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Dokumentenidentifikation DE69429968T2 14.11.2002
EP-Veröffentlichungsnummer 0655624
Titel Kolonne und Kolonnenvorrichtung für Flüssigchromatographie, und Verfahren zum Gebrauch dieser Kolonnenvorrichtung
Anmelder NGK Insulators, Ltd., Nagoya, Aichi, JP
Erfinder Yamada, Saichi, Ichinomiya City, Aichi Pref., JP;
Takeuchi, Hideki, Handa Citym, Aichi Pref., JP;
Yamada, Kazunari, Nagoya City, Aichi Pref., JP;
Majima, Tsuyoshi, Tokai City, Aichi Pref., JP
Vertreter LEINWEBER & ZIMMERMANN, 80331 München
DE-Aktenzeichen 69429968
Vertragsstaaten DE, FR, GB
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 25.11.1994
EP-Aktenzeichen 943087411
EP-Offenlegungsdatum 31.05.1995
EP date of grant 27.02.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 14.11.2002
IPC-Hauptklasse G01N 30/00
IPC-Nebenklasse G01N 30/60   

Beschreibung[de]
Hintergrund der Erfindung (1) Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Säule zur Flüssigkeitschromatographie, die dazu verwendet wird, Materialien, im Speziellen physiologisch aktive Materialien wie Proteine und Peptide, zu trennen und zu reinigen, sowie ein Verfahren zur Verwendung einer solchen Säule.

(2) Verwandter Stand der Technik

Bis dato wurden die physiologisch aktiven Materiale wie Proteine und Peptide üblicherweise mittels Niederdruckchromatographie getrennt und gereinigt. Nach diesem Verfahren wird ein weiches Gel in eine zylinderförmige Glassäule geladen und das gewünschte Material durch spontanen Fluss eines flüssigen Rohmaterials durch das weiche Gel getrennt und gereinigt. Da jedoch dieses System, das auch als offenes System bezeichnet wird, in der Praxis eine lange Zeitspanne zur Trennung und Reinigung erfordert, sind in letzter Zeit Untersuchungen darüber durchgeführt worden, diese Trennung und Reinigung mittels Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) in kürzerer Zeit durchzuführen.

Gemäß kürzlich entwickelter und angewandter Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie wird flüssiges Rohmaterial durch einen körnigen Füllstoff geführt, der in eine schlanke, hochdruckfeste Edelstahlsäule geladen ist, um das gewünschte Material aufzutrennen und zu reinigen. Dennoch wirft die Trennung und Reinigung mit einer solchen Edelstahlsäule folgende Probleme auf. Da (1) sogar die Edelstahlsäule korrodieren kann, kann das flüssige Rohmaterial kontaminiert werden. (2) Da die Edelstahlsäule undurchsichtig ist, kann visuell nicht beobachtet werden, ob sich im Füllstoff Blasen befinden oder nicht oder ob das flüssige Rohmaterial durch den Füllstoff in einem normalen Zustand fließt oder nicht. Deshalb können auch Schwankung oder Verschlechterung der Messergebnisse im Vorfeld von außen nicht verhindert werden. Selbst wenn das Messergebnis relativ breit ausfällt, ist es schwierig, den richtigen Grund dafür zu erkennen. (3) Weiters ist der Druckverlust, wenn die Flüssigkeit durch den Füllstoff in der Säulenvorrichtung fließt, groß, da die konventionelle Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie langwierig und die Korngröße des körnigen, in der Säule geladenen Füllstoffs gering ist. Demgemäß muss das flüssige Rohmaterial der Säule unter hohem Druck zugeführt werden, um die Trennung und Reinigung mit hoher Geschwindigkeit zu bewirken. Aus diesem Grund ist es notwendig, dass die Edelstahlsäule in ausreichendem Maße hochdruckfest ist und dass eine Hochdruckpumpe verwendet wird. Dadurch wird die Ausrüstung aber sehr teuer. (4) Wird die Säulenausrüstung zur Trennung und Reinigung in größerem Umfang im Maßstab vergrößert, so erhöht sich auch das Gewicht der Säule. Somit wird es auch unter dem kostentechnischen Gesichtspunkt schwierig, die Edelstahlsäule anzupassen. (5) Weiters besteht die Möglichkeit, dass zu trennende oder zu reinigende Proteine oder dergleichen bei der Trennung und Reinigung unter hohem Druck deaktiviert wird.

Da andererseits das flüssige Rohmaterial durch eine Membranchromatographievorrichtung fließen kann, die eine Trennmembran unter relativ geringem Druck verwendet, herrscht in einer solchen Membranchromatographievorrichtung nicht einmal bei hoher Durchflussgeschwindigkeit ein hoher Druck. Aus diesem Grund können, da der Grad der Druckfestigkeit in der Membranchromatographievorrichtung im Vergleich zu jenem der Edelstahlsäule reduziert werden kann, auch die Kosten für die Säulenausrüstung gesenkt werden. Allerdings ist ein Teil der Membranchromatographievorrichtung, der zur Adsorption eines Materials fähig ist, bei weitem kleiner als jener des körnigen Füllstoffs in der Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie. Deshalb ist auch der Anteil des gewonnenen Materials gering, obwohl Trennung und Reinigung rasch mit hoher Durchflussgeschwindigkeit erfolgen.

Wird eine anorganische Glassäule zur Abtrennung einer flüssigen aus dem Blut stammenden Arnzei von einem zu behandelnden flüssigen Rohmaterial verwendet, deaktivieren Silanolgruppen im Glas Proteine in der aus dem Blut stammenden Arznei.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung soll die Probleme der oben angeführten Techniken lösen oder zumindest teilweise verringern. Die Erfindung kann frei von Kontaminierung des flüssigen Rohmaterials durch Eisenoxid, etc. Durchgeführt werden, kann auch das Vorhandensein von Bläschen im Füllstoff (Trägerstoff) erlauben, und der Fluss des flüssigen Rohmaterials durch die Säule kann während der Trennung und Reinigung visuell beobachtet werden. Die Säule kann ein geringes Gewicht aufweisen und auch leicht zu installieren sein. Eine Säule zur Flüssigkeitschromatographie gemäß vorliegender Erfindung ist wie in Anspruch 1 dargelegt.

Die folgenden optionalen Merkmale werden als für die Säule zur Flüssigkeitschromatographie gemäß vorliegender Erfindung bevorzugt betrachtet.

(1) Der Kopfteil ist aus einem durchsichtigen oder durchscheinenden Wachs, wobei der Säulenkörper und der Kopfteil jeweils aus einem Material bestehen, das aus Polypropylen, HD-Polyethylen, Polysulfon und Polyvinylchlorid ausgewählt ist.

(2) Ein Stufenabschnitt ist am Umfang jeder der abdichtenden Kontaktflächen des Säulenkörpers und des Kopfteiles vorgesehen, und der Stufenabschnitt des Säulenkörpers steht mit dem des Kopfteils in Eingriff.

(3) Der Kopfteil umfasst einen Flansch mit einem größeren Durchmesser als ein Einsatzabschnitt, der abdichtend an den offenen Endabschnitt des Säulenkörpers eingepasst ist.

(4) Der Einsatzabschnitt des Kopfteils weist Zylinderform auf, wobei ein Gewinde an der äußeren Umfangsfläche des Einsatzabschnitts vorgesehen ist, sowie einen entsprechenden Gewindeabschnitt an einer zylindrischen Innenumfangsfläche des offenen Endes des Säulenkörpers, wobei die beiden Gewindeabschnitte ineinander greifen.

Die Säule zur Hochgeschwindigkeits-Niederdruck-Flüssigkeitschromatographie gemäß vorliegender Erfindung kann so ausgeführt sein, dass ein körniger Füllstoff in die Säulenkammer geladen ist.

Weiters ist das Verfahren zur Trennung und Reinigung eines physiologisch aktiven Materials gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass die oben ausgeführte Säule für eine Hochgeschwindigkeits-Niederdruck-Flüssigkeitschromatographie, umfassend einen körnigen Füllstoff, mit einer Geschwindigkeit vom 50fachen Säulenvolumen/h bis zum 200fachen Säulenvolumen/h unter einem Druck von 0,2 kp/cm² bis 7 kp/cm² verwendet wird.

Das flüssige Rohmaterial fließt durch die Säulenvorrichtung für eine Hochgeschwindigkeits-Niederdruck-Flüssigkeitschromatographie auf die gleiche Weise wie durch eine gewöhnliche Säulenvorrichtung, so dass ein Material wie etwa Protein im flüssigen Rohmaterial an den in die Säulenkammer geladenen Füllstoff adsorbiert wird. Die Säule, die Säulenvorrichtung und das Verfahren, das die Säulenvorrichtung verwendet, zeigen folgende Wirkung.

(1) Da der Säulenkörper und der Kopfteil der Säule für die Hochgeschwindigkeits-Niederdruck-Flüssigkeitschromatographie aus Kunststoff bestehen, nimmt das zu trennende flüssige Rohmaterial nicht Eisenoxid oder dergleichen auf.

(2) Wenn zumindest der Säulenkörper aus dem durchsichtigen oder durchscheinenden Harz besteht, kann sehr leicht von außen festgestellt werden, ob sich Bläschen im in die Säulenkammer des Säulenkörpers geladenen Füllstoff befinden. Aus diesem Grund können, selbst wenn sich Bläschen im Füllstoff befinden, diese sehr leicht dadurch entfernt werden, dass eine Füllspritze an der Einfließöffnung des Säulenkopfabschnitts oder an der Ausfließöffnung des Säulenkörpers angebracht wird, um ein Lösungsmittel, das in der Spritze aufgezogen ist, unter Druck in den Säulenkörper einzufüllen. Demgemäß ist es möglich, das gewünschte Material in ausgezeichneter Weise zu trennen und zu reinigen. Weiters kann auch eine Kontaminierung des Füllstoffs mit solchen Bläschen, wenn der Kopfabschnitt ebenfalls aus durchsichtigem oder durchscheinendem Harz gefertigt ist, effektiver erkannt werden.

(3) Da die Säule und der Kopfteil aus dem Harz bestehen, sind die Säule sowie die Säulenvorrichtung sehr leicht und einfach zu handhaben, so dass die Säule für die Hochgeschwindigkeits-Niederdruck-Flüssigkeitschromatographie sehr einfach an ein Trenn-/Reinigungssystem angepasst werden kann.

(4) Da die Säule und der Kopfteil aus dem Harz bestehen, ist auch eine weniger kostenintensive Herstellung der Säule möglich.

(5) Wenn die Oberfläche des Kopfteils, das dem Innenraum des Säulenkörpers gegenüber freiliegt, konisch und axial nach außen verjüngt geformt ist, können Bläschen, die sich in den Füllstoff einmischen, sehr leicht aus der Säule entfernt werden.

(6) Der druckfeste Ring ist um die Außenseite eines Abschnitts des Säulenkörpers, an den der Kopfteil angepasst ist, mit Presssitz aufgepasst. Der druckfeste Ring verhindert, dass sich der Säulenkörper unter dem in der Säulenkammer herrschenden Innendruck radial nach außen ausdehnt. Demgemäß können ein Bruch der Säule und ein Auslecken der Flüssigkeit effektiv verhindert werden.

(7) Weist die Säulenkammer zylindrische Form auf und ist das Verhältnis zwischen Achsenlänge und Durchmesser der Säulenkammer mit nicht über 2 festgelegt, kann physiologisch aktives Material, wie z.B. Proteine, effektiv mit hoher Geschwindigkeit und unter geringem Druck getrennt und gereinigt werden.

(8) Besteht die Säule aus dem Säulenkörper, in welchem eine zylindrische Außenumfangsfläche und eine zylindrische Innenumfangsfläche die Säulenkammer bilden, kann die Produktivität der Säule noch weiter gesteigert werden.

Diese und andere optionalen Merkmale und Vorteile der Erfindung werden nach Lektüre der nachfolgenden Beschreibung der Erfindung in Kombination mit den beigefügten Zeichnungen klar erkannt werden, wobei es sich versteht, dass einige Modifikationen, Änderungen und Variationen derselben von Fachleuten auf dem Gebiet der Technik, dem die Erfindung angehört, vorgenommen werden könnten.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Zum besseren Verständnis der Erfindung wird auf die beiliegenden Zeichnungen Bezug genommen, worin:

Fig. 1 eine Schnittansicht einer Ausführungsform der Säule für die Hochgeschwindigkeits-Niederdruck-Flüssigkeitschromatographie gemäß vorliegender Erfindung in zerlegtem Zustand ist;

Fig. 2 eine Schnittansicht der Ausführungsform der Säule für die Hochgeschwindigkeits- Niederdruck-Flüssigkeitschromatographie der vorliegenden Erfindung aus Fig. 1 in zusammengebautem Zustand ist;

Fig. 3 eine Schnittansicht einer weiteren Ausführungsform der Säule für die Hochgeschwindigkeits-Niederdruck-Flüssigkeitschromatographie gemäß vorliegender Erfindung in zusammengebautem Zustand ist;

Fig. 4 eine schematische Darstellung eines Trennungs-/Reinigungssystems ist, das mit einer Säulenvorrichtung für die Hochgeschwindigkeits-Niederdruck-Flüssigkeitschromatographie, wie in den Fig. 1 und 2 gezeigt, arbeitet;

Fig. 5 ein Diagramm ist, das die Beziehung zwischen Elutionszeit und dem gemessenen Ausmaß an UV-Strahlung im Antikörper-Trennungstest Nr. 1 veranschaulicht;

Fig. 6 ein Diagramm ist, das die Beziehung zwischen Elutionszeit und dem gemessenen Ausmaß an UV-Strahlung veranschaulicht, wenn Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Säule für die Hochgeschwindigkeits-Niederdruck-Flüssigkeitschromatographie gemäß vorliegender Erfindung durchgeführt wurde;

Fig. 7 ein Diagramm ist, das die Beziehung zwischen Elutionszeit und dem gemessenen Ausmaß an UV-Strahlung veranschaulicht, wenn die Überstandsflüssigkeit einer Serumkultur unter Verwendung einer Säule für die Hochgeschwindigkeits-Niederdruck-Flüssigkeitschromatographie gemäß vorliegender Erfindung getrennt und gereinigt wurde;

Fig. 8 ein Diagramm ist, das die Beziehung zwischen Elutionszeit und dem gemessenen Ausmaß an UV-Strahlung veranschaulicht, wenn Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung einer Säule für die Hochgeschwindigkeits-Niederdruck-Flüssigkeitschromatographie gemäß vorliegender Erfindung durchgeführt wurde.

Detaillierte Beschreibung von Ausführungsformen

Als durchsichtige oder durchscheinende Harze für die Verwendung für den zylindrischen Säulenkörper und den Kopfabschnitt der Säule gemäß vorliegender Erfindung können Polypropylen, HD-Polyethylen, Polysulfon und Polyvinylchlorid erwähnt werden. Davon wird Polypropylen als bevorzugt angesehen. Die Dicke des Säulenkörpers und des Kopfes können in Hinblick auf Trennungs- und Reinigungsdruck sowie die Art der verwendeten Materialien, etc. richtig festgelegt werden. Der hierin verwendete Terminus "Harz" umfasst "Kunststoffe".

Um die Existenz von Bläschen mit einem Durchmesser von nicht weniger als 1 mm von außerhalb der Säulenvorrichtung visuell beobachten zu können, beträgt die lineare Lichtdurchlässigkeit der Säule vorzugsweise nicht weniger als 8%. Im Fall von durchscheinendem Polypropylenharz ist es erwünscht, dass die lineare Lichtdurchlässigkeit 2% oder mehr und die Dicke nicht mehr als 6 mm beträgt, so dass der Fluss der Flüssigkeit durch die Säulenvorrichtung von außen visuell beobachtet werden kann, doch wenn die lineare Lichtdurchlässigkeit nicht weniger als 8% oder mehr beträgt, so können Bläschen mit einem Durchmesser von 1 mm oder mehr von außerhalb der Säule visuell beobachtet werden. In diesem Fall weist das Harz eine Dicke von nicht mehr als 3 mm auf.

Eine Säulenkammer ist innerhalb des zylindrischen Säulenkörpers ausgebildet. Die Form der Säulenkammer ist im Allgemeinen zylindrisch angelegt. Solange die Flüssigkeit jedoch mit Sicherheit einheitlich durch die Säulenkammer fließt, ist die Säulenkammer nicht notwendigerweise auf die zylindrische Form beschränkt. Um einen gleichmäßigen Fluss des flüssigen Rohmaterials durch die Säule zu ermöglichen und die Entfernung von Bläschen zu erleichtern, ist die innere Form des Säulenkörpers an der Seite der Ausfließöffnung vorzugsweise konisch mit einer Ausfließöffnung als Scheitelpunkt ausgebildet.

Die passende Konfiguration sowie die Dimensionen des zylindrischen Säulenkörpers und des Kopfabschnitts werden in Hinblick auf Trennungs- und Reinigungsdruck geeignet festgelegt. Wenn der Kopfabschnitt z.B. einen Abschnitt mit einem großen Durchmesser und einen Einsatzabschnitt, der sich axial von dem Abschnitt mit dem großen Durchmesser weg erstreckt, umfasst und der Einsatzabschnitt abdichtend in den offenen Endabschnitt des Säulenkörpers eingepasst ist, ist der Außendurchmesser des Außenumfangsabschnitts des Einsatzabschnitts ein wenig größer als der Innendurchmesser der Innenumfangsfläche des offenen Endabschnitts des Säulenkörpers. Der Außendurchmesser des Außenumfangsabschnitts des Einsatzabschnitts und die eingesetzte (mit Presssitz angepasste) Länge des Einsatzabschnitts im offenen Endabschnitt sind so festgelegt, dass der einsetzende Abschnitt, wenn er in den offenen Endabschnitt des Säulenkörpers eingepasst wird, seine Position im offenen Endabschnitt gegen einen gegebenen Innendruck beibehält.

Ein Paar von stromauf und stromab angeordneten Filtern ist aus einem porösen Harzmaterial, wie z.B. Teflon, hergestellt und weist jeweils einen Außendurchmesser auf, der geringfügig größer ist als der Innendurchmesser der Säulenkammer. Die Filter werden abdichtend innerhalb der Säulenkammer eingepasst.

Der Füllstoff wird in die Säulenkammer zwischen den stromauf- und -abwärtigen Filtern innerhalb der Säule unter Verwendung einer Säule für die Hochgeschwindigkeits-Niederdruck-Flüssigkeitschromatographie gemäß vorliegender Erfindung geladen. Als solche Füllstoffe können z.B. verschiedene Chromatographieträger, wie etwa Träger für die Ionenaustauschchromatographie, Träger für die Hydrophobchromatographie, Träger für die Umkehrphasen-Chromatographie und Träger für die Affinitätschromatographie, erwähnt werden. Erfolgt die Trennung und Reinigung bei hoher Durchflussgeschwindigkeit, wird der Träger für die Hochgeschwindigkeits-Affinitätschromatographie, der ein poröses Polymer oder Silikon als Material verwendet und über eine große Härte und eine hohe Adsorptionskapazität verfügt, verwendet. Dieser Träger ermöglicht eine Trennung selbst bei einer Durchflussgeschwindigkeit vom 50- bis 200fachen Säulenvolumen/h mit einer hohen Ausbeute und ohne wesentliche Verluste und weist eine Adsorptionsfähigkeit von nicht weniger als 10 mg IgG/ml (Gel) im Falle eines Antikörpers (Mäuse-IgG bei 10% Durchbruch). Ist die Durchflussgeschwindigkeit geringer als das 200fache Säulenvolumen/h, nimmt die Leistungsfähigkeit stark ab. Vom Standpunkt aus, dass das flüssige Rohmaterial durch den Träger mit einer hohen Geschwindigkeit ohne größeren Druckverlust fließen sollte, liegt der Korndurchmesser des in dieser Erfindung verwendeten Trägers vorzugsweise bei 20-50 um.

Als Füllstoff kann ein Material aus vernetzten Copolymeren von Styrol mit Divinylbenzol, das Körner mit relativen großen oder dicken Löchern (Durchgangsporen) und vielen kleinen und dünnen Poren (Adsorptionsporen), die von den großen oder dicken Poren abzweigen (siehe Fig. 8a), umfasst, verwendet werden. Als ein solches Material kann z.B. ein Füllstoff verwendet werden, der unter dem Namen PorosTM Gel von PerSeptive Biosystems (USA) hergestellt wird und im Handel erhältlich ist. Dieses PorosTM Gel kann als Gel für die Perfusionschromatographie verwendet werden. Weiters kann als oben angeführter Füllstoff auch ein Verbundstrukturmaterial verwendet werden, in welchem ein Hydrogel mit Adsorptionsgruppen in ein Polystyrolnetzwerk eingefüllt ist. Als derartiges Material kann ein Füllstoff verwendet werden, der eine starre Verbundmatrix aufweist und unter dem Namen Hyper DTM Gel von Biosepra Inc. (USA) hergestellt wird und im Handel erhältlich ist. Hyper DTM Gel kann als Gel für die Hyperdiffusionschromatographie verwendet werden. In der folgenden Tabelle werden PorosTM Gel und Hyper DTM Gel als Beispiele angeführt.

POROS Medien basieren auf einer stark vernetzten Polystyrol/Divinylbenzol-Trägermatrix, die über hohe mechanische Festigkeit und exzellente Beständigkeit gegen eine Vielzahl von Lösungsmitteln und Chemikalien, einschließlich pH 1-14, verfügt. Um eine biologisch verträgliche Umgebung für empfindliche biologische Moleküle zu schaffen, wird diese Basis daraufhin mit einem vernetzten Polymer beschichtet, wodurch eine einheitliche ladungsneutrale Oberfläche mit hohen Konzentrationen an Hydroxylgruppen gebildet wird. Diese hydrophile Oberflächenbeschichtung ist weiters auch chemisch hochresistent und fungiert als verlässliche Plattform zur Derivatisierung mit einer Vielzahl funktioneller Gruppen.

Das sich daraus ergebende chromatographische Teilchen verfügt über volle mechanische und chemische Beständigkeit, reagiert ohne nichtspezifische Adsorption, ist für Proteine nicht denaturierend und sorgt für gesteigerte Wiederfindung von biologischer Aktivität.

Tabelle 1 Vergleich von Protein A Gelen

Messbedingungen: Durchflussgeschwindigkeit ... 60 cm/h

IgG-Konzentration ... 1 mg/ml

Als Adsorptionslösungsmittel und Waschlösemittel kann in der vorliegenden Erfindung z.B. eine Pufferlösung mit einem hohen Anteil eines Salzes mit einer hohen Konzentration an Natriumchlorid, Natriumsulfat oder dergleichen verwendet werden. So wurden z.B. die Antikörper kürzlich in industriellem Maßstab als Diagnosearzneien fraktioniert. Soll ein Mäuse-IgG1-Antikörper mit einem Träger für die Affinitätschromatographie, welcher ein Protein A als Liganden verwendet, getrennt werden, so wird ein Lösungsmittel mit einer hohen Viskosität (1,5 M Glycin + 3 M NaCl, pH 8,9) als Adsorptionspufferlösung verwendet. Was das Elutionslösemittel betrifft, so wird das gewünschte Material mit einer Pufferlösung eluiert, die in vielen Fällen eine hohe Salzkonzentration aufweist. In diesen Fällen wird die Pufferlösung mit einer hohen Salzkonzentration auch als Elutionslösung im Falle von Ionenaustausch-Chromatographie und Affinitätschromatographie verwendet.

Eine Vielzahl von Materialien kann unter Verwendung der Säule für die Hochgeschwindigkeits-Niederdruck-Flüssigkeitschromatographie gemäß vorliegender Erfindung aufgetrennt und gereinigt werden. Als Materialien, die vorteilhaft aufgetrennt und gereinigt werden, können z.B. verschiedene Proteine wie etwa Blutgerinnungsfaktoren, rekombinante Proteine, Antikörperproteine und Zuckerproteine erwähnt werden.

(Ausführungsformen)

Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezug auf die in den beiligenden Zeichnungen dargestellten Ausführungsformen detaillierter beschrieben.

Die Fig. 1 und 2 sind Schnittansichten einer Ausführungsform der Säulenvorrichtung für die Hochgeschwindigkeits-Niederdruck-Flüssigkeitschromatographie gemäß vorliegender Erfindung. In einen zylindrischen Säulenkörper 1 aus durchsichtigem oder durchscheinendem Harz ist ein Teil eines zylindrischen Kopfabschnitts 2, der ebenfalls aus durchsichtigem oder durchscheinendem Harz besteht, in einen offenen Endabschnitt 3 des Säulenkörpers 1 eingesetzt. Der zylindrische Säulenkörper 1 hat eine Form, die der eines Spitzenabschnittes eines Injektors ähnelt, und weist eine Dicke "e1" von 0,5 mm oder mehr auf. Ein Ende des Säulenkörpers ist bei 3 geöffnet, und das andere Ende ist zu einer Trichterform mit einer dünnen Ausfließöffnung 4 gedrosselt. Der Kopfabschnitt 2 umfasst einen Abschnitt mit einem großen Durchmesser 5 und einen Einsatzabschnitt 6, der sich axial von einem zentralen Abschnitt des Abschnitts mit großem Durchmesser 5 weg erstreckt. Der Einsatzabschnitt 3 weist einen Außendurchmesser auf, der beinahe gleich dem, aber doch ein wenig größer ist als der Innendurchmesser des offenen Endabschnitts 3 des zylindrischen Säulenkörpers 1. Wie in Fig. 2 dargestellt ist der Einsatzabschnitt 6 innig und abdichtend in den offenen Endabschnitt 3 des zylindrischen Säulenkörpers 1 eingesetzt. Ein zentraler Abschnitt des Kopfabschnitts 2 ist mit einem Durchgangsloch A versehen, das mit dem Außen- und Innenraum des Säulenkörpers 1 kommuniziert. Der Einsatzabschnitt 6 des Kopfabschnitts 2 steht fest mit der Innenumfangsfläche des zylindrischen Säulenkörpers 1 über seine gesamte Außenumfangsfläche in Eingriff, so dass eine breite Kontaktfläche zwischen den beiden garantiert ist. Die Unterfläche des Abschnitts mit dem großen Durchmesser 5 steht mit der Endfläche des offenen Endabschnitts 3 des Säulenkörpers 1 in Kontakt. Wie in Fig. 2 abgebildet wird der Kopfabschnitt 2 in den zylindrischen Säulenkörper 1 eingepasst und bildet dabei eine Säulenkammer 7 innerhalb des zylindrischen Säulenkörpers 1 aus. Ein Filterpaar 8, 8' ist an den gegenüberliegenden Enden der Säulenkammer 7 eingepasst, und ein körniger Füllstoff 9 für die Hochgeschwindigkeits-Niederdruck-Flüssigkeitschromatographie wird zwischen das Filterpaar 8, 8' geladen.

Nachdem der Kopfabschnitt 2 in den zylindrischen Säulenkörper 1 eingepasst ist, wird ein druckfester Ring 10 um einen Abschnitt des Außenumfangs des Säulenkörpers 1, in welchen der Einsatzabschnitt 6 des Kopfabschnitts 2 eingepasst ist, herum aufgepasst. Der Außendurchmesser des Abschnitts mit dem großen Durchmesser 5 des Kopfabschnitts 2 ist größer ausgeführt als der R1 des Säulenkörpers, so dass der Ring 10 stabil um den Säulenkörper 1 herum gehalten wird, während der Ring gegen die Unterfläche des Abschnitts mit dem großen Durchmesser 5, die sich radial vom Säulenkörper 1 nach außen erstreckt, gedrückt wird. Der druckfeste Ring 10 verhindert, dass sich der zylindrische Säulenkörper 1 aufgrund des Innendrucks im Inneren des Säulenkörpers 1 ausdehnt. Der Innendurchmesser R2 des druckfesten Rings 10 ist geringfügig kleiner als der Außendurchmesser R1 des zylindrischen Säulenkörpers 1. Obwohl dies natürlich von den verwendeten Materialien abhängt, kann das Auslecken der Flüssigkeit aus der Säule effektiv dadurch verhindert werden, dass die Differenz zwischen R1 und R2 z.B. 0,4 mm bis 0,6 mm beträgt. Der druckfeste Ring 10 verstärkt den zylindrischen Säulenkörper 1 und den Kopfabschnitt 2, so dass die Säule einem gegebenen Innendruck standhalten kann. Der Einsatzabschnitt 6 steht mit dem Innenumfangsabschnitt des zylindrischen Säulenkörpers über die gesamte Breite der Außenumfangsfläche in sehr engem Kontakt, um somit eine große Kontaktfläche zu gewährleisten. Um eine Druckfestigkeit von 7 kg/cm² zwischen dem Säulenkörper 1 und dem Einsatzabschnitt 6 zu ergeben, wird die Länge L1 des Einsatzabschnitts 6 mit 4 mm oder mehr festgelegt. Die Länge des Einsatzabschnitts 6 kann in Hinblick auf den gewünschten Innendruck genau festgesetzt werden.

Der Säulenkörper 1 und der Kopfabschnitt 2 bestehen jeweils aus einem Material mit großer Festigkeit und Härte, das gegen in der Chromatographie verwendete Säuren oder Basen beständig, hitzebeständig gegen Temperaturen für die Sterilisation im Autoklaven sowie so durchsichtig oder durchscheinend ist, dass es möglich ist, das Innere der Säule von außen zu beobachten. Das Material darf nicht mit der zu behandelnden Flüssigkeit reagieren. Wenn ein physiologisches Material, wie z.B. Proteine, getrennt und gereinigt wird, müssen die Materialien für den Säulenkörper und Kopfabschnitt Materialien sein, die nicht mit den physiologischen Materialien reagieren.

Als Harze, die die oben angeführten Erfordernisse erfüllen, werden z.B. vorzugsweise thermoplastische Harze wie Polypropylen, HD-Polyethylen, Polysulfon und/oder Polyvinylchlorid verwendet. In dieser Ausführungsform bestehen der zylindrische Säulenkörper 1 und der Kopfabschnitt 2 aus Polypropylen. Andererseits ist das Material des druckfesten Rings 10 auf kein bestimmtes Material beschränkt. Ist der druckfeste Ring 10 aus Harz, so muss das Harz Festigkeit und Härte aufweisen. Unter dem obigen Gesichtspunkt wird Polyvinylchlorid für den druckfesten Ring 10 in dieser Ausführungsform verwendet. Besteht der druckfeste Ring 10 aus Polyvinylchlorid, werden die Breite L2 und die Dicke e2 des druckfesten Rings 10 mit 3 mm oder mehr bzw. 3 mm oder mehr festgelegt. Die Filter 8, 8' bestehen aus einem porösen Material wie Teflon, das sehr schwer Protein oder dergleichen adsorbiert und eine Reihe von Poren aufweist, die die Flüssigkeit und die Lösung durchfließen lassen, dem körnigen Füllstoff jedoch den Durchgang verwehren. Als körniger Füllstoff 9 können eine Vielzahl von Chromatographieträgern, so etwa Träger für die Ionenaustauschchromatographie, Träger für die Hydrophobohromatographie, Träger für die Umkehrphasen-Chromatographie und Träger für die Affinitätschromatographie, verwendet werden. Damit die Trennung und Reinigung bei einer hohen Durchflussgeschwindigkeit erfolgt, wird ein hartes Gel aus einem Material wie einem porösen Polymer oder aus Silicamaterial verwendet. In Hinblick auf einen Durchfluss mit einem niedrigen Druckverlust bei einer hohen Durchflussgeschwindigkeit beträgt die Korngröße des Trägers vorzugsweise zwischen 20 um bis 50 um.

In dieser Ausführungsform ist die Säulenkammer 7 in einem niedrigen Seitenverhältnis ausgeführt, worin das Verhältnis zwischen axialer Länge L und Durchmesser D2 oder weniger beträgt. Durch diese Konstruktionsweise kann der Druckverlust auf ein niedriges Niveau gedrückt werden, sogar wenn die Flüssigkeit die Säule mit hoher Durchflussgeschwindigkeit durchfließt. Aus diesem Grund muss kein hoher Druck während des Durchflusses der Flüssigkeit durch die Säule angewendet werden. Als Konsequenz daraus können Bruch des zylindrischen Säulenkörpers 1 und des Kopfabschnitts 2, die aus dem/den Harzen bestehen, wie auch ein Auslecken der Flüssigkeit verhindert werden.

Fig. 3 zeigt eine weitere Ausführungsform der Hochgeschwindigkeits-Niederdruck-Flüssigkeitschromatographie gemäß vorliegender Erfindung, wobei diese Ausführungsform abgesehen von den Konfigurationen des Säulenkörpers und des Kopfabschnitts dieselbe ist wie jene der Fig. 1 und 2. In der Säulenvorrichtung in Fig. 3 ist ein Stufenabschnitt an jeder der entsprechenden Kontaktaußen- und Kontaktinnenumfangsflächen des Säulenkörpers 1 bzw. des Kopfabschnitts 2 vorgesehen, und die Stufenabschnitte stehen miteinander im Eingriff, um dadurch effektiv das Auslecken der Flüssigkeit durch die Kontaktfläche zwischen dem Säulenkörper 1 und dem Kopfabschnitt 2 zu verhindern.

Fig. 4 gibt ein Beispiel für ein Trennungs-/Reinigungssystem, das eine Säulenvorrichtung für die Hochgeschwindigkeits-Niederdruck-Flüssigkeitschromatographie gemäß vorliegender Erfindung (Hochgeschwindigkeits-Niederdruck-Flüssigkeitschromatographiesystem von Millipore Inc. unter dem Namen Consep LC100 hergestellt) verwendet. Eine Probenflüssigkeit in einer Spritze 31 wird in ein Mischgefäß 32 eingefüllt, und eine Pufferflüssigkeit oder Waschflüssigkeit in einer Flasche 34A, 34B, 34C, 34D wird dem Mischgefäß 32 zugeführt. Im Mischgefäß 32 wird der Puffer in die Probenflüssigkeit eingemischt. Das resultierende Flüssigkeitsgemisch wird daraufhin der Säulenvorrichtung zugeführt, und ein zu trennendes Material wird an den Füllstoff adsorbiert. Das gewünschte Material wird getrennt, gereinigt und in einer Vorlageflasche 35A, 35B, 35C, etc. gesammelt, indem zwischen der Zufuhr von Pufferflüssigkeit und Waschflüssigkeit gewechselt wird. 36 ist eine UV-Zelle, und eine CPU 37 steuert den Betrieb der Pumpe, die Zufuhr der Pufferflüssigkeit, den Betrieb der UV-Zelle und das Wechseln der Vorlageflasche entsprechend einem gegebenen Programm. Ein Aufzeichnungsgerät 38 zeigt die von der UV-Zelle 36 gemessenen Resultate an und zeichnet diese auf. Im Trennungs-/Reinigungssystem ist die Säulenvorrichtung für die Hochgeschwindigkeits-Niederdruck-Flüssigkeitschromatographie gemäß vorliegender Erfindung in einer seitlichen Richtung angebracht, die Säulenvorrichtung kann aber auch in einer vertikalen Ausrichtung, in einer schrägen oder in einer reversierten vertikalen Richtung montiert sein.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Trennung und Reinigung eines physiologischen Materials, wie z.B. von Proteinen, bei hoher Durchflussgeschwindigkeit unter hohem Druck. Für diesen Zweck wird eine Zahnradpumpe oder eine Walzenpumpe (Fördergeschwindigkeit: 3 Liter/min) verwendet. So muss die Durchflussgeschwindigkeit einer Zahnradpumpe, die im Hochgeschwindigkeits-Niederdruck-Flüssigkeitschromatographiesystem Consep LC100 (Millipore Inc.) verwendet wird, bezogen auf den Druck gesteuert werden. In dieser Pumpe ist eine hohe Durchflussgeschwindigkeit von bis zu 50 ml/min erreichbar, und die Druckverlustgrenze wird bei 7 kp/cm² unter einem quantitativen Gesichtspunkt der Durchflussgeschwindigkeit festgesetzt. Um die Proteine zu trennen und zu reinigen, wird der Druck vorzugsweise bei nicht mehr als 7 kp/cm² festgesetzt. Andererseits wird die Durchflussgeschwindigkeit unter dem Gesichtspunkt des praktischen Trennungs- und Reinigungsbetriebs festgelegt, und von der Konfiguration der Säule wird gefordert, dass diese dem niedrigen Druck und der praktischen Durchflussgeschwindigkeit entspricht.

Experimente: Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung detaillierter mit Bezug auf die folgenden Experimente erklärt.

Test Nr. 1: Antikörpertrennung

Eine Säulenvorrichtung für die Hochgeschwindigkeits-Niederdruck-Flüssigkeitschromatographie gemäß vorliegender Erfindung wurde in ein System für eine Hochgeschwindigkeits-Niederdruck-Flüssigkeitschromatographie, wie in Fig. 3 dargestellt, eingesetzt. Ein Antiserum, 250 ul, vorab mit einem Filter mit Poren von nicht mehr als 0,8 um filtriert, wurde durch eine Säulenvorrichtung mit einer Durchflussgeschwindigkeit des 80- fachen Säulenvolumens/h (4 ml/min) geführt und an einen Füllstoff adsorbiert. Danach wurde die Säulenvorrichtung gewaschen, in dem eine Waschflüssigkeit (20 mM Phosphatpuffer, pH 7,4) 12 Minuten lang durch die Säulenvorrichtung laufen gelassen wurde, und im Anschluss daran wurde der an den körnigen Füllstoff adsorbierte Antikörper (IgG) eluiert, indem eine Elutionsflüssigkeit (0,1 M Citronensäure + 0,15 M NaCl, pH 4) 10 Minuten lang die Säulenvorrichtung passierte. Die Inhaltsstoffe, die in der aus der Säule eluierten Flüssigkeit enthalten waren, wurde mit einem UV-Detektor gemessen, wodurch die grafische Darstellung aus Fig. 5 erhalten wurde. Aus diesem Diagramm ist abzulesen, dass der Antikörper (IgG) exzellent adsorbiert und eluiert wurde. Als körniger Füllstoff wurde ein Träger für die Hochgeschwindigkeits-Affinitätschromatographie nass in die Säulenkammer geladen. In diesem Träger für die Affinitätschromatographie wurde Kieselgel mit einem mittleren Durchmesser von 30 um als Trägermaterial und Protein A als Ligand verwendet. Die Flüssigkeit wurde in folgender Reihenfolge durch die Säulenvorrichtung geführt: Einfließöffnung des zentralen Abschnitts des Kopfabschnitts, Säulenkammer und Ausfließöffnung im zylindrischen Säulenkörper. Ein Eichtest vor dem Durchfluss des Antiserum enthüllte, dass im Fall von 4 ml/min (80faches Säulenvolumen/h) im Inneren der Säulenkammer ein Druck von 3 kp/cm² erzeugt wurde.

Die maximale Durchflussgeschwindigkeit der im verwendeten Chromatographiesystem angeordneten Zahnradpumpe betrug 50 ml/min. und der Trenn- und Reinigungsvorgang wurde bei einer Durchflussgeschwindigkeit des 80fachen Säulenvolumens/h durchgeführt. In diesem Fall kann eine Säule mit einem Säulenvolumen von bis zu 37,5 ml in das System eingepasst werden. Die Menge des körnigen Füllstoffes kann bezogen auf das Adsorptionsvolumen des körnigen Füllstoffs und die Menge (Behandlungsmenge) des in der zu behandelnden Flüssigkeit enthaltenen gewünschten Materials selektiv festgelegt werden. In diesem Test betrug die Menge des Füllstoffes etwa 1 ml. Um die Reinigungszeit mit 30 Minuten festzusetzen, wurde eine Säule verwendet, in welcher das Volumen der Säulenkammer auf 3 ml festgelegt war, das Verhältnis der Länge zum Durchmesser der Säulenkammer lag bei 0,6. Der Außendurchmesser R1 des zylindrischen Säulenkörpers betrug 23 mm, der Innendurchmesser des druckfesten Rings 22,57 mm, die Länge L des Einsatzabschnittes des Kopfabschnitts 10 mm, und die Durchmesser der Einfließ- und Ausfließöffnung lagen bei 4 mm bzw. 2 mm.

Trennungstests Nr. 2 bis 4

Probe: Mäuse-Bauchwasser (Mäuse-IgG1), 7,5 mg IgG (25 ml)

Verwendete Säule: Säulenkammervolumen 20 ml, Säulenkammerlänge/Durchmesser: 1,46, Protein A-Kunststoffsäule (Gel 20 ml, 26 · 38 mm Länge)

Durchflussgeschwindigkeit: Adsorption ... 20 ml/min (60faches Säulenvolumen/h)

Waschung ... 20 ml/min (60faches Säulenvolumen/h) · 20 Minuten

Elution ... 10 ml/min (30faches Säulenvolumen/h)

Puffer: Adsorptions-/Waschflüssigkeit ... 1,5 M Glycin + 3 M NaCl (pH 8,9)

Elutionsflüssigkeit ... Phosphorsäure-Citronensäure-Kautschuklösung (pH 6)

Reinigungszeit: 25 Minuten

Ausbeute: 96% (189,4 mg Mäuse-IgG)

Trennungstest Nr. 3: Reinigung im Verfahrensmaßstab

Probe: Überstandsflüssigkeit (Mäuse-IgGI), 0,73 mg/ml (400 ml)

Verwendete Säule: Säulenkammervolumen 50 ml, Säulenkammerlänge/Durchmesser: 1,0, Protein A-Kunststoffsäule (Gel 50 ml, 40 · 40 mm Länge)

Durchflussgeschwindigkeit: Adsorption ... 50 ml/min (60faches Säulenvolumen/h)

Waschung... 50 ml/min (60faches Säulenvolumen/h) · 10 Minuten

Elution ... 20 ml/min (24faches Säulenvolumen/h)

Puffer: Adsorptions-/Waschflüssigkeit ... 1,5 M Glycin + 3 M NaCl (pH 8,9)

Elutionsflüssigkeit ... Phosphorsäure-Citronensäure-Kautschuklösung (pH 6)

Reinigungszeit: 45 Minuten

Ausbeute: 95% (277,4 mg Mäuse-IgG)

Trennungstest Nr. 4: Ionenaustausch-Chromatographie

Probe: Gemisch aus Ovalbumin und Rinderalbumin (verwendete Menge jeweils: 1 mg)

Verwendete Säule: Säulenkammervolumen 5 ml, Säulenkammerlänge/Durchmesser: 0,8, Poros® 20HQ (starker Anionenaustauscher), Druckverlust 6 kp/cm²

Durchflussgeschwindigkeit: Adsorption ... 10 ml/min (120faches Säulenvolumen/h)

Waschung ... 10 ml/min (120faches Säulenvolumen/h) · 2 Minuten

Elution ... 10 ml/min (120faches Säulenvolumen/h)

Puffer: Adsorptions-/Waschflüssigkeit... 50 mM Tris-HCl (pH 8,5)

Elutionsflüssigkeit ... 50 mM Tris-HCl + 0,5 M NaCl (pH 8,5)

Reinigungszeit: 8 Minuten

Ausbeute: 96% (Ovalbumin), 95% (Rinderalbumin; BSA)


Anspruch[de]

1. Säule zur Flüssigkeitschromatographie, umfassend einen rohrförmigen Körper (1) aus einem Harz, mit einem ersten offen Ende (3) und einem zweiten Ende, das eine Flüssigkeitsausfließöffnung (4) aufweist, wobei ein Kopfteil (2) aus Harz abnehmbar in das genannte erste Ende (3) des rohrförmigen Körpers eingepasst ist und eine Flüssigkeitseinfließöffnung (A) aufweist, die durch ihn hindurchgeht, wobei der rohrförmige Körper und der Kopfteil miteinander eine Säulenkammer definieren, und zwei Filter (8, 8') in dem rohrförmigen Körper dazu dienen, bei Gebrauch zwischen einander einen körnigen Füllstoff einzuschließen, dadurch gekennzeichnet, dass dort, wo der Kopfteil (2) im Inneren eingepasst ist, um die Außenseite des rohrförmigen Körpers herum ein druckfester Ring (10) aufgepasst ist, und wobei der Ring (10) die Ausdehnung des rohrförmigen Körpers unter dem Einfluss der sich innerhalb des Rohrkörpers befindlichen Flüssigkeit verhindert.

2. Säule nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Ring (10) mit Presssitz auf den rohrförmigen Körper (1) aufgepasst ist.

3. Säule nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass in seinem unaufgepassten Zustand der Innendurchmesser des Rings (10) kleiner ist als der Außendurchmesser des rohrförmigen Körpers (1) auf dem der Ring aufgepasst wird.

4. Säule nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der rohrförmige Körper (1) und der Kopfteil (2) jeweils aus durchsichtigem oder durchscheinendem Harz bestehen, das aus Polypropylen, Polyethylen hoher Dichte, Polysulfon und Polyvinylchlorid ausgewählt ist.

5. Säule nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass an jeder der abdichtenden Kontaktflächen des rohrförmigen Körpers (1) und des Kopfteils (2) ein umlaufender Stufenabschnitt vorgesehen ist, und der Stufenabschnitt des Körpers (1) mit dem des Kopfteils (2) (Fig. 3) im Angriff steht.

6. Säule nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Kopfteil (2) einen Flansch (5) größeren Durchmessers als ein Einsatzabschnitt (6) aufweist, der in das offene Ende des rohrförmigen Körpers abdichtend eingepasst ist.

7. Säule nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Einsatzabschnitt (6) des Kopfteils eine Zylinderform aufweist, wobei ein Gewinde an einer äußeren Umfangsfläche des Einsatzabschnittes vorgesehen ist, sowie ein korrespondierendes Gewinde an einer zylindrischen Umfangsinnenfläche des offenen Ende des rohrförmigen Körpers (1) vorgesehen ist, sowie die beiden Gewinde ineinander eingreifen.

8. Säule nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Säulenkammer eine zylindrische Form aufweist und das Verhältnis Axiallänge/Durchmesser der Säulenkammer nicht größer als 2 ist.

9. Säule nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass in die Säulenkammer ein körniger Füllstoff eingepackt ist.

10. Verfahren zum Auftrennen und Reinigen eines physiologisch aktiven Materials durch Flüssigchromotographie unter Verwendung der Säule nach Anspruch 9 mit einer Geschwindigkeit vom 50fachen Säulenvolumen/h bis zum 200fachen Säulenvolumen/h bei einem Druck von 20 kPa (0,2 kp/cm²) bis 700 kPa (7 kp/cm²).







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