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Dokumentenidentifikation DE69805844T2 24.10.2002
EP-Veröffentlichungsnummer 1037658
Titel IFNNAR/IFN KOMPLEX
Anmelder Applied Research Systems ARS Holding N.V., Curacao, AN
Erfinder TEPPER, Mark, Canton, US;
CUNNINGHAM, Mark, Waltham, US;
SHERRIS, David, Jamaican Plain, US;
EL TAYAR, Nabil, Milton, US;
MCKENNA, Sean, Ducksberry, US
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69805844
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 18.12.1998
EP-Aktenzeichen 989640719
WO-Anmeldetag 18.12.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/US98/26926
WO-Veröffentlichungsnummer 0009932141
WO-Veröffentlichungsdatum 01.07.1999
EP-Offenlegungsdatum 27.09.2000
EP date of grant 05.06.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 24.10.2002
IPC-Hauptklasse A61K 38/21
IPC-Nebenklasse A61K 38/17   C07K 14/555   C07K 14/715   C07K 19/00   C12N 15/12   C12N 5/10   

Beschreibung[de]
GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Komplex des Typ I Interferons, der aus der Polypeptid-Sequenz der extrazellulären Domäne des menschlichen Interferon α/β-Rezeptors (IFNAR) und einem Typ I Interferon (IFNα, IFNβ und IFNω) besteht. Dieser Komplex verbessert die Stabilität, steigert die Wirkung und verlängert die Pharmakokinetik in vivo von freiem IFN für anti-virale, Anti-Krebs- und Immunmodulationsaktivität. Insbesondere ist der Komplex ein Fusionsprotein oder ein kovalenter Komplex oder ein nicht kovalenter Komplex, der die Polypeptid-Sequenz der gesamten extrazellulären Domäne von IFNAR2 oder eine Interferon bindende Unterfraktion davon, die mit einem Typ I Interferon (IFNα, IFNβ, IFNω) einen Komplex bildet, oder eine biologische aktive Unterfraktion davon enthält.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Interferone werden entweder in die Klasse des aus Leukozyten und Fibroblast gewonnenen Typ I Interferons oder in die Klasse des mitogen induzierten oder "immunen" Typ II Interferons (Pestka et al. 1987) eingeteilt. Durch die Analyse der Sequenzidentitäten und gewöhnlichen biologischen Aktivitäten schließen Typ I Interferone Interferon Alpha (IFNα), Interferon Beta (IFNβ) und Interferon Omega (IFNω) ein, während zum Typ II Interferon Interferon Gamma (IFNγ) gehört. Die IFNα, IFNβ und IFNω Gene sind auf dem kurzen Ast von Chromosom 9 gebündelt (Lengyl, 1982). Es gibt wenigstens 25 nicht- allelische IFNα-Gene, 6 nicht-allelische IFNω-Gene und ein einzelnes IFNβ-Gen. Von allen wird angenommen, dass sie sich aus einem einzelnen gemeinsamen Ursprungsgen entwickelt haben. Innerhalb von Spezies sind bei IFNα-Genen mindestens 80% Sequenzidentität gleich. Das IFNβ-Gen hat ungefähr 50% gleiche Sequenzidentität wie das IFNα; und das IFNω-Gen hat 70% Entsprechung mit IFNα (Weissman et al. 1986; Dron et al. 1992). IFNα weist ein Molekulargewicht im Bereich von 17-23 kDa (165-166 Aminosäuren) auf, IFNβ ~ 23 kDa (166 Aminosäuren) und IFNω ~ 24 kDa (172 Aminosäuren).

Typ I Interferone sind pleiotrope Zytokine mit Aktivität in Wirtsverteidigung gegen virale und parasitäre Infektionen, als Anti-Krebs-Zytokine und als Immunmodulatoren (Baron et al. 1994; Baron et al. 1991). Zu den physiologischen Antworten des Typ I Interferons zählten anti-proliferative Aktivität auf normale und transformierte Zellen; Stimulation von zytotoxischer Aktivität in Lymphozyten, natürlichen Killerzellen und phagozytischen Zellen; Modulation der zellulären Differenzierung; Stimulation der Expression von Klasse I MHC-Antigenen; Inhibition von Klasse II MHC; und Modulation verschiedener Zelloberflächenrezeptoren. Unter normalen physiologischen Bedingungen werden IFNα und IFNβ (IFN α/β) konstitutiv von den meisten menschlichen Zellen in geringen Ausmaßen abgesondert, wobei die Expression durch die Zugabe von verschiedenen Induktoren nach oben reguliert wird, einschließlich infektiöser Agentien (Viren, Bakterien, Mykoplasma und Protozoa), dsRNA und Zytokine (M-CSF, IL-1α, IL-2, TNFα). Die Aktionen des Typ I Interferons in vivo können mit Hilfe von Surrogat-Markern, Neopterin, 2', 5' Oligoadenylatsynthetase, und β 2 Mikroglobulin (Alam et al. 1997; Fierlbeck et al. 1996; Salmon et al. 1996) überwacht werden.

Typ I Interferone (IFNα/β/ω) agieren durch einen Zelloberflächenrezeptorkomplex, um spezifische biologische Wirkungen zu induzieren, wie anti-virale, Anti-Tumor- und Immunmodulationsaktivität. Der Typ I IFN-Rezeptor (IFNAR) ist ein heteromultimerer Rezeptorkomplex, der aus mindestens zwei unterschiedlichen Polypeptidketten (Colamonici et al. 1992; Colamonici et al. 1993; Platanias et al. 1993) besteht. Die Gene für diese Ketten befinden sich auf Chromosom 21, und ihre Proteine werden auf der Oberfläche der meisten Zellen exprimiert (Tan et al. 1973). Die Rezeptorketten wurden ursprünglich als Alpha und Beta bezeichnet, weil sie von den monoklonalen Antikörpern IFNαR3 beziehungsweise IFNaRβ1 erkannt werden können. Vor kurzem wurden sie in IFNAR1 für die Alpha- Untereinheit und IFNAR2 für die Beta-Untereinheit umbenannt. In den meisten Zellen weist IFNAR1 (Alpha-Kette, Uze-Untereinheit) (Uze et al. 1990) ein Molekulargewicht von 100- 130 kDa auf, während IFNAR2 (Beta-Kette, BL, IFNα/βR) ein Molekulargewicht von 100 kDa aufweist. In bestimmten Zelltypen (monozytische Zelllinien und normale Knochenmarkszellen) wurde ein alternierender Rezeptorkomplex identifiziert, wobei die IFNAR2 Untereinheit (βs) als ein trunkierter Rezeptor mit einem Molekulargewicht von 51 kDa exprimiert wird. Die IFNAR1 und IFNAR2 βs und βL Untereinheiten wurden geklont (Novick et al. 1994; Domanski et al. 1995). Die IFNAR2 βs und βL Untereinheiten weisen identische extrazelluläre und transmembrane Domänen auf; in der zytoplasmischen Domäne weisen sie jedoch nur in den ersten 15 Aminosäuren dieselbe Identität auf. Die IFNAR2 Untereinheit alleine ist in der Lage, IFNα/β zu binden, während die IFNAR1 Untereinheit nicht in der Lage ist, IFNα/β zu binden. Wenn die menschliche IFNAR1 Rezeptor- Untereinheit alleine in L-929 Fibroblast von Mäusen transfektiert wurde, konnten keine menschlichen IFNαs - mit Ausnahme von IFNα8/IFNαB - an die Zellen binden (Uze et al. 1990). Die menschliche IFNAR2 Untereinheit, die in die L-Zellen in Abwesenheit der menschlichen IFNAR1 Untereinheit transfektiert wurde, bindet menschliches IFNα2, wobei das Binden mit Kd von ungefähr 0,45 nM erfolgt. Wenn menschliche IFNAR2 Untereinheiten in Gegenwart der menschlichen IFNAR1 Untereinheit transfektiert wurden, konnte eine hohe Affinitätsbindung mit Kd von 0,026-0,114 nM (Novick et al. 1994; Domanski et al. 1995) gezeigt werden. Es wird geschätzt, dass von 500-20.000 Hochaffinitäts- und 2.000-100.000 Niedrigaffinitäts-IFN-Bindungsorte auf den meisten Zellen existieren. Obwohl die IFNAR1/2-Komplex (α/βs oder α/βL)-Untereinheiten IFNα mit hoher Affinität binden, erscheint nur das α/βL-Paar ein funktioneller Signalrezeptor zu sein.

Transfektion der IFNAR1 und IFNAR2 βL Untereinheiten in L-929-Zellen von Mäusen, mit anschließender Inkubation mit IFNα2, induziert einen anti-viralen Status, initiiert intrazelluläre Proteinphosphorylation und verursacht die Aktivierung der intrazellulären Kinasen (Jakl und Tyk2) und Transkriptionsfaktoren (STAT 1, 2 und 3) (Novick et al. 1994; Domanski et al. 1995). In einem entsprechenden Experiment gelang es durch Transfektion der IFNAR2 βs Untereinheit nicht, eine ähnliche Reaktion zu initiieren. Somit ist die IFNAR2 βL Untereinheit für funktionelle Aktivität (αnti-virale Reaktion) erforderlich, wobei es in Zusammenhang mit der IFNAR1 Untereinheit zu maximaler Induktion kommt.

Zusätzlich zu membrangebundenen Zelloberflächen-IFNAR-Formen wurde ein lösliches IFNAR sowohl in menschlichem Urin als auch Serum identifiziert (Novick et al. 1994; Novick et al. 1995; Novick et al. 1992; Lutfalla et al. 1995). Das vom Serum isolierte lösliche IFNAR weist ein scheinbares Molekulargewicht von 55 kDa auf SDS-PAGE auf, während das lösliche IFNAR von Urin ein scheinbares Molekulargewicht von 40-45 kDa (p40) aufweist. Transkripte für das lösliche p40 IFNAR2 sind auf mRNA-Ebene vorhanden und umfassen fast die gesamte extrazelluläre Domäne der IFNAR2 Untereinheit, mit zwei neuen Aminosäuren am Carboxy-terminalen Ende. Es gibt fünf potentielle Glycosylierungsorte auf dem löslichen IFNAR2 Rezeptor. Es wurde gezeigt, dass lösliches p40 IFNAR2 das IFNα2 und IFNβ bindet und in vitro die anti-virale Aktivität einer Mischung von IFNα-Spezies ("Leukozyten-IFN") und individuellen Typ I IFNs (Novick et al. 1995) hemmt. Es wurde gezeigt, dass ein rekombinantes IFNAR2-Untereinheit Ig- Fusionsprotein die Bindung einer Reihe von Typ I IFN-Spezies (IFNαA, IFNαβ, IFNαD, IFNβ, IFNα Con1 und IFNω) an Daudi-Zellen und α/βs Untereinheit doppelt transfektierte COS-Zellen hemmt.

Typ I IFN-Signalpfade wurden vor kurzem identifiziert (Platanias et al. 1996; Yan et al. 1996; Qureshi et al. 1996; Duncan et al. 1996; Sharf et al. 1995; Yang et al. 1996). Es wird angenommen, dass anfängliche Ereignisse, die zum Signalisieren führen, durch die Bindung von IFNα/β/ω an die IFNAR2 Untereinheit eintreten, gefolgt von der IFNAR1 Untereinheit, die sich assoziiert, um einen IFNAR1/2 Komplex zu bilden (Platanias et al. 1994). Das Binden von IFNα/β/ω an den IFNAR1/2 Komplex führt zur Aktivierung von zwei Janus-Kinasen (Jak1 und Tyk2), von denen angenommen wird, dass sie spezifische Tyrosine auf den IFNAR1 und IFNAR2 Untereinheiten phosphorylieren. Sobald diese Untereinheiten phosphoryliert sind, werden STAT-Moleküle (STAT 1, 2 und 3) phosphoryliert, was zu Dimerisierung von STAT-Transkriptionskomplexen führt, gefolgt von nuklearer Lokalisation des Transkriptionskomplexes und der Aktivierung von spezifischen IFN-induzierbaren Genen.

Die Pharmakokinetik und Pharmakodynamik von Typ I IFNs wurden bei Menschen ermittelt (Alan et al. 1997; Fierlbeck et al. 1996; Salmon et al. 1996). Die Clearance von IFNβ ist ziemlich schnell, wobei die Bioverfügbarkeit von IFNβ bei den meisten Zytokinen geringer als erwartet ist. Obwohl die Pharmakodynamik von IFNβ in Menschen ermittelt wurde, wurde keine klare Korrelation zwischen der Bioverfügbarkeit von IFNβ und der klinischen Wirksamkeit hergestellt. In normalen, gesunden menschlichen Freiwilligen führte die Verabreichung einer einzelnen, intravenösen (iv) Bolus-Dosis (6 MIU) eines rekombinanten, CHO-derivierten IFNβ zu einer schnellen Distributionsphase von 5 Minuten und einer terminalen Halblebenszeit von ~ 5 Stunden (Alam et al. 1997). Nach subkutaner (sc) oder intramuskulärer (im) Verabreichung von IFNβ sind die Serum-Level flach, wobei nur ~ 15% der Dosis systemisch verfügbar sind. Die Pharmakodynamik von IFNβ nach iv, im oder sc Verabreichung (wie durch die Veränderungen in der 2'5'- Oligoadenylatsynthetasen (2', 5'-AS)-Aktivität in PBMCs gemessen) war innerhalb der ersten 24 Stunden erhöht und sank während der nächsten 4 Tage langsam auf den Grundlevel. Das Ausmaß und die Dauer der biologischen Wirkung war gleich, ungeachtet des Verabreichungsweges.

Die Pharmakokinetik (PK) und die Pharmakodynamik (PD) von IFNβ, das von zwei verschiedenen Unternehmen (REBIF®-Serono und AVONEX®-Biogen) hergestellt wird, wurde nach der im-Injektion einer einzelnen Dosis von 6 MIU von rekombinantem IFNβ (Salmon, 1996) untersucht. Im Laufe der Zeit wurden die Serumkonzentration von IFNβ und der IFNβ Surrogatmarker, Neopterin, überwacht. Beide IFNβ-Präparate wiesen ähnliche PK- Profile auf, wobei nach ~ 12-15 Stunden Spitzenserumlevel von IFNβ erreicht wurden, obwohl REBIF® niedrigere Höchstlevel ergab. Die IFNβ-Level blieben sowohl für REBIF® als auch für AVONEX® während mindestens der ersten 36 Stunden nach im-Injektion erhöht und fielen dann bis spätestens 48 Stunden danach auf knapp über den Grundwert ab. Die Neopterin-Level wiesen bei REBIF® und AVONEX® ein sehr ähnliches Profil auf, wobei die maximalen Neopterin-Level bei ~ 44-50 Stunden nach der Injektion erreicht wurden, bis 72 Stunden nach der Injektion erhöht blieben und dann allmählich bis 144 Stunden danach auf den Grundwert fielen.

Eine Mehrfachdosis-Pharmakodynamikstudie von IFNβ wurde bei menschlichen Melanompatienten (Fierlbeck et al. 1996) durchgeführt, wobei IFNβ drei Mal pro Woche mit 3 MIU/Dosis über einen Zeitraum von sechs Monaten auf dem sc-Weg verabreicht wurde. Die Pharmakodynamik-Marker, 2', 5'-AS Synthetase, β2-Mikroglobulin, Neopterin und NK-Zellaktivierung erreichten ihren Höhepunkt bis zur zweiten Injektion (Tag 4) und fielen bis 28 Tage danach ab, wobei sie bis zum Ende der sechs Monate nur leicht erhöht blieben.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Clearance von Typ I Interferonen in Menschen schnell vor sich geht. Ein lang agierendes Interferonpräparat würde wahrscheinlich zu einer Verbesserung beim klinischen Benefit führen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es wurde nun festgestellt, dass ein Komplex des Typ I Interferons, der aus löslichem IFNAR besteht, das mit Typ I Interferonen (IFN) einen Komplex bildet, im Vergleich zu freiem IFN für anti-virale, Anti-Krebs- und Immunmodulationsaktivität verbesserte Stabilität, größere Wirkung und längere Pharmakokinetik in vivo aufweist.

Die vorliegende Erfindung schafft somit einen Typ I Interferon (IFN)-Komplex, der aus der Polypeptidsequenz der extrazellulären Domäne einer menschlichen Interferon α/β Rezeptor (IFNAR)-Untereinheit und Typ I Interferonen besteht, welcher im Vergleich zu freiem IFN für anti-virale, Anti-Krebs- und Immunmodulationsaktivität verbesserte Stabilität, größere Wirkung und/oder verlängerte Pharmakokinetik in vivo aufweist. Vorzugsweise besteht der Komplex aus der extrazellulären Domäne der IFNAR2 Untereinheit mit einem Typ I Interferon oder der IFNAR1 Untereinheit mit IFNα.

Insbesondere ist der Komplex ein Fusionsprotein oder ein kovalenter Komplex oder ein nicht kovalenter Komplex, der die Polypeptidsequenz der gesamten extrazellulären Domäne von IFNAR, vorzugsweise IFNAR2, oder eine Interferon bindende Unterfraktion davon enthält, als Komplex verbunden mit IFNα oder IFNβ oder IFNω oder einer biologisch aktiven Unterfraktion davon.

Die Bezeichnung IFNAR ist so zu verstehen, dass sie alle bekannten extrazellulären IFNAR-Rezeptoren so wie oben definiert und alle aktiven Fragmente davon umfasst. IFNAR kann optional an ein anderes Protein, zum Beispiel ein Immunoglobulin wie IgG, fusioniert werden. IFN, IFNα, IFNβ und IFNω stehen für eine der mehr als 20 Typ I Interferone, die bis dato identifiziert wurden, oder ein anderes Typ I Interferon, das in Zukunft identifiziert wird.

In einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung besteht der Komplex aus IFNα oder IFNβ, kovalent verbunden mit IFNAR2 über eine chemische Verbindung.

Ein weiteres Ausführungsbeispiel umfasst einen Komplex, der aus IFNα oder IFNβ besteht, nicht kovalent mit IFNAR2 in einem Komplex verbunden. Dieses weitere Ausführungsbeispiel schließt auch eine Zusammensetzung ein, welche ein Typ I IFN und IFNAR2 in beliebigem Verhältnis enthält. Eine Formulierung von Typ I IFN mit einem Überschuss an IFNAR2 wie oben definiert, ist ebenfalls in der Definition des Begriffes "Komplex" der vorliegenden Anmeldung eingeschlossen. Die zwei Komponenten können auch getrennt verabreicht werden, um den Komplex in vivo zu bilden. Somit besteht in einem weiteren Ausführungsbeispiel der Komplex aus einer Mischung aus IFNAR2 und IFN, erhalten durch simultane oder nachfolgende Co-Verabreichung von IFNα oder IFNβ und löslichem IFNAR2. Weiters kann das IFNAR ohne gleichzeitige Verabreichung von IFN verabreicht werden, so dass der Komplex in vivo mit endogenem zirkulierenden IFN gebildet werden kann, wodurch die Wirkungen des endogenen IFN potenziert werden.

Als ein spezielles Ausführungsbeispiel besteht der Komplex aus IFNα oder IFNβ oder IFNω, fusioniert an IFNAR2 als ein rekombinantes Fusionsprotein, wobei das IFN und die IFNAR2-Hälften optional über ein flexibles Peptidlinkermolekül fusioniert werden. Dieser Peptidlinker kann in vivo teilbar oder nicht teilbar sein.

Die Erfindung betrifft weiters eine DNA, die solche Fusionsproteine codiert, Vektoren, welche diese DNA enthalten, Wirtszellen, die mit solchen Vektoren auf solche Weise transformiert sind, dass sie die Fusionsproteine und Produktionsverfahren dieser Fusionsproteine durch Kultivierung dieser Wirtszellen und Isolieren der dadurch exprimierten Fusionsproteine exprimieren.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die Verfahren zur Verwendung der Komplexe der vorliegenden Erfindung für die Verlängerung der in vivo-Wirkung von IFN, was bei der Behandlung einer Krankheit oder eines Zustandes, der durch IFN behandelbar ist, nützlich ist.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von IFNAR als Stabilisator in Formulierungen von IFN. Freies IFNβ hat eine Tendenz zum Oligomerisieren. Dies wird verhindert, sobald es mit IFNAR einen Komplex bildet, insbesondere mit IFNAR2. Heutige Formulierungen von rekombinantem IFNβ müssen einen sauren pH- Wert aufweisen, welcher bei der Verabreichung einige lokalisierte Irritationen hervorrufen kann. Nicht saure Zusammensetzungen können formuliert werden, wenn IFNAR als Stabilisator verwendet wird.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die vorliegende Erfindung ist leichter in Verbindung mit den folgenden Zeichnungen zu verstehen, wobei:

Fig. 1 ein Schaubild ist, das dosisabhängige anti-virale Aktivität von sIFNAR2 oder IFNAR2Ig (bestehend aus der extrazellulären Domäne von hIFNAR2, fusioniert an menschliches IgG1-Hinge, CH2- und CH3-Domänen) in der Gegenwart von IFNβ zeigt;

Fig. 2 ein Schaubild ist, das anti-virale Aktivität von sIFNAR2 und IFNβ bei einer sub-optimalen Dosis von IFNβ zeigt. Synergistische anti-virale Aktivität von IFNβ und sIFNAR2, nach einer Stunde Präinkubation, wird bei einer mittleren IFNβ-Dosis offenbart.

Fig. 4 ist ein Schaubild, das anti-virale Aktivität von sIFNAR2 und eine sub-effektive Dosis von IFNβ (0,95 IU/ml) als eine Funktion der Präinkubationszeit zeigt. WISH-Zellen wurden IFNβ (0,95 IU/ml sub-effektiver Dosis) und sIFNAR2 ausgesetzt, nach einer Präinkubation zu den angegebenen Zeiten. Synergistische anti-virale Aktivität wird erst nach vierstündiger Präinkubation beobachtet. Anti-virale Aktivität wurde durch MTT-Konversion 48 Stunden nach einer VSV-Provokation gemessen. Bei sub-therapeutischen Leveln von IFNβ führt die Bildung des IFNAR2/IFN-Komplexes zu verstärkter anti-viraler Aktivität.

Fig. 4 ist ein Schaubild, das verstärkte anti-virale Aktivität von menschlichem IFNβ nach Präinkubation mit sIFNAR2 zeigt.

Fig. 5 ist ein Schaubild, das zeigt, dass verstärkte anti-virale Aktivität von menschlichem IFNβ, das mit sIFNAR assoziiert ist, für IFNAR2, aber nicht für andere Proteine spezifisch ist.

Fig. 6 ist ein Schaubild, das den Pharmakokinetik-Vergleich von menschlichem IFNβ und dem IFNβ/IFNAR2-Komplex in Mäusen zeigt, wie durch ELISA bestimmt.

Fig. 7 ist ein Schaubild, das den Pharmakokinetik-Vergleich zwischen menschlichem IFNβ und dem IFNβ/IFNAR2-Komplex in Mäusen zeigt, so wie durch Bioassay bestimmt.

Fig. 8 ist ein Schaubild, das den Pharmakokinetik-Vergleich zwischen menschlichem IFNα und IFNα/IFNAR2-Komplex in Mäusen zeigt, sowie durch ELISA bestimmt.

Fig. 9 ist ein Schaubild, das den Pharmakokinetik-Vergleich zwischen menschlichem IFNα und IFNα/IFNAR2-Komplex in Mäusen zeigt, wie durch Bioassay bestimmt.

Fig. 10 zeigt die Aminosäuresequenz des n = 2 IFNAR2/IFNβ Fusionsproteins (SEQ ID NO:14). Der (GGGGS)&sub2; (Reste 240-249 von SEQ ID NO:14) Linker ist unterstrichen.

Fig. 11 ist ein Gel, das die Restriktionsenzymanalyse von pCMV-IFNAR2/IFNβ zeigt; 10% PAG; Lanes 3-7: BamHI/XhoI Digests; Lane 2: SmaI/XhoI Digest; Lane 1: pBR322 DNA-MspI Digest-Marker; Lane 2: pCMV-IFNAR2/IFNβ, OGS; Lane 3: 1GS; Lane 4: 2GS; Lane 5: 3GS; Lane 6: 4GS; Lane 7: 5G5; Lane 8: X174 RFDNA HaeIII Digest-Marker.

Fig. 12 ist die Restriktions-Endonuclease-Map des IFNAR2/IFNβ- Expressionsvektors.

Fig. 13 ist die Western-Blot-Analyse des IFNAR2/IFNβ-Fusionsproteins. Lane 1, IFNAR2/IFNβ Konstrukt, das keinen Linker enthält; Lane 2, IFNAR2/IFNβ Konstrukt, das einen Gly&sub4;Ser (SEQ ID NO:1)-Linker enthält; Lane 3, IFNAR2/IFNβ Konstrukt, das zwei Gly&sub4;Ser (SEQ ID NO: 1)-Linker enthält; Lane 4, IFNAR/IFNβ-Konstrukt, das drei Gly&sub4;Ser (SEQ ID NO:1)-Linker enthält; Lane 5, IFNAR/IFNβ-Konstrukt, das vier Gly&sub4;Ser (SEQ ID NO:1)-Linker enthält; Lane 6, IFNAR/IFNβ-Konstrukt, das fünf Gly&sub4;Ser (SEQ ID NO:1)- Linker enthält.

Fig. 14 ist ein Schaubild, das anti-virale Aktivität von Interfusionsmolekülen zeigt, exprimiert in CHO-Zellen-Supernatanten und normalisiert auf IFNβ-Standardaktivität.

Fig. 15 A-B sind Schaubilder, welche die Pharmakokinetik von IFNβ zeigen, das nach intravenöser Injektion von IFNAR2 verabreicht wurde. IFNβ wurde entweder alleine injiziert, als ein IFNAR-Komplex oder unmittelbar nach einer getrennten I.V.-Injektion von sIFNAR2. Die Serum-Halblebenszeit wurde zu den angegebenen Zeiten nach der Injektion durch IFNβ spezifisches ELISA (Fig. 15A) und durch Bioaktivität im WISH anti-viralen Assay (Fig. 15B) festgestellt.

Fig. 16 ist ein Schaubild, das die Schutzwirkung in Zytotoxität-Prozent verschiedener Dosen eines Komplexes von "Universal" IFN (menschliches IFNαA/D) in einem Komplex mit sIFNAR2 zeigt, im Vergleich zur Verabreichung von Universal IFN alleine oder einer Kontrollsubstanz.

Fig. 17 ist ein Schaubild, das die Serumkonzentration von IFNβ als eine Zeitfunktion nach einer einzelnen Bolus intravenösen Injektion von Interfusion GS5 oder hIFNβ alleine zeigt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELE

Der IFNAR/IFN-Komplex der vorliegenden Erfindung und die ermöglichende Technologie, die benötigt wird, um diesen Komplex zu erzeugen, werden im Folgenden im Detail beschrieben. Für die meisten Ergebnisse wurde IFNβ als ein nicht einschränkendes Beispiel gewählt.

Fusionsprotein. Das C-terminale Ende von IFNAR2 oder eine beliebige Interferon bindende Subsequenz davon, wurde an das N-terminale Ende von IFNβ oder biologisch aktive Fragmente davon fusioniert, da dabei die kürzeste Distanz zwischen den zwei Molekülen überbrückt werden muss. Die umgekehrten Konstrukte können ebenfalls erstellt werden, wo das C-terminale Ende von IFNβ oder Fragmente davon an das N-terminale Ende von IFNAR2 oder Subsequenzen davon fusioniert wird.

Von Molekularmodellen des IFNAR2/IFNβ-Komplexes beträgt die geschätzte Distanz zwischen der eingeschränkten C-terminalen extrazellulären Domäne von IFNAR2 und dem N-Terminal von IFNβ im aktiven Komplexmodell ~ 80 Angstrom. Um einen IFNAR2/IFNβ- Komplex erstellen zu können, der es ermöglicht, den aktiven Komplex aufrechtzuerhalten, kann ein flexibler Peptidlinker, zum Beispiel Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (GGGGS) (SEQ ID NO:1) Wiederholungen, verwendet werden. Alternativ dazu kann der Linker flexibel und ein Target für proteolytisches Schneiden durch Serum, Membranbindung und/oder zelluläre Proteasen sein. Als Beispiel für einen Serum-Protease-Schnittstelle kann die erstellte IFNAR2/IFNβ-Komplex-Fusion eine Schnittstelle mit Faktor Xa aufweisen. Faktor Xa spaltet Prothrombin an zwei Orten Arg273 und Arg322 und weist ein Tetrapeptiderkennungssignal auf Ile-Glu-Glu-Arg (SEQ ID NO:2) (Nagai et al. 1984). Der Faktor Xa selbst wird sowohl von intrinsischen als auch extrinsischen Pfaden durch eine Reihe von Aktivatoren erzeugt, einschließlich Gewebefaktor, der durch vaskuläre endotheliale Zellen, Makrophagen und Neutrophile freigesetzt wird.

Faktor Xa kann auf einem sIFNAR2/IFN-Fusionsprotein wirken, das eine Faktor Xa- Erkennungssequenz in der Linkerdomäne enthält, und den IFNAR2/IFN-Komplex freisetzen, so dass der Komplex als nicht kovalenter Komplex funktionieren kann.

Alternativ dazu kann die IFNAR2/IFNβ-Komplexfusion einen Zellmembranprotease (z. B. Hepsin)-Schnittstelle aufweisen. Hepsin ist ein 51 kDa Membran gebundenes Serinproteasezymogen, das in hohen Werten im Lebergewebe exprimiert ist, aber auch in der Niere, im Pankreas, in der Lunge, der Schilddrüse, der Pituitaria und Testis zu finden ist. Eine Sequenz, von der bekannt ist, dass sie durch Hepsin gespalten wird, ist die Arg152- Ile153 Peptidbindung in Faktor VII. Hepsin wurde in die Bildung von Thrombin auf Tumorzellen eingebunden (Kazam et al. 1995).

Hepsin kann auf ein sIFNAR2/IFN-Fusionsprotein wirken, das eine Hepsinerkennungssequenz in der Linkerdomäne enthält und den IFNAR2/IFN-Komplex freisetzen, so dass der Komplex in nicht kovalenter Weise funktionieren kann.

Alternativ dazu kann der IFNAR2/IFNβ-Fusionskomplex einen intrazellulären Proteaseschnittstelle aufweisen. Eine Reihe von Proteasen wird durch nekrotisierende Zellen und Apoptosezellen freigesetzt. Dazu gehören Caspasen (Interleukin 1 Beta umwandelnde enzymähnliche Proteasen), Metallo-Proteinasen, Lysosomalproteasen (z B. Cathepsin B) und Elastase. Elastase wird während der Krankheitszustände (z. B. Sepsis) durch Granulozyten freigesetzt und weist in Bezug auf die Aminosäurespaltungssequenz eine breite Spezifizität auf, ähnlich der von Trypsin (Ertel et al. 1994; Szilagyi et al. 1995).

Intrazelluläre Proteasen können auf ein sIFNAR2/IFN-Fusionsprotein wirken, das eine intrazelluläre Proteaseerkennungssequenz in der Linkerdomäne enthält, und den IFNAR2/IFN-Komplex freisetzen, so dass der Komplex als nicht kovalenter Komplex funktionieren kann.

Es wurden mehrere Beispiele von Fusionsproteinkonstrukten, bei denen das C- Terminal von sIFNAR2 (P40-ESEFS) an das N-Terminal von IFNβ (MSY) über flexible Linker gebunden ist, erstellt. Beispiele für Peptidlinker sind: ESEFS (GGGGS)n MSY, wobei n = 5 (SEQ ID NO:3), 4 (SEQ ID NO:4), 3 (SEQ ID NO:5), 2 (SEQ ID NO:6) oder 1 (SEQ ID NO:7); ESEFS (hCG-CTP) MSY, wobei hCG-CTP = SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO:8); ESEFS (EFM)n MSY, wobei n = 5 (SEQ ID NO:9), 4 (SEQ ID NO:10) oder 3 (SEQ ID NO:11); ESEFS (EFGAGLVLGGQFM)n MSY, wobei n = 1 (SEQ ID NO:12) oder 2 (SEQ ID NO:13) und jeder andere geeignete Linker, der die Distanz zwischen dem IFNAR2 bindenden Ort und IFNβ im Komplexmodell überbrückt und der kein immunogenes Epitop zwischen den Interferon- und Rezeptorhälften bildet. Vorzugsweise haben diese Linker eine Länge von bis zu ungefähr 30 Aminosäuren.

Kovalenter Komplex. Ein Beispiel für das Erzeugen von chemisch quer verbundenen Molekülen besteht in der ortsspezifischen Änderung von IFNAR2, indem ein biologisch abbaubarer Linker, wie Polyethylenglycol (PEG), mit vorhandenen oder in IFNAR2 eingebauten Zysteinen zum Reagieren gebracht wird, unter Verwendung von entweder einem Aminosäureersatz wie Ser&sub2;&sub1;&sub0; zu Cys oder Asn&sub8;&sub9; zu Cys (ortsgerichtete Mutagenese). Die folgenden Konstrukte könnten erstellt werden: IFNAR (S210C) - PEGn - IFNβ (Cys 17), wobei n = 2000, 5000 oder 10.000 Dalton oder IFNAR (N89C) - PEGn - IFNβ (Cys 17).

Auch die Bildung von kovalenten Disulfidbindungen zwischen Cys der zwei unterschiedlichen (optional erstellten) Hälften liegt auch innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.

Nicht kovalenter Komplex. Menschliches IFNAR2 wird mit IFNβ unter Bedingungen in einem Komplex verbunden, welche die Erzeugung des aktiven Komplexes maximieren. In vitro ist ein optimales Verhältnis von 2,5 ng von IFNAR2 zu 1 internationalen Einheit (IU) von IFNβ erforderlich, um einen maximal aktiven Komplex zu erzielen, wie in den Beispielen angeführt. Das optimale Verhältnis von IFNAR2 zu IFNβ, welches die Erzeugung des aktiven Komplexes für in vivo-Aktivität maximiert, wird zur Zeit bestimmt, obwohl es so erscheint, dass das optimale Verhältnis von der Konzentration von IFNβ abhängen wird. So lag zum Beispiel das optimale Verhältnis von IFNAR2:IFNβ in der Verstärkung der Anti-Tumor-Aktivität bei einer Konzentration von 2 · 10&sup4; IU/Maus/Tag IFNβ bei 2,5 ng IFNAR2 pro pg IFNβ, während bei einer Konzentration von 5 · 10&sup4; IU/Maus/Tag IFNβ 0,3 ng IFNAR2 pro pg IFNβ optimal war. Dasselbe Verhältnis, das verwendet wurde, um die Erzeugung des aktiven Komplexes in vitro zu maximieren, führte zu verlängerter Pharmakokinetik des IFN in vivo.

Vorzugsweise sind IFNAR2 und IFNβ, die verwendet werden, um den Komplex zu erzeugen, rekombinante Moleküle. In in vitro anti-viralen Assays wies der Interferon/Rezeptor-Komplex im Vergleich zur Aktivität von IFNβ alleine verstärkte Aktivität auf. Eine konstante Konzentration von IFNβ wurde mit unterschiedlichen Konzentrationen von rekombinantem sIFNAR2 gemischt, und diese Mischung (IFNAR2/IFN-Komplex) wurde zu WISH-Zellen (menschliche amniotische Zellen) hinzugefügt. Diese WISH-Zellen wurden dann mit dem Vesikulären Stomatitis Virus (VSV) provoziert, und die anti-virale Aktivität von IFN wurde als Grad des Zellenüberlebens nach 48 Stunden Inkubation überwacht. In allen Experimenten führte die Zugabe von IFNAR2 zu einer konstanten Menge von IFNβ zu einer dosisabhängigen Steigerung des Zellenüberlebens bei Provokation mit dem VSV bei einem optimalen Verhältnis von IFNAR2 zu IFN. Diese Ergebnisse beweisen, dass ein Komplex von IFNAR2 und IFNβ verstärkte Aktivität im Vergleich zu freiem IFNβ in einem anti-viralen Assay aufweist. Die praktischen Auswirkungen dieses Umstandes sind, dass der IFNAR2/IFNβ-Komplex größere Wirkung und verstärkte Aktivität im Vergleich zu freiem IFN für eine Reihe von therapeutischen Indikationen hat, bei denen IFN selbst aktiv ist. Zu diesen Indikationen gehören jene, bei denen freie IFNs einige therapeutische Aktivität gezeigt haben, wie anti-virale, Anti-Krebs- und Immunmodulationsaktivität. Es wird erwartet, dass der IFNAR2/IFN-Komplex auf Grund seiner größeren Wirkung, verstärkten Aktivität und/oder verbesserten Pharmakokinetik (d. h. Halblebenszeit) bei der Behandlung von viralen, onkologischen und Immunstörungen effizienter ist.

Wenn in vivo verabreicht, verstärkt der Interferon-Rezeptor-Komplex die Bioverfügbarkeit, Pharmakokinetik und/oder Pharmakodynamik des IFN, wodurch die antiviralen, Anti-Krebs- und Immunmodulationseigenschaften des IFN erhöht werden.

Die verbesserte Bioverfügbarkeit von IFN, die durch den Komplex herbeigeführt wurde, kann entweder durch Vor-Bildung eines IFN/IFNAR nicht kovalenten Komplexes, Co-Verabreichung von freiem IFN mit IFNAR, über sequentielle Verabreichung der IFN- oder IFNAR-Komponente, über Verabreichung eines IFN/IFNAR kovalenten Komplexes oder über Verabreichung eines IFNAR/IFN-Fusionsproteins erfolgen.

In einem weiteren Ausführungsbeispiel kann eine solche verbesserte Bioverfügbarkeit auch durch Verabreichung der IFNAR-Komponente alleine erreicht werden, ohne Zugabe von IFN: Das IFNAR wird den "Komplex" in vivo mit endogenem IFN bilden und somit die Bioverfügbarkeit, Pharmakokinetik und/oder Pharmakodynamik des endogenen IFN verbessern. Das ist besonders für die Behandlung von Patienten nützlich, welche eine Krankheit oder einen Zustand aufweisen, die auf natürliche Weise die Induktion von nativem IFN verursachen, so dass das IFN bereits zum Zwecke seiner beabsichtigten natürlichen Wirkung der Bekämpfung dieser Krankheit oder dieses Zustandes zirkulieren wird. Das hinzugefügte IFNAR wird diese Wirkungen des nativen IFN verstärken.

Die bevorzugten Moleküle zur Verwendung in den Komplexen der vorliegenden Erfindung weisen die Sequenz eines nativen IFN und IFNAR auf. Die native Sequenz ist jene eines natürlich vorkommenden menschlichen IFN oder IFNAR. Diese Sequenzen sind bekannt und können leicht in der Literatur gefunden werden. Natürlich vorkommende allelische Variationen werden auch als native Sequenzen betrachtet.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Analoga des oben angeführten IFNAR2/IFN- Komplexes der Erfindung, wobei diese Analoga im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität des Komplexes behalten, der im Wesentlichen die Sequenzen von nativem IFNAR2 und IFN aufweist. Solche Analoga können solche sein, bei denen bis zu ungefähr 30 Aminosäurereste gelöscht, hinzugefügt oder durch andere in den IFNAR2- und/oder IFN- Hälften des Komplexes ersetzt werden, so dass Änderungen dieser Art die biologische Aktivität des chimerischen Proteinanalogons im Vergleich zum Komplex selbst nicht wesentlich ändern. Die verschiedenen Analoga können sich voneinander und vom Grundkomplexmolekül (jenes mit im Wesentlichen nur auf natürliche Weise auftretenden IFNAR2- und IFN-Sequenzen) am meisten am Ort des Linkerpeptids unterscheiden, das die zwei Hälften im Komplex verbindet. Wie oben angeführt, ist ein solcher Linker vorzugsweise bis zu ungefähr 30 Aminosäuren lang und dient dazu, die IFNAR2- und IFN- Hälften im Komplex voneinander zu trennen. In Bezug auf einen solchen Linker sollte bei der Auswahl seiner Sequenz (und somit auch beim biologischen Testen der einzelnen Analoga in geeigneten standardmäßigen Assays) darauf geachtet werden, dass es zum Beispiel nicht zu inkorrektem Falten des Komplexes kommt, was dazu führen könnte, dass der Komplex inaktiv wird oder keine verbesserte Aktivität erzielt oder das Komplexanalogon immunogen wird, wodurch Antikörper dagegen in einem Patienten, der damit behandelt werden soll, erzeugt werden, was dazu führt, dass ein solches Analogon zumindest als mittel- oder langfristiges Medikament unwirksam wird. Was die oben genannten Analoga des Komplexes der Erfindung anbelangt, sind diese Analoga solche, bei denen einer oder mehrere und bis zu ungefähr 30 der Aminosäurereste des Grundkomplexes der Erfindung durch verschiedene Aminosäurereste ersetzt oder gelöscht werden oder einer oder mehrere Aminosäurereste, bis zu ungefähr 30, zur ursprünglichen Sequenz des Komplexes der Erfindung (jener mit im Wesentlichen nur nativen IFNAR2/IFN-Sequenzen) hinzugefügt werden, ohne die Aktivität der resultierenden Produkte im Vergleich zum Grundkomplex der Erfindung beträchtlich zu ändern. Diese Analoga werden durch bekannte Synthese- und/oder durch ortsgerichtete Mutagenesetechniken oder andere bekannte, dafür geeignete Techniken erstellt.

Jedes dieser Analoga weist vorzugsweise eine Sequenz von Aminosäuren auf, die ausreichend duplikativ in Bezug auf den Grundkomplex IFNAR2/IFN sind, so dass sie im Wesentlichen ähnliche Aktivität aufweisen. Somit lässt sich durch routinemäßiges Experimentieren, wozu auch zählt, dass jedes der Analoga den in den Beispielen 2 bis 7 unten angeführten Tests betreffend die biologische Aktivität und Stabilität unterzogen wird, festlegen, ob ein bestimmtes Analogon im Wesentlichen dieselbe Aktivität und/oder Stabilität aufweist wie der Grundkomplex der Erfindung.

Analoga des Komplexes, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, oder Nucleinsäuresequenzcodierung dafür, schließen einen finiten Satz an im Wesentlichen entsprechenden Sequenzen als Substitutionspeptide oder Polynucleotide ein, welche routinemäßig durch einen Fachmann erhalten werden können, ohne übermäßiges Experimentieren, basierend auf den im vorliegenden Dokument präsentierten Lehren und Weisungen. Für eine detaillierte Beschreibung der Proteinchemie und -struktur siehe Schulz. et al. Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1978); und Creighton, T. E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co, San Francisco (1983), die hiermit als Bezugnahme aufgenommen werden. Für eine Präsentation von Nucleotidsequenzersätzen wie Codon-Präferenzen, siehe Ausubel et al (1987, 1992), §§ A.1. I-A. 1.23 und Sambrook et al (1987, 1992), §§6.3 und 6.4 in Anhang C und D.

Bevorzugte Änderungen für Analoga gemäß der vorliegenden Erfindung sind als "konservative" Substitutionen bekannt. Konservative Aminosäuresubstitutionen von jenen im Komplex, die im Wesentlichen die natürlich auftretenden IFNAR2- und IFN-Sequenzen aufweisen, können synonyme Aminosäuren innerhalb einer Gruppe einschließen, welche ausreichende ähnliche physikochemische Eigenschaften aufweisen, damit die Substitution zwischen Mitgliedern der Gruppe die biologische Funktion des Moleküls bewahrt (Grantham, 1974). Es ist klar, dass Zugaben oder das Entfernen von Aminosäuren in den oben definierten Sequenzen auch ohne Änderung ihrer Funktion erfolgen kann, insbesondere wenn die Zugaben oder das Entfernen nur einige Aminosäuren betrifft, z. B. unter dreißig, und vorzugsweise unter zehn, und keine Aminosäuren entfernt oder versetzt werden, die für eine funktionelle Konformation kritisch sind. z. B. Zysteinreste (Anfinsen, 1973). Analoga, die durch solches Entfernen und/oder solche Zugaben erzeugt wurden, fallen in den Umfang der vorliegenden Erfindung.

Vorzugsweise sind die synonymen Aminosäuregruppen jene, die in Tabelle I definiert werden. Insbesondere sind die synonymen Aminosäuregruppen jene, die in Tabelle II definiert werden und am bevorzugtesten sind die synonymen Aminosäuregruppen jene, die in Tabelle III definiert werden.

Tabelle I Bevorzugte Gruppen von synonymen Aminosäuren Aminosäure Synonyme Gruppe

Ser Ser, Thr, Gly, Asn

Ar Ar, Gln, Lys, Glu, His

Leu Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu

Pro Gly, Ala, Thr, Pro

Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr

Ala Gly, Thr, Pro, Ala

Val Met, Thr, Phe, Ile, Leu, Val

Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly

Ile Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile

Phe Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe

Tyr Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr

Cys Ser, Thr, Cys

His Glu, Lys, Gln, Thr, Ar, His

Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Ar, Gln

Asn Gln, Asp, Ser, Asn

Lys Glu, Gln, His, Ar, Lys

Asp Glu, Asn, Asp

Glu As, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu

Met Phe, Ile, Val, Leu, Met

Trp Trp

Tabelle II Mehr bevorzugte Gruppen von synonymen Aminosäuren Aminosäure Synonymen Gruppe

Ser Ser

Ar His, Lys, Arg

Leu Leu, Ile, Phe, Met

Pro Ala, Pro

Thr Thr

Ala Pro, Ala

Val Val, Met, Ile

Gly Gly

Ile Ile, Met, Phe, Val, Leu

Phe Met, Tyr, Ile, Leu, Phe

Tyr Phe, Tyr

Cys Cys, Ser

His His, Gln, Arg

Gln Glu, Gln, His

Asn Asp, Asn

Lys Lys, Arg

Asp Asp, Asn

Glu Glu, Gln

Met Met, Phe, Ile, Val, Leu

Trp Trp

Tabelle III Am meisten bevorzugte Gruppen von synonymen Aminosäuren Aminosäure Synonymen Gruppe

Ser Ser

Arg Arg

Leu Leu, Ile, Met

Pro Pro

Thr Thr

Ala Ala

Val Val

Gly Gly

Ile Ile, Met, Leu

Phe Phe

Tr Tr

Cys Cys, Ser

His His

Gln Gln

Asn Asn

Lys Lys

Asp Glu

Glu Glu

Met Met, Ile, Leu

Trp Met

Beispiele für die Erzeugung von Aminosäurensubstitutionen in Proteinen, welche für das Erhalten von Analoga des Komplexes IFNAR2/IFN zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen alle bekannten Verfahrensschritte, wie jene, die in den US-Patentschriften RE 33,653; 4,959,314; 4,588,585 und 4,737,462 an Mark et al. 5,116,943 an Koths et al. 4,965,195 an Namen et al. und 5,017,691 an Lee et al präsentiert werden, und Lysin substituierte Proteine ein, die in der US-Patentschrift 4,904,584 (Shaw et al) präsentiert werden.

In einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung weist jedes der Analoga des Komplexes zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung eine Aminosäuresequenz auf, welche im Wesentlichen jener des oben angeführten Grundkomplexes der Erfindung entspricht. Der Begriff "im Wesentlichen entspricht" ist so zu verstehen, dass Analoga mit kleineren Änderungen an der Sequenz des Grundkomplexes eingeschlossen sind, welche die grundsätzlichen Eigenschaften des Grundkomplexes nicht beeinflussen, insbesondere was zum Beispiel seine Fähigkeit anbelangt, Krebszellenproliferation zu hemmen oder Knochenmarkstransplantationen zu fördern. Die Art von Änderungen, welche im Allgemeinen in den Bereich der Formulierung "im Wesentlichen entspricht" fällt, sind jene Änderungen, welche sich aus herkömmlichen Mutagenesetechniken der DNA ergeben würden, welche für den Komplex der Erfindung codiert, was zu einigen kleineren Modifizierungen und zum Überprüfen auf die gewünschte Aktivität in der oben besprochenen Weise führt.

Vorzugsweise weist der IFNAR2-Abschnitt des Komplexes eine Kernsequenz auf, welche dieselbe ist wie jene der nativen Sequenz oder des biologisch aktiven Fragments davon, oder einer Variante davon, welche eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens 70% Identität mit der nativen Aminosäuresequenz aufweist und die biologische Aktivität davon beibehält. Insbesondere weist eine solche Sequenz mindestens 85% Identität, mindestens 90% Identität oder am bevorzugtesten mindestens 95% Identität mit der nativen Sequenz auf.

In Bezug auf den IFN-Abschnitt des Komplexes ist die Kernsequenz, die verwendet werden kann, die native Sequenz oder ein biologisch aktives Fragment davon oder eine Variante davon, welche eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens 70% Identität damit aufweist, insbesondere mindestens 85% oder mindestens 90% und am bevorzugtesten mindestens 95% Identität. Diese Analoga müssen die biologische Aktivität der nativen IFN-Sequenz oder des Fragmentes davon behalten oder antagonistische Aktivität aufweisen, wie weiter unten besprochen.

Der Begriff "Sequenzidentität", so wie er hierin verwendet wird, bedeutet, dass die Sequenzen wie folgt verglichen werden. Die Sequenzen werden unter Verwendung von Version 9 des GAP (Global Alignment Program) der Genetic Computing Group unter Verwendung der Default (BLOSUM62)-Matrix (Werte -4 bis + 11) mit einer Gap-Open- Strafe von -12 (für die erste Null eines Gaps) und einer Gap-Extension-Strafe von -4 (für jede zusätzliche konsekutive Null im Gap) ausgerichtet. Nach der Ausrichtung wird die prozentmäßige Identität berechnet durch Exprimieren der Anzahl von Übereinstimmungen als Prozentsatz der Anzahl an Aminosäuren in der beanspruchten Sequenz.

Analoga gemäß der vorliegenden Erfindung können auch gemäß folgendem Verfahren bestimmt werden. In Bezug auf entweder den IFNAR-Abschnitt des Komplexes oder den IFN-Abschnitt des Komplexes ist die DNA der nativen Sequenz dem Stand der Technik bekannt und ist entweder in der im Hintergrundabschnitt der vorliegenden Spezifikation angeführten Literatur zu finden oder kann leicht von Fachleuten lokalisiert werden. Polypeptide, die durch eine Nucleinsäure codiert werden, so wie DNA oder RNA, welche an das Komplement der nativen DNA oder RNA unter hoch stringenten oder mäßig stringenten Bedingungen hybridisiert, so lange das Polypeptid die biologische Aktivität der nativen Sequenz aufrechterhält oder im Fall von IFN entweder die biologische Aktivität aufrechterhält oder antagonistische Aktivität besitzt, gelten auch als im Umfang der vorliegenden Erfindung liegend.

Bedingungen der Stringenz sind eine Funktion der Temperatur, die im Hybridisierungsexperiment verwendet wird, der Molarität der monovalenten Kationen und des Prozentsatzes an Formamid in der Hybridisierungslösung. Um den Grad der Stringenz zu bestimmen, die bei einer bestimmten Gruppe von Bedingungen gilt, wird zuerst die Gleichung von Meinkoth et al. (1984) zur Bestimmung der Stabilität der Hybriden mit 100% Identität verwendet, exprimiert als Schmelztemperatur Tm des DNA-DNA-Hybrids: Tm = 81,5ºC + 16,6 (LogM) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% Form) - 500/L, wobei M die Molarität von monovalenten Kationen, %GC der Prozentsatz von G und C Nucleotiden in der DNA, % Form der Prozentsatz an Formamid in der Hybridisierungslösung und L die Länge des Hybrids in Grundpaaren ist. Für jeden 1ºC, um den die Tm von jener reduziert wird, die für einen Hybriden mit 100% Identität berechnet wurde, wird die Menge an zulässiger Fehlübereinstimmung um ungefähr 1% erhöht. Wenn die Tm, die für ein bestimmtes Hybridisierungsexperiment mit den spezifizierten Salz- und Formamidkonzentrationen verwendet wird, 10ºC unter der Tm liegt, welche für einen 100% Hybriden gemäß der Gleichung von Meinkoth berechnet wurde, kommt es zur Hybridisierung selbst dann, wenn es bis zu ungefähr 10% Fehlübereinstimmung gibt.

So wie hierin verwendet, sind hoch stringente Bedingungen solche, welche bis zu ungefähr 15% Sequenzdivergenz tolerant sind, während mäßig stringente Bedingungen solche sind, welche bis zu ungefähr 20% Sequenzdivergenz tolerant sind. Beispiele für hoch stringente (12-15ºC unter der berechneten Tm des Hybriden) und mäßig stringente (15- 20ºC unter der berechneten Tm des Hybriden) Bedingungen verwenden ohne Einschränkungen eine Waschlösung von 2 · SSC (standardmäßiges salzhaltiges Zitrat) und 0,5% SDS bei der entsprechenden Temperatur unter der berechneten Tm des Hybriden. Die endgültige Stringenz der Bedingungen hängt vorrangig mit den Waschbedingungen zusammen, insbesondere wenn die Hybridisierungsbedingungen, die verwendet werden, solche sind, welche weniger stabilen Hybriden erlauben, sich gemeinsam mit stabilen Hybriden zu bilden. Die Waschbedingungen bei höherer Stringenz entfernen dann die weniger stabilen Hybride. Eine häufige Hybridisierungsbedingung, die mit den hoch stringenten bis mäßig stringenten Waschbedingungen, die oben beschrieben wurden, verwendet werden kann, ist die Hybridisierung in einer Lösung von 6 X SSC (oder 6 X SSPE), 5 X Denhardts Reagens, 0,5% SDS, 100 ug/ml denaturiertes, fragmentiertes Lachssperma DNA bei einer Temperatur von ungefähr 20º bis 25ºC unter der Tm. Wenn gemischte Sonden verwendet werden, ist es besser Tetramethylammoniumchlorid (TMAC) anstatt SSC (Ausubel, 1987, 1998) zu verwenden.

"Funktionelle Derivate", so wie hierin verwendet, decken Derivate ab, welche aus den funktionellen Gruppen durch im Fachgebiet bekannte Mittel erstellt werden können, welche als Seitenketten auf den Resten der N- oder C-terminalen Gruppen auftreten, und sind in der Erfindung eingeschlossen, so lange sie pharmazeutisch annehmbar bleiben, d. h. sie nicht die biologische Aktivität des entsprechenden Proteins des Komplexes, so wie hierin beschrieben, zerstören und Zusammensetzungen, in denen es enthalten ist, oder den Komplex, der dafür gemacht wird, nicht mit toxischen Eigenschaften versehen. Derivate können chemische Hälften wie Kohlenhydrat- oder Phosphatreste aufweisen, vorausgesetzt solch eine Fraktion weist dieselbe biologische Aktivität auf und bleibt pharmazeutisch annehmbar.

Derivate können zum Beispiel aliphatische Ester des Carboxyls der Carboxylgruppen, Amide der Carboxylgruppen durch Reaktion mit Ammoniak oder mit primären oder sekundären Aminen, N-Acylderivate oder freie Aminogruppen der Aminosäurereste, die mit Acylhälften (z. B. Alkanoyl oder carbozyklischen Aroylgruppen) gebildet werden, oder 0- Acylderivate einer freien Hydroxylgruppe (z. B. jener von Seryl- oder Threonylresten), die mit Acylhälften gebildet werden, einschließen. Solche Derivate können zum Beispiel auch Polyethylenglycol-Seitenketten einschließen, welche Antigenorte verdecken und die Residenz des Komplexes oder die Abschnitte davon in Körperflüssigkeiten ausweiten.

Der Begriff "Derivate" ist so zu verstehen, dass er nur solche Derivate einschließt, die keine der Aminosäuren gegen eine andere der zwanzig üblicherweise natürlich vorkommenden Aminosäuren austauschen.

Der Begriff "Salze" im vorliegenden Dokument bezieht sich sowohl auf Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen des Komplexes der Erfindung oder Analoga davon. Salze einer Carboxylgruppe können mit Hilfe von im Fachgebiet bekannten Mitteln gebildet werden und anorganische Salze, zum Beispiel Natrium, Kalzium, Ammonium, Eisen(III)-Salze oder Zinksalze und dergleichen und Salze mit organischen Basen wie jene, die zum Beispiel mit Aminen gebildet werden, einschließen, zum Beispiel Triethanolamin, Arginin oder Lysin, Piperidin, Procain und dergleichen. Säureadditionssalze schließen zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren wie zum Beispiel Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren wie zum Beispiel Essigsäure oder Oxalsäure ein. Natürlich muss jedes dieser Salze im Wesentlichen eine ähnliche biologische Aktivität aufweisen wie der Komplex der Erfindung oder seine Analoga.

Der Begriff "biologische Aktivität", so wie hierin verwendet, wird wie folgt ausgelegt. Was den IFNAR2-Abschnitt des Komplexes anbelangt, so ist die wichtige biologische Aktivität seine Fähigkeit, an das Typ I Interferon zu binden. Daher müssen Analoga oder Varianten, Salze und funktionelle Derivate so ausgewählt werden, dass sie diese Fähigkeit zur Interferonbindung bewahren. Das kann durch routinemäßige Bindungs-Assay- Experimente getestet werden. Außerdem können Fragmente von IFNAR2 oder Analoga davon verwendet werden, so lange sie ihre Interferon bindende Aktivität beibehalten. Fragmente können leicht hergestellt werden, indem Aminosäuren von einem der Enden des Interferon bindenden Polypeptids entfernt werden und das Ergebnis auf Interferon bindende Eigenschaften überprüft wird. Proteasen für das Entfernen jeweils einer Aminosäure zu einem bestimmten Zeitpunkt entweder vom N-Terminal oder dem C-Terminal eines Polypeptids sind bekannt, und daher schließt die Bestimmung der Fragmente, welche die Interferon bindende Fähigkeit bewahren, nur routinemäßiges Experimentieren ein.

Außerdem kann das Polypeptid, das solche Interferon bindende Aktivität aufweist, gleich ob es sich um IFNAR2, sIFNAR2, ein Analogon oder eine Variante, ein Salz, funktionelles Derivat oder Fragment davon handelt, auch zusätzliche Aminosäurereste enthalten, welche das Interferon bindende Polypeptid flankieren. So lange das resultierende Molekül die Interferon bindende Fähigkeit des Kern-Polypeptids bewahrt, kann durch routinemäßiges Experimentieren bestimmt werden, ob sich solche flankierenden Reste auf die grundlegenden und neuen Eigenschaften des Kernpeptids auswirken, d. h. seiner Interferon bindenden Eigenschaften. Der Begriff "im Wesentlichen bestehend aus", wenn in Bezug auf eine spezifizierte Sequenz verwendet, bedeutet, dass zusätzliche flankierende Reste vorhanden sein können, die sich nicht auf die grundlegende und neue Eigenschaft der spezifizierten Sequenz auswirken. Dieser Begriff umfasst nicht Substitutionen, Löschungen oder Zugaben innerhalb der spezifizierten Sequenz.

Obgleich IFNAR2 oder sIFNAR2 im Laufe der vorliegenden Beschreibung und in den Beispielen verwendet wurden, wird festgehalten, dass dies lediglich das bevorzugte Beispiel ist und dass die IFNAR1-Untereinheit und insbesondere ihre extrazelluläre Domäne IFNAR2 ersetzen kann, wo immer in der vorliegenden Offenbarung auf IFNAR2 Bezug genommen wird. IFNAR1 kann nur in Verbindung mit Interferonen verwendet werden, an die es bindet. IFNAR1 ist bekannt dafür, dass es an IFNα bindet. Jeder Komplex, der IFNAR1 verwendet, muss eine Spezies von Interferon aufweisen, und vorzugsweise eine Spezies von IFNα, an die das IFNAR1 bindet.

In Bezug auf den Interferon-Teil des Komplexes der vorliegenden Erfindung ist die biologische Aktivität, die in jedem der Analoga oder Varianten, Salze, funktionellen Derivate oder Fragmente aufrechterhalten werden muss, die Aktivität des Interferons, auf das sich die beabsichtigte Nutzung stützt. In den meisten Fällen ist dies die Fähigkeit, an einen nativen Zelloberflächenrezeptor zu binden und dadurch die Signalproduktion durch den Rezeptor zu vermitteln. Daher sollten all diese Analoga, Derivate oder Fragmente diese rezeptoragonistische Aktivität aufrecht erhalten, um in der vorliegenden Erfindung für die Nutzung nützlich zu sein. Andrerseits ist es manchmal nützlich, ein Molekül mit antagonistischer Aktivität auf dem Rezeptor zu haben, um die biologische Aktivität von nativem Interferon zu verhindern. Ein solcher Antagonist kann auch für verlängerte heilsame Wirkung mittels des Komplexes der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Für Anwendungsfälle, in denen es gewünscht wird, einen unerwünschten Effekt von Interferon zu beseitigen, können Analoga, die noch immer durch den Rezeptor und durch den IFNAR- Abschnitt des Komplexes gebunden sind, aber die keine Signal- und Blocksignalerzeugung durch das native Interferon auf diesem Rezeptor vermitteln, auch als biologisch aktiv für den Zweck der vorliegenden Erfindung und als durch den Begriff Interferon erfasst betrachtet werden, wenn sie in Bezug auf die Komplexe der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Einfache Assays können bestimmen, ob ein solches Analogon eine solche rezeptoragonistische Aktivität aufrecht erhält oder rezeptor-antagonistische Aktivität aufweist und daher für eine der Verwendungsmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung nützlich wäre.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch DNA-Sequenzen, welche den oben genannten Komplex der Erfindung und ihre Analoga codieren, sowie DNA-Vektoren, die solche DNA- Sequenzen zur Expression in geeigneten prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen tragen. Die Fähigkeit, große Mengen an heterologen Proteinen unter Verwendung eines rekombinanten Proteinexpressionssystems zu erzeugen, hat zur Entwicklung von verschiedenen therapeutischen Wirkstoffen geführt, z B. t-PA und EPO (Edington, 1995). Die verschiedenen Expressionswirte, aus denen rekombinante Proteine erzeugt werden können, reichen von prokaryotisch im Ursprung (z. B. Bakterien), (Olins, 1993), über niedrigere Eukaryoten (z. B. Hefe) (Ratner, 1989) zu höheren eukaryotischen Spezies (z. B. Insekten- und Säugetierzellen (Reuveny, 1993; Reff, 1993). Alle diese Systeme beruhen auf demselben Prinzip - Einführen der DNA-Sequenz des Proteins, das von Interesse ist, in den gewählten Zelltyp (in transienter oder stabiler Weise, als ein integriertes oder episomales Element) und Verwendung der Wirtstranskription, Übersetzungs- und Transportmaschinerie, um die eingeführte DNA-Sequenz als heterologes Protein zu überexprimieren (Keown, 1990).

Zusätzlich zur Expression von nativen Gensequenzen hat die Fähigkeit, DNA auf nucleotider Ebene zu manipulieren, die Entwicklung von neuen engineerten Sequenzen beschleunigt, die - obwohl auf natürlichen Proteinen basierend - neue Aktivitäten in Folge der Änderung in der primären Proteinstruktur (Grazia, 1997) besitzen.

Außerdem können ausgewählte DNA-Sequenzen physikalisch verbunden werden, um Transkripte zu erzeugen, welche sich zu neuen Fusionsproteinen entwickeln, wo ehemals unabhängige Proteine nun als eine Polypeptideinheit (Ibanez, 1991) exprimiert werden. Die Aktivität solcher Fusionsproteine kann unterschiedlich sein, z. B. stärker als eines der individuellen Proteine (Curtis, 1991).

Menschliches IFNβ wird aus einem Produktionsprozess abgeleitet, welcher die Säugetier-Ovarzelle des chinesischen Hamsters (CHO) verwendet. Typ 1 Interferone können in einer Reihe von Wirtszellen exprimiert werden, einschließlich Bakterien (Utsumi, 1987), Insekten (Smith, 1983) und Menschen (Christoffnis, 1981). Menschliches sIFNAR2 wurde auch unter Verwendung der CHO-Wirtszelle exprimiert. Alternativ wurden auch lösliche Rezeptoren wie sIFNAR2 erfolgreich in bakteriellen Expressionssystemen (Terlizzese, 1996) exprimiert. Die DNA für jedes Gen wurde in das CHO-Genom unter Verwendung eines Transfektionsverfahrens eingeführt, welches in Rekombination und Integration des Expressionsvektors resultierte. Zellen, welche das Protein, das von Interesse war, exprimierten, wurden dann isoliert, kultiviert und das Protein mit Hilfe von standardmäßigen auf dem Fachgebiet bekannten industriellen Methoden gewonnen und gereinigt.

Die Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche als aktiven Inhaltsstoff einen IFNAR2/IFN-Komplex oder Analoga davon oder Mischungen davon oder Salze davon und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, ein Verdünnungsmittel oder Excipienten umfasst. Eine Ausführungsform der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung schließt eine pharmazeutische Zusammensetzung für verstärkte IFN Typ Aktion in der Behandlung von viralen Erkrankungen, bei der Anti- Krebs-Therapie, in der Immunmodulationstherapie und anderen Anwendungen von Interferonen und Zytokinen, die damit in Zusammenhang stehen, ein.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung werden zur Verabreichung erstellt, indem der Komplex oder seine Analoga mit physiologisch annehmbaren Trägern und/oder Stabilisatoren und/oder Excipienten vermischt und in Dosierungform zubereitet wurden, z. B. durch Lyophilisation in Dosierungsfläschchen. Das Verfahren der Verabreichung kann über eine der akzeptierten Formen der Verabreichung für ähnliche Wirkstoffe erfolgen und hängt von der zu behandelten Bedingung ab. z. B. intravenös, intramuskulär, subkutan, durch lokale Injektion oder topische Anwendung oder durchgehend durch Infusion usw. Die Menge der aktiven Zusammensetzung, die zu verabreichen ist, hängt vom Verabreichungsweg, der zu behandelnden Erkrankung und dem Zustand des Patienten ab. Lokale Injektion zum Beispiel erfordert eine geringere Menge an Protein auf einer Körpergewichtsbasis als intravenöse Infusion.

Freies IFNβ neigt zu Oligomerisation. Um diese Neigung zu unterdrücken, weisen heutige Formulierungen von IFNβ einen sauren pH-Wert auf, welcher bei der Verabreichung etwas lokalisierte Irritation verursachen kann. Da IFNAR als Stabilisierungsfaktor für IFNβ dienen und somit Oligomerisation verhindern kann, kann seine Verwendung in IFNβ- Formulierungen dazu dienen, das IFNβ zu stabilisieren und dadurch die Notwendigkeit von sauren Formulierungen zu beseitigen. Demzufolge ist eine nicht saure pharmazeutische Zusammensetzung, welche IFNβ und IFNAR enthält, gemeinsam mit anderen herkömmlichen pharmazeutischen annehmbaren Excipienten auch Teil der vorliegenden Erfindung.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verwendungen des Komplexes der Erfindung oder seiner Analoga oder Mischungen davon für anti-virale, Anti-Krebs- und Immunmodulationstherapie. Insbesondere sind die Interferonrezeptor-Interferon-Komplexe der vorliegenden Erfindung für anti-virale Therapie bei solchen therapeutischen Indikationen wie chronischer granulomatoser Krankheit, Condyloma Acuminatum, juvenile Larynxpapillomatose, Hepatits A und chronischer Infektion mit Hepatitis B und C Viren nützlich.

Insbesondere sind die Interferonrezeptor-Interferon-Komplexe der vorliegenden Erfindung für Anti-Krebs-Therapie bei therapeutischen Indikationen wie Haarzellenleukämie, Kaposis Sarkom, multiples Myelom, chronische myelogene Leukämie, non- Hodgkins-Lymphom und Melanom nützlich.

Die Interferonrezeptor-Interferon-Komplexe der vorliegenden Erfindung sind auch für Immunmodulationstherapie wie Multiple Sklerose, rheumatische Arthritis, Myastenia Gravis, Diabetes, AIDS, Lupus usw. nützlich.

Ebenso betrifft die vorliegende Erfindung den Komplex oder Analoga davon oder Mischungen davon zur Verwendung bei der Zubereitung von Medikamenten zur Behandlung der oben genannten Leiden oder zur Verwendung in den oben angeführten Indikationen. Die vorliegende Erfindung wird nun detailliert in den folgenden, nicht einschränkenden Beispielen und den begleitenden Zeichnungen beschrieben.

Beispiele Materialien und Verfahren ANTI-VIRALER WISH BIOASSAY UND KOMPLEXERZEUGUNG

Ein WISH Assay wurde auf der Grundlage des Protokolls von Novick et al (1982) entwickelt.

Materialien

- WISH-Zellen (ATCC CCL 25)

- Vesikuläre Stomatitis Virus Stocks (ATCC V-520-001-522), gelagert bei -70ºC

- IFNβ, menschlich rekombinant, InterPharm Laboratories LTD 90 · 10&sup6; IU/ml, spezifische Aktivität: 264,5 · 10&sup6; IU/mg

- lösliches menschliches IFNAR2, 373 ug/ml Stockkonzentration in PBS

- WISH Wachstumsmedium (MEM hohe Glucose mit Earls-Salzen + 10% FBS + 1,0% L-Glutamin + Penicillin/Streptomycin (100 U/ml, 100 ug/ml))

- WISH Assay-Medium (MEM hohe Glucose mit Earls-Salzen + 5 % FBS + 1,0% L- Glutamin + Penicillin/Streptomycin (100 U/ml, 100 ug/ml), MTT bei 5 mg/ml in PBS, gelagert bei -70ºC.

Verfahren

- Verdünnen von rekombinantem, menschlichen IFNβ auf 19 IU/ml (4X die vorbestimmte EC&sub5;&sub0;-Dosis) in WISH-Assay-Medium

- Beginnen mit 90 ug/ml, Durchführen von elf (11) dreifachen Verdünnungen von menschlichem, rekombinanten sIFNAR2 in Eppindorf-Röhren in WISH-Assay-Medium. Die zwölfte Röhre enthält nur das WISH-Assay-Medium.

- 25 ul von IFNβ zu jeder Vertiefung in einer flachbödigen 96-Vertiefungsplatte hinzufügen (25 ul von WISH-Assay-Medium alleine zu einem 3 · 12 Vertiefungsabschnitt hinzufügen, um IFNAR2-Effekte in Abwesenheit von IFNβ zu kontrollieren).

- 25 ul von jeder Verdünnung des sIFNAR2 (oder nur Assay-Medium in Reihe zwölf) in Triplikat die zwölf Reihen der 96-Vertiefungsplatte hinunter hinzufügen.

- IFNβ mit sIFNAR2 über 1-4 Stunden lang in 37ºC Inkubator vor dem Hinzufügen von WISH-Zellen präinkubieren.

- Log-Wachstumsphasen-WISH-Zellen mit Trypsin/EDTA-Lösung ernten, in WISH- Assay-Medium waschen und auf eine Endkonzentration von 0,8 · 10&sup6; Zellen/ml bringen.

- 50 ul WISH-Zellen-Suspension (4 · 10&sup4; Zellen pro Vertiefung) zu jeder Vertiefung hinzufügen. Endkonzentration von IFNβ und IFNAR2 ist jene, die den Zellen ausgesetzt wird, so dass die Endkonzentration von IFNβ gleich 4,75 IU/ml (1X) und die Endkonzentration von sIFNAR2 in Reihe eins gleich 22,5 ug/ml ist.

- Nach Inkubation über einen Zeitraum von 24 Stunden in einem 5% CO&sub2; Feuchtinkubator, werden 50 ul einer 1 : 10 Verdünnung (in WISH-Assay-Medium) von VSV- Stock (eine vorbestimmte Dosis zu Lyse 100% von WISH-Zellen innerhalb von 48 Stunden) allen Vertiefungen hinzugefügt, außer den Nicht-Virus-Kontrollvertiefungen (diese erhalten ein gleiches Volumen des Assay-Mediums alleine).

- Nach weiteren 48 Stunden werden 25 ul MTT-Lösung zu allen Vertiefungen hinzugefügt, danach werden die Platten weitere 2 Stunden im Inkubator inkubiert.

- Inhalt der Vertiefungen wird durch Platteninversion entfernt, und 200 ul von 100% Ethanol werden zu den Vertiefungen hinzugefügt.

- Nach 1 Stunde werden die Platten bei 595 nm unter Verwendung des Soft max Pro Softwarepakets und des Spectramax Spectrophotometersystems (molekulare Vorrichtungen) gelesen.

Alle Sequenzierungsreaktionen wurden unter Verwendung des ThermoSequenaseTM radiolabeled Terminator Cycle Sequencing Kit (Amersham Life Science; Cleveland, OH) durchgeführt. Es wurden die vom Hersteller bereitgestellten Protokolle verwendet. Alle Sequenzierungsreaktionen wurden auf CastAwayTM Precast Sequenzierungsgele (Stratagene; LaJolla, CA) analysiert, welche 6% Polyacrylamid und 7M Urea enthielten. Die Sequenzierungsreaktionen wurden in der Reihenfolge A-C-G-T geladen. Die Autoradiographien der Sequenzierungsgele wurden manuell gelesen. Die Genetics Computer Group Sequence Analysis Software Package und UNIX Workstation wurden für die DNA-Sequenz-Analyse verwendet.

BEISPIEL 1

Um die anti-virale Aktivität des menschlichen IFNAR2/IFNβ Komplexes und des menschlichen IFNAR2Ig-IFNβ-Komplexes zu bestimmen, wurde eine fixe Konzentration von IFNβ (4,75 IU/ml) 3 Stunden lang bei 37ºC mit menschlichem sIFNAR2 (rekombinant p40) oder menschlichem IFNAR2Ig bei unterschiedlichen Konzentrationen (0,25-30.000 ng/ml) präinkubiert und dann in einem WISH-VSV Zytopathizitäts-Assay getestet. In Abwesenheit von IFN wurde kein anti-viraler Schutz entdeckt (Daten nicht gezeigt).

Anti-virale Aktivität von Typ I Interferonen (verwendet mit vorbestimmten EC&sub5;&sub0; Konzentrationen) in der Gegenwart von ungefähr 30 ng/ml sIFNAR2 zeigt agonistische Aktivität mit IFNβ, aber nicht alleine. Anti-virale Aktivität wurde durch MTT-Konversion 48 h nach einer VSV-Provokation gemessen.

Wenn IFN bei einer erwarteten ED&sub5;&sub0; Konzentration anwesend war, wurde Schutz beobachtet (siehe Fig. 1; Absorbanz gleich 0,45, keine Schutzabsorbanz ist gleich ~ 0,0, vollständige Schutzabsorbanz ist gleich ~ 1,8)). Wenn IFNAR2 oder IFNAR2Ig mit unterschiedlichen Konzentrationen titriert wurden, gab es ~ 4X Verstärkung der Aktivität von IFNβ bis zu 32 ng/ml von IFNAR2 und IFNAR2Ig (siehe auch Beispiel 2 und Fig. 2). Über 32 ng/ml IFNAR oder IFNAR2Ig verringerte sich die IFNβ-Aktivität wie erwartet, wahrscheinlich auf Grund der Konkurrenz um IFNβ von sIFNAR mit dem Membran basierten IFNAR. Dieses Experiment belegt somit die gesteigerte Wirkung und verstärkte Aktivität von IFNβ im IFNAR2/IFN-Komplex.

BEISPIEL 2

Die Wirkung des Änderns der IFNβ-Konzentration auf die sIFNAR2/IFN- Komplexaktivität wurde bei verschiedenen Konzentrationen von IFNβ zusätzlich zu ED&sub5;&sub0; geprüft. Wie in Fig. 2 ersichtlich, verstärkte bei 4,75 IU/ml IFNβ eine 1 Stunden lange IFNAR2-Präinkubation die Aktivität von IFNβ um ~ 2X bei einem Konzentrationsmaximum von ~ 32 ng/ml. Bei keiner der höheren Konzentrationen von IFNβ war es möglich, eine Verstärkung der IFNβ anti-viralen Aktivität festzustellen, da die Aktivität bereits maximal war. Diese Ergebnisse belegen ebenfalls, dass ein IFNAR2/IFNβ-Komplex die IFN-Aktivität verstärkt hat.

BEISPIEL 3

Die Kinetik der IFNAR2/IFNβ-Komplexbildung wurde durch Feststellen der antiviralen Aktivität einer subeffektiven Konzentration von IFNβ (0,95 IU/ml) zu verschiedenen Präinkubationszeiten mit unterschiedlichen Konzentrationen von IFNAR2 überprüft. Wie in Fig. 3 zu sehen, war eine vierstündige Präinkubation notwendig, um eine verstärkte antivirale Aktivität von IFNβ bei dieser subeffektiven Dosis zu erreichen. Somit führte bei Werten von IFNβ, die für sich selbst inaktiv sind, die Zugabe von IFNAR2, um einen Komplex zu erzeugen, zu bedeutender IFN anti-viraler Aktivität. Dieses Experiment ist ein weiterer Beleg für die verstärkte IFN-Aktivität des IFNAR2/IFNβ-Komplexes.

BEISPIEL 4

Es wurde festgestellt, dass die IFNβ-Bioaktivität nach in vitro Rekonstitution bei 37 ºC (physiologischer salzhaltiger Puffer pH-Wert 7,4) rapide abnimmt. Das ist, zumindest teilweise, auf die Bildung von IFNβ oligomeren Strukturen zurückzuführen, welche reduzierte Aktivität aufweisen. Um zu testen, ob IFNAR2 die Stabilität von IFNβ bei einem physiologischen pH-Wert stärkt, wurde ein Experiment durchgeführt, bei dem unterschiedliche Konzentrationen an IFNβ alleine (in RPMI 1640 Medien, Gibco) oder in denselben Medien in der Gegenwart von IFNAR2 bei einem konstanten Verhältnis von IFNAR2 zu IFNβ (2,5 ng/IU) inkubiert wurden.

IFNβ (500 IU/ml) wurde mit einem gleichen Volumen von entweder sIFNAR2 (1,25 ug/ml) oder nur RPMI 3 Stunden lang bei 37ºC präinkubiert. Titrierung von beiden IFNβ- Lösungen wurde in einem WISH-Assay-Medium in einer 96-Vertiefungen-Platte vor der Zugabe von WISH-Zellen durchgeführt. Das VSV wurde nach 24 Stunden hinzugefügt und nach einer weiteren 48-Stunden-Inkubation ermittelt, wie durch MTT-Konversion bestimmt.

Wie in Fig. 4 zu sehen, weist IFNβ alleine eine ED&sub5;&sub0; von ~ 104 IU/ml auf, während die Präinkubation von IFNβ mit löslichem IFNAR2 zu bedeutend verstärkter ED&sub5;&sub0; = ~ 7 IU/ml führt. Die hohe ED&sub5;&sub0; von IFNβ alleine kann auf die Oligomerisation von IFNβ in Lösung zurückzuführen sein. Die oben genannten Ergebnisse zeigen wieder die verstärkte Stabilität von IFNβ, wenn mit IFNAR2 in einem Komplex verbunden.

BEISPIEL 5

Um festzustellen, ob die verstärkte Aktivität von IFNβ in Gegenwart von IFNAR2 auf spezifischen Schutz durch sIFNAR zurückzuführen ist, wurde die Aktivität von IFNβ nach Komplexation mit IFNAR2 oder anderen nicht verwandten Proteinen mit derselben Konzentration evaluiert (menschliches IgG, Rinderserum Albumin (BSA)).

Wie in Fig. 5 gezeigt, wurde IFNβ (S00 IU/ml) mit einem gleichen Volumen von entweder den angeführten Proteinen (1,25 uf/ml) oder nur RPMI 4 Stunden lang bei 37ºC präinkubiert. Die Titrierung dieser IFNβ-Lösungen in einem WISH-Assay-Medium wurde in einer 96-Vertiefungen-Platte vor der Zugabe der WISH-Zellen durchgeführt. Frisch zubereitetes IFNβ wurde ebenfalls inkludiert, um die Wirkung der Präinkubation auf die IFNβ-Aktivität zu bestimmen. Das VSV wurde nach 24 Stunden hinzugefügt, und CPE wurde nach einer weiteren 48-Stunden-Inkubation ermittelt, wie durch MTT-Konversion bestimmt.

Die Präinkubation von IFNβ mit nicht spezifischen Proteinen (d. h. BSA oder humanem IgG) bei 2,5 ng/IU IFNβ hat die Aktivität von IFNβ nach Rekonstitution nicht geschützt. Die Aktivität des IFNAR2/IFNβ-Komplexes in diesem Assay war ähnlich dem frisch hinzugefügten IFNβ, was die Erkenntnis stützt, dass sIFNAR2 die IFNβ-Aktivität stabilisiert.

BEISPIEL 6

Der IFNAR2/IFNβ-Komplex zeigte ein stark verlängertes pharmakokinetisches Profil von IFNβ in der Maus, basierend auf ELISA und der Bioassay-Analyse (Fig. 6 und 7).

B6D2F1-Mäuse erhielten eine einzelne intravenöse Bolus-Injektion von menschlichem IFNβ (2,5 · 10&sup6; IU/kg) oder derselben Konzentration an IFNβ, 1 Stunde lang bei 4ºC präinkubiert, mit menschlichem IFNAR2 (2,5 ng/IU von IFN). Sera wurden 0,05 bis 48 Stunden nach Verabreichung vom retro-orbitalen Plexus entnommen, und die IFNβ- Konzentration und die IFNβ anti-virale Aktivität wurden durch ELISA (Fig. 6) oder WISH-Bioassay (Fig. 7) ermittelt. Serumkonzentrationen, die unter das Niveau der Assaysensibilität (7,55 IU/ml) im ELISA-Assay gefallen sind, wurden nicht graphisch dargestellt.

Der Komplex zeigte nicht nur ein ausgedehntes pharmakokinetisches Profil, sondern durch den WISH anti-viralen Assay wurde der Wert des biologisch aktiven IFNβ in der Maus im Laufe der Zeit deutlich gestärkt, wodurch die gestärkte Stabilität und die verlängerte Plasma-Halblebenszeit des IFNAR2/IFNβ-Komplexes der Erfindung im Vergleich zu IFNβ alleine gezeigt wurden.

BEISPIEL 7

Der IFNAR2/IFNα2a-Komplex zeigte ein stark verlängertes pharmakokinetisches Profil von IFNα2a in der Maus, basierend auf ELISA und Bioassay-Tests (Fig. 8 und 9).

B6D2F1-Mäuse erhielten eine einzelne intravenöse Bolus-Injektion von menschlichem IFNα (1,25 · 10&sup5; IU/kg) oder derselben Konzentration an IFNα, 1 Stunde lang bei 4ºC präinkubiert, mit menschlichem IFNAR2 (14,9 ng/IU von IFN). Sera wurden zu angegebenen Zeiten vom retro-orbitalen Plexus entnommen, und die IFNα2a-Konzentration und die IFNα anti-virale Aktivität wurden durch ELISA (Fig. 8) oder WISH-Bioassay (Fig. 9) ermittelt.

IFNα wurde durch für menschliches IFNα spezifischen ELISA ermittelt. Serumkonzentrationen, die unter das Niveau der Assaysensibilität (30 IU/ml) im ELISA gefallen sind, wurden nicht graphisch dargestellt.

Der Komplex zeigte nicht nur ein ausgedehntes pharmakokinetisches Profil für IFNα, sondern durch den WISH anti-viralen Assay wurde der Wert des biologisch aktiven IFNα in der Maus im Laufe der Zeit deutlich gestärkt, wodurch die gestärkte Stabilität und die verlängerte Plasma-Halblebenszeit des IFNAR2/IFN-Komplexes der Erfindung im Vergleich zu IFNα alleine gezeigt wurden.

BEISPIEL 8 Engineering von IFNAR2/IFN-Fusionsproteinen

Konstrukte wurden engineert, so dass das C-Terminal der IFNAR2 extrazellulären Domäne an den N-Terminus des reifen IFN unter Verwendung der folgenden Peptidlinker fusioniert wird, wobei G und S die Aminosäuren Glycin beziehungsweise Serin darstellen:

IFNAR2 extrazellulär (Linker) reif IFNβ

...ESEFS(GGGGS)nMSY..., wobei n = 0 (SEQ ID NO:5), 1 (SEQ ID NO:7), 2 (SEQ ID NO:6), 3 (SEQ ID NO:5), 4 (SEQ ID NO:4) und 5 (SEQ ID NO:3).

Die volle Aminosäuresequenz der n = 2 IFNAR2/IFNβ-Fusion wird in Fig. 10 (SEQ ID NO:14) gezeigt.

Der Expressionsvektor pSVEIF, welcher das Gen exprimierende menschliche rekombinante IFN enthielt, wurde als Templat für PCR verwendet. Synthetische Primer wurden entwickelt, so dass nur der reife Proteincodierungsbereich des menschlichen IFN (MSY...) vom Templat aus verstärkt werden konnte. Der 5' Primer bestand aus Sequenzen für einen digestierten-SmaI Ort, den letzten sieben Aminosäuren von IFNAR2 (GQESEFS) (Reste 344-349 von SEQ ID NO:14), und dem (GGGGS)&sub1; (SEQ ID NO:1) Linker. BamHI und XhoI-Orte wurden ebenfalls in den 5'PCR-Primer inkludiert, um das Klonen der anderen Kassetten zu erleichtern. Der 3' Primer enthielt einen AvrII-Ort, der unmittelbar dem TGA Stop-Codon von hIFNβ folgt. Die PCR enthielt ungefähr 1 g Templat DNA, 1 g jedes PCR-Primer, 0,2 mM jedes dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 1X ThermoPol-Reaktions- Puffer (10 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, (pH 8,8 bei 25ºC), 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 2 mM MgSO&sub4;, 0,1% Triton X-100: New England Biolabs; Beverly, MA), und 3 mM MgSO&sub4; (5 mM MgSO&sub4; Endkonzentration) in einem Reaktionsvolumen von 100 ul. Nach einer VENTR® Anfangsinkubation bei 99,9ºC für 30 Sekunden, wurden 2 Einheiten von VENTR® DNA Polymerase zur Reaktion hinzugefügt. Die PCR bestand aus 20 Zyklen des Folgenden: (α) 99,9ºC für 30 Sekunden, (b) 65ºC-55ºC für 30 Sekunden, Abnahme von 0,5ºC mit jedem Zyklus, und (c) 75ºC für 40 Sekunden. Zusätzliche 15 Zyklen wurden mit oben genanntem Profil durchgeführt, wobei die Glühtemperatur jedoch bei 55ºC gehalten wurde. Die PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung des WizardTM PCR Preps DNA Purification System (Promega; Madison, WI) gereinigt. Nach Digestion der PCR-Produkte mit AvrII wurden die Reaktionen auf Agarosegele mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt. Das Gel gereinigte Fragment, das die hIFNβ reife Proteinsequenz mit 1 GS Linker enthält, wurde in den (SmaI + AvrII) digestierten Expressionsvektor pCMV-p40 ligiert, welcher die Gencodierung für die lösliche Form des menschlichen rekombinanten IFNAR2 enthielt. Die Ligationsreaktionen wurden verwendet, um kompetente E. coli XL-1 Blue Zellen unter Verwendung von Standardmethoden (Sambrook et al. 1989) zu transformieren. Ein korrekter Zusammenbau der Konstruktion, genannt pCMV-IFNAR2/IFNAβ GS, wurde durch Restriktions-Endonuclease-Digestion und Sequenzierung des PCR erzeugten Bereichs der "Interfusion" bestätigt. Nachfolgende Konstrukte wurden durch Verwendung von Oligonucleotidkassetten engineert, wobei jede einen BamHI-Überhang, den geeigneten (GGGGS)n Linker (SEQ ID NO:1 wenn n = 1) und einen XhoI-Überhang enthält. Die 0 GS Kassetten enthielten SmaI und XhoI-Uberhänge. Nach Bestätigung des pCMV- IFNAR2/IFNAβ 1 GS-Vektors wurde er mit BamHI und XhoI digestiert und die geeigneten Kassetten wurden in diesen Vektor ligiert. Für das 0 GS-Konstrukt wurde der Vektor mit SmaI und XhoI für die Ligation der Kassette digestiert.

Insgesamt wurden sechs Vektoren geschaffen, pCMV-IFNAR2/IFNβ n (GS), wobei n für 0, 1, 2, 3, 4 oder 5 GGGGS (SEQ ID NO:1) Linkereinheiten steht. Diese Restriktionsdigestionsergebnisse werden in Fig. 11 dargestellt. Sequenzierungsprimer wurden so entwickelt, dass die Kassette für jedes Konstrukt vollständig sequenziert wurde. Groß angelegte Plasmid-DNA-Kulturen wurden für jedes der bestätigten Konstrukte unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits und der vom Hersteller (Qiagen; Chatsworth, CA) beschriebenen Protokolle vorbereitet.

Fig. 12 ist eine repräsentative Plasmid-Map der pCMV-IFNAR2/IFNAβ "Interfusions"-Expressionsvektoren. Die Transkription des IFNAR2/IFNβ-Fusionsproteins wird durch den menschlichen unmittelbaren frühen CMV-Promoter geleitet. Die Polyadenylationssignalsequenz des menschlichen Wachstumshormons (hGH), bereitgestellt vom Vektor, wurde für 3'-Verarbeitung der IFNAR2/IFNβ-Transkripte verwendet.

VEKTORENLISTE

Sequenzdaten wurden für den PCR erzeugten Bereich der IFNAR2/IFNβ 1GS-Fusion erhalten; diese Daten zeigten, dass die Sequenz den Vorhersagen entsprach. Sequenzdaten wurden für den Peptidlinkerbereich der anderen Konstruktionen erhalten; die Sequenzen waren ebenfalls wie vorhergesehen.

Eine Northern-Blot-Analyse wurde auf Zellen durchgeführt, die mit jedem Konstrukt transfektiert wurden. Ein Band mit ungefähr 1,4 kb Größe war in allen Lanes vorhanden, welche die IFNAR2/IFNβ n GS Proben für die IFNAR2-Sonde und für die IFNβ-Sonde enthielten. Bei der IFNβ-Sonde wird ein zusätzliches Band von ungefähr 0,9 kb beobachtet. Ein Band dieser Größe würde einem alternativ gespleißten Transkript entsprechen, das die letzten sechs Aminosäuren von IFNAR2, den (n) GS Peptidelinker und die hIFN reife Proteincodierungssequenz enthalten würde. Dies wurde durch Sequenzierung von cDNA bestätigt, erstellt aus der Gesamt-RNA, isoliert aus den transient transfektierten CHO-Zellen von Beispiel 9.

BEISPIEL 9

Transiente Transfektion. CHO-DUKX-Zellen sind ein klonaler Mutant von Ovarzellen des chinesischen Hamsters, denen Dihydrofolatreduktase-Aktivität fehlt (Urlaub et al (1980); Graff et al (1982)).

Die Zellen wurden in einem Alpha-Minimum-Essential-Medium (αMEM) plus Ribonucleoside und Desoxyribonucleoside gehalten, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% L-Glutamin (komplettes Medium). Eine transiente Transfektion wurde unter Verwendung des Lipofectamine PLUSTM Reagens (GibcoBRL Life Technologies; Gaithersburg, MD) und des vom Hersteller bereitgestellten Protokolls durchgeführt. Ungefähr 24 Stunden vor der Transfektion wurden die Zellen in Schalen mit 100 mm Durchmesser mit einer Dichte von 2 · 10&sup6; Zellen/Schale plattiert. Für die Transfektion wurden 4 ug des Supercoil-Vektor-Plasmid-DNA (pCMV-IFNAR2/IFN n GS, wobei n = 0, 1, 2, 3, 4 oder 5) verwendet. Das vom Hersteller bereitgestellte serumfreie Medium wurde zur Verdünnung von DNA und PLUS-Reagens verwendet. Zellen-Supernatante wurden nach Inkubation bei 37ºC über einen Zeitraum von 48 Stunden in komplettem Medium für ELISAs (IFNAR2, IFNβ) und Western-Gele gesammelt.

RNA-Extraktion und Northern-Analyse. Die gesamte zelluläre RNA (Chomczynski et al. 1987) wurde aus den transient transfektierten CHO-DUKX-Zellen extrahiert. Zehn g von der Gesamt-RNA pro Lane wurden in Agarosegele der Größe nach fraktioniert, welche Formaldehyd als Denaturant enthielten. Proben wurden in Duplikatsets geladen. Die RNA wurde auf GeneScreen Plus Nylonmembrane (DuPont/NEN Medical Products; Boston, MA) durch Kapillarblot in 10 · SSC (1,5 M Natriumchlorid, 0,15 M Natriumzitrat) übertragen. Die immobilisierte RNA wurde an ³²P-labeled hIFNAR2 und hIFNβ PCR-Fragmente in einer Lösung hybridisiert, welche von jener von Church und Gilbert (1984) modifiziert wurde. Der Puffer enthielt 0,25 M Natriumphosphat, pH 7,2, 0,25 M Natriumchlorid, 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM Ethylenediamintetra-Essigsäure und 100 ug/ml E. coli tRNA. Die ³²P-labeled Sonden wurden unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kit ("High Prime" Boehringer Mannheim; Indianapolis, IN) und der darin beschriebenen Verfahren erzeugt. Nicht inkorporierte Radioaktivität wurde durch Chromatographie auf Sephadex G-50-Säulen entfernt. Nach der Hybridisierung wurden die Blots gewaschen; die stringenteste verwendete Bedingung war 0,2 X SSC, 0,1% SDS bei 65ºC. Die Blots wurden einer Autoradiographie unterzogen.

Expression der Interfusionsproteine

Es wurden Supernatanten von den einzelnen Interfusionskonstrukten, die transient in die CHO-Zellen transfektiert wurden, auf IFNAR2- und IFNβ-Expressionswerte unter Verwendung eines IFNAR2 spezifischen ELISA und eines IFNβ ELISA (Toray) analysiert. Die Ergebnisse dieser Analyse werden in Tabelle IV dargestellt.

Tabelle IV In CHO-Zellen transient transfektierte Interfusionskonstrukte

* - mit Hilfe des TORAY-Kits bestimmt

+ - mit Hilfe von hIFNAR2 ELISA bestimmt

≠ basierend auf einer spezifischen Aktivität von 2,0 · 10&sup5; U/mg (2 · 10&sup8;/mg)

# - basierend auf einer Masse von 22.200 Daltons (Durchschnittsmasse durch MALDITOF-Analyse von hIFNβ)

$ - basierend auf einer Masse von 34.400 Daltons (Durchschnittsmasse durch MALDITOF-Analyse)

Wie zu sehen ist, wurde mit steigender Linkerlänge eine Abnahme bei erfassbarem IFNAR2 und IFNβ beobachtet. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt ist es nicht möglich, festzustellen, ob dies auf eine Abnahme in der Menge des exprimierten Interfusionsproteins mit steigender Linkerlänge zurückzuführen ist, oder ob mit steigender Linkerlänge das IFNβ am IFNAR2-Bindungsort binden kann und daher nicht vollständig durch die ELISA-Assays erfassbar ist. Es ist bekannt, dass der IFNβ-Assay nur nicht im Komplex verbundenes IFNβ erfasst.

Western-Blot-Analyse des IFNAR2/IFNβ-Fusionsproteins

Um festzuhalten, dass die Interfusionsproteine mit dem geeigneten Molekulargewicht exprimiert wurden und dass kein freies IFNβ exprimiert wurde, wurden die Überstande aus transfektierten Zellen durch Western-Blotting unter Verwendung eines Anti-IFNβ- Antikörpers analysiert, um die Interfusion zu erfassen. Die Ergebnisse dieser Analyse werden in Fig. 13 gezeigt.

15 ul Kultivierungsüberstand aus CHO-Zellen, transient transfektiert mit IFNAR2/IFNβ-Konstrukt (Lanes 1-6) oder IFNAR2-Konstrukt (Lane 7), Kultivierungsmedium (Lane 8) oder IFNβ (Lane 9) wurden SDS-PAGE unter nicht reduzierender Bedingung unterzogen, gefolgt von Elektrotransfer zur PVDF-Membran. Die Membran wurde mit Ziegen-Anti-IFNβ-Antikörper sondiert und mit Alkalinphosphatase konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen unter Verwendung eines Western-Star Lumineszenzerfassungskits entwickelt.

In keinem der Supernatanten der Interfusionskonstrukte wurde ein freies IFNβ entdeckt. Ebenso exprimierte jedes der Konstrukte ein Protein, das durch Western-Blot das geeignete MW für jedes Interfusionskonstrukt war.

BEISPIEL 10

Anti-virale Aktivität von Interfusionsmolekülen. Jeder Kultivierungssupernatant, der eine Interfusion enthielt, wurde auf anti-virale Aktivität in einem Zytopathizitätsassay geprüft, in dem WISH-Zellen (menschliche amniotische Zellen) nach Zugabe von IFNβ (Kontrolle) oder den Interfusionen gegenüber VSV exponiert wurden. Die Ergebnisse werden in Fig. 14 dargestellt.

CHO-Zellen-Supernatanten, welche exprimierte rekombinante Proteine enthalten (wie durch ELISA und Western-Blot festgestellt), oder das CHO-Kultivierungsmedium alleine wurden in Duplikat zur obersten Reihe der 96-Vertiefungen-Flachboden-Gewebekultivierungsschalen in einem Volumen von 75 ul/Vertiefung hinzugefügt. Dreifache serielle Verdünnungen von jeder Probe wurden durch Entfernen von 25 ul aus den Vertiefungen, welche die Supernatanten (oberste Reihe) enthielten, und durch Hinzufügen davon zur nächsten Reihe, welche die 50 ul des WISH-Assay-Mediums enthält, durchgeführt. In den positiven Kontrollvertiefungen wurde das Supernatant in der obersten Reihe mit dem WISH- Assay-Medium ersetzt, das 1000 IU/ml menschliches IFNβ enthält, welches ebenso seriell dreifach die Länge der Schale hinunter verdünnt wurde. Jede e erhielt dann 50 ul einer WISH-Zellen-Suspension (0,6 · 10&sup6; Zellen/ml in WISH-Assay-Medium), so dass die Endkonzentration in der obersten Reihe, welche REBIF® enthält, 500 IU/ml beträgt, und die Startverdünnung für die CHO-Zellen-Supernatanten bei 1 : 2 liegt. Nach 24 Stunden Inkubation in 5% CO&sub2; bei 37ºC erhielt jede Vertiefung (mit Ausnahme jener, die als die nicht infektierten Kontrollvertiefungen gekennzeichnet waren) 50 ul des WISH-Assay- Mediums, welches das vesikuläre Stomatitis Virus (1 : 10 des Stocks) enthielt. Die Lebensfähigkeit der WISH-Zellen wurde nach weiteren 48 Stunden Kultivierung durch MTT-Konversion bestimmt.

Die von den Interfusionsmolekülen vermittelte anti-virale Aktivität wurde durch Normalisierung des Verdünnungsfaktors der Supernatanten bestimmt, der erforderlich ist, um EC&sub5;&sub0; zu EC&sub5;&sub0; zu erreichen, das für den gereinigten menschlichen IFNβ-Standard bestimmt ist. Mit Ansteigen der Linkerlänge steigt auch die anti-virale Aktivität der Interfusionskonstrukte.

BEISPIEL 11

Dieses Beispiel ist eine pharmakokinetische Studie eines menschlichen IFNβ/sIFNAR2-Komplexes in der Maus bei intravenöser Verabreichung. Vergleiche werden zwischen vorgebildeteten und getrennt injizierten Komplexkomponenten durchgeführt. Sechsunddreißig D2F1-Mäuse (6-8 Wochen) (ungefähr jeweils 20 g) werden wie folgt in vier Gruppen eingeteilt:

Gruppe 1 umfasst neun Mäuse, die intravenös mit einem Einzel-Bolus von 200 ul einer Lösung von 50.000 IU/ml menschlichem IFNβ (Enddosis von 10.000 IU/Maus) zu injizieren sind.

Gruppe 2 (neun Mäuse) erhielt 200 ul einer Lösung von 50.000 IU/ml menschlichem IFNβ und 125 mg/ml sIFNAR2 (2,5 ng/IU-Verhältnis).

Gruppe 3 (neun Mäuse) erhielt (1) 200 ul einer Lösung von 125 mg/ml, gefolgt von (2) 200 ml einer Lösung von 50.000 IU/ml menschlichem IFNβ (2,5 ng/IU-Verhältnis).

Gruppe 4 (9 Mäuse) erhielt (1) 200 ul einer Lösung von 625 mg/ml, gefolgt von (2) 200 ml einer Lösung von 50.000 IU/ml menschlichem IFNβ (10 ng/IU-Verhältnis).

Blutproben (ungefähr 200 ul/Probe) werden zu den angegebenen Zeiten durch Durchschlagen des retro-orbitalen Venenplexus mit einem Kapillarrohr gesammelt. Bei drei Mäusen aus jeder Gruppe wurden Blutproben 0,05, 2 und 12 Stunden nach der Verabreichung entnommen. Bei drei Mäusen von jeder Gruppe wurden Blutproben 0,54 und 24 Stunden nach der Verabreichung entnommen und bei drei Mäusen von jeder Gruppe wurden Blutproben 1, 8 und 48 Stunden nach der Verabreichung entnommen. Die Blutproben wurden eine Stunde bei Raumtemperatur zum Gerinnen gebracht, umrandet und mikrozentrifugiert. Die daraus entnommenen Sera wurden bei -70ºC gelagert, bis alle Proben eingesammelt waren. Die Sera werden auf Gegenwart von menschlichem IFNβ mit Hilfe von IFNβ spezifischem ELISA unter Verwendung des Toray menschlichen IFNβ ELISA Kit (TFB, Inc.) überprüft und unter Verwendung des WISH anti-viralen Assay auf Bioaktivität hin geprüft.

Die Ergebnisse des IFNβ spezifischen ELISA-Assay werden in Fig. 15A und die Ergebnisse des WISH anti-viralen Assay in Fig. 15 B gezeigt.

Es ist ersichtlich, dass die Serumhalblebenszeit von IFNβ, injiziert als IFNAR2- Komplex, ähnlich jener von IFNβ ist, das nach separater IFNAR-Injektion injiziert wurde. Diese Ergebnisse stimmen mit einer in vivo Bildung eines IFNβ/IFNAR2-Komplexes mit verbesserter Halblebenszeit überein.

BEISPIEL 12

C57BL/6-Mäuse wurden mit einem Komplex von "Universal" IFN (menschliches IFNαA/D) und sIFNAR2 behandelt. Die Schutzwirkung in Bezug auf die Zytotoxizität wurde im Vergleich zur Verabreichung von verschiedenen Dosen von Universal IFN alleine oder einer Kontrollsubstanz gemessen. Die erste Gruppe erhielt 5 · 10³ IU Universal IFN, im Komplex verbunden mit 5/ng IU sIFNAR2. Die zweite Gruppe erhielt 5 · 10³ IU Universal IFN. Die dritte Gruppe erhielt 5 · 10&sup4; IU Universal IFN und die vierte Gruppe PBS/2% NMS. Für jede dieser Mäuse wurde die NK-Aktivität als Zytotoxizität von splenischen Zellen gegenüber den NK-Zielzellen YAC-1 gemessen. Die Ergebnisse werden in Fig. 16 dargestellt. Die NK-Aktivität war bei Mäusen, die mit dem Universal IFN/sIFNAR2- Komplex behandelt wurden, wesentlich größer als bei den Mäusen, die nur mit Universal IFN behandelt worden sind.

BEISPIEL 13

Wie oben angeführt, haben pharmakokinetische Studien eine dramatische Verbesserung der Serum-Halblebenszeit von Typ I IFNs gezeigt, wenn es zu einer Verabreichung als Komplex mit sIFNAR2 gekommen ist, der löslichen Form der IFN- Rezeptor-Untereinheiten. In vitro Ergebnisse lassen vermuten, dass die physikalische Assoziation mit IFNAR2 zur Stabilisierung von normalerweise labilem IFN führt. Um festzustellen, ob das verbesserte PK-Profil und der Stabilisierungseffekt von IFNAR2 eine Verbesserung und Verlängerung von IFN vermittelter Wirkungskraft in vivo zur Folge haben, wurde ein Modell entwickelt, in dem Mäuse mit schwerer kombinierter Immundefizienz (scid/scid) mit einer tödlichen Dosis der IFN-sensitiven Daudi menschlichen B Zell-Lymphoma-Zelllinie (Ghetie, 1991; Ghetie, 1990) provoziert werden. Diese Mäuse entwickelten zwischen den Tagen 14 bis 20 nach der Injektion von Tumorzellen eine Paralyse in Verbindung mit histologischem Nachweis von verbreitetem Lymphoma. Auffallend ist, dass das Überleben dieser Mäuse in dosisabhängiger Weise durch tägliche subkutane Verabreichung von humanem IFNβ verlängert werden kann. Dieses Modell wird verwendet, um IFNAR2 als Potentiator der biologischen Aktivität in Zusammenhang mit Typ 1 IFNs in vivo zu evaluieren.

Um die Beziehung zwischen der mittleren Zeit bis zur Paralyse und der Dosis von IFNβ im Daudi scid-Modell festzulegen, erhielten fünf Gruppen von 5 Mäuse des Stamms BALB/cByJSmn-scid/scid, im Alter von 4 bis 5 Wochen, weiblich, eine subkutane Verabreichung von 200 ul pro Maus pro Tag von menschlichem IFNβ, jeden Tag von Tag 0 bis Tag 30. Die standardmäßige Daudi-Zell-Dosis, expandiert aus gefrorenem Stock, lag bei 5 · 10&sup6; Zellen pro Maus durch subkutane Injektion ins Genick am Tag 0 in PBS. Die Mäusegruppen erhielten folgende Mengen an IFN.

Gruppe 1: 135 · 10&sup4; IU/Maus (675 · 10&sup4; IU/ml)

Gruppe 2: 45 · 10&sup4; IU/Maus (225 · 10&sup4; IU/ml)

Gruppe 3: 15 · 10&sup4; IU/Maus (75 · 10&sup4; IU/ml)

Gruppe 4: 5 · 10&sup4; IU/Maus (25 · 10&sup4; IU/ml)

Gruppe 5: PBS mit 2% NMS

Die Zeit zur Paralyse als Einzel- und Durchschnittswert wird in Tabelle V gezeigt.

Tabelle V

Somit ist ersichtlich, dass die mittlere Zeit zur Paralyse im Daudi/scid-Xenograft- Modell durch tägliche subkutane Verabreichung von menschlichem IFN in dosisabhängiger Weise verlängert wird.

BEISPIEL 14

Um festzustellen, ob der Antitumor-Effekt von IFNβ durch Komplexbildung mit IFNAR2 bei 2,5 ng/IU verbessert werden kann, wurden sieben Gruppen von fünf Mäusen mit demselben Protokoll behandelt, das in Beispiel 13 besprochen wurde, außer, dass die den einzelnen Gruppen verabreichten Testmaterialien folgende waren:

Nur IFNβ/Maus IFNβ plus sIFNAR2/Maus

Gruppe 1 2 · 10² IU Gruppe 4 2 · 10² IU plus 0,5 ug

Gruppe 2 2 · 10³ IU Gruppe 5 2 · 10³ IU plus 5,0 ug

Gruppe 3 2 · 10&sup4; IU Gruppe 6 2 · 10&sup4; IU plus 50,0 ug

Gruppe 7 erhielt Daudi-Zellen, Behandlung ist nur verdünnend

Die Zeit zur Paralyse wird als Einzel- und Durchschnittswert in folgender Tabelle gezeigt:

Tabelle VI

* Deutlich anders (p-Wert ≤ 0,05) als dieselbe Konzentration an IFNβ in nicht- komplexer Form in paarweisem Gruppenvergleich, wie durch Einweg-ANOVA bestimmt.

Es ist ersichtlich, dass die Anti-Tumor-Aktivität einer geringen Dosis von IFNβ 2 · 10&sup4; IU/Maus/Tag und das Daudi/scid-Xenograft-Modell durch die Komplexbildung mit IFNAR2 deutlich verbessert werden.

In einem weiteren Experiment (nicht dargestellt) wurde die Wirkung der Injektionsfrequenz auf die mittlere Paralysezeit untersucht. Es wurde festgestellt, dass durch Behandlung mit dem IFNβ/IFNAR G2-Komplex, wenn die Injektion so wenig häufig wie ein Mal pro Woche erfolgt, im Vergleich zu freiem IFNβ, das so oft wie ein Mal pro Tag injiziert wird, im Daudi/scid-Xenograft-Modell eine deutlich verbesserte Antitumor-Aktivität erzielt werden kann. Außerdem wurde in einem weiteren Experiment (nicht dargestellt) das optimale Verhältnis von IFNAR zu IFNβ getestet. Es wurde herausgefunden, dass das optimale Verhältnis von IFNAR2:IFNβ zur Verstärkung der Anti-Tumor-Aktivität in einer einfachen Konzentration von IFNβ (2 · 10&sup4;/IU/Maus/Tag) bei 2,5 ng IFNAR2 pro pg IFNβ lag.

In einem zweiten Experiment wurde festgestellt, dass das optimale Verhältnis von IFNAR2:IFNβ zur Verstärkung der Anti-Tumor-Aktivität bei einer Konzentration von IFNβ von 5 · 10&sup4; IU/Maus/Tag bei 0,3 ng IFNAR2 pro pg IFNβ lag. Diese beiden Experimente zeigen, dass das optimale Verhältnis von der Konzentration an IFNβ abhängt, und scheinen anzuzeigen, dass das Verhältnis umso niedriger sein kann, je höher die Konzentration von IFNβ ist.

In einem anderen Experiment wurde unter Verwendung desselben Models festgestellt, dass die Verabreichung von IFNAR2 alleine das Überleben der Mäuse aus der Studie nicht unterstützt.

BEISPIEL 15

Dieses Beispiel ist eine pharmakokinetische Studie, um die Serumhalblebenszeit des Interfusions-5GS-Moleküls im Mausserum nach einer einzelnen intravenösen Bolusinjektion zu bestimmen. Einundzwanzig weibliche Mäuse des Stamms B6D2F1 (6 bis 8 Wochen) (ungefähr jeweils 20 g) wurden in drei Gruppen wie folgt aufgeteilt:

Gruppe 1: enthält neun Mäuse, denen intravenös ein einzelner Bolus von 200 ul einer Lösung von 100.000 IU/ml Interfusions-5GS (Enddosis von 20.000 IU/Maus oder 5 · 10&sup6; IU/kg) injiziert wurde.

Gruppe 2: (neuen Mäuse) erhielten 200 ul einer Lösung von 100.000 IU/ml menschlichem IFNβ.

Gruppe 3: enthält drei Mäuse, die keine Injektionen erhielten und die als negative Kontrollgruppe dienen.

Unter Annahme eines Blutvolumens von ungefähr 2 ml/Maus liegt die theoretische Cmax und Tmax bei 10.000 IU/ml für Gruppe 1 und Gruppe 2. Drei Mäusen aus Gruppe 1 und drei Mäusen aus Gruppe 2 wurde 0,05, 2 und 12 Stunden nach der Verabreichung Blut entnommen. Drei Mäusen aus Gruppe 1 und drei Mäusen aus Gruppe 2 wurde 0,5, 4 und 24 Stunden nach der Verabreichung Blut entnommen, und drei Mäusen aus Gruppe 1 und aus Gruppe 2 wurde 1, 8 und 48 Stunden nach der Verabreichung Blut entnommen. Die Sera wurden auf Gegenwart von bioaktivem menschlichen IFNβ unter Verwendung der WISH- Assay überprüft.

Die Ergebnisse werden in Fig. 17 dargestellt. Während IFNβ beinahe sofort gecleart wird, bleibt das Interfusionsmolekül lange Zeit nach der Injektion im Serum. Dies zeigt, dass das Fusionsprotein die gewünschte Stabilisierungswirkung hat.

Die vorhergehende Beschreibung der spezifischen Ausführungsbeispiele wird die allgemeine Natur der Erfindung vollständig offenbaren, so dass andere durch Anwenden von aktuellem Wissen diese spezifischen Ausführungsbeispiele leicht modifizieren und/oder für verschiedene Anwendungen anpassen können, ohne übermäßiges Experimentieren und ohne vom allgemeinen Konzept abzuweichen und daher sollten und gelten solche Anpassungen und Änderungen als innerhalb des Rahmens von Äquivalenten der offenbarten Ausführungsbeispiele. Es versteht sich, dass die im vorliegenden Dokument verwendete Phraseologie und Terminologie nur beschreibenden und keinen einschränkenden Charakter hat. Die Mittel, Materialien und Schritte zum Ausführen verschiedener, offenbarter Funktionen können verschiedene alternative Formen annehmen, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Somit sind die Formulierungen "Mittel zu ..." und "Mittel für ..." oder Formulierungen in Bezug auf Verfahrensschritte, so wie sie in obiger Spezifikation und/oder in den folgenden Ansprüchen vorkommen können, gefolgt von einer funktionellen Erklärung, so zu verstehen, dass sie jegliches strukturelles, physikalisches, chemisches oder elektrisches Element oder jegliche Struktur oder jeglichen Verfahrensschritt definieren und abdecken, die jetzt oder in Zukunft existieren und die genannte Funktion erfüllen, gleich ob genau so wie im Ausführungsbeispiel oder den Ausführungsbeispielen, die in obiger Spezifikation offenbart werden, oder nicht, d. h. andere Mittel oder Schritte zum Erfüllen derselben Funktion können verwendet werden; und es wird festgehalten, dass die verwendeten Formulierungen in ihrem weitesten Sinne auszulegen sind.

LITERATURHINWEISEN

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SEQUENZAUFSTELLUNG

< 110> TEPPER, Mark

CUNNINGHAM, Mark

SHERRIS, David

EL TAYAR, Nabil

McKENNA, Sean

< 120> IFNAR2/IFN-KOMPLEX

< 130> TEPPER1A.SEQ

< 140> noch nicht empfangen

< 141> 1998-12-18

< 150> 60/068,295

< 151> 1997-12-19 <

160> 14

< 170> PatentIn Ver. 2.0

< 210> 1

< 211> 5

< 212> PRT

< 213> Unbekannt

< 220>

< 223> Beschreibung von unbekanntem Organismus: Peptid

< 400> 1

< 210> 2

< 211> 4

< 212> PRT

< 213> Unbekannt

< 220>

< 223> Beschreibung von unbekanntem Organismus: Peptid

< 400> 2

< 210> 3

< 211> 33

< 212> PRT

< 213> Unbekannt

< 220> <

223> Beschreibung von unbekanntem Organismus: Peptid

< 400> 3

< 210> 4

< 211> 28

< 212> PRT

< 213> Unbekannt

< 220>

< 223> Beschreibung von unbekanntem Organismus: Peptid

< 400> 4

< 210> 5

< 211> 23

< 212> PRT

< 213> Unbekannt

< 220>

< 223> Beschreibung von unbekanntem Organismus: Peptid <

400> 5

< 210> 6

< 211> 18

< 212> PRT

< 213> Unbekannt

< 220>

< 223> Beschreibung von unbekanntem Organismus: Peptid

< 400> 6

< 210> 7

< 211> 13

< 212> PRT

< 213> Unbekannt

< 220>

< 223> Beschreibung von unbekanntem Organismus: Peptid

< 400> 7

< 210> 8 <

211> 36

< 212> PRT

< 213> Unbekannt

< 220>

< 223> Beschreibung von unbekanntem Organismus: Peptid

< 400> 8

< 210> 9

< 211> 23

< 212> PRT

< 213> Unbekannt

< 220>

< 223> Beschreibung von unbekanntem Organismus: Peptid

< 400> 9

< 210> 10

< 211> 20 <

212> PRT

< 213> Unbekannt

< 220>

< 223> Beschreibung von unbekanntem Organismus: Peptid

< 400> 10

< 210> 11

< 211> 17

< 212> PRT

< 213> Unbekannt

< 220>

< 223> Beschreibung von unbekanntem Organismus: Peptid

< 400> 11

< 210> 12

< 211> 21

< 212> PRT

< 213> Unbekannt

< 220>

< 223> Beschreibung von unbekanntem Organismus: Peptid

< 400> 12

< 210> 13

< 211> 34

< 212> PRT

< 213> Unbekannt

< 220>

< 223> Beschreibung von unbekanntem Organismus: Peptid

< 400> 13

< 210> 14

< 211> 400

< 212> PRT

< 213> Unbekannt

< 220>

< 223> Beschreibung von unbekanntem Organismus: Peptid

< 400> 14


Anspruch[de]

Komplex, welcher ein Typ I Interferon (IFN) und eine Untereinheit des menschlichen Interferon α/β-Rezeptors (IFNAR), der in der Lage ist, an das Typ I IFN des Komplexes zu binden, enthält, wobei das Typ I IFN ist:

a) ein natives Typ I IFN;

b) ein Fragment von a), welches die biologische Aktivität des Typ I IFN hat;

c) eine Variante von a) oder b), welche wenigstens 70% Sequenzidentität mit a) oder b) aufweist, und welche die biologische Aktivität des Typ I IFN hat;

d) eine Variante von a) oder b) welche durch eine DNA-Sequenz codiert ist, die an das Komplement der nativen DNA-Sequenz, das für a) oder b) codiert, unter mäßig stringenten Bedingungen hybridisiert, und welche die biologische Aktivität des Typ I IFN hat; oder

e) ein Salz oder funktionelles Derivat von a), b), c) oder d), welches die biologische Aktivität des Typ I IFN hat; und

wobei das IFNAR ist:

f) eine native menschliche IFNAR Polypeptidkette;

g) ein Fragment von f), welches die biologische Aktivität des IFNAR hat;

h) eine Variante von f) oder g), welche wenigstens 70% Sequenzidentität mit a) oder b) aufweist, und welche die biologische Aktivität des IFNAR hat;

i) eine Variante von f) oder g), welche durch eine DNA-Sequenz codiert ist, die an das Komplement der nativen DNA-Sequenz, die für f) oder g) codiert, unter mäßig stringenten Bedingungen hybridisiert, und welche die biologische Aktivität des IFNAR hat; oder

j) ein Salz oder funktionelles Derivat von f), g), h) oder i), welches die biologische Aktivität des IFNAR hat.

2. Komplex nach Anspruch 1, wobei das Typ I IFN durch eine kovalente Bindung an das IFNAR gebunden ist.

3. Komplex nach Anspruch 1, wobei das Typ I IFN durch eine Peptidbindung an das IFNAR gebunden ist.

4. Komplex nach Anspruch 3, wobei das Typ I IFN mittels eines Peptidlinkers mit dem IFNAR verbunden ist.

5. Komplex nach Anspruch 4, wobei der Peptidlinker (GGGGS)n ist, wobei n = 1-5 ist.

6. Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Typ I IFN ein IFNα, ein IFNβ oder ein IFNω ist.

7. Komplex nach Anspruch 5, wobei das Typ I IFN IFNβ ist.

8. Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das IFNAR die Beta-Untereinheit des menschlichen Interferon α/β-Rezeptors (IFNAR2) ist.

9. DNA-Molekül, welches für ein Fusionsprotein nach Anspruch 3, 4 oder 5 codiert.

10. Vektor, welcher ein DNA-Molekül nach Anspruch 9 enthält.

11. Wirtszelle, welche mit einem Vektor nach Anspruch 10 in einer Weise transformiert ist, welche die Expression des Fusionsproteins gestattet.

12. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und einen Komplex nach einen der Ansprüche 1 bis 8 enthält.

13. Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 8, zur Verwendung als Medikament.

14. Komplex nach Anspruch 13, zur Verwendung in antiviraler, anti-Krebs oder Immunmodulations-Therapie.

15. Komplex nach Anspruch 13 oder 14, zur Verwendung zur Verlängerung der in vivo- Wirkung des Typ I IFN in einem Patienten.

16. Medikament, welches ein Typ I Interferon (IFN) enthält und eine Untereinheit des menschlichen Interferon α/β-Rezeptors (IFNAR) zur separaten, simultanen oder sequentiellen Verabreichung an einen Patienten zur antiviralen, anti-Krebs oder Immunmodulations-Therapie, wobei das Typ I IFN ist:

a) ein natives Typ I IFN;

b) ein Fragment von a) welches die biologische Aktivität des Typ I IFN hat.

17. Medikament nach Anspruch 16, wobei das Typ I Interferon (IFN) und das IFNAR separat verabreicht werden und ein Komplex nach den Ansprüchen 1 bis 8 in vivo gebildet wird.

18. Medikament nach Anspruch 16 oder 17, wobei das IFN ein IFNα, ein IFNβ oder ein IFNω ist.

19. Medikament nach Anspruch 18, wobei das IFN IFNβ ist.

20. Medikament nach einem der Ansprüche 16 bis 19, wobei das IFNAR die Beta-Untereinheit des menschlichen Interferon α/β-Rezeptors (IFNAR2) ist.

21. Verwendung des menschlichen Interferon α/β-Rezeptors (IFNAR) in der Herstellung eines Medikaments zur Potenzierung der biologischen Wirkung des Typ I Interferon (IFN), wobei das IFNAR ist:

a) eine native menschliche IFNAR Polypeptidkette;

b) ein Fragment von a), welches die biologische Aktivität des IFNAR hat;

c) eine Variante von a) oder b) welche wenigstens 70% Sequenzidentität mit a) oder b) aufweist, und welche die biologische Aktivität des IFNAR hat;

d) eine Variante von a) oder b) welche durch eine DNA-Sequenz codiert ist, die an das Komplement der nativen DNA-Sequenz, das für a) oder b) codiert, unter mäßig stringenten Bedingungen hybridisiert, und welche die biologische Aktivität des IFNAR hat; oder

e) ein Salz oder funktionelles Derivat von a), b), c) oder d), welches die biologische Aktivität des IFNAR hat.

22. Verwendung des Typ I Interferon (IFN) und einer Untereinheit des menschlichen Interferon α/β-Rezeptors (IFNAR), der in der Lage ist, an das Typ I IFN zu binden, in der Herstellung eines kombinierten Präparats zur simultanen, sequentiellen oder separaten Verabreichung zur Verlängerung der in vivo-Wirkung des Typ I IFN, wobei das Typ I IFN ist:

a) ein natives Typ I IFN;

b) ein Fragment von a) welches die biologische Aktivität des Typ I IFN hat;

c) eine Variante von a) oder b) welche wenigstens 70% Sequenzidentität mit a) oder b) aufweist, und welche die biologische Aktivität des Typ I IFN hat;

d) eine Variante von a) oder b) welche durch eine DNA-Sequenz codiert ist, die an das Komplement der nativen DNA-Sequenz, das für a) oder b) codiert, unter mäßig stringenten Bedingungen hybridisiert, und welche die biologische Aktivität des Typ I IFN hat; oder

e) ein Salz oder funktionelles Derivat von a), b), c) oder d), welches die biologische Aktivität des Typ I IFN hat; und

wobei das IFNAR ist:

f) eine native menschliche IFNAR Polypeptidkette;

g) ein Fragment von f), welches die biologische Aktivität des IFNAR hat;

h) eine Variante von f) oder g) welche eine Sequenzgleichheit mit f) oder g) von zumindest 70% hat und welche die biologische Aktivität des IFNAR hat;

i) eine Variante von f) oder g) welche durch eine DNA-Sequenz codiert ist, die an das Komplement der nativen DNA-Sequenz, das für f) oder g) codiert, unter mäßig stringenten Bedingungen hybridisiert, und welche die biologische Aktivität des IFNAR hat; oder

j) ein Salz oder funktionelles Derivat von f), g), h) oder i), welches die biologische Aktivität des IFNAR hat.

23. Verwendung eines Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zur Verlängerung der in vivo-Wirkung des Typ I IFN.

24. Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins, welches die Kultivierung einer Wirtszelle nach Anspruch 11 und die Gewinnung des dabei exprimierten Fusionsproteins beinhaltet.

25. Verfahren zur Verbesserung der Lagerfähigkeit des Typ I Interferons, welches die Lagerung des Interferons in Form eines Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 8 beinhaltet.







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