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Dokumentenidentifikation DE69711733T2 14.11.2002
EP-Veröffentlichungsnummer 0786666
Titel Verbesserter Test für Aminoglykosid-Antibiotika
Anmelder F. Hoffmann-La Roche AG, Basel, CH
Erfinder Cheng, Charles Minnan, Bridgewater, New Jersey 08807, US
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69711733
Vertragsstaaten DE, FR, IT
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 17.01.1997
EP-Aktenzeichen 971007307
EP-Offenlegungsdatum 30.07.1997
EP date of grant 10.04.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 14.11.2002
IPC-Hauptklasse G01N 33/94

Beschreibung[de]

Diese Erfindung ist auf die Verwendung von Polycarbonsäure-Polymeren gerichtet, um die Leistungsfähigkeit immunochemischer Tests zur Quantifizierung von Aminoglykosid- Antibiotika in biologischen Proben zu verbessern. Diese Erfindung betrifft auch verbesserte homogene immunochemische Nachweistests, welche aus der Verwendung dieser Polycarbonsäure-Polymeren in diesen Tests resultieren.

Diagnostische Tests zum Nachweis von verschiedenen Substanzen ("Analyte") in klinischen Proben (z. B. Plasma, Serum, Urin) sind gut bekannt. Diese klinischen diagnostischen Tests können im Allgemeinen in zwei Systeme unterteilt werden: heterogene und homogene Systeme. Heterogene Systeme, z. B. ELISA (enzyme linked immunosorbent assay; Enzym-gekoppelter Immun-Absorbenstest), beinhalten typischerweise die Verwendung einer Analyt- oder Antikörper-gekoppelten festen Phase zur Ausbildung des Signals und erfordern das Abtrennen und das Waschen der festen Phase, um unspezifische Bindung an die feste Phase oder das Hintergrundsignal bei den Messungen des Tests zu reduzieren. Im Gegensatz dazu verwenden homogene Systeme wie das COBAS® FP und COBAS® OnLine (Roche Diagnostic Systems, Inc., Branchburg, NJ., USA), TDx® FP (Abbott Laboratories, North Chicago, IL, USA); EMITTM (Syva Co., Palo Alto, CA, USA) und CEDIA® (Microgenics Corp., Concord, CA, USA) ausschließlich flüssige Reagenzien und das Signal wird direkt aus dem Reagenziengemisch ohne ein Trennverfahren ausgebildet. Aufgrund ihrer Einfachheit können homogene Tests voll automatisiert werden.

Es ist auch bekannt, verschiedene Zusätze in dem Waschpuffer heterogener Immuntests einzuschließen, um die Leistungsfähigkeit des Tests zu verbessern. z. B. offenbart das US. Patent Nr. 5393659 die Verwendung eines wasserlöslichen Polymers, welches Carboxylgruppen enthält, um die Sensitivität von ELISA-Tests zu Verbessern. Diese "verstärkenden" Zusätze tragen im Allgemeinen nicht zu der immunochemischen Umsetzung selbst bei, sondern verbessern eher die Wirksamkeit des Waschens und reduzieren die unspezifische Bindung an die feste Phase, wobei das Hintergrundsignal vermindert wird (in einem heterogenen System). Diese Zusätze können auch die minimal ablesbare Konzentration des Analyten optimieren, d. h. die Sensitivität des Tests verbessern (siehe z. B. US. Patent Nr. 5393659).

Wenn wir uns den Analyten zuwenden, die durch immunochemische Tests nachgewiesen werden, sind Aminoglykosid- Antibiotika bekannt dafür, ein großes Potenzial aufzuweisen und ein breites Spektrum bakterizider Wirkung sowohl gegen Gram-negative als auch Gram-positive Organismen zu haben. Sie sind jedoch auch dafür bekannt, einen engen therapeutischen Index zu haben, was ihre Verwendung riskant macht, insbesondere in Patienten mit verminderter Nierenfunktion [siehe M. Jolley et al., Clin. Chem. 27 (7): 1190-1197 (1981); U.S. Pat. Nr. 5079234]. So werden Patienten, welche mit Aminoglykosid- Antibiotika behandelt weiden, genau auf die Konzentration dieser Wirkstoffe in ihrem Serum überwacht. Wegen des hohen Toxizitätspotenzials dieser Wirkstoffe gibt es auch fortbestehende Anstrengungen die Leistungsfähigkeit und Sensitivität bekannter Tests für Aminoglykosid-Antibiotika zu verbessern.

Die Erfindung resultiert aus der Entdeckung, dass die Verwendung von wasserlöslichen Polycarbonsäure-Polymeren (und Copolymeren) der allgemeinen Formel

wobei R¹ ein Wasserstoffatom oder eine COOH-Gruppe darstellt,

R² ein Wasserstoffatom oder eine CH&sub3;-Gruppe bedeutet

und n einen Wert von 25-17.400 hat,

in bekannten homogenen immunologischen Tests zum Nachweis von Aminoglykosid-Antibiotika die allumfassende Leistungsfähigkeit der Tests bedeutsam verbessert.

Fig. 1A zeigt die Verbesserung der Amikacin-Kalibrierungskurve, wenn Poly(acrylsäure)(PAA) zu einem kommerziell erhältlichen Amikacin-Test zugegeben wird. Diese Figur ist in Beispiel 1 weiter beschrieben.

Fig. 1B zeigt die Verbesserung in der Gentamicin- Kalibrierungskurve, wenn PAA einem kommerziell erhältlichen Gentamicin-Test zugegeben wird. Diese Figur ist in Beispiel 2 weiter beschrieben.

Fig. 2A zeigt die Verbesserung in der Tobramycin- Kalibrierungskurve, wenn PAA zu einem kommerziell erhältlichen Tobramycin-Test zugegeben wird. Diese Figur ist in Beispiel 3 weiter beschrieben.

Fig. 2B zeigt die Verbesserung in der Amikacin- Kalibrierungskurve, wenn Poly(methacrylsäure)(PMAA) zu einem kommerziell erhältlichen Amikacin-Test zugegeben wird. Diese Figur ist in Beispiel 4 weiter beschrieben.

In allen Immuntests werden typischerweise eine begrenzte Anzahl von Kalibrator-Konzentrationen bekannter Analyte (am häufigsten 6 Kalibrator-Konzentrationen) verwendet, um für einen bestimmten Analyten (z. B. einen Wirkstoff) eine nicht- lineare Standardkurve zu konstruieren. Die Kalibrierungskurve wird für jedes bestimmte Gerät unter Verwendung üblicher mathematischer Gleichungen, welche dem Fachmann bekannt sind, wie Gleichungen, die ein exponentielles 5-Paramter-Verhältnis oder logit/log 5-Verhältnisse beschreiben, konstruiert. Die spezifische Gleichung für ein bestimmtes Gerät ist im Allgemeinen in dem Handbuch bereitgestellt, welches das Gerät begleitet. Es ist kritisch, dass die Signale von 2 benachbarten Kalibrator-Konzentrationen, die verwendet werden, um die Kurve zu erstellen (z. B. Absorption, Fluoreszenz- Polarisation oder Bio-/Chemilumineszenz), immer unterscheidbar sind, derart dass die Analyt-Konzentration zwischen diesen beiden Kalibrator-Konzentrationen genau bestimmt werden kann. Eine wirkungsvolle Test-Antwort hängt von unterscheidbaren Signalen der unterschiedlichen Kalibrator-Konzentrationen wie auch von einer geeigneten mathematischen Dosis-Antwort-Kurven- Passform ab.

In aktuellen homogenen Immuntests für Aminoglykosid- Antibiotika wie Amikacin, Gentamicin und Tobramycin, insbesondere Tests vom Fluoreszenz-Polarisations ("FP")-Typ, zeigen die resultierenden Kalibrierungskurven häufig eine schlechte Test-Antwort (Signalaustausch pro Einheitskonzentration des Analyten), insbesondere am oberen Ende der Kalibrierungskurve, wo das gemessene Signal minimal unterscheidbar sein kann. Das ist eine ernsthafte Einschränkung, da die oberen Konzentrationsbereiche, welche häufig für ein angemessenes diagnostisches Überwachen am interessantesten sind, oft innerhalb dieses weniger genauen Bereiches der Kurve liegen. Deshalb werden häufig weniger präzise Ergebnisse erhalten, wenn derartige Tests verwendet werden, um die Aminoglykosid-Antibiotika-Konzentrationen in höheren Konzentrationsbereichen zu bestimmen.

Die Forschung in Richtung Verbesserung der Leistungsfähigkeit-Merkmale homogener Aminoglykosid-Antibiotika-Immuntests hat zu der Entdeckung geführt, dass die Verwendung von wasserlöslichen Polycarbonsäure-Polymeren der Formel I

in der R¹ ein Wasserstoffatom oder eine COOH-Gruppe darstellt,

R² ein Wasserstoffatom oder eine CH&sub3;-Gruppe bedeutet

und n einen Wert von 25-17.400 hat,

in diesen Tests die Gestalt der Kalibrierungskurve bedeutsam verändert und die Dosis-Antwort für die höheren Analyt- Konzentrationen dieser Tests erhöht, wobei eine verbesserte mathematische Passform einer interpolierten Linie für die begrenzte Anzahl von Kalibratorkonzentrationen, die verwendet wurden (z. B. 6), bereitgestellt wird. Diese Verschiebung in der Kalibrierungskurve resultiert in einer verbesserten Genauigkeit und Präzision des Tests für Analyte bei höheren Konzentrationsbereichen als bis dahin bekannt.

Wie hierin verwendet beziehen sich "lösliche" oder "wasserlösliche Polycarbonsäure-Polymere" auf Polymere (und Copolymere), die zahlreiche Carboxylgruppen enthalten, welche in wässriger Lösung löslich sind. Es wurde gefunden, dass kommerziell erhältliche lösliche Polycarbonsäure-Polymere der Formel I, welche einen Molekulargewichtsbereich von etwa 1,8 kDa bis etwa 1.250 kDa besitzen, die Leistungsfähigkeit des Tests verbessern. Vorzugsweise weist das Polymer ein Molekulargewicht von etwa 1,8 kDa bis etwa 1.250 kDa auf.

Geeignete Polycarbonsäure-Polymere der Formel I zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung beinhalten Polyacrylsäure ("PAA"; polyacrylic acid), Polymethacrylsäure ("PMAA"; polymethacrylic acid), Polymaleinsäure und die entsprechenden Copolymere der vorstehenden Polymere. PAA und PMAA werden am meisten bevorzugt. Diese Polymere sind kommerziell leicht erhältlich, z. B. von Aldrich. Chemical Co. (WI, USA), Polysciences (PA, USA) und Fluka (NY, USA).

Aminoglykosid-Antibiotika, welche, durch den erfindungsgemäßen verbesserten Test nachweisbar sind, beinhalten Amikacin, Gentamicin, Tobramycin, Kanamycin, Dibekacin und Netilmicin.

Die Erfindung betrifft weiter verbesserte Reagenzien zum Nachweis von Aminoglykosid-Antibiotika, wobei die Verbesserung den Einschluss von mindestens einem Polycarbonsäure-Polymer der Formel I in die Reagenzien-Zusammensetzung oder das Gemisch umfasst. Vorzugsweise wird das Polycarbonsäure-Polymer als ein unabhängiges Reagenz verwendet, es kann aber auch in das Antikörper-Reagenz oder andere Reagenzien des Immuntests aufgenommen werden. Die minimale Konzentration an Polycarbonsäure-Polymer in dem Reagenziengemisch, welche in einer verbesserten Leistungsfähigkeit des Tests resultiert, variiert von Test zu Test wie auch von einem Antikörper-Typ zu dem anderen. Die Konzentration der Polycarbonsäure hängt auch von dem Typ des verwendeten Polycarbonsäure-Polymers ab. Es wurde z. B. gefunden, dass eine so niedrige Konzentration wie 0,002% des Gesamtreaktionsgemischs ausreichend war, einen Tobramycin- Test, welcher einen monoclonalen Antikörper in dem Reagenziengemisch verwendet, zu verbessern, wenn PAA mit einem Molekulargewicht von 20.000 Dalton verwendet wird. In einem Amikacin-Test, welcher polyclonale Antikörper verwendet, war eine PAA (Molekulargewicht 1.800 Dalton)-Konzentration von 0,6% in dem Reaktionsgemisch erforderlich, um die gewünschte Leistungsfähigkeit des Tests zu erreichen. Die Bestimmung der äußersten Konzentration einer löslichen Polycarbonsäure, die in einem bestimmten Test zweckmäßig ist, in dem Reaktionsgemisch liegt im Bereich der Sachkenntnis eines Fachmanns auf dem Gebiet von Immuntests. Es wird jedoch davon ausgegangen, dass eine Endkonzentration an löslichem Polycarbonsäure-Polymer in dem Reaktionsgemisch von etwa 0,001% in den erfindungsgemäßen Verfahren zweckmäßig ist. Vorzugsweise liegt das lösliche Polycarbonsäure-Polymer in dem gesamten Reaktionsgemisch in einer Konzentration von etwa 0,002% bis etwa 0,6% vor.

Die vorliegende Erfindung ist mit Fluoreszenz-Polarisations-Immuntests (FPIAs; fluorescence polarization immunoassays) veranschaulicht, welche unter Verwendung der COBAS®-FP- Reagenzien für sowohl Amikacin, Gentamicin als auch Tobramycin, an COBAS INTEGRA® und COBAS FARA II® (Roche Diagnostic Systems, Branchburg, NJ., USA)-Chemiesystemen durchgeführt wurden. Ein erfindungsgemäßes FPIA kann jedoch auch von Hand oder an jedem anderen Typen von automatisiertem System durchgeführt werden.

In FPIAs, ist die Fluoreszenz-Polarisation eine reproduzierbare Funktion der Liganden (z. B. Wirkstoff)-Konzentration und ist damit für die quantitative Bestimmung der Liganden-Konzentration im Serum zum Zweck des therapeutischen Wirkstoff-Überwachung-Monitoring geeignet. Die Verwendung von Fluoreszenz-Polarisation (FP) in Immuntests, um ein quantitatives Hilfsmittel zum Messen der Menge an Träger- Antikörper-Konjugat bereitzustellen, welches in einem kompetitiven Bindungs-Immuntest gebildet wird, [siehe z. B. Dandliker and Feigen, Biochem. Biophys. Res. Comm. 5: 299 (1961) und A. M. Geddes et al., Chemother. 20, 245-256 (1974)], ist gut bekannt. Im Allgemeinen sind Fluoreszenz- Polarisationsverfahren auf dem Prinzip begründet, dass eine Fluoreszenz-markierte Verbindung, wenn sie durch linearpolarisiertes Licht angeregt wird, Fluoreszenz emittiert, welche einen Grad an Polarisation besitzt, der im umgekehrten Verhältnis zu ihrer Rotationsfrequenz steht.

Die COBAS®-FP-Systeme verwenden FP, um die Bindung von Fluorescein-markierten Wirkstoffen (der "Tracer") an spezifische Antikörper zu messen. Wenn in der COBAS-Küvette Tracer, Antikörper enthaltendes Serum, welche für den Wirkstoff spezifisch sind, welcher gemessen werden soll, und Wirkstoff freies Patientenserum miteinander vermischt werden, bindet das meiste des Tracers an die Antikörper. Wenn der gebundene Tracer mit polarisiertem Licht (470-490 nm) angeregt wird, ist als ein Ergebnis das emittierte Licht (510-530 um) stark polarisiert, da das gebundene Molekül nicht rotieren und das Licht depolarisieren kann. Wenn andererseits der Wirkstoff in der Patientenprobe vorliegt, wird der Wirkstoff mit dem Tracer um die Bindung an die Antikörper konkurrieren. Damit wird mehr vom Tracer ungebunden bleiben (und damit frei, um zu rotieren) und die Polarisation des emittierten Lichts wird abnehmen.

Das COBAS®-FP-Testsystem misst die Fluoreszenz- Polarisation, welche aus der Interaktion von Tracer, Antikörper und Kalibrator, welcher bekannte Mengen an Wirkstoff in menschlichem Serum enthält, resultiert, um eine Kurve zu erzeugen, die die Wirkstoffkonzentration zu Millipolarisations (mP)-Einheiten in Beziehung setzt. Darauffolgend werden der Tracer, der Antikörper und das Patientenserum unter den gleichen Bedingungen, welche die Kalibrierungskurve erzeugt haben, interagieren gelassen. Die somit erhaltenen mP-Einheiten können durch Vergleich mit der Kalibrierungskurve in dem Test mit den Wirkstoffmengen in dem Patientenserum korreliert werden.

Vom Gesichtspunkt der Lesbarkeit und Genauigkeit ist es um so leichter, die Wirkstoffkonzentration in Korrelation zu setzen, je steiler die Neigung der Kalibrierungskurve ist. Deshalb beziehen sich die Fachleute häufig auf das Konzept der Spannweite für die Messung eines bestimmten Wirkstoffs. Die "Spannweite" oder der "Delta-Wert" ist die Signaldifferenz zwischen 2 spezifischen Analyt-Konzentrationen. Eine größere Spannweite in einem Bereich der Kurve stellt in einem FPIA für diesen bestimmten Bereich eine verbesserte Präzision bereit. Gleichzeitig ist es jedoch wünschenswert, einen gewissen Grad an genereller Einheitlichkeit in der Passform der Kurve zu haben. Somit ist es nicht wünschenswert, eine sehr große Signalspanne in einem Bereich der Kurve zu erhalten, wenn diese gleichzeitig in einer schlechten Passform der Kurve resultiert, was gleichbedeutend ist mit schlechter Lesegenauigkeit in einem anderen Bereich der Kurve. Deshalb ist erforderlich, dass eine große Signal-Spannweite in einem Bereich mit einer relativ ausgeglichenen Verteilung von. "Spannweiten" über die gesamte Kalibrierungskurve verteilt, ausgeglichen wird, damit ein verlässliches FPIA resultiert.

Wie durch die nachfolgenden Beispiele weiter veranschaulicht wird, ist gefunden worden, dass die Einbeziehung von löslichen Polycarbonsäure-Polymeren der Formel I in das kommerziell erhältliche Probe/Reagenz-Gemisch eines COBAS®- Chemie-Analysegeräts das Erscheinungsbild der Kalibrierungskurve derart veränderte, dass der kommerzielle Test über einen größeren Bereich an Analyt-Konzentrationen mit größerer Präzision durchgeführt werden konnte.

BEISPIELE Allgemeiner Hintergrund A. Materialien

Die folgenden Materialien, welche in den Beispielen verwendet wurden, wurden von den folgenden kommerziellen Quellen erhalten:

a. Polyacrylsäure (als eine freie Säure oder als ein Natriumsalz) wurde entweder von Polysciences (Warrington, PA, USA), Fluka (Ronkonkoma, NY, USA) oder Aldrich chemical Co. (Milwaukee, WI, USA) erhalten;

b. Polymethacrylsäure wude von Polysciences (Warrington, PA, USA) erhalten;

c. Polymaleinsäure wurde von Polysciences (Warrington, PA, USA) erhalten;

d. COBAS®-Produkte sind von Roche Diagnostic Inc. (Branchburg, NJ, USA) erhältlich.

B. Test-Verfahren

Die Testprotokolle, welche in diesen Beispielen verwendet wurden, sind wie folgt. Als erstes wurden Antikörper-Reagenz, Polycarbonsäure-Lösung, Probenverdünnung und Patientenprobe in eine COBAS-Küvette gegeben und die parallelen und senkrechten Fluoreszenz-Hintergrund-Intensitäten wurden gemessen. Dann wurde der Tracer zugegeben und die parallelen und senkrechten Fluoreszenz-Test-Intensitäten wurden dann nochmal gemessen. Der Polarisationswert wurde mit Hilfe des automatisierten Analysators (COBAS INTEGRA® oder COBAS FARA- II®) unter Verwendung der gemessenen parallelen und senkrechten Test- und Hintergrund-Fluoreszenzintensitäten berechnet.

Die COBAS INTEGRA® und COBAS FARA II®-Systeme berechnen die Millipolarisations(mP)-Einheiten einer Probe unter Verwendung der folgenden Formel:

worin m P = Millipolarisationseinheiten (Polarisation · 1000)

III BLK = Parallele Intensität des abgelesenen Nullwerts

III TEST = parallele Intensität des abgelesenen Testwerts

IIBLK = senkrechte Intensität des abgelesenen Nullwerts

IITEST = senkrechte Intensität des abgelesenen Testwerts

VB = Volumen des Nullwerts

VTOT = Volumen des Testwerts (gesamt)

k = Angleichungsfaktor des Gerätes

Die Systeme berechnen mP-Werte für 6 Kalibrierungs-Konzentrationen und die eingesetzte Patientenprobe(n). Die Systeme berechnen dann eine Kurve mit der besten Passform für die Kalibrierungs-Konzentrationen unter Verwendung einer nicht- linearen Regressionsanalyse des kleinsten Quadranten. Die Konzentration des Wirkstoffs in jeder Probe wird dann unter Verwendung der gemessenen Polarisationswerte aus dieser Kurve interpoliert.

In den folgenden Beispielen wurden die Tests wie Vorstehend offenbart durchgeführt, wobei eine bestimmte Polyacrylsäure als ein unabhängiges Reagenz in den bestimmten angegebenen Mengen in jedem Beispiel zugegeben wurde.

Im Allgemeinen sind die Ergebnisse in Form von Figuren oder Tabellen am besten zu verstehen und werden deshalb derart präsentiert.

Beispiel 1 Erweiterung der Amikacin-Kalibrierungskurve durch PAA

In Beispiel 1 wurde ein Test für Amikacin durchgeführt, in dem ein kommerziell erhältlicher COBAS®-FP-Reagenzienkit für Amikacin verwendet wurde, und PAA, welches ein Molekulargewicht von 20.000 Dalton hat, zugegeben wurde. Die Konzentration von PAA im Endtestreaktionsgemisch war 0,15%. Wie in Fig. 1A gezeigt, ist der Signalbereich für den Amikacin-Test im Wirkstoff-Konzentrationsbereich zwischen 20 und 40 ug/ml nach Zugabe von 0,15% PAA bedeutend erhöht (von 11,7 mP auf 21,6 mP). Wenn der Test ohne die Zugabe von PAA durchgeführt wurde (die gestrichelte Linie in Fig. 1A), war die Bestimmung des Analyten oberhalb von 25 ug/ml aufgrund des eingeschränkt differenzierbaren Signals zwischen den letzten beiden Kalibrierungs-Konzentrationen (bei den Konzentrationen 20 ug/ml und 40 ug/ml: Signalbereich = 11,7 mP) nicht optimal. Sobald. PAA den Amikacin-Testreagenzien hinzugefügt wurde, wurde die Präzision der Lesbarkeit für Amikacin- Konzentrationen zwischen 20 und 40 ug/ml aufgrund eines erhöhten Signalbereichs zwischen Kalibrierungs-Konzentrationen von 20 und 40 ug/ml (Signalbereich = 21,6 mP) dramatisch verbessert und die resultierende Passform der Gesamtkurve war ebenfalls verbessert. Die Verbesserung in der Amikacin- Konzentrationskuve in dem Bereich zwischen 20 bis 40 ug/ml ist insofern besonders bedeutsam, da der typische therapeutische Bereich von Amikacin in der Tat zwischen 20 und 30 ug/ml liegt.

Beispiel 2 Ausweitung der Gentamicin-Kalibrierungskurve durch PAA

In ähnlicher Weise wurde in Beispiel 2 ein Test für Gentamicin unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen COBAS®-FP-Reagenzienkit für Gentamicin verwendet, wobei PAA zugegeben wurde, welches ein Molekulargewicht von 20.000 Dalton hat. Die Konzentration von PAA im Endtestreaktionsgemisch war 0,05%. Wie in der Figur gezeigt, war der Signalbereich für den Gentamicin-Test in dem Wirkstoff-Konzentrationsbereich zwischen 7,4 und 14 ug/ml nach der Zugabe von 0,05% PAA bedeutsam erhöht (von 11,6 mP auf 17,8 mP). Wenn im Gegensatz dazu der Test ohne die Zugabe von PAA durchgeführt wurde (die gestrichelte Linie in Fig. 1B), war die Kalibrierungskurve für den Bereich 7,4 bis 14 ug/ml nahezu eine flache Linie (d. h. die Kurve hatte einen sehr kleinen Anstieg, was es sehr schwierig macht, Konzentrationsunterschiede zu ermitteln). Nachdem PAA zu den Testreagenzien zugegeben wurde, verbesserte sich die Präzision der Lesbarkeit für die Gentamicin-Konzentrationen zwischen 7,4 und 14 ug/ml (die letzten beiden Kalibrierungs- Konzentrationen) aufgrund eines Anstiegs in diesem Signalbereich außerordentlich und gleiches gilt für die Passform der Gesamtkurve. Die Verbesserung in der Gentamicin- Konzentrationskurve in dem Bereich zwischen 7,4 und 14 ug/ml ist insofern sehr bedeutend, da der typische therapeutische Bereich für Gentamicin zwischen etwa 6 bis etwa 10 ug/ml liegt.

Beispiel 3 Erweiterung der Tobramycin-Kalibrierungskurve durch PAA

Analog zu den Beispielen 1 und 2 wurde in Beispiel 3 ein Test für Tobramycin unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen. COBAS®-FP-Reagenzienkit für Tobramycin durchgeführt, wobei PAA zugegeben wurde, welches ein Molekulargewicht von 20.000 Dalton hat. Die Konzentration von PAA im Endtestreaktionsgemisch betrug 0,0189%. Wie in Fig. 2A gezeigt, wurde der Signalbereich für den Tobramyzin-Test nach Zugabe von PAA in dem Wirkstoff-Konzentrationsbereich zwischen 7 ug/ml und 10 ug/ml gewaltig erhöht (Von 5,7 mP auf 10,3 mP). Nach einmal ist die gewaltige Verbesserung der Tobramycin- Konzentrationskurve in dem Bereich zwischen 7 bis 10 ug/ml besonders bedeutend, da der typische therapeutische Bereich für Tobramycin zwischen 6 und 10 ug/ml liegt.

Beispiel 4 Erweiterung der Amikacin-Kalibrierungskurve durch PMAA

In Beispiel 4 wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen COBAS®-FP-Reagenzienkit für Amikacin ein Test für Amikacin durchgeführt, wobei PMAA, welches ein Molekulargewicht von 15.000 Dalton hat, zugegeben wurde. Die Konzentration von PMAA im Endtestreaktionsgemisch betrug 0,178%. Wie in Fig. 2B gezeigt, ist der Signalbereich für den Amikacin-Test in dem Wirkstoff-Konzentrationsbereich zwischen 20 bis 40 ug/ml, welches wie vorstehend festgestellt der Schlüsselbereich für das therapeutische Monitoring der Amikacin-Konzentration ist, nach Zugabe von PMAA wesentlich erhöht (von 11,1 mP auf 21,4 mP).

Beispiel 5 Verbesserte Testgenauigkeit für den Amikacin-Test unter Verwendung von PAA

In diesem Experiment wurden 2 Standardkurven erstellt, wobei die gemessenen Signale von jedem von 6 Kalibrierungskonzentrationen verwendet wurden, welche bekannte Amikacin- Konzentrationen besitzen. Die Amikacin-Konzentration von jedem Kalibrator ist in nachfolgender Tabelle I gezeigt. Beide Kurven wurden mit Hilfe eines COBAS®-FP-Reagenzienkits für Amikacin erstellt. Wie in Tabelle I angemerkt, wurde eine Kurve unter Verwendung von Standardreagenzien ohne PAA erstellt und die andere Kurve wurde erstellt, nachdem PAA zu dem Reaktionsgemisch zugegeben wurde. Das Molekulargewicht (MW) des in diesem Experiment verwendeten PAA betrug etwa 20.000 Dalton und die PAA-Konzentration in dem Endtestreaktionsgemisch war 0,1%. Alle 6 Kalibrator- Konzentrationen wurden dann als unbekannte Proben getestet und die jeweils bestimmte Konzentration wurde mit den bekannten Konzentrationen verglichen und die Abweichung (dev.; deviation) zwischen den beiden Konzentrationen wurde für jeden Kalibrator berechnet. Von einem klinischen Standpunkt aus ist es wünschenswert, für jede Probe beim Ablesen eine Abweichung zu haben, die geringer als 5% ist. Wie in nachfolgender Tabelle I gezeigt, konnte eine Abweichung von weniger als 5% bei den Konzentrationsmessungen unter Verwendung des COBAS®-FP- Amikacin-Tests ohne zugegebenes PAA nicht erhalten werden. Vielmehr betrug die Abweichung der Konzentrationsmessungen bei einer Konzentration von etwa 20 ug/ml, wie in Tabelle I gezeigt, mehr als 40%. Wenn jedoch PAA in das Reaktionsgemisch für den Amikacin-Test einbezogen wurde, war entlang der gesamten Länge der Kalibrierungskurve die Abweichung bei der gemessenen Konzentration wesentlich reduziert und demgemäß war die Präzision der Kurve stark verbessert.

Tabelle I Wirkung von Poly(acryl)säure (PAA) [MW etwa 20000] auf die Kalibrierungskurven-Passform (Präzision der Lesbarkeit) des Amikacin-Tests.

Beispiele 6-10

In den Beispielen 6-10 wurde das gleiche Verfahren durchgeführt wie vorstehend in Beispiel 5 für den Amikacin- Test beschrieben, wobei jedoch ein PAA verwendet wurde, welches ein unterschiedliches Molekulargewicht hat, als dasjenige, welches in Beispiel 5 verwendet wurde, oder unter Verwendung von PMAA anstelle von PAA. Die Ergebnisse der Beispiele 6-10 sind nachfolgend in den Tabellen II-VI zusammengefasst.

Tabelle II Wirkung von Poly(acrylsäure) (PAA) [MW etwa 1.800 Da] auf die Kalibrierungskurven-Passform (Präzision der Lesbarkeit) des Amikacin-Tests.
Tabelle III Wirkung von Poly(acrylsäure) (PAA) [MW etwa 225.000 Da] auf die Kalibrierungskurven-Passform (Präzision der Lesbarkeit) des Amikacin-Tests.
Tabelle IV Wirkung von Poly(acrylsäure) (PAA) [MW etwa 1.250.000 Da] auf die Kalibrierungskurven-Passform (Präzision der Lesbarkeit) des Amikacin-Tests.
Tabelle V Wirkung von Poly(methacryl)säure (PMAA) [MW etwa 15.000 Da] auf die Kalibrierungskurven-Passform (Präzision der Lesbarkeit) des Amikacin-Tests.
Tabelle VI Wirkung von Poly(maleinsäure) (PMA) [Polysciences PMA, Katalog Nr. 09732] auf die Kalibrierungskurven-Passform (Präzision der Lesbarkeit) des Amikacin-Tests.

Wie in Beispiel 5 und Tabelle I, zeigen die Beispiele 6-10 und die Tabellen II bis VI, dass die Zugabe eines kommerziell erhältlichen löslichen Polycarbonsäure-Polymers zu dem Amikacin-Standard-Immuntest in einer stark verbesserten Abweichung in der Wirkstoff-Konzentrationskurve und demgemäß in einer verbesserten Präzision des Tests resultiert.

Beispiel 11 Verbesserung der Präzision des Aminoglykosid-Tests in dem oberen Bereich der Kalibrierungskurve

In Beispiel 11 wurde eine Probe bekannter Amikacin- Konzentration (21,5 ug/ml) in zwei voneinander getrennten Experimenten analysiert. Für jeden Test wurden 10 Messungen durchgeführt und der Durchschnittswert dieser 10 Messungen ist nachfolgend in Tabelle VII dargestellt. Die Experimente wurden wiederholt und die gleichen Messungen wurden gemacht, wobei jedoch PAA zu dem Reaktionsgemisch zugegeben Wurde (0,15% Endkonzentration von PAA mit einem Molekulargewicht von 20.000 Dalton).

Zusätzlich zu der Darstellung der mittleren Konzentration, die für jedes Experiment gemessen wurde, stellt Tabelle VII auch den "Variationskoeffizienten" (coefficient of variation; CV) für die Probe dar, welcher eine Messung der Unterschiede innerhalb der 10 Messungen darstellt. Der CV wird dadurch erhalten, dass die statistische Streuung der 10 Messungen durch den Mittelwert geteilt wird. Der Variationskoeffizient (d. h. Streuung "innerhalb des Experiments") ist eine Messgröße für die Präzision, welche in einem bestimmten Test erhalten wird, das bedeutet die Fähigkeit, die Ergebnisse in dem Tests zu reproduzieren.

Tabelle VII Wirkung von PAA auf die Präzision und Genauigkeit wie in dem Amikacin-Test erläutert.

Tabelle VII zeigt, dass bei einer Probenkonzentration von 21,5 ug/ml durch die Zugabe von PAA die Präzision des Amikacin-Tests wesentlich verbessert wird. Dies wird durch die Messungen von 25,82 und 29,04 (kein PAA), im Gegensatz zu 21,72 und 21,66 (mit PAA) für eine bekannte Konzentration von 21,5 ug/ml offensichtlich. Zusätzlich zeigt Tabelle VII ebenfalls, dass die Zugabe von PAA in einer verbesserten Präzision des Tests resultiert, wie durch den Variationskoeffizienten gemessen.


Anspruch[de]

1. Homogener immunochemischer Nachweistest zur Bestimmung von Aminoglycosid-Antibiotika in einer biologischen Probe, wobei der Test die Verwendung eines wasserlöslichen Polycarbonsäure-Polymers mit der allgemeinen Formel I

umfasst, in der R¹ ein Wasserstoffatom oder eine COOH-Gruppe darstellt, R² ein Wasserstoffatom oder eine CH&sub3;-Gruppe bedeutet, und n einen Wert von 25 bis 17.400 hat, und Copolymere davon.

2. Test nach Anspruch 1, wobei das lösliche Polycarbonsäure-Polymer ein Molekulargewicht von etwa 1,8 kDa bis etwa 1250 kDa aufweist.

3. Test nach Anspruch 2, wobei das Polycarbonsäure-Polymer ein Molekulargewicht von etwa 1,8 kDa bis etwa 225 kDa aufweist.

4. Test nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Polycarbonsäure-Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyacrylsäure, Polymaleinsäure, Polymethacrylsäure und Copolymeren davon.

5. Test nach Anspruch 4, wobei das Polycarbonsäure-Polymer ausgewählt ist aus Polyacrylsäure und Polymethacrylsäure.

6. Test nach Anspruch 5, wobei die Menge des wasserlöslichen Polycarbonsäure- Polymers in dem Endtestreaktionsgemisch mindestes 0,001% beträgt.

7. Test nach Anspruch 6, wobei die Menge des Polycarbonsäure-Polymers in dem Endtestreaktionsgemisch etwa 0,02% bis etwa 0,6% beträgt.







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