohe Dichte von Biomolekül-Sonden auf dem Trägermaterial aufgebracht werden kann.
  • - Ein weiterer Vorteil ist es, daß im Gegensatz zur Niederdruck- Plasmabehandlung des Trägermaterials nicht nur an der äußeren Oberfläche, sondern auch an Oberflächen im Inneren einer porösen Struktur Biomolekül-Sonden aufgebracht werden können.
  • - Die Flüssigkeiten können vorzugsweise ausschließlich aufgrund der Schwerkraft durch die Vorrichtung fließen bzw. strömen. Somit erfordert eine Anreicherung der Biomoleküle keine Zwischenschritte, wie Entleeren und Ausklopfen der Kavitäten.
  • - Mit Hilfe des Trägermaterials kann eine Anreicherung von Biomolekülen und gegebenenfalls auch ihr Nachweis wesentlich schneller erreicht werden. Durch die zusätzliche Verwendung einer Saugvorrichtung kann die notwenige Zeit nochmals reduziert werden.
  • - Das Trägermaterial zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen ist weniger kontaminationsanfällig als bisher bekannte Systeme.
  • - Das Trägermaterial ist insbesondere für den Nachweis und das Anreichern von Biomolekülen in kleinen Probenstückzahlen geeignet.
  • - Das Trägermaterial ermöglicht den Geräte-unabhängigen Nachweis und das Anreichern von Biomolekülen. Es werden kein Washer oder Lesegerät (Plate-Reader) o. ä. benötigt. Die Ergebnisse von Nachweisreaktionen können optisch ausgelesen werden, es besteht jedoch auch die Möglichkeit, entsprechende technische Hilfsmittel einzusetzen.
  • - Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Trägermaterials können auch Biomoleküle trotz stark denaturierender Verhältnisse in der Lösung, beispielsweise durch die Gegenwart von Harnstoff, angereichert werden.
  • - Das Trägermaterial zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen erlaubt durch Variation der Inkubations- bzw. Verweilzeiten einer beliebigen Flüssigkeit auf dem Trägermaterial die Durchführung von Reaktionen auf und in dem Trägermaterial.

Der Aufbau der Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen weist ein homogen an- und/oder durchströmbares Trägermaterial mit mindestens einer daran immobilisierten Biomolekül-Sonde auf. Die Vorrichtung kann sehr variabel gestaltet werden. Die Vorrichtung ist vorzugsweise ein Hohlkörper, in dessen Lumen eines oder mehrere der Trägermaterialien angeordnet sind. Ein homogenes Durchströmen des Hohlkörpers soll vorzugsweise gewährleistet sein. Es ist ebenfalls bevorzugt, daß keine Randeffekte auftreten oder andere Bereiche gebildet werden, in denen der Durchfluß schneller oder langsamer ist, als an anderen Stellen. Die Vorrichtung ist vorzugsweise eine kleine, oben und unten offene Säule oder Tubus zum Einmalgebrauch.

Das Trägermaterial liegt in Form eines Formkörpers, loser Schüttungen von Partikeln, in Form eines Gels, einer Membran oder in Membranen eingebettet oder als Dispersion vor. Auch Kombinationen von Trägermaterialien sind denkbar. Das Trägermaterial ist vorzugsweise in der Lage, Mantel-Moleküle unspezifisch zu binden. Es muß für ein Fluidum durchlässig sein. Das Trägermaterial weist vorzugsweise einen mittleren Porendurchmesser von 0,1 bis 300 µm auf. Bei Schüttungen, Dispersionen und gesinterten Materialien sind diese Poren die zwischen den Partikeln vorhandenen Poren und nicht die Poren der Oberfläche eines Partikels des Trägermaterials. Das Trägermaterial bindet vorzugsweise Mantel-Moleküle beim Fluß durch das Trägermaterial unspezifisch.

Das Trägermaterial besteht vorzugsweise aus gesintertem organischen oder anorganischen Material. Als gesintertes organisches Material kommen insbesondere thermoplastische Kunststoffe, vorzugsweise in Partikelform, in Frage. Dazu gehören zum Beispiel Polyethylen und Polystyrol.

In einer weiteren Ausführungsform kann das Trägermaterial partikelförmig für lose Schüttungen oder Gele, gelförmig oder als selbsttragender Formkörper, z. B. als Fritte, vorliegen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Trägermaterial eine Fritte aus gesintertem organischen oder anorganischen Material, vorzugsweise aus thermoplastischen Kunststoffpartikeln, wie Polyethylen oder Polystyrol.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das Trägermaterial aus geschäumten Kunststoffen, insbesondere solchen in retikulierter Form, Hohlfasern, verstreckten Folien, Komposit- oder Mehrschichtenmaterialien mit unterschiedlichen Eigenschaften für die Sorption, den Durchfluß oder die Festigkeit und zur Vermeidung durchgängig großer Poren, keramischen Materialien, Zeolithen, Metallen, Metalloxiden, Legierungen, Glas oder Kohlenstoffmodifikationen oder Kombinationen davon in Mischungen oder geschichteten Lagen.

Im allgemeinen kommen homogene, poröse Materialien, insbesondere solche mit ausreichender nicht spezifischer Sorption von Mantel-Molekülen in Frage. Dazu gehören zum Beispiel auch die in der Mikroflitration, gegebenenfalls auch Ultrafiltration und Tiefenfiltration eingesetzten Materialien und Membranen. Das Trägermaterial kann als gesinterter Formkörper, hergestellt durch Sinterung unter Wärme und/oder Druck mit oder ohne Bindemittel und/oder Makroporenbildner, in dichten Schüttungen (Kieselgur, Sand, Anthrazit), Schaumstoffen, Fasern und Hohlfasern, als Quer- oder Längsfasern, Vliese, Wirrvliese, Mikrofilamenten, Fiberglas, etc. vorliegen. Neben den genannten organischen Materialien kommen grundsätzlich auch andere Materialien und Herstellprozesse in Frage, wie sie insbesondere in Ullmann Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A16, ab Seite 224, in Eberhardt Staude, Membranen und Membranprozesse, Verlag Chemie Weinheim 1992, ab Seite 8, und in Siegfried Ripperger, Mikrofiltration mit Membranen, Verlag Chemie Weinheim 1992 ab Seite 15, genannt sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Trägermaterial einheitlich in bezug auf seine Eigenschaften. Für die Kontrolle der Einheitlichkeit des Trägermaterials kommen als meßbare Parameter gleichmässiges Gewicht oder Dichte und/oder gleichmässige Durchflußgeschwindigkeit in Betracht. Gewichts- und Durchflußschwankungen deuten bei den Trägermaterialien auf entsprechende Schwankungen der Parameter Porendurchmesser, gesamtes Porenvolumen und innere Oberfläche hin, die neben anderen Parametern das Sorptionsverhalten des Trägermaterials bestimmen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist das Trägermaterial homogen an- und/oder durchströmbar, vorzugsweise für ein Fluidum homogen an- und/oder durchströmbar. Ein homogen durchströmbares Trägermaterial wird bevorzugt. Dabei ist eine homogene Durchströmbarkeit des Trägermaterials mit einer gleichförmigen Porenstruktur korreliert, besonders bezüglich der adsorbierenden inneren Oberfläche, über die Fläche der Trägermaterialien, aber auch über deren Querschnitt, d. h. in Richtung des Durchflußes. Eine solche symmetrische, homogene Porenstruktur ist vorteilhaft. Es ist jedoch auch möglich, asymmetrische Porenstrukturen zu verwenden, mit in Durchflußrichtung gesehen z. B. zuerst kleineren Poren, um eine größere innere Oberfläche zur Verfügung zu stellen, gefolgt von größeren Poren, damit die Durchflußgeschwindigkeit nicht zu klein wird.

Durch Sintern werden Membranen mit niedriger Porosität (bis 40%, eventuell bis 60%) und irregulärer Porenstruktur mit insgesamt sehr breiter Porengrößenverteilung erhältlich.

Durch Verstrecken von Polymerfolien werden Membranen hoher Porosität bis 90% und relativ regulärer Porenstruktur mit einheitlicher Porengrößenverteilung erhalten, wie sich beispielsweise aus Ullmann a. a. O., Seite 216, ergibt. Die Membranen lassen sich nach dem Stand der Technik mittels an sich bekannter Verfahren herstellen.

Das Trägermaterial kann in einer bevorzugten Ausführungsform an der Oberfläche mit Biopolymeren, wie Proteinen, beschichtet sein. Es kann ebenfalls, je nach Einsatzbereich, an der Oberfläche hydrophobiert oder hydrophiliert sein.

Die Herstellung des Trägermaterials ist dem Fachmann bekannt. Sie geht davon aus, daß bestimmte Siebfraktionen von sinterbaren Materialien gesintert werden. Die nicht während des Sinterprozesses im Sinterverband eingebundenen Partikel werden danach aus dem gesinterten Material entfernt.

Weiterhin ist die Entfernung störender Partikel wünschenswert. Diese Entfernung führt zu Materialien, die einheitlicher sind und nur noch geringe Unterschiede in ihren Eigenschaften aufweisen.

Im Falle anderer Trägermaterialien, wie geschäumten Kunststoffen, insbesondere solchen in retikulierter Form, Hohlfasern, verstreckten Folien, Komposit- oder Mehrschichtmaterialien, keramischen Materialien, Zeolithen, Metallen, Metalloxiden, Legierungen, Glas oder Kohlenstoff werden auch entweder Verfahrensschritte zur Entfernung von unpassenden Partikelgrößen durchgeführt und/oder die Größe der Poren, insbesondere bei membranartigen Materialien, durch an sich bekannte Verfahrensparameter gesteuert. Ziel kann es sein, eine relativ enge Größenverteilung der Poren zu erreichen.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Trägermaterial mit möglichst exakter geometrischer Form (z. B. Zylinder mit Querschnitt entsprechend dem Querschnitt des Durchflußgefässes bei zylindrischen Durchflußgefäßen, z. B. Quader mit entsprechendem Querschnitt bei Durchflußgefäßen mit rechteckigem Querschnitt) in eine Hülse eingepaßt. Das Trägermaterial kann mittels im Lumen des Hohlkörpers angeordneten Einrichtungen fixiert sein. Diese Einrichtungen weisen vorzugsweise ein homogenes Durchströmverhalten für ein Fluidum, insbesondere Lösungen mit Analyten auf.

Gemäß der vorliegenden Erfindung weist das Trägermaterial mindestens eine daran immobilisierte Biomolekül-Sonde auf. Dabei ist das Trägermaterial mit mindestens einer Biomolekül-Sonde erhältlich durch ein Verfahren bei dem man

  • 1. das Trägermaterial mit einem Mantel-Molekül anströmend, durchströmend oder im Batch-Verfahren belädt, wobei das Mantel- Molekül entweder direkt an das Trägermaterial unspezifisch oder mittelbar an mindestens eine an das Trägermaterial gebundene Komponente seinerseits unspezifisch oder spezifisch gebunden und als Umhüllung um das Trägermaterial fixiert ist, und
  • 2. ein geeignetes Vernetzungsreagenz und die Biomolekül-Sonden zugibt, wobei die Biomolekül-Sonden auf der Oberfläche des umhüllenden Mantel-Moleküls unspezifisch oder spezifisch gebunden werden.

Das umhüllende Mantel-Molekül bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Gruppe von Verbindungen, die in Lebewesen auftreten. Zu ihnen gehören unter anderem Proteine, Nukleinsäuren, Polysaccharide, Lipide, sowie ihre Grundbausteine, wie Aminosäuren, Nucleobasen, Monosaccharide, Fettsäuren und Vitamine. Weiterhin umfaßt der Begriff Biomoleküle auch Derivate der oben genannten Biomoleküle sowie synthetische Polymere der Grundbausteine, wie beispielsweise Polyaminosäuren, vorzugsweise Polylysin. Auch Mischungen verschiedener Biomoleküle sind denkbar. Vorzugsweise handelt es sich um ein Protein, insbesondere um ein Albumin. Ganz besonders bevorzugt ist das Rinderserumalbumin.

Es ist bevorzugt, daß das umhüllende Biomolekül direkt an das Trägermaterial unspezifisch gebunden ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt das umhüllende Mantel-Molekül eine Bindungsmatrix mit polaren Gruppen, wie beispielsweise NH2, SH, SiO2, COOH und OH, zur Verfügung, die Möglichkeiten zu spezifischen Wechselwirkungen, insbesondere mit Biomolekül-Sonden bieten.

Das Trägermaterial weist weiterhin mindestens eine Biomolekül-Sonde auf. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnen Biomolekül-Sonden, die Gruppe von Verbindungen, die mit Biomolekülen in Wechselwirkungen treten. Die Biomolekül-Sonde ist insbesondere ausgewählt aus der Gruppe der Enzyme, mit Enzymen in Wechselwirkung tretenden Substraten, Antikörpern, Antigenen, wie hochmolekularen Substanzen oder Pollen oder anderen Allergenen, Haptenen, Biotin oder Streptavidin, Nukleinsäuren vom RNA- oder DNA Typ, insbesondere solche, die hybridisierbar mit anderen Nukleinsäuren sind, Rezeptor oder Liganden eines Rezeptors, Viren, Bakterien, Zellen, Zellorganellen, Blutkörperchen, Teilchen, wie kolloidalen Teilchen von Metallen, Metalloxiden, Polymeren oder Kombinationen der genannten Biomolekül-Sonden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden Nukeinsäuren, Antikörper und Antigene als Biomolekül- Sonden bevorzugt. Ganz besonders bevorzugte Biomolekül-Sonden sind Oligonukleotide.

Die mindestens eine Biomolekül-Sonde wird auf der Oberfläche des umhüllenden Biomolekül-Mantels unspezifisch oder spezifisch gebunden. Dabei ist eine kovalente Anbindung bevorzugt.

Die Modifizierung des Trägermaterials mit mindestens einer Biomolekül-Sonde kann durch Beladen des Trägermaterials mit einem Mantel-Molekül und anschließendem Vernetzen des Mantel-Moleküls mit üblichen Hilfsreagenzien in der Gegenwart von Biomolekül-Sonden erreicht werden, ohne daß eine vorherige Modifikation des Trägermaterials mit nicht spezifischem Material erfolgt.

Die Beladung des Trägermaterials kann über das sogenannte Durchflußverfahren oder im Batch-Verfahren erfolgen. Beim Durchfluß-Verfahren wird das unspezifisch oder spezifisch anzubindende Mantel-Molekül gelöst und im Durchfluß vorzugsweise bei vertikaler Fließrichtung vorzugsweise unter der Wirkung der Schwerkraft über das zu beladende Trägermaterial gegeben. Insbesondere hat es sich dabei bewährt, die Beladung in Beladungsgefäßen, wie beispielsweise zylindrischen Hohlkörpern durchzuführen. Dabei ist das Trägermaterial im Lumen des Hohlkörpers angeordnet, und zwar möglichst in exakter Anpassung an die Wandungen. Dies kann zum einen dadurch geschehen, daß entsprechend geformte Formkörper aus Trägermaterial angefertigt werden und in das Lumen des Hohlkörpers hinein verbracht werden. Eine weitere Alternative besteht darin, daß das Trägermaterial zwischen zwei Fritten, die vorzugsweise keine Wechselwirkung mit dem anzubindenden Mantel-Molekül und mit später durchfließenden Komponenten aufweisen sollten, anzuordnen. Danach wird die Lösung mit dem anzubindenden Mantel-Molekül in den Hohlkörper, der Einlaß- und Auslaßöffnung aufweist, gegeben, so daß im Durchfluß beim Durchströmen der Lösung mit Mantel-Molekül dieses an der Oberfläche des Trägermaterials unspezifisch adsorptiv gebunden wird.

In Anordnungen mit vertikalem Durchfluß unter Schwerkraft kann die Beladungsmethode bei Trägermaterialien mit langsamem Durchfluß noch durch Anlegen eines Unterdrucks am Auslaß des zylindrischen Hohlkörpers oder Verwendung bestimmter Vorrichtungen, wie beispielsweise einer Saugvorrichtung, sowie durch Einwirkung eines Überdrucks am Einlaßende des zylindrischen Hohlkörpers beschleunigt werden. Dies wirkt sich gegebenenfalls auch vorteilhaft auf die Gleichmäßigkeit der Beladung aus. Ebenso kann durch Einbau bestimmter Einrichtungen, beispielsweise Fritten, oder Sog bzw. Gegendruck, der Durchfluß durch den zylindrischen Hohlkörper verlangsamt werden, um bei entsprechenden Materialien den Durchfluß zu homogenisieren, insbesondere aber eine ausreichende Beladung zu erreichen, sowie bei höherer Beladung auch eine Verringerung der Schwankung der Beladung. Dieselben Maßnahmen können auch bei den Verfahrensschritten zur Anwendung kommen. Gegebenenfalls wird das Trägermaterial ein oder mehrmals gewaschen.

Die Vernetzung des anzubindenden Mantel-Moleküls in Gegenwart der mindestens einen Biomolekül-Sonde erfolgt in einem analogen Verfahrensschritt durch Zugabe einer Lösung enthaltend das geeignete Vernetzungsreagenz und die mindestens eine Biomolekül-Sonde.

Im Batch-Verfahren, das im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise angewendet wird, wird das Trägermaterial in einem geeigneten Lösungsmittel aufgenommen, so daß das Trägermaterial vollständig mit Lösungsmittel bedeckt ist, und durch Zugabe von Mantel-Molekülen mit diesen beladen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine phosphatgepufferte wäßrige Lösung (PBS) mit physiologischem pH verwendet. Die Inkubation erfolgt vorteilhafterweise auf einem Überkopfschüttler für mehrere Stunden. Dabei ist eine Inkubationszeit von 0,01-24 Stunden, insbesondere von 3-16 Stunden bevorzugt.

Anschließend wird überstehendes Lösungsmittel dekantiert und ungefähr die gleiche Menge geeignetes Lösungsmittel zugegeben. Diese Waschprozedur kann mehrfach wiederholt werden. Vorteilhafterweise wird das gleiche Lösungsmittel wie zur Beladung des Trägermaterials verwendet. Es ist ebenfalls günstig, azide PBS (gepuffert auf pH = 4.8) als Lösungsmittel einzusetzen.

Zur Vernetzung und Einführung der mindestens einen Biomolekül-Sonde werden Vernetzungsreagenzien und die mindestens eine Biomolekül-Sonde in geeigneter Menge zugegeben. Die Inkubation erfolgt vorzugsweise wieder auf einem Überkopfschüttler für mehrere Stunden. Dabei ist eine Inkubationszeit von 0,01-24 Stunden, insbesondere von 3-16 Stunden bevorzugt.

Anschließend wird überstehendes Lösungsmittel dekantiert und ungefähr die gleiche Menge geeignetes Lösungsmittel zugegeben. Diese Waschprozedur kann mehrfach wiederholt werden. Vorteilhafterweise wird PBS (pH physiol.) als Lösungsmittel eingesetzt.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden verbleibende aktive Gruppen des Vernetzungsreagenzes mittels Mantel-Molekülen blockiert, vorzugsweise den gleichen Mantel-Molekülen, die zur Herstellung des Mantel-Molekül-Umhüllung verwendet wurden. Die Inkubation erfolgt auf einem Überkopfschüttler für 0,01-24 Stunden, vorzugsweise für 3-16 Stunden.

Der Formträger kann nach der Kopplung getrocknet werden, indem man ihn für eine bestimmte Zeit, beispielsweise 4 Stunden, mit einer geeigneten Lösung inkubiert und anschließend bei geeigneter Temperatur für bestimmte Zeit trocknet. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Protein-Zuckerlösung zur Inkubation verwendet.

Die Wahl der geeigneten Temperatur ist für den Fachmann offensichtlich. Sie ist so zu wählen, daß sich die charakteristischen Eigenschaften der Vorrichtung nicht verändern, beispielsweise durch Denaturierung des Mantel-Moleküls oder chemische Umwandlungen.

Geeignete Reagenzien für die Vernetzung der umhüllenden Mantel-Moleküle sowie die Kopplung der Biomolekül-Sonden sind dem Fachmann bekannt. Sie umfassen beispielsweise bifunktionelle Crosslinker, wie Carbodiimide oder Glutaraldehyde, vorzugsweise solche, die Biomolekül-Sonden an das Mantel- Molekül binden können. Im Rahmen vorliegenden Erfindung werden weiterhin Vernetzungsreagenzien bevorzugt, die in der Lage sind, die mindestens eine Biomolekül-Sonde kovalent an das Mantel-Molekül zu binden. Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Vernetzungsreagenz sind das 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimid hydrochlorid (EDC) und das Sulfosuccinimidyl-6-[a-methyl-a-(2-pyridyl-dithio)toluamido]hexanoat (Sulfo- LC-SMPT).

Die zur Herstellung des Trägermaterials einzusetzenden Mengen an anzubindenden Mantel-Molekülen, Vernetzungsreagenzien und Biomolekül-Sonden hängen von den gewünschten Eigenschaften des Trägermaterials und dem geplanten Einsatzziel ab.

Nachfolgend wird die Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren beispielhaft erläutert.

Fig. 1 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform. Sie weist eine Einlaßöffnung (1), ein Probenröhrchen (2), ein durchströmbares Trägermaterial (3) und eine Auslaßöffnung (4) auf. Erfindungsgemäß trägt das Trägermaterial eine an ihr immobilisierte Biomolekül-Sonde.

Fig. 2 zeigt eine besonders bevorzugte Ausführungsform. Sie weist eine Einlaßöffnung (1), ein Probenröhrchen (2), ein an- und/oder durchströmbares Trägermaterial (3) mit mindestens einer daran immobilisierten Biomolekül-Sonde, ein saugfähiges Material (4) und eine Auslaßöffnung (5) auf.

Das saugfähige Material (4) ist stromab vom Trägermaterial (3) angeordnet. Dies bedeutet, daß das Fluid, welches das Trägermaterial (3) an- und durchströmt zunächst das Trägermaterial (3) und danach das saugfähige Material (4) kontaktiert.

Zugleich ist das saugfähige Material (4) zum Trägermaterial (3) beabstandet angeordnet. Der Abstand wird dabei gezielt so gewählt, daß ein sich stromab des Trägermaterials (3) ausbildender Flüssigkeitstropfen spätestens bei maximaler Ausdehnung in direkten Kontakt mit dem Saugmaterial (4) treten muß.

Fig. 3 gibt eine idealisierte Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform von einem Trägermaterial mit mindestens einer Biomolekül-Sonde im Querschnitt bzw. als Aufsicht wieder. Sie weist ein Trägermaterial (3), einzelne Trägermaterial-Partikel (6), Mantel-Moleküle (7), Vernetzer (8), Biomolekül- Sonden (9) in den Trägermaterial-Poren (10) auf.

Das Trägermaterial kann zur Anreicherung und zum Nachweis von Biomolekülen verwendet werden. Der Begriff Biomoleküle ist - wie bereits weiter vorne erwähnt - dem Fachmann bekannt und bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Erfindung die in Lebewesen auftretenden Moleküle. Zu ihnen gehören unter anderem Proteine, Nukleinsäuren, Polysaccharide, Lipide, sowie ihre Grundbausteine, wie Aminosäuren, Nucleobasen, Monosaccharide, Fettsäuren und Vitamine.

Bevorzugt werden Verfahren zur Anreicherung von Biomolekülen, die sich dadurch auszeichnen, daß man

  • 1. unter Anwendung von Unter- oder Überdruck oder Verwendung von die Durchflußgeschwindigkeit des Fluidums beeinflussenden Bauteilen eine Lösung, die das anzureicherende Biomolekül enthält, auf das Trägermaterial aufbringt,
  • 2. die Biomoleküle mit dem Trägermaterial wechselwirken läßt, und
  • 3. mit einer Waschlösung nicht spezifisch gebundene Biomoleküle herunterwäscht.

Eine bevorzugte Zeitspanne zum Wechselwirken der Biomoleküle mit der Biomolekül-Sonde liegt zwischen 1 bis 10 Minuten, vorzugsweise zwischen 3 bis 5 Minuten.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die auf dem Trägermaterial angereicherten Biomoleküle nachgewiesen oder unter Verwendung eines geeigneten Lösungsmittels eluiert. Ein geeignetes Lösungsmittel in diesem Zusammenhang ist ein Lösungsmittel, welches in der Lage ist, die Wechselwirkung zwischen der Biomolekül-Sonde und dem angereicherten Biomolekül aufzubrechen. Vorzugsweise werden polare Lösungsmittel verwendet, insbesondere wäßrige Lösungen. Es ist weiterhin bevorzugt, daß die wäßrigen Lösungen Säuren, Basen, Salze, Detergentien, Proteine, Zucker und Mischungen derselben enthalten. Durch anschließendes Entfernen des Lösungsmittels sind die entsprechenden Biomoleküle in guter Reinheit zugänglich.

Die Visualisierung der aufgetrennten Biomoleküle kann beispielsweise durch dem Fachmann bekannte Verfahren, wie Enzym-Substratumsetzung, mittels Chemoluminiszenz oder auf radioaktiven Wege erfolgen. Auch der Einsatz von Online-Detektionssystemen basierend auf der Energietransfer-Technologie ist insbesondere bei hohem Probenaufkommen vorteilhaft. Es arbeitet mit zwei Fluorchromen und zwei Fluoreszenzwellenlängen (Exzitation/Emission). Diese Geräte-intensiven Detektionssysteme sind jedoch in der Anschaffung sehr teuer und daher für die gelegentliche Durchführung von Tests weniger geeignet.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt der Nachweis der angereicherten Biomoleküle, insbesondere durch Visualisierung direkt auf dem Trägermaterial. Eine Elution der angereicherten Biomoleküle ist dabei nicht erforderlich.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen bevorzugt, das sich dadurch auszeichnet, daß man

  • 1. über das Verfahren das nachzuweisende Biomolekül auf dem Trägermaterial anreichert,
  • 2. über das Verfahren ein Affinitäts-Biomolekül auf dem Trägermaterial anreichert, um einen Biomolekül- Affinitäts-Biomolekül-Komplex auszubilden, und
  • 3. ein Nachweisreagenz für den Biomolekül-Antikörper-Komplex zugibt.

Der Begriff Affinitäts-Biomolekül bezeichnet eine zu dem nachzuweisenden, spezifisch gebundenen Biomolekül Verbindung, die in Lage ist, mit dem nachzuweisenden, angereicherten Biomolekül spezifisch in Wechselwirkung zu treten und auf diese Weise einen Biomolekül-Affinitäts- Biomolekül-Komplex ausbildet. In diesem Zusammenhang werden erfindungsgemäß Dipol-Dipol-Wechselwirkungen, Wasserstoffbrücken- Bindungen, Coulomb-Wechselwirkungen und elektrostatitische Wechselwirkungen bevorzugt. Ebenfalls bevorzugt ist die Ausbildung einer oder mehrerer kovalenter Bindungen zwischen dem angereichteren Biomolekül und dem Affinitäts-Biomolekül.

Die Affinitäts-Biomoleküle bilden mit dem angereicherten Biomolekül einen Biomolekül-Affinitäts-Biomolekül-Komplex aus, der vorzugsweise nicht während des Verfahrens zum Nachweis von Biomolekülen eluiert wird, sondern auf dem Trägermaterial verbleibt. Erfindungsgemäß einsetzbare Affinitäts-Biomoleküle sind dem Fachmann bekannt. Sie werden beispielsweise in der Affinitätschromatographie zum Nachweis von Biomolekülen verwendet. Zu den im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugten Affinitäts-Biomolekülen gehören Antikörper und Avidine, insbesondere Streptavidin.

Gegebenenfalls ist das Affinitäts-Biomolekül modifiziert, um den Nachweis des Biomolekül-Affinitäts-Biomolekül-Komplexes zu erleichtern. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist der Einsatz von Peroxidase-gekoppelten Antikörpern besonders vorteilhaft.

Falls nötig wird zum Nachweis des Biomolekül-Affinitäts-Biomolekül- Komplexes ein sogenanntes Nachweisreagenz zugegeben. Die Detektion kann dabei über die dem Fachmann bekannte Verfahren durchgeführt werden.

Das Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen kann deutlicher schneller als bisher bekannte Verfahren durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren zum Anreichern von Biomolekülen in weniger als 30 Minuten durchgeführt. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine Saugvorrichtung eingesetzt, so daß das Verfahren in weniger als 20 Minuten, vorzugsweise in weniger als 15 Minuten durchgeführt werden kann. Dabei ist die Verwendung einer Saugvorrichtung besonders vorteilhaft, die ein an- und/oder durchströmbares Trägermaterial und ein saugfähiges Material aufweist, wobei das saugfähige Material mit einem Abstand unterhalb des Trägermaterials angeordnet ist, der kleiner als die maximal mögliche senkrechte Ausdehnung eines vollständig ausgebildeten, an dem Trägermaterial anhaftenden Flüssigkeitstropfens, vorzugsweise eine Wassertropfens ist. Eine derartige Saugvorrichtung wird in der eingereichten Gebrauchsmusteranmeldung mit dem Titel "Saugvorrichtung" beschrieben. Für weitere Details wird explizit auf die Offenbarung dieser Gebrauchsmusteranmeldung verwiesen (DE 200 18 454.7).

Die Temperatur, bei der die Trägermaterialien verwendet werden, ist so zu wählen, daß weder Veränderungen des Biomolekül-Mantels, der Biomolekül-Sonden oder der anzureichernden bzw. nachzuweisenden Biomoleküle, wie beispielsweise Denaturierung und chemische Zersetzungsreaktionen auftreten. Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Trägermaterialien bei Raumtemperatur angewendet.

Mögliche Einsatzgebiete des Trägermaterials sind dem Fachmann offensichtlich. Dazu gehören unter anderem Verfahren zur DNA-Hybridisierung, Immunoassays, Anreicherung von Molekülen organischer oder anorgischer Natur, Bakterien, Viren, Human-, Pflanzen- und Tier- Zellen sowie die Verwendung als Enzym-Substrat-Systeme.

Das Trägermaterial kann auch zur routinemäßigen Überprüfung von Proben eingesetzt werden, die möglicherweise mit Viren oder Bakterien belastet sind. So können beispielsweise Blutprodukte in Blutbanken auf HIV, Hepatitis, Syphilis und dergleichen untersucht werden. Der Test eignet sich für Antigene, bei denen ein positiver Befund relativ selten zu erwarten ist und darüber hinaus auch überall dort, wo eine große Anzahl von Seren untersucht werden muß.

Die Verwendung des Trägermaterials erfolgt vorteilhafterweise in Kombination mit einer Saugvorrichtung, insbesondere mit einer Saugvorrichtung gemäß der oben genannten Gebrauchsmusteranmeldung, wobei die aufgetragenen Flüssigkeiten die Vorrichtung nicht verlassen und in einem "waste"-Behälter aufgefangen werden, sondern mit einer Saugvorrichtung, beispielsweise in Form eines Saugfilters aus Zellwatte/Zellstoff o. ä., die unterhalb des porösen Filterscheibchens angeordnet wird, aufgesaugt werden. Die Verwendung einer Saugvorrichtung, insbesondere einer Saugvorrichtung gemäß der oben genannten Gebrauchsmusteranmeldung, bietet den Vorteil, daß die Verfahren zum Anreichern oder zum Nachweis der Biomoleküle nochmals deutlich schneller durchgeführt werden können. Weiterhin ist es vorteilhaft, daß solche Vorrichtungssysteme noch weniger kontaminationsanfällig sind.

Somit wird durch die Vorrichtung mit einem homogen durchströmbaren Hohlkörper aufweisend in seinem Inneren ein Trägermaterial mit mindestens einer daran immobilisierten Biomolekül-Sonde und den entsprechenden Verfahren zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen ein völlig neuartige Vorrichtung zur Verfügung gestellt, um Jedermann ohne komplizierte und teure Maschinenkonfigurationen, das Anreichern und Nachweisen von Biomolekülen zu ermöglichen.

Beansprucht werden auch Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen mit einem Trägermaterial gemäß der Erfindung, mindestens einem Hilfsreagenz zum Nachweis von Biomolekülen und gegebenenfalls einem oder mehreren Auffangbehältern oder einer oder mehreren Saugvorrichtungen, vorzugsweise einer Saugvorrichtung gemäß der oben genannten Gebrauchsmusteranmeldung.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Beispielen eingehender erläutert, ohne daß die Erfindung auf dieses Beispiel beschränkt werden soll. Dabei beschreiben Beispiel 1 bis 4 die Möglichkeiten zur Herstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Beispiele 5 bis 7 beziehen sich auf verschiedene Möglichkeiten zur Denaturierung von Nukleinsäuren. Beispiel 8 zeigt eine Möglichkeit zur erfindungsgemäßen Anreicherung von Biomolekülen auf. Beispiel 9 und 10 beschreiben eine Nachweismethode der an der erfindungsgemäßen Vorrichtung spezifisch gebundenen Biomoleküle.

Beispiel 1 Kopplung von Biomolekülen an Polyethylen Material

Runde Fritte aus Polyethylen, 5 mm Durchmesser, 5 mm Höhe, formgenau für den Querschnitt eines Durchflußgefäßes, die durch Sintern aus Polyethylenpulver mit enger Korngrößenverteilung durch Aussieben hergestellt wurden (Korngröße unter 250 µm); Nenn-Porengröße 5-150 µm, Durchmesser 5 mm, Fassungsvermögen für Probenlösungen über eine am oberen Ende des konischen Teils angesetzte, 5 mm hohe Fritte, ca. 0,8 ml; das Volumen des Trägermaterials betrug 80 µl.

300 poröse Formträger aus Polyethylen werden in einer Glasflasche in 200 ml absolutem Ethanol 30 Minuten mittels einer Vakuumpumpe bzw. Wasserstrahlpumpe im Batch-Verfahren entgast.

Die Formträger werden in 75 ml PBS mit physiologischem pH aufgenommen und es wird Rinderserumalbumin (BSA) zugegeben, bis eine Endkonzentration von 70 µg/ml erreicht ist. Die Inkubation erfolgt auf einem Überkopfschüttler für 16 Stunden. Anschließend wird der Überstand dekantiert (ca. 75 ml) und die Formträger werden mit PBS (pH physiol.) 8 × gewaschen und wieder dekantiert. Daran anschließend werden ca. 75 ml azide PBS (gepuffert auf pH = 4.8) zugegeben.

Zur Vernetzung und Einführung der Sonden werden 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid (EDC)) mit einer Endkonzentration von 1,3 mg/ml sowie 50 µmol/Fritte 5'-phosphoryliertes Oligonukleotid (Biometra) zugegeben. Die Inkubation erfolgt auf einem Überkopfschüttler für 16 Stunden. Anschließend wird der Überstand dekantiert, die Formträger werden mit PBS (pH physiol.) 8 × gewaschen und wieder dekantiert.

Verbleibende aktive Gruppen des Vernetzungsreagenzes werden mittels Rinderserumalbumin (1%ige Lösung in PBS (pH physiol.)) blockiert. Die Inkubation erfolgt auf einem Überkopfschüttler für 16 Stunden.

Die Formträger können nach der Kopplung getrocknet werden, indem man sie für 4 Stunden in einer Protein-Zuckerlösung (1% BSA/10% Polysaccharid) inkubiert und anschließend bei 42°C für 16 Stunden trocknet.

Beispiel 2 Kopplung von Biomolekülen an Polyethylen

300 poröse Formträger aus Polyethylen (Fritten wie in Beispiel 1) werden unbehandelt eingesetzt.

Die Formträger werden in 75 ml PBS mit physiologischem pH aufgenommen und es wird Rinderserumalbumin (BSA) zugegeben, bis eine Endkonzentration von 70 µg/ml erreicht ist. Die Inkubation erfolgt auf einem Überkopfschüttler für 16 Stunden. Anschließend wird der Überstand dekantiert (ca. 75 ml) und die Formträger werden mit PBS (pH physiol.) 8 × gewaschen und wieder dekantiert. Daran anschließend werden ca. 75 ml azide PBS (gepuffert auf pH = 4.8) zugegeben.

Zur Vernetzung und Einführung der Sonden werden 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid (EDC)) mit einer Endkonzentration von 1,3 mg/ml sowie 50 pmol/Fritte 5'-phosphoryliertes Oligonukleotid (Biometra) zugegeben. Die Inkubation erfolgt auf einem Überkopfschüttler für 16 Stunden. Anschließend wird der Überstand dekantiert, die Formträger werden mit PBS (pH physiol.) 8 × gewaschen und wieder dekantiert.

Verbleibende aktive Gruppen des Vernetzungsreagenzes werden mittels Rinderserumalbumin (1%ige Lösung in PBS (physiol.)) blockiert. Die Inkubation erfolgt auf einem Überkopfschüttler für 16 Stunden.

Die Formträger können nach der Kopplung getrocknet werden, indem man sie für 4 Stunden in einer Protein-Zuckerlösung (1% BSA/10% Polysaccharid) inkubiert und anschließend bei 42°C für 16 Stunden trocknet.

Beispiel 3 Kopplung von Biomolekülen an Polyethylen

200 poröse Formträger aus Polyethylen (Fritten wie in Beispiel 1) werden in einer Glasflasche in 200 ml absolutem Ethanol 30 Minuten mittels einer Vakuumpumpe bzw. Wasserstrahlpumpe im Batch-Verfahren entgast. Die porösen Formträger werden 8 × mit PBS (pH 7,8) gewaschen und äquilibriert. Die Formträgen werden im Kühlschrank aufbewahrt.

Die Formträger werden in 75 ml PBS mit physiologischem pH aufgenommen und es wird Rinderserumalbumin (BSA) zugegeben, bis eine Endkonzentration von 70 µg/ml erreicht ist. Die Inkubation erfolgt auf einem Überkopfschüttler für 8 Stunden, die Aufbewahrung in einem Kühlschrank. Anschließend wird der Überstand dekantiert (ca. 75 ml) und die Formträger werden mit PBS (pH physiol.) 8 × gewaschen und wieder dekantiert. Daran anschließend werden ca. 75 ml azide PBS (gepuffert auf pH = 4.8) zugegeben, der Überstand dekantiert und nochmals ca. 75 ml azide PBS (gepuffert auf pH = 4.8) zugegeben.

Zur Vernetzung und Einführung der Sonden werden 1 mg Sulfo-LC-SMPT in 4 ml PBS (pH 4,8) sowie 50 pmol/Fritte 5'-phosphoryliertes Oligonukleotid (Biometra) zugegeben. Die Inkubation erfolgt auf einem Überkopfschüttler für 16 Stunden. Anschließend wird der Überstand mit einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt, die Formträger werden mit PBS (pH physiol.) 8 × gewaschen und wieder dekantiert.

Die Formträger werden 75 ml in PBS (pH 7,8) aufgenommen und der Überstand wird dekantiert.

Verbleibende aktive Gruppen des Vernetzungsreagenzes werden mittels Rinderserumalbumin (1%ige Lösung in PBS (physiol.)) blockiert. Die Inkubation erfolgt auf einem Überkopfschüttler für 4 Stunden.

Anschließend wird der Überstand mit einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt, die Formträger werden mit PBS (pH physiol.) 8 × gewaschen und wieder dekantiert. Die Formträger werden in 75 ml PBS aufgenommen.

Beispiel 4 Kopplung von Biomolekülen an Polyethylen

50 poröse Formträger aus Polyethylen (Fritten wie in Beispiel 1) werden in einer Glasflasche in 200 ml absolutem Ethanol 30 Minuten mittels einer Vakuumpumpe bzw. Wasserstrahlpumpe im Batch-Verfahren entgast. Die porösen Formträger werden 8 × mit PBS (pH 7,8) gewaschen und äquilibriert. Die Formträgen werden im Kühlschrank aufbewahrt.

Die Formträger werden in 25 ml PBS mit physiologischem pH aufgenommen und es werden 0,5 ml Polylysin-Lösung (0,1%; Sigma-Adrich) zugegeben. Die Inkubation erfolgt auf einem Überkopfschüttler für 4 Stunden, die Aufbewahrung in einem Kühlschrank. Anschließend wird der Überstand dekantiert (ca. 25 ml) und die Formträger werden mit PBS (pH physiol.) 8 × gewaschen und wieder dekantiert. Daran anschließend werden ca. 25 ml azide PBS (gepuffert auf pH = 4.8) zugegeben. Nach 10 Minuten wird der Überstand dekantiert und nochmals ca. 23 ml azide PBS (gepuffert auf pH = 4.8) zugegeben.

Zur Vernetzung und Einführung der Sonden werden 32,5 mg EDC in 2 ml PBS (pH 4,8) sowie 50 µmol/Fritte 5'-phosphoryliertes Oligonukleotid (Biometra) zugegeben. Die Inkubation erfolgt auf einem Überkopfschüttler für 4 Stunden. Anschließend wird der Überstand mit einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt, die Formträger werden mit PBS (pH physiol.) 8 × gewaschen und wieder dekantiert.

Die Formträger werden 25 ml in PBS (pH 7,8) aufgenommen und der Überstand wird dekantiert.

Verbleibende aktive Gruppen des Vernetzungsreagenzes werden mittels Rinderserumalbumin (1%ige Lösung in PBS (physiol.)) blockiert. Die Inkubation erfolgt auf einem Überkopfschüttler für 4 Stunden.

Anschließend wird der Überstand mit einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt, die Formträger werden mit PBS (pH physiol.) 8 × gewaschen und wieder dekantiert. Die Formträger werden in 75 ml PBS aufgenommen.

Beispiel 5 Denaturierung der Nukleinsäure durch Harnstoff

10 µl des biotinyl. PCR-Amplifikates werden mit 90 µl einer 8 M Harnstoff/Wasser-Lösung versetzt und 5 Minuten in einem separaten Reaktionsgefäß bei Raumtemperatur denaturiert/inkubiert. Anschließend kann der Ansatz direkt auf die Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen gegeben werden, in welcher das mit der spezifischen Sonde (Oligonukleotid) ummantelte Trägermaterial eingelassen ist (⇐ Beispiel 8).

Beispiel 6 Denaturierung der Nukleinsäure durch Alkalibehandlung

10 µl des biotinyl. PCR-Amplifikates werden mit 30 µl einer 0,2 N NaOH- Lösung versetzt und 5 Minuten in einem separatem Reaktionsgefäß bei Raumtemperatur denaturiert. Anschließend werden 30 µl einer 1 M TRIS-HCl- Lösung (pH = 7.5) hinzugegeben und der Ansatz unmittelbar auf die Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen gegeben, in welcher das mit der spezifischen Sonde (Oligonukleotid) ummantelte Trägermaterial eingelassen ist (⇐ Beispiel 8).

Beispiel 7 Denaturierung der Nukleinsäure durch Hitze

Zu 10 µl des biotinyl. PCR-Amplifikates werden 90 µl [PBS/0.05% Tween® 20 (pH physiol.) plus 300 mM NaCl] pipettiert und zusammen 5 Minuten bei 95°C (Heizblock) inkubiert. Anschließend kann der Ansatz direkt auf die Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen gegeben werden, in welcher das mit der spezifischen Sonde (Oligonukleotid) ummantelte Trägermaterial eingelassen ist (⇐ Beispiel 8).

Beispiel 8 Hybridisierung

Das denaturierte biotinyl. Amplifikat verbleibt 3-5 Minuten bei Raumtemperatur auf der Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen und kann in der Zeit mit der komplementären Sonde hybridisieren. Danach wird mit einem Waschpuffer (PBS pH (physiol.) 2 × 50 µl nicht spezifisch gebundenes Amplifikat heruntergewaschen.

Beispiel 9 Antikörper-Enzym-Bindung

100 µl eines anti-Biotin-Antikörpers (Horse-Radish-Peroxidase; 1 : 1000 in Waschpuffer verdünnt) werden auf die spezifisch gebundene Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen (Beispiel 8) gegeben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nachfolgend wird mit PBS (pH 9,23; aus PBS (physiol.) + 0,5% Tween® 20) 2 × 500 µl nicht gebundener Antikörper heruntergewaschen.

Beispiel 10 Zugabe des Enzym-Substrates

20 µl präzipitierendes Substrat TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin) werden auf die Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen aus Beispiel 9 gegeben. Nach 2 Minuten wird die Reaktion mit 600 µl bidestilliertem Wasser, die auf die Säule gegeben werden, gestoppt. Man beobachtet eine Blaufärbung. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengefaßt. Tabelle 1




Anspruch[de]
  1. 1. Trägermaterial, das zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen homogen an- und/oder durchströmbar ist, mit mindestens einer daran immobilisierten Biomolekül-Sonde, dadurch gekennzeichnet, daß es erhältlich ist durch ein Verfahren, bei dem man
    1. 1. das Trägermaterial mit einem Mantel-Molekül anströmend, durchströmend oder im Batch-Verfahren belädt, wobei das Mantel-Molekül entweder direkt an das Trägermaterial unspezifisch oder mittelbar an mindestens eine an das Trägermaterial gebundene Komponente seinerseits unspezifisch oder spezifisch gebunden und als Umhüllung um das Trägermaterial fixiert ist, und
    2. 2. ein Vernetzungsreagenz und die Biomolekül-Sonden zugibt, wobei die Biomolekül-Sonden auf der Oberfläche des umhüllenden Mantel-Moleküls unspezifisch oder spezifisch gebunden werden.
  2. 2. Trägermaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es einen mittleren Porendurchmesser von 0,1 bis 300 µm aufweist.
  3. 3. Trägermaterial nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es als Fritte aus gesintertem organischen oder anorganischen Material ausgebildet ist.
  4. 4. Trägermaterial nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Biomolekül-Sonden aus Molekülen, Molekülgruppen oder Teilchen mit affinen Eigenschaften zu anderen Substanzen bestehen.
  5. 5. Trägermaterial nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das umhüllende Mantel-Molekül ein Protein ist.
  6. 6. Verfahren zur Herstellung eines Trägermaterials gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
    1. 1. das Trägermaterial mit einem Mantel-Molekül anströmend, durchströmend oder im Batch-Verfahren belädt, wobei das Mantel-Molekül entweder direkt an das Trägermaterial unspezifisch oder mittelbar an mindestens eine an das Trägermaterial gebundene Komponente seinerseits unspezifisch oder spezifisch gebunden und als Umhüllung um das Trägermaterial fixiert ist, und
    2. 2. ein Vernetzungsreagenz und die Biomolekül-Sonden zugibt, wobei die Biomolekül-Sonden auf der Oberfläche des umhüllenden Mantel-Moleküls unspezifisch oder spezifisch gebunden werden.
  7. 7. Verfahren zur Anreicherung von Biomolekülen, dadurch gekennzeichnet, daß man
    1. 1. unter Anwendung von Unter- oder Überdruck oder Verwendung von die Durchflußgeschwindigkeit des Fludiums beeinflussenden Bauteilen eine Lösung, die das anzureicherende Biomolekül enthält, auf das Trägermaterial gemäß einem Ansprüche 1 bis 5 aufbringt,
    2. 2. die Biomoleküle mit dem Trägermaterial wechselwirken läßt, und
    3. 3. mit einer Waschlösung nicht spezifisch gebundene Biomoleküle herunterwäscht.
  8. 8. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen, dadurch gekennzeichnet, daß man
    1. 1. gemäß Anspruch 7 das nachzuweisende Biomoleküls auf das Trägermaterial gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 anreichert,
    2. 2. gemäß Anspruch 7 ein Affinitäts-Biomolekül auf dem Trägermaterial anreichert, um einen Biomolekül-Affinitäts- Biomolekül-Komplex auszubilden, und
    3. 3. ein Nachweisreagenz für den Biomolekül-Affinitäts-Biomolekül- Komplex zugibt.
  9. 9. Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen mit einem Trägermaterial gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, mindestens einem Hilfsreagenz zum Nachweis von Biomolekülen und einem oder mehreren Auffangbehältern oder einer oder mehreren Saugvorrichtungen.






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