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Dokumentenidentifikation DE69525736T2 24.10.2002
EP-Veröffentlichungsnummer 0735046
Titel OLIGONUKLEOTID UND KANZEROSTATISCHES MITTEL DAS DIESES ALS AKTIVEN INHALTSTOFF ENTHÄLT
Anmelder Taiho Pharmaceutical Co. Ltd., Tokio/Tokyo, JP
Erfinder MATSUO, Ken-ichi, Saitama 357, JP;
SUGIMOTO, Yoshikazu, Saitama 357, JP;
MASUKO, Norio, Saitama 357, JP;
YAMADA, Yuji, Saitama 359, JP
Vertreter Patent- und Rechtsanwälte Kraus & Weisert, 80539 München
DE-Aktenzeichen 69525736
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 13.10.1995
EP-Aktenzeichen 959343054
WO-Anmeldetag 13.10.1995
PCT-Aktenzeichen PCT/JP95/02113
WO-Veröffentlichungsnummer 0009611938
WO-Veröffentlichungsdatum 25.04.1996
EP-Offenlegungsdatum 02.10.1996
EP date of grant 06.03.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 24.10.2002
IPC-Hauptklasse C07H 21/04
IPC-Nebenklasse A61K 31/70   C07H 21/02   C12N 15/10   

Beschreibung[de]
TECHNISCHES GEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Oligonukleotid oder ein Derivat davon, das zur Behandlung und Prävention von Krebs bei Menschen verwendbar ist.

STAND DER TECHNIK

Mit der Entdeckung einer Reihe von mit Krebs in Verbindung stehender Gene in den letzten Jahren wurde nach und nach mit der Aufklärung des Mechanismus bösartiger Transformationen begonnen. Das Ergebnis war, dass gezeigt wurde, dass viele Krebsarten bestimmte genetische Erkrankungen sind, die durch die Abnormalität von Genen verursacht werden. Da abnorme Mutantenzellen natürlicherweise von normalen Zellen abstammen, werden sie im lebenden Körper nicht einfach als Fremdkörper erkannt, und ihre biologischen oder biochemischen Eigenschaften sind im Gegensatz zu infektiösen Erkrankungen, die durch das Eindringen anderer Organismen verursacht werden, nicht sehr groß.

Obgleich infolge verschiedener Arzneimittel therapeutische Verfahren und Reagentien gegen Krebs entwickelt wurden, diese aber wegen ihrer geringen Selektivität für Krebszellen nicht nur auf Krebszellen, sondern auch auf normale Gewebe und normale Zellen Wirkungen ausüben, ist in der derzeitigen Situation die Verwendung solcher Arzneimittel aufgrund ihrer Nebenwirkungen auf Anwendungen beschränkt, wo sie wirksam sind.

Andererseits wurden kürzlich Regulierungsverfahren für die Expression spezifischer Gene entwickelt, die Nukleinsäuren und ihre Derivate verwenden. Da Krebs eine genetische Krankheit ist, wie dies oben beschrieben ist, können Krebszellen-spezifische Effekte durch solche Expressionskontrollmethoden erwartet werden, wenn ein spezifisches Gen, insbesondere ein maligner Transformationsfaktor, als Target eingesetzt wird.

Eines dieser Mittel ist das Antisense-Verfahren. In diesem Verfahren wird ein kurzes Oligonukleotid (mit einer Länge von etwa 15 bis 30 Basen), das eine Nukleotidsequenz hat, die zu einer Nukleotidsequenz eines als Target zu verwendenen Gens komplementär ist, in Zellen eingeführt, um eine Inhibition der Transkription oder Translation des malignen Transformationsgens zu bewirken. Das Antisense-Verfahren wird grob in ein Antigen-Verfahren und ein Antimessenger- Verfahren eingeteilt, und zwar in Abhängigkeit von den Targetmolekülen.

Das Antimessenger-Verfahren verwendet Messenger-RNA als Target. In diesem Verfahren wird ein Oligonukleotid, das eine Nukleotidsequenz hat, die zu einem Target- Einzelstrang-RNA-Molekül komplementär ist, unter Bildung einer Doppelstrangkette durch die Watson-Crick-Bindung hergestellt; auf diese Weise wird eine Inhibition des Splicing oder der Translation der Target-RNA oder ihres Abbaus mit einem Doppelstrang-spezifischen RNA-abbauenden Enzym bewirkt. Dagegen kann das Antigen-Verfahren, das später beschrieben wird, alle RNA-Moleküle als Target verwenden. Daher wurden Untersuchungen über dieses Verfahren beschrieben, die Oncogene wie z. B. das c-myc-Gen (Nature, 328, 445-449 (1987)) und dergleichen als Target verwenden. Da allerdings Messenger-RNA-Moleküle in Zellen in einer großen Menge vorliegen (speziell im Fall von malignen Transformationsfaktoren) wird auch die Menge an Antisense- Molekülen, die erforderlich ist, um auf die Zellen einen Einfluss auszuüben, groß. Selbst wenn seine Wirkung auf dem Level kultivierter Zellen anerkannt ist, wird davon ausgegangen, dass seine klinische Anwendung derzeit schwierig ist. In dem Antigen-Verfahren wird dagegen ein Antisense-Molekül um eine Doppelstrang-DNA-Kette eines Targetgens unter Bildung einer Dreistrangkette gewunden. Da die Menge eines solchen Targets in Zellen anders als im Fall des Antimessenger-Verfahrens, dessen Target Messenger-RNA wird, klein ist, scheint das Antigen-Verfahren, das auf Gen-DNA gerichtet ist, unter Berücksichtigung der Stabilität und dergleichen von Oligonukleotiden im lebenden Körper nachgängigen Techniken in Betracht gezogen werden, ein für eine klinische Anwendung geeigneteres Verfahren zu sein. Die Bildung der Dreifachstrang-Kette, die für das Antigen-Verfahren essentiell ist, hängt von der Hoogsteen-Bindung ab. Es ist bekannt, dass eine Seite der Doppelstrang-DNA für die Bildung der Hoogsteen-Bindung eine kontinuierliche Purinbasensequenz (Homopurin/Homopyrimidin-Sequenz) haben muss.

Dementsprechend besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, unter Anwendung des Antigen-Verfahrens ein Oligonukleotid oder ein Derivat desselben bereitzustellen, das selektiv auf Krebszellen wirkt und das daher als pharmazeutische Zusammensetzung, z. B. als Mittel gegen Krebs, verwendbar ist. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung zur Vorbeugung und Prävention von Krebsarten und in einem Verfahren zur Inhibition der p120- Gentranskription.

In Anbetracht der obigen Ausführungen stellten die Erfinder der vorliegenden Erfindung als Resultat ausgedehnter Forschungen auf der Basis der Feststellungen, dass in normalen Geweben meistens kein maligner Transformationsvektor p120 vorhanden ist, der aber in verschiedenen Krebsgeweben vorhanden ist (Cancer Res., 48, 1244-1251 (1988)) fest, dass das Wachstum von Krebszellen durch spezifische Inhibition der Expression von p120 selektiv gehemmt werden kann und dass, da eine Homopurin/Homopyrimidin-Region in der Transkriptionssteuerungsregion der Gen-DNA-1353/-1337 stromaufwärts des Translations-Initiationspunktes vorhanden ist, ein Antigen-Verfahren, bei dem eine Dreifachstrang-Kette durch Wickeln eines Antisense-Moleküls oder eines Sense-Moleküls um diese Homopurin/Homopyrimidin- Region gebildet wird, einen hervorragenderen Effekt zur Inhibition der Expression des Gens als ein Antimessenger- Verfahren, das auf Messenger-RNA abzielt, zeigen kann. Auf der Basis dieser Feststellungen wurde die vorliegende Erfindung beendet.

Somit wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Oligonukleotid mit wenigstens 15 aufeinanderfolgenden Basen der Nukleotidsequenz, die als Sequenz ID NO: 1 dargestellt ist, und/oder einer komplementären Sequenz der Nukleotidsequenz oder ein Derivat davon bereitgestellt; ebenfalls wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das Oligonukleotid oder ein Derivat davon als Wirkstoff enthält, und die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge mindestens eines der Oligonukleotide oder Derivate davon zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention und Behandlung von Krebsarten bei Säugern einschließlich beim Menschen sowie das Oligonukleotid oder ein Derivat davon zur Verwendung in einem Verfahren zur Prävention und Behandlung von Krebsarten bei Säugern einschließlich des Menschen bereitgestellt.

Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Inhibition der Transkription eines p120-Gens bereit, um passend die Verwendung eines Oligonukleotids, das in der Lage ist, eine Tripel-Helix (Kette mit drei Strängen) in einem Homopurin/Homopyrimidin-Bereich des p120-Gens zu bilden. Da die Transkription des p120-Gens gehemmt wird, ist dieses Verfahren bei der Hemmung der Produktion des p120-Proteins wirksam; auf diese Weise verleiht sie Krebscytotoxische Aktivität.

Das Oligonukleotid der vorliegenden Erfindung entspricht der vorstehend beschriebenen Homopurin/Homopyrimidin- Region -1353/-1337 stromaufwärts des p120-Gen-Translations-Initiations-Punkts; die -1340-Position der Homopurin-Region ist Thymin, das als solches vorliegen kann oder durch Adenin ersetzt sein kann, so dass Purinbasen fortlaufend sind. D. h., W in Sequenz ID NO: 1 ist Thymin oder Adenin und Sequenz ID NO: 2 ist eine Homopurin-Sequenz, in der W durch A ersetzt ist. Das Oligonukleotid der vorliegenden Erfindung umfasst auch eine Homopyrimidin-Region- Sequenz, die eine zu der Sequenz ID NO: 1 komplementäre Sequenz ist (die komplementäre Sequenz von Sequenz ID NO: 2 ist eine Homopyrimidin-Sequenz). Jedes der Oligonukleotide der Sequenz ID NO: 1 der vorliegenden Erfindung und ihrer komplementären Sequenzen werden eine Sequenz, die in der Lage ist, eine Dreifachstrang-Kette mit der Homopurin/Homopyrimidin-Region zu bilden, wenn sie mindestens 15 aufeinanderfolgende Basen hat.

Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann jedes Oligonukleotid der Sequenz ID NO: 1, in der W T oder A ist, oder komplementäre Oligonukleotide davon in derselben Zusammensetzung allein oder in Kombination enthalten, und kann durch fakultative Einstellung des Formulierungsverhältnisses der entsprechenden Oligonukleotide verwendet werden.

Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann aus dem vorstehend beschriebenen Oligonukleotid und einem bekannten Träger zur pharmazeutischen Verwendung bestehen und ist insbesondere als Medikament zur Vorbeugung und Prävention von Krebsarten einsetzbar.

Das erfindungsgemäße Oligonukleotid kann im Allgemeinen unter Verwendung einer im Handel erhältlichen DNA- Syntheseapparatur nach den bekannten Techniken synthetisiert werden. Im Hinblick auf einen intracellulären Einbau und im Hinblick auf die Stabilität kann in jedem Fall eine Phosphodiesterbindung durch eine Methylphosphatbindung (U.S. Patent Nr. 4 511 713) oder eine Phosphorthioatbindung (JP-A-1-503302, der Ausdruck "JP-A" wie er hier verwendet wird, meint eine "nichtgeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung") ersetzt werden. Jeder dieser Typen kann unter Verwendung einer im Handel erhältlichen DNA-Syntheseapparatur synthetisiert werden.

Außerdem ist es möglich, die Affinität eines Oligonukleotids, das diese Sequenz für DNA enthält, zu erhöhen, indem ein DNA-Intercalat oder dergleichen an seinem 5'- oder 3'- Ende gebunden wird, oder seinen Einbau in Zellen zu erhöhen, indem eine fettlösliche Verbindung, wie z. B. Cholesterin, daran gebunden wird. Acridin oder ein Derivat davon können als Beispiel für das DNA-Intercalat genannt werden (WO 92/20698).

Folglich umfassen Beispiele für das Oligonukleotidderivat der vorliegenden Erfindung solche, die ähnlich wie im Fall des erfindungsgemäßen Oligonukleotids die Wirkung aufweisen, die Expression von p120-Protein zu inhibieren, wobei die Phosphodiester-Bindung durch eine Methylphosphat- Bindung oder eine Phosphorthioat-Bindung ersetzt ist, oder ein DNA-Interkalat oder eine fettlösliche Verbindung am 5'- oder 3'-Ende gebunden ist.

Da das erfindungsgemäße Oligonukleotid starke Wirkung zur Abtötung von Zellen und zur Inhibierung der Expression von p120-Protein hat, kann es als Wirkstoff von Antikrebs- Mitteln verwendet werden.

Wenn das erfindungsgemäße Oligonukleotid als Arzneimittel für Säuger einschließlich des Menschen angewendet wird, kann es in Abhängigkeit vom jeweiligen vorbeugenden oder therapeutischen Zweck zu verschiedenen Dosierformen verarbeitet werden, z. B. orale Zubereitungen, Injektionen, Suppositorien, Zubereitungen zur äußerlichen Anwendung (z. B. Kataplasmen, Pflaster und ähnliche Klebezubereitungen, Salben, Cremes und Lotionen), Augentropfen, Nasentropfen und dergleichen; diese Zubereitungen können nach den entsprechenden Arzneimittel-Herstellungstechniken, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, produziert werden.

Wenn feste Zubereitungen für eine orale Verabreichung hergestellt werden, wird die erfindungsgemäße Verbindung mit einem Arzneimittel-Trägerstoff und wenn notwendig mit einem Bindemittel, einem Zerfallsmittel, einem Gleitmittel, einem Farbmittel, einem Aromastoff, einem Geruchskorrekturmittel und dergleichen vermischt; das resultierende Gemisch wird dann nach einem üblichen Verfahren zu Tabletten, überzogenen Tabletten, Granulat, Pulver, Kapseln und dergleichen verarbeitet. Als solche Zusatzstoffe können verschiedene Verbindungen, die allgemein auf diesem Gebiet verwendet werden, eingesetzt werden, z. B. Lactose, Saccharose, Natriumchlorid, Glucose, Stärke, Calciumcarbonat, Kaolin, mikrokristalline Cellulose, Kieselsäure und dergleichen als Arzneimittel-Trägerstoffe; Wasser, Ethanol, Propanol, einfacher Sirup, Glucoselösung, Stärkelösung, Gelatinelösung, Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylstärke, Methylcellulose, Ethylcellulose, Shellack, Calciumphosphat, Polyvinylpyrrolidon und dergleichen als Bindemittel; trockene Stärke, Natriumalginat, Agarpulver, Natriumhydrogencarbonat, Calciumcarbonat, Natriumlaurylsulfat, Stearinsäuremonoglycerid, Lactose und dergleichen als Zerfallsmittel; gereinigter Talk, Stearinsäuresalz, Borax, Polyethylenglykol und dergleichen als Gleitmittel; und Saccharose, Bitterorangenschale, Citronensäure, Weinsäure und dergleichen als Aromamittel.

Wenn flüssige Zubereitungen zur oralen Verabreichung hergestellt werden, wird die erfindungsgemäße Verbindung mit einem Aromamittel, einem Puffer, einem Stabilisator, einem Geruchskorrekturmittel und dergleichen vermischt, und das resultierende Gemisch wird nach einem üblichen Verfahren zu Lösungen für eine innerliche Verwendung, Sirupe, Elixiere und dergleichen verarbeitet. In diesem Fall können die vorstehend genannten Aromamittel verwendet werden, Natriumcitrat und dergleichen kann als Puffer verwendet werden, und Traganth, Gummi arabicum, Gelatine und dergleichen können als Stabilisator verwendet werden.

Wenn Injektionen hergestellt werden, können subkutane, intramuskuläre und intravenöse Injektionen hergestellt werden, indem die erfindungsgemäße Verbindung nach einem üblichen Verfahren mit einem Mittel zur pH-Einstellung, einem Puffer, einem Stabilisator, einem isotonischen Mittel, einem Lokalanästhetikum und dergleichen vermischt wird. Beispiele für das Mittel zur pH-Einstellung und das Puffermittel umfassen in diesem Fall Natriumcitrat, Natriumacetat, Natriumphosphat und dergleichen. Als Stabilisator können Natriumpyrosulfit, EDTA, Thioglykolsäure, Thiomilchsäure und dergleichen eingesetzt werden. Beispiele für das Lokalanästhetikum umfassen Procainhydrochlorid, Lidocainhydrochlorid und dergleichen. Natriumchlorid, Glucose und dergleichen können als isotonisches Mittel verwendet werden.

Suppositorien können hergestellt werden, indem die erfindungsgemäße Verbindung mit pharmazeutischen Trägern, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie z. B. Polyethylenglykol, Lanolin, Kakaobutter und Fettsäuretriglycerid, wie auch Tween (Handelsbezeichnung) und ähnlichen oberflächenaktiven Mitteln, falls erforderlich, vermischt wird und das resultierende Gemisch danach in einem üblichen Verfahren geformt wird.

Salben werden hergestellt, indem die erfindungsgemäße Verbindung mit allgemein verwendeten Grundmaterialien, Stabilisatoren, Gleitmitteln, Konservierungsmitteln und dergleichen in Abhängigkeit vom jeweiligen Zweck vermischt wird und die Rezeptur nach einem üblichen Verfahren gemischt wird. Beispiele für solche Grundmaterialien umfassen flüssiges Paraffin, Alvolen, gebleichtes Bienenwachs, Octyldodecylalkohol, Paraffin und dergleichen. Beispiele der Konservierungsstoffe umfassen Methylparaoxybenzoat, Ethylparaoxybenzoat, Propylparaoxybenzoat und dergleichen.

Klebe-Zubereitungen werden in der üblichen Weise durch Beschichten eines im Allgemeinen verwendeten Trägers mit den vorher genannten Salben, Cremes, Gelen, Pasten oder dergleichen hergestellt. Beispiele für geeignete Träger umfassen Gewebe- oder Faservlies aus Baumwolle, Stapelfaser, Chemiefaser und dergleichen und Filme oder geschäumte Folien aus weichem Vinylchlorid, Polyethylen, Polyurethan und dergleichen.

Darüber hinaus kann die erfindungsgemäße Verbindung verabreicht werden, indem sie in Liposome eingekapselt wird, in denen der Wirkstoff in feinen Teilchen, die aus wässrigen konzentrischen Schichten, die an Fettschichten haften, bestehen, dispergiert ist oder als pharmakologische Zusammensetzung, die in anderen Formen enthalten ist, verwendet werden. In Abhängigkeit von seiner Löslichkeit kann der Wirkstoff sowohl in wässrigen Schichten wie auch in Fettschichten vorliegen oder in Form einer sogenannten Liposomsuspension verwendet werden. Die hydrophobe Schicht besteht aus einem Phospholipid wie z. B. Lecithin, einem Steroid, wie z. B. Cholesterin, einem schwach ionischen oberflächenaktiven Mittel, wie z. B. Dicetylphosphat, Stearylamin oder Phosphatidylsäure und/oder anderen hydrophoben Verbindungen. Die Teilchengröße von Liposomen liegt allgemein im Bereich von etwa 15 nm bis etwa 5 um.

Obgleich der Gehalt des Oligonukleotids der vorliegenden Erfindung in pharmazeutischen Zubereitungen in Abhängigkeit von der jeweiligen Zubereitung variiert, kann er vorzugsweise im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 70 Gew.-% liegen.

Das Verabreichungsverfahren für die pharmazeutische Zubereitung der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders eingeschränkt und kann gegebenenfalls in Abhängigkeit von der jeweiligen Dosierungsform, dem Alter, dem Geschlecht und anderen Krankheitsbildern des jeweiligen Patienten, dem Grad der Symptome und dergleichen ausgewählt werden. Beispielsweise kann eine Injektionszubereitung zur intravenösen Injektion als solche oder durch Vermischen mit üblichen Hilfslösungen, wie z. B. von Glucose, Aminosäure und dergleichen, verwendet werden oder sie kann nach Bedarf alleine für eine intraarterielle, intramuskuläre, subkutane oder intraperitoneale Injektion verwendet werden. Suppositorien werden in das Rektum verabreicht, und Salben werden auf die Haut, Mund, Schleimhaut und dergleichen aufgetragen.

Die Dosis des erfindungsgemäßen Oligonukleotids kann gegebenenfalls abhängig vom jeweiligen Verabreichungsverfahren, Alter, Geschlecht und anderen Krankheitsbildern des jeweiligen Patienten, dem Grad der Symptome und dergleichen ausgewählt werden. Im Allgemeinen kann die erfindungsgemäße Verbindung in einer geeigneten Dosis von 0,01 bis 1000 mg/kg/Tag, vorzugsweise von 0,1 bis 500 mg/kg/Tag verabreicht werden. Die vorstehend angegebene tägliche Dosis kann auf einmal oder in 2 bis 4 Tagesdosen aufgeteilt verabreicht werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist ein Schaubild, das das Infrarot-Absorptionsspektrum des Oligonukleotids, welches durch Sequenz ID NO: 2 dargestellt wird, zeigt.

Fig. 2 ist ein Schaubild, das das kernmagnetische Resonanzspektrum des Oligonukleotids, das durch Sequenz ID NO: 2 dargestellt wird, zeigt.

Fig. 3 ist ein Diagramm, das Hela-cytotoxische Aktivitäten des erfindungsgemäßen Oligonukleotids und von p120- Sense- und -Antisense-Oligonukleotiden des Antimessenger- Verfahrens zeigt.

Fig. 4 ist eine Darstellung, die die Wirkung des erfindungsgemäßen Oligonukleotids und von p120-Sense- und -Antisense-Oligonukleotiden des Antimessenger-Verfahrens auf die Expression von p120-Protein zeigt.

BESTER MODUS ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung wird nun detaillierter anhand des folgenden erfindungsgemäßen Beispiels, der Testbeispiele und Rezepturbeispiele erläutert.

Erfindungsgemäßes Beispiel 1: Planung und Produktion des Oligonukleotids

Die Homopurin/Homopyrimidin-Sequenz, die in dem stromaufwärts gelegenen transkriptionalen Kontrollbereich des p120-Gens lokalisiert ist, wurde als eine Dreifachstrang- Kette-bildende Sequenz ausgewählt. Um eine stabile Bildung der Dreifachstrang-Kette (bzw. Tripel-Helix) zu erreichen, wurde die Antisense-DNA-Sequenz in eine antiparallele Sequenz, die hauptsächlich aus Homopurin besteht, übergeführt. Basierend auf dem so aufgebauten Oligonukleotid wurde das in Sequenz ID NO: 2 dargestellte Oligonukleotid unter Verwendung einer im Handel erhältlichen automatischen DNA-Synthese-Apparatur (hergestellt von Applied Biosystems) synthetisiert, wobei ein β-Cyanoethyl-Syntheseverfahren angewendet wurde. In Fig. 1 ist eine Aufnahme des Infrarot-Absorptionsspektrums (KBr-Verfahren) gezeigt, und in Fig. 2 ist eine Aufnahme des kernmagnetischen Resonanzspektrums (in D&sub2;O, 270 MHz) gezeigt.

Als Kontroll-Oligonukleotide des Antimessenger-Verfahrens wurden ein Antisense-Oligonukleotid (AACTTGCGCCCCATGGTA) und ein Sense-Oligonukleotid (TACCATGGGGCGCAAGTT), von denen jedes aus 18 Basenpaaren (-4 bis +14) entsprechend dem p120-Translationcodon (AUG-Stelle), synthetisiert.

Testbeispiel 1:

Die cyotoxische Aktivität des in dem erfindungsgemäßen Beispiel 1 erhaltenen Oligonukleotids wurde untersucht, wobei humane zervikale Karzinom-He-La-Zellen in einem Kultursystem verwendet wurden. D. h., 5 · 10² Zellen/100 ul/Vertiefung He-La-Zellen wurden in eine Kulturschale mit 96 Vertiefungen gesät, und nach 2tägiger Kultur wurde jede Vertiefung mit 100 ul einer Lösung beschickt, die 4 uM Lipofectin enthält, und jedem Oligonukleotid beschickt, die dann bei Raumtemperatur 1 Stunde lang miteinander reagieren gelassen wurden. Nach einer weiteren 3tägigen Kultur wurde die Anzahl der Zellen nach dem Kristallviolett- Verfahren bestimmt. Die Resultate sind in Fig. 3 angegeben. Wie aus den Resultaten offensichtlich wird, zeigt das DNA-Dreifachstrang-bildende Oligonukleotid der vorliegenden Erfindung (p120-Tripel-Helix) im Vergleich zu dem Antisense-Oligonukleotid (p120-Antisense) und dem Sense- Oligonukleotid (p120-Sense), die jeweils aus 18 Basenpaaren entsprechend dem p120-Translationscodon, bestehen, deutlich stärkere cytotoxische Aktivität.

Testbeispiel 2:

Um zu bestätigen, dass die cytotoxische Aktivität des erfindungsgemäßen Oligonukleotids, die in Testbeispiel 1 gezeigt wurde, durch die Inhibition der p120-Expression verursacht wird, wurden Veränderungen im p120-Protein durch Western-Blotting untersucht. D. h., He-La-Zellen wurden 2 Tage in einer Platte mit 24 Vertiefungen kultiviert, in der gleichen Weise wie für Testbeispiel 1 beschrieben mit dem Oligonukleotid behandelt und dann für weitere 7 Tage kultiviert. Danach wurden die resultierenden Zellen durch Trypsin-EDTA-Behandlung gewonnen und dann mit einem Solubilisierungsmittel (50 mM Tris-Puffer, pH 7,5/0,05% SDS) behandelt, wobei ein roher Zellextrakt erhalten wurde. Nach Bestimmung der Proteinkonzentration in jeder Probe wurde eine vorher festgelegte Menge des Proteinextrakts der SDS-PAGE-Elektrophorese unterworfen. Nach der Elektrophorese wurde Protein auf eine Nitrocellulosemembran transferiert, um die Menge an p120-Protein in jeder Probe unter Verwendung eines anti-p120-monoclonalen Antikörpers zu bestimmen. Als Kontrolltest wurde Western-Blotting in der gleichen Weise unter Verwendung von GAPDH (Glyceraldehydphosphat-Dehydrogenase) durchgeführt, die sich unter Zellwachstums-Bedingungen kaum ändert. Das Ergebnis war, dass durch die Behandlung mit 0,5 uM des erfindungsgemäßen Oligonukleotids (p120-Tripel-Helix) die Expression von p120-Protein fast vollständig inhibiert war, was in Fig. 4 dargestellt ist. Da keine Veränderungen in der Größenordnung der GADPH-Expression nachweisbar waren, wird angenommen, dass das erfindungsgemäße Oligonukleotid eine Verarmung an p120-Protein verursacht, indem die Transkription des p120-Gens selektiv gehemmt wird, was zu der Bildung der Cytotoxizität, die in Fig. 3 dargestellt ist, führt.

Rezepturbeispiel 1: Injektions-Zubereitung:

Erfindungsgemäße Verbindung 5 mg

Destilliertes Wasser zur Injektion Rest

pro Ampulle 5 ml

Unter Verwendung der obigen Rezeptur wurde eine Injektionszubereitung nach einem üblichen Verfahren hergestellt.

Rezepturbeispiel 2: Zubereitung in Kapselform:

Erfindungsgemäße Verbindung 10 mg

Lactose 50 mg

Maisstärke 47 mg

Kristalline Cellulose 50 mg

Talk 2 mg

Magnesiumstearat 1 mg

pro Kapsel 160 mg

Unter Verwendung der obigen Rezeptur wurde eine Kapsel- Zubereitung nach einem üblichen Verfahren hergestellt.

Rezepturbeispiel 3: Suppositorium:

Erfindungsgemäße Verbindung 20 mg

Witepsol W-35 (Handelbezeichnung, hergestellt von Dynamite Novel) 1380 mg

pro Suppositorium 1400 mg

INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT

Da das erfindungsgemäße Oligonukleotid oder ein Derivat davon die Transkription des krebsspezifischen p120-Gens, das in Krebszellen weit verbreitet ist, aufgrund seiner Eigenschaft, eine Dreifachstrang-Kette zu bilden, hemmen kann und als Resultat die Expression des p120-Proteins hemmt, kann es das Wachstum von Tumoren hemmen und ist daher als Mittel mit geringen Nebenwirkungen zur Verwendung in der Prävention und Behandlung von Krebsarten verwendbar.

SEQUENZPROTOKOLL (1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER:

(A) NAME: TAIHO PHARMACEUTICAL CO., LTD.

(B) STRASSE: 27, Kandanishikicho 1-chome, Chiyoda-ku

(C) ORT: Tokio

(E) LAND: Japan

(F) POSTLEITZAHL: 101

(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: OLIGONUKLEOTID UND KANZEROSTATISCHES MITTEL, DAS DIESES ALS AKTIVEN INHALTSSTOFF ENTHÄLT

(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2

(iv) COMPUTERLESBARE FASSUNG:

(A) DATENTRÄGER: Diskette

(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel

(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0,

Version #1.30 (EPO)

(v) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:

ANMELDENUMMER: EP 95 934 305.4

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 17 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nukleinsäure

(A) BESCHREIBUNG: /desc = "synthetisches Oligonukleotid"

(iv) ANTISENSE: JA

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: spezielles Merkmal

(B) LAGE: 4

(D) SONSTIGE ANGABEN: /Produkt = "W ist T oder A"

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

GAAWGGAGGA GGAGAAA 17

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 17 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nukleinsäure

(A) BESCHREIBUNG: /desc = "synthetisches Oligonukleotid"

(iv) ANTISENSE: JA

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

GAAAGGAGGA GGAGAAA 17


Anspruch[de]

1. Oligonukleotid mit wenigstens 15 aufeinanderfolgenden Basen der Nukleotidsequenz GAA-WGG-AGG-AGG-AGA-AA (W = A oder T) oder solchen Derivaten davon, bei denen die Phosphodiester-Bindung durch eine Methylphosphatbindung oder eine Phosphorthioatbindung ersetzt ist, oder bei denen eine DNA-interkalierende Substanz oder eine fettlösliche Verbindung an deren 5'- oder 3'-Ende gebunden ist.

2. Oligonukleotid oder Derivat davon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid 17 Basen hat.

3. Oligonukleotid oder Derivat davon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass W für A steht.

4. Oligonukleotid oder Derivat davon nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid 17 Basen hat.

5. Oligonukleotid oder Derivat davon, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Derivat die Phosphodiester-Bindung durch eine Methylphosphatbindung oder eine Phosphorthioatbindung ersetzt ist, oder eine DNA- interkalierende Substanz oder eine fettlösliche Verbindung an dessen 5'- oder 3'-Ende gebunden ist, mit wenigstens 15 aufeinanderfolgenden Basen einer Sequenz, die komplementär zu der Nukleotidsequenz GAA-WGG-AGG-AGG-AGA-AA (W = A oder T) ist.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff wenigstens eines der in den Ansprüchen 1 bis 5 beanspruchten Oligonukleotide oder Derivate davon enthält.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung ein vorbeugendes und therapeutisches Mittel für Krebs ist.

8. Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge wenigstens einer der Oligonukleotide oder Derivate davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung und Behandlung von Krebsarten bei Säugetieren einschließlich des Menschen.

9. Oligonukleotid oder Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung in einem Verfahren zur Vorbeugung und Behandlung von Krebsarten bei Säugetieren einschließlich des Menschen.

10. Verfahren zur Inhibition der Transkription eines p120-Gens in vitro, umfassend die Verwendung eines Oligonukleotids oder eines Derivats davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das in der Lage ist, eine Trippel-Helix (Kette mit drei Strängen) in einem Homopurin/Homopyrimidin-Bereich des p120-Gens zu bilden.







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