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Dokumentenidentifikation DE3486293T3 21.11.2002
EP-Veröffentlichungsnummer 0344872
Titel Impfstoff-Zubereitung.
Anmelder Wyeth (n.d.Ges.d. Staates Delaware), Madison, N.J., US
Erfinder Acree, William Marshall, Temple Texas 76501, US;
Edwards, Bobby, Temple Texas 76501, US;
Black, John Wesley, Mitton Tennessee 37118, US
Vertreter Kinzebach und Kollegen, 81679 München
DE-Aktenzeichen 3486293
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, FR, GB, LI, LU, NL, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 14.06.1984
EP-Aktenzeichen 892020017
EP-Offenlegungsdatum 06.12.1989
EP date of grant 23.03.1994
EPO date of publication of amended patent 24.04.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 21.11.2002
IPC-Hauptklasse A61K 39/215

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft Hundecoronavirusvakzine, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und Adjuvantien zur Verwendung damit.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung inaktivierte Hundecoronavirusvakzine, die im Darmtrakt sowohl systemische Immunität als auch lokale Immunität bewirken, und ein Verfahren zur Herstellung derselben.

Hintergrund und Anwendungsgebiet der Erfindung

Hundecoronavirus (CCV)-Enteritis ist eine hoch ansteckende Krankheit bei Hunden mit weltweiter Verbreitung. CCV- Gastroenteritis wurde zuerst im Februar 1970 in einer U.S. Luftwaffen-Hundeausbildungsschule in Wiesbaden, Bundesrepublik Deutschland, festgestellt. Im Januar 1971 wurde das Wiederauftreten des Gastroenteritiskrankheitssyndroms festgestellt und der Erreger wurde als ein CCV identifiziert. 1972 berichteten Cartwright und Lucas, daß sich Antikörpertiter auf übertragbares Gastroenteritis (TGE)-Virus in Hunden nach einem Ausbruch von Erbrechen und Diarrhoe signifikant erhöht hatten. Es wurde gefolgert, daß TGE oder wahrscheinlicher ein serologisch verwandtes Virus, wie CCV, zur Erkrankung dieser Hunde führte.

Infektion resultiert aus einem Kontakt zwischen infizierten und anfälligen Hunden. Infizierte Hunde zeigen gewöhnlich Krankheitssymptome. Jedoch können Hunde, die sich von der Krankheit erholen, in ihren Fäkalien Virus ausscheiden und sich als kontinuierliche Infektionsquelle für anfällige Hunde erweisen.

Mit den plötzlichen Ausbrüchen von durch Hundeparvovirus hervorgerufener Enteritis im Jahr 1978 wurde erneute Energie und Interesse an Hundeentero-Viren stimuliert. Die ersten Bemühungen waren auf das Finden des Erregers dieses neuen hämorrhagischen Enteritis-Myokarditissyndroms gerichtet, das einen schweren und tödlichen Verlauf zeigte. Bei Untersuchungen entdeckten Forscher zwei verschiedene Viren, Hundecoronavirus (CCV) und Hundeparovirus (CPV). Nach weiterer Untersuchung erwies sich das CPV als das neue Agens, das am häufigsten die höchste Erkrankungsziffer und Sterblichkeit verursacht. Das CCV rief eine Krankheit hervor, die in etwa ähnlich, aber weniger oft tödlich verlief. Über die gleichzeitige Isolierung von CPV und CCV wurde berichtet. Eine durchgeführte Begutachtung zeigte, daß es sich bei 17% der Fälle von Hundeenteritis um Doppelinfektionen mit CPV und CCV handelte. Verschiedene staatliche Diagnoselaboratorien bestätigen diese Befunde.

Die Differenzierung von parvoviraler und coronaviraler Enteritis ist schwierig. Die wahrscheinlich gleichzeitigen Infektionen mit beiden Viren machen die Differenzierung noch schwieriger. In einer serologischen Begutachtung der Situation in einem Hundezwinger zeigte sich, daß 55% der getesteten Hunde sowohl CCV als auch CPV ausgesetzt waren. Einige getestete Hundezwinger ergaben eine positive Exposition von bis zu 87% für beide Agenzien. Die Schwere einer durch gleichzeitige Infektion bewirkten Enteritis ist unbekannt. Jedoch nimmt ein Forschungsexperte auf dem Gebiet an, daß eine Infektion durch beide Viren die Wahrscheinlichkeit einer Erkrankung des Hundes erhöht.

Wie oben angegeben, ist CCV-Enteritis eine hoch ansteckende Krankheit, die weltweit festgestellt wurde. Die Inzidenz der CCV-Erkrankung bei als Haustier gehaltenen Hunden wurde mit 14,8 bis 25% angegeben. Die Inzidenz bei Hunden, die in Hundezwingern gehalten werden, beträgt bis zu 30%. Die Inzidenz von Gastroenteritis, wobei sowohl CCV als auch CPV isoliert wurden, ist noch höher. Die Krankheit kann in Hunden jeden Alters auftreten. Die Bedeutung von CCV-Gastoenteritis hat mit dem Ausbrechen von CPV-Gastoenteritis deutlich zugenommen.

CCV-Gastoenteritis ist durch eine Reihe von Krankheitssymptomen gekennzeichnet, die aus der Literatur wie folgt zusammengestellt wurden: Die ersten Anzeichen von Krankheit sind Lethargie, Anorexie und Depression. Das plötzliche Einsetzen von Erbrechen ist zu beobachten, wobei zuweilen Blut gefunden werden kann. Diarrhoe kann mäßig bis schwer und stoßweise auftreten. Diarrhoe kann bis zu 10 Tagen andauern. Das Fäkalienmaterial hat eine gelborange Farbe, wobei gelegentlich darin Blut und Schleim zu finden sind. Außerdem hat das Fäkalienmaterial einen markanten widerlichen Geruch. Der Darmtrakt enthält wässeriges, gelbgrünes Material. Von Wasserverlust, Gewichtsverlust und Tod wurde berichtet. Langwierige oder wiederkehrende Diarrhoe kann 2 bis 3 Wochen später auftreten. Es wird angenommen, daß die Schwere des CCV- Krankheitssyndroms entsprechend dem Alter, dem Stress, den Umgebungsbedingungen, der Rasse und gleichzeitigen Infektionen variiert. CCV war auch mit respiratorischen Krankheitssymptomen von Augen- und Nasenabsonderungen verbunden.

Sowohl respiratorische als auch enterische Symptome der Krankheit wurden von den vorliegenden Forschern experimentell festgestellt. Die festgestellten Symptome umfaßten einen leichten Augenausfluß, einen leichten Nasenausfluß, Diarrhoe, Gewichtsverlust, Anorexie, Wasserverlust, erhöhte Temperaturen und einen leichten Abfall der Spiegel sowohl der weißen Blutkörperchen als auch der Lymphozyten. Darmproben von infizierten Hunden zeigen, daß eine signifikante Virusinfektion nach Reizung auftritt.

CCV ist ein Mitglied der Coronavirusgruppe von Viren.

Einige einschlägige Merkmale der Coronavirusgruppe sind:

a) Das Virusteilchen ist sphärisch oder elliptisch mit knopfähnlichen Vorsprüngen an der Außenfläche von 18 bis 20 Nanometern (nm).

b) Die Viren haben sehr anspruchsvolle in vitro- Wachstumserfordernisse.

c) Die Virusteilchengrößen variieren im Durchmesser von 80 bis 200 nm.

d) Das Virus weist ein Einzelstrang-RNA-Nukleoprotein auf.

e) Das Virus entwickelt sich im Zytoplasma der Zelle.

f) Es gibt eine komplexe antigene Ähnlichkeit innerhalb der Gruppe.

g) Die Virusdichte in Cäsiumchlorid (CsCl) beträgt 1,24 bis 1,26 g/ml.

Untersuchungen zeigen, daß es keine deutlichen antigenen Unterschiede zwischen verschiedenen CCV-Isolaten zu geben scheint.

Die Veterinärmedizin hat den Bedarf an einem CCV-Vakzin erkannt, doch zeigt die Literatur, daß auf diesem Gebiet wenig erfolgreiche Arbeit geleistet wurde. Experten auf dem Gebiet haben einen oral-intranasalen Weg der Vakzination empfohlen um nicht nur die Erzielung von systemischer Immunität, sondern auch die Erzielung von lokaler Immunität im Darmtrakt zu gewährleisten.

Die Sicherheit von attenuiertem Lebendvirusvakzin muß vom Entwickler nachgewiesen und von einer U.S. Regierungsbehörde zugelassen werden. Jedoch kann der Mißbrauch von attenuierten Lebendvirusvakzinen oder die Verwendung von attenuierten Lebendvirusvakzinen in einem gefährdeten Wirt zu Problemen führen. Der Mißbrauch von Produkten involviert, ohne hierauf beschränkt zu sein, das Kombinieren mehrerer Vakzine zur gleichzeitigen Verwendung, wenn diese Vakzine nicht untersucht oder zur Verwendung auf diese Weise empfohlen wurden. Ein gefährdeter Wirt umfaßt, ohne hierauf beschränkt zu sein, inokulierte Tiere, die einen aktiven infektiösen Prozeß durchmachen, Tiere, die allgemein nicht sehr gesund sind, und Tiere, die imunologisch inkompetent sind. Die immunologische Inkompetenz kann wegen immunologischer Schwäche auf Grund von ererbten genetischen Merkmalen, wegen eines gleichzeitigen infektiösen Prozesses oder der Behandlung mit bestimmten chemischen Verbindungen, wie Dexamethason, gegeben sein.

Einige Beispiele von attenuierten Lebendvirusvakzinen, die zum Verkauf zugelassen wurden, aber postvakzinale Probleme in Verbindung mit Praxis-Mißbrauch oder Verwendung in einem gefährdeten Wirt verursacht haben können, sind "Modified Live Low Egg Passage Rabies"-Vakzine, einige "Modified Live Canine Distemper"-Vakzine und ein "Modified Live High Egg Passage Rabies"-Vakzin. Verbesserte Diagnosetechniken haben zur Feststellung von Problemen, die mit attenuierten Lebendvirusvakzinen verbunden sind, beigetragen.

Sicherheitsprobleme in der Praxis auf Grund von Mißbrauch oder auf Grund der Verwendung in einem gefährdeten Wirt können mit einem inaktivierten Virusvakzin minimiert oder eliminiert werden. Obwohl inaktivierte oder abgetötete Virusvakzine auf Grund ihrer Sicherheit vorzuziehen sein werden, waren sie im Vergleich zu attenuierten Lebendvirusvakzinen bisher von niedrigerer Effizienz. Obwohl Produktionstechniken und Adjuvanssysteme zur Entwicklung einiger hochwirksamer inaktivierter Virusvakzine geführt haben, waren die mit einer bestimmten Technik oder einem bestimmten Adjuvanssystem erzielbaren Ergebnisse nicht vorhersagbar.

Inaktivierte Virusvakzine wurden größtenteils für Wirtstiere im Bereich von landwirtschaftlich genutzten Tieren bis zur Katze entwickelt. Die einzigen derzeit von USDA zugelassenen inaktivierten Produkte für den Hund wurden für Hundeparvovirusenteritis und Tollwut verwendet. Obwohl andere inaktivierte Virusprodukte für den Hund hergestellt wurden, wurden sie wegen der geringeren Wirksamkeit im Vergleich mit den entsprechenden abgeschwächten Lebendvirusvakzinen vom Markt nicht angenommen.

Ein Problem bei der Herstellung eines inaktivierten Hundecoronavirusvakzins war die allgemeine Annahme, daß intestinaler Schutz nicht ohne Vakzinvirusreplikation innerhalb des Zielgewebes des Darmtraktes erzielt werden könnte. Virusreplikation kann mit einer inaktivierten Virusvakzine nicht erzielt werden.

Es wurde erwartet, daß ein oral-intranasaler Weg der Vakzination mit einem Lebendvirusvakzin erforderlich wäre, um nicht nur die Erzielung systemischer Immunität, sondern auch die Induktion von lokaler Immunität im Darmtrakt zu gewährleisten. Unerwarteterweise wurde gefunden, daß ein parenteral verabreichtes abgetötetes Hundecoronavirusvakzin systemische Immunität und auch lokale Immunität im Darmtrakt induziert.

Appel et al. offenbaren in Canine Practice, Juli-August 1980, 4, 22-34, den Ursprung und Grundlagen von Hundevirusenteritis und beschreiben insbesondere die Wirkungen von CCV und Möglichkeiten zu dessen Prävention und Bekämpfung. Die Autoren geben an, daß zum Zeitpunkt des Artikels ein Vakzin zum Schutz gegen CCV nicht verfügbar war.

Andere Autoren, beispielsweise Woods, Veterinary Microbiology, 1982, 7, 427-435, und Gill Diss'n Abs. Intl. 43(8), Microbiology, 2452-B (Feb. 1983), offenbaren die Vermehrung, aber nicht die Attenuierung von CCV in verschiedenen Zellinien.

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, sowohl attenuierte als auch inaktivierte Hundecoronavirusvakzine bereitzustellen, die bei parenteraler Verabreichung sowohl systemische Immunität als auch lokale Immunität im Darmtrakt bewirken.

Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein inaktiviertes Hundecoronavirusvakzin bereitzustellen, das so wirksam ist wie abgeschwächte Lebendhundecoronavirusvakzine.

Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Inaktivieren eines Hundecoronavirus und zum Herstellen eines Vakzins daraus bereitzustellen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine Vakzinzusammensetzung, die das avirulente antigene Produkt, gebildet durch Inaktivieren von in Katzen- oder Hundezellen vermehrtem Hundecoronavirus, wobei das avirulente antigene Produkt in einer Menge vorhanden ist, die Hunde vor Infektion durch virulentes Hundecoronavirus wirksam schützt, und einen nicht-toxischen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.

Die ursprüngliche Isolierung des virulenten CCV erfolgte aus einem Hund, der an Gastroenteritis starb. Dem Isolat wurde die Bezeichnung TN-449 gegeben. Virusnachweismethoden einschließlich Elektronenmikroskopie zeigten, daß CCV als das einzige Virus in den vom Hund entnommenen Proben vorhanden war. Dann wurde das Virusisolat für Vermehrungs- und Attenuierungszwecke in CRFK-Zellkulturen gegeben.

Das Verfahren zum Vermehren des CCV in Säugerzellen umfaßt die folgenden Schritte: Animpfen von Säugergewebekulturzellen mit CCV, Kultivieren der Zellen bis zu einer einhundertprozentig (100%) konfluenten, dichten Monoschicht vor dem Animpfschritt oder innerhalb von 24 Stunden nach diesem Animpfschritt, Ernten der Zellen 24 bis 96 Stunden nach Animpfung und Abtrennung des vermehrten Virus von den geernteten Zellen.

Die Säugergewebekulturzellen werden mit CCV bei einem Verhältnis von CCV-Virus (gemessen nach der FAID&sub5;&sub0;-Methode) zu Zellen von 1 : 500 bis 1. 1, vorzugsweise 1 : 100 bis 1 : 5, insbesondere 1 : 75 bis 1 : 10, angeimpft. Die Säugergewebekulturzellen sind, ohne hierauf beschränkt zu sein, Crandall-Katzennierenzellen (CRFK), Woods Katzenzellinie (FC), eine Hundenierenzellinie (DK), Madin Darby-Hundenieren-(MDCK) und die Hunde A72-Zellinie. Das CCV wird einer Suspension der Zellen zugesetzt oder auf eine Monoschicht der Zellen aufgebracht. Die Menge an Zellen und Virus soll so gewählt sein, daß sich eine konfluente dichte Monoschicht der Zellen innerhalb von 12 bis 48, vorzugsweise 24 bis 36 Stunden nach Animpfung bildet. Optimal sollten zum Zeitpunkt der Animpfung die Zellen im Wachstumsbehälter in einer Menge vorhanden sein, die ausreichend ist, eine Zellmonoschicht von mindestens 100 000 bis 1 000 000 Zellen pro cm² innerhalb von etwa 12 bis 48 Stunden nach Animpfung, vorzugsweise innerhalb von 24 Stunden nach Animpfung, zu bilden. Jedoch kann eine geringere Zahl von Zellen verwendet werden. Vorzugsweise sind die Zellen in einer Menge vorhanden, die ausreichend ist, zwischen 150 000 und 500 000 Zellen/cm² innerhalb von 12 bis 48 Stunden, vorzugsweise innerhalb von 24 Stunden, zu bilden. Das Virus wird an den Zellen während mindestens 60 Minuten, aber gewöhnlich weniger als 300 Minuten, vorzugsweise zwischen 90 und 240 Minuten, bei 28 bis 40ºC, vorzugsweise 35 bis 38ºC, adsorbiert.

Erntbare Virustiter von mindestens etwa 1000 und gewöhnlich mindestens etwa 2000, gemessen nach der FAID&sub5;&sub0;- Methode, können innerhalb von 18 Stunden nach Animpfung erhalten werden, jedoch kann es in manchen Fällen bis zu 120 Stunden oder länger dauern, um maximale Virustiter zu erhalten. Maximale Virustiter werden gewöhnlich etwa 24 bis 96 Stunden nach Animpfung erhalten. Die Zellmonoschicht wird entweder durch Gefrieren und Auftauen oder durch enzymatische Einwirkung zum Erhöhen des Virusgehaltes der geernteten Flüssigkeiten entfernt. Die geernteten Flüssigkeiten werden dann mit einem Virusstabilisator, wie Saccharosephosphatglutamat (SPG), Saccharosephosphatglutamatalbumin (SPGA) oder NZ-Amin-Gelatine zum Abfüllen des Endproduktes vereinigt oder in größerer Menge zum späteren Auftauen und Auffüllen mit Virusstabilisator eingefroren. Alternativ können die geernteten Flüssigkeiten inaktiviert werden.

Ein Hauptaspekt dieser Erfindung ist die Verwendung eines inaktivierten Hundecoronavirusvakzins zur Prävention des Hundecoronaviruskrankheitskomplexes. Andere Aspekte dieser Erfindung betreffen die Zusammensetzung der Hundecoronavirus (CCV)-Vakzine, das für das Hundecoronavirus verwendete Inaktivierungsverfahren und die in Verbindung mit dem CCV- Vakzin verwendeten Adjuvantien.

Isolate von Hundecoronavirus, wie der I-171 Stamm (ATCC VR-809), das TN-499 (ATCC VR-2068) oder eines der drei von der Cornell Universität erhältlichen Hundecoronaviren (K378-8-,S378-6- und A76-Stämme), können zur Herstellung eines inaktivierten CCV-Vakzins verwendet werden. Die inaktivierte CCV-Vakzinzusammensetzung umfaßt ein oder mehrere Isolate eines inaktivierten Hundecoronavirus mit Präinaktivierungsvirustitern von höher als 4,0 log Virusteilchen/ml (oder Dosis) und vorzugsweise höher als 5,0 log Virusteilchenjml (oder Dosis), gemessen durch die FAID&sub5;&sub0; (Fluoreszenz-Antikörper-Infektiöse Dosis)-Methode (King et al., Can. Journal of Comparative Medicine and Vet Science 29, S. 85-89, 1965). Die typische Dosis ist 1 ml.

Inaktivierte CCV-Flüssigkeiten können auch durch eine beliebige Zahl von verfügbaren Techniken, wie eine Amicon- Konzentriereinrichtung, Pellicon (Millipore)- Konzentriereinrichtung, Fälltechniken, wie mit Ammoniumchlorid, Konzentrieren mit Carbowax-Flüssigkeit oder -Wachs in Verbindung mit einem Dialyserohr, oder Adjuvans- Konzentriertechniken, wie mit Aluminiumphosphat, konzentriert werden.

Titer in einer Höhe von 5 bis 7 log FAID&sub5;&sub0; wurden erhalten. Die inaktivierte CCV-Vakzinzusammensetzung umfaßt ein oder mehrere inaktivierte Hundecoronaviren und kann auch ein attenuiertes modifiziertes Lebend- oder abgetötetes Hundeparvovirus (CPV) enthalten. Außerdem kann das Vakzin in jeder Kombination oder einzeln zusätzliche attenuierte modifizierte Lebendviren oder abgetötete Viren, wie Hundestaupevirus, Hundeparainfluenzavirus, Hundeadenovirus I, Hundeadenovirus II, Hunderotavirus, Masernvirus, Hundecalicivirus und Hundeherpesvirus enthalten. Das inaktivierte CCV-Vakzin ruft eine vollständige immunologische Reaktion auf die Virusinfektion hervor.

Die Vakzinzusammensetzung umfaßt eine ausreichende Menge des Hundecoronavirus-Antigens zur Herbeiführung einer immunologischen Reaktion in einem Hund und ein nicht-toxisches pharmazeutisch annehmbares Adjuvans oder eine Adjuvanskombination.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft den Verabreichungsweg. Die Induktion von humoral-systemischem Schutz, gemessen durch den Serumspiegel neutralisierender Antikörper, sowie die Induktion von lokaler Immunität im Darmtrakt sind ein wichtiges Merkmal dieser Erfindung. Die oral-intranasalen Verabreichungswege sollen beide Arten von Schutz bewirken. Jedoch ist die allgemeine Akzeptanz dieses Verabreichungsweges nicht gut, so daß die Anwendung und der anschließende Schutz durch ein CCV-Vakzin nicht realisiert werden könnte. Ein attenuiertes Lebendvirusvakzin, das parenteral verabreicht wird, führt zu humoraler und lokalisierter Immunität. Die parenterale Vakzination mit einem inaktivierten CCV-Vakzin induziert sowohl humorale Immunität als auch lokalisierte Immunität. Der Ausdruck "parenterale Vakzination" soll subkutane und intramuskuläre Impfwege einschließen.

Das attenuierte Vakzin wird gewöhnlich in einer Dosis von mindestens 2,5 log Virusteilchen pro Dosis, vozugsweise mindestens 1000 Virusteilchen (3 log Virusteilchen) pro Dosis, insbesondere mindestens 3,3 log Virusteilchen pro Dosis, parenteral verabreicht.

Das inaktivierte Vakzin wird vorzugsweise in einer Dosis von mindestens 10 000 inaktivierten Virusteilchen (4 log Virusteilchen) pro Dosis, vorzugsweise mindestens 5,0 log Virusteilchen pro Dosis, parenteral verabreicht. Das Vakzin kann als Einzeldosis oder in zwei Dosen verabreicht werden. Die zweite Dosis sollte nicht mehr als 6 Wochen nach der ersten verabreicht werden. Vorzugsweise wird die zweite Dosis 2 bis 3 Wochen nach der ersten Dosis verabreicht.

Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist die Inaktivierung des Hundecoronavirus. CCV-Flüssigkeiten können mit einer Reihe von Inaktivierungsmitteln inaktiviert werden, wie, ohne hierauf beschränkt zu sein, binäres Äthylenimin, Acetyläthylenimin, β-Propiolacton, Formalin, Phenol, UV-Strahlung oder γ-Strahlung.

Vorzugsweise wird β-Propiolacton in Konzentrationen von 0,01 bis 0,5% verwendet. Konzentrationen von β-Propiolacton von 0,05 bis 0,2% werden am häufigsten verwendet. Das Inaktivierungsmittel wird den in den Vermehrungsbehältern enthaltenen Virusflüssigkeiten, Flüssigkeiten, die aus dem Vermehrungsbehälter geerntet und kombiniert wurden, oder Virusflüssigkeiten, die aus den Vermehrungsbehältern geerntet, kombiniert, gelagert, gefroren und dann aufgetaut wurden, zugesetzt.

β-Propiolacton wird den Virusflüssigkeiten zugesetzt, wobei die nachteilige Verschiebung des pH in den sauren Bereich mit Natriumhydroxid- oder Natriumbicarbonatlösung reguliert wird. Die Kombination aus Inaktivierungsmittel und Virusflüssigkeiten wird bei Temperaturen von 4 bis 37ºC inkubiert. Inkubationszeiten von 24 bis 72 Stunden werden verwendet.

Ein anderes verwendetes Inaktivierungsmittel ist binäres Äthylenimin. Gleiche Volumina einer 0,2 molaren Bromäithylaminhydrobromidlösung und einer 0,4 molaren Natriumhydroxidlösung werden gemischt und 60 min bei etwa 37ºC inkubiert. Das resultierende cyclisierte Inaktivierungsmittel ist binäres Äthylenimin, das den Virusflüssigkeiten in Anteilen von 0,5 bis 4% V/V zugesetzt wird. Die Inaktivierungsvirusflüssigkeiten werden 24 bis 72 Stunden unter periodischem Rühren bei etwa 4 bis 37ºC gehalten.

Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung betrifft das Adjuvanssystem. Ein einziges Adjuvans oder Kombinationen verschiedener Adjuvantien können zum Erhöhen der Immunreaktion verwendet werden. Adjuvantien, wie Aluminiumphosphat, Äthylenmaleinsäureanhydrid, Neocryl A640 und ein Aluminiumhydroxid können verwendet werden, ohne hierauf beschränkt zu sein. Neocryl ist ein Markenname für eine Latexemulsion eines Copolymers von Styrol und einer Mischung von Acryl- und Methacrylsäure. Neocryl A640 ist ein nichtkoalisiertes wässeriges Acrylcopolymer mit Styrol mit einem pH von 7,5, einer Viskosität von 100 cps (Brookfield 250C), das Gewicht pro Gallone beträgt 8,6 Pfund, wie geliefert, mit einem Gehallt von 40 Gew.-% Feststoffen und 38 Vol.-% Feststoffen. Die Bezeichnung A640 gibt die Qualitätstufe davon an. Andere verwendbare Neocryl-Qualitäten sind 520, 625 und 966. Die Bezeichnung 'CSMA' wird im nachstehenden für ein Copolymer von Styrol mit einer Mischung von Acryl- und Methacrylsäure verwendet.

Äthylenmaleinsäureanhydrid (EMA), hergestellt mit einer 5% G/V Konzentration in Wasser wird in inaktivierten Virusflüssigkeiten in einer Konzentration von 0,01 bis 6% V/V zugesetzt. Der pH der resultierenden Flüssigkeiten wird durch Zusatz von 1 n Natriumhydroxid auf 7, 7 eingestellt.

CSMA, hergestellt in einer 50% V/V Suspension in Wasser wird den inaktivierten CCV-Flüssigkeiten in einer Menge von 0,1 bis 10 Vol.-% zugesetzt. Gewöhnlich ist es nicht notwendig, den pH einzustellen, da CSMA neutralen pH aufweist.

Das Kombinieren von zwei oder mehreren Adjuvantien kann wie folgt durchgeführt werden, ist aber nicht auf diese Kombination beschränkt. Äthylenmaleinsäureanhydrid, wie beschrieben, wird zu 0,01 bis 6% V/V den inaktivierten Virusflüssigkeiten zugesetzt. Die Mischung wird durch Zusatz von 1 n Natriumhydroxid auf 7,1 bis 7, 7 eingestellt. Die Zugabe von 0,01 bis 10% CSMA, wie beschrieben, wird durchgeführt, ohne daß weitere pH-Einstellungen erforderlich sind.

Ein weiterer Hauptbefund dieser Erfindung ist, daß unerwarteterweise das inaktivierte Virusvakzin lokalisierten intestinalen Schutz bewirkt, gemessen durch Vakzinations- Reizuntersuchungen, wenn das Vakzin parenteral verabreicht wird, sowie erwarteten humoralen systemischen Schutz, gemessen durch neutralisierende Serumantikörperspiegel, bewirkt. Eine Induktion lokalisierter Immunität war mit anderen Vakzinationswegen als dem parenteralen Weg verbunden und die Möglichkeit, den Darmtrakt durch parenterale Vakzination mit CCV lokal zu immunisieren, wurde als unwahrscheinlich erachtet, insbesondere mit einem abgetöteten Antigen. Die systemische Immunität ist wahrscheinlich in erster Linie der Anwesenheit von γ-Immunoglobulin (IgG) zuzuschreiben und die lokale Immunität im Darmtrakt ist wahrscheinlich zumindest teilweise der Anwesenheit von a-Immunoglobulin (IgA) sowie IgG zuzuschreiben. Die Anwesenheit von IgA wird mit einem abgetöteten Vakzin nicht erwartet.

Vakzinierte Hunde, denen eine Dosis des abgetöteten CCV- Vakzins gegeben wurde, zeigten bei Reizung eine Verminderung der Darminfektion von bis zu 95% im Vergleich mit nicht- vakzinierten Kontrollen. Die Daten unterstützen somit die Einmaligkeit dieses Teiles des Befunds, daß parenteral verabreichte inaktivierte CCV-Vakzine systemischen, humoralen Schutz sowie lokale Immunität im Darmtrakt bewirken.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Methode, die zum Bestimmen der Wirksamkeit eines CCV- Vakzins verwendet wird. Die Methode umfaßt die folgenden Schritte: Vakzinieren eines Hundes mit einem modifizierten Lebend-CCV-Vakzin, Entnahme von Blut des vakzinierten Hundes, nachdem dieser eine immunologische Reaktion auf das Vakzin entwickelt hat, Trennen des Serums vom Blut, Reizen des vakzinierten Versuchshundes und eines nicht-vakzinierten Hundes mit einer infektiösen Menge eines virulenten CCV auf intranasal-oralem Weg und Prüfen von Darmtraktproben der vakzinierten Hunde und der Kontrollhunde zum Bestimmen des Replikationsgrades des Reizvirus. Das United States Department of Agriculture (USDA) hat Standardtesterfordernisse zum Bestimmen der Wirtstierwirksamkeit einiger Veterinärprodukte. Es gibt weder eine Standardanforderung noch vorgeschlagene Testerfordernisse für CCV-Vakzine. Weiterhin waren keine Adaptierungen der Standard- oder vorgeschlagenen Testverfahren möglich, um die Wirksamkeit des Produktes in Wirtstieren gültig zu bestimmen. Daher wurde eine neue Testmethode zum Bestimmen der Wirksamkeit der CCV-Vakzine entwickelt. Diese Methode beinhaltet das direkte Messen des Schutzes, der im Darmtrakt von vakzinierten Tieren gegen Infektion des Darmtraktes mit virulentem Hundecoronareizvirus erzielt wird. Im allgemeinen wird vakzinierten Hunden mindestens 7, vorzugsweise 7 bis 21 Tage nach Vakzination Blut entnommen, um den bewirkten humoralen Schutz zu bestimmen, indem die Menge an im Serum vorhandenem neutralisierenden Serum-Antikörper gemessen wird. Diese Hunde werden dann zusammen mit nicht-vakzinierten Kontrollhunden mit virulentem CCV auf intranasal-oralem Weg gereizt. Die Darmtraktproben sowohl der vakzinierten als auch der Kontrollhunde werden untersucht, um den Grad der erfolgten Reizvirusreplikation zu bestimmen. Die Probeentnahme kann 2 bis 14, vorzugsweise 3 bis 10 Tage, nach Reizung durchgeführt werden. Ausstriche, Darmschabsel oder behandeltes Darmschabsel können für Bestimmungszwecke verwendet werden.

Der Nachweis von Virus in der Darmprobe umfaßt, ohne hierauf beschränkt zu sein, sowohl direkte als auch indirekte Färbung mit fluoreszierendem Antikörper. Das Ausmaß der Vakzinwirksamkeit zum Herbeiführen von lokaler Immunität wird durch den Unterschied im Infektionsgrad zwischen vakzinierten und Kontrollhunden gemessen. Eine Verminderung von 90% ist nicht unüblich.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beruht auf mehreren Neuerungen. Eine Neuerung ist das für das Hundecoronavirus verwendete Vermehrungsverfahren, das ausreichend hohe, zur Vakzin Herstellung erforderliche Titer für Mischzwecke ergibt. Die Vermehrung von Hundecoronavirus auf hohe Virusinfektionsitätsspiegel kann schwierig sein, so daß dieser Aspekt der Erfindung außerordentlich wichtig ist. Die entwickelten Herstellungsverfahren ergeben Virusinfektionsitätstiter von mindestens 3 log Virus pro ml, gemessen durch die direkte FAID&sub5;&sub0;-Methode.

Ein weiterer in Verbindung mit diesem Aspekt der Erfindung zu beachtender Punkt ist, daß die durch die hier beschriebene Methode erzielten CCV-Titer zum Mischen mit Virusstabilisatorkomponenten ausreichend sind, aber auch von ausreichender Menge, um die Kombination von CCV mit anderen Virusmitteln, wie, ohne hierauf beschränkt zu sein, Hundeparvovirus, Hundestaupevirus, Hundeadenovirus I, Hundeadenovirus II, Hundeparainfluenza, Hunderotavirus, Leptospira canicola und Leptospira icterohemorrhagiae, zu ermöglichen.

Einige Hauptfaktoren beim Erzielen eines hohen Coronavirustiters sind das Virus-Zellenverhältnis, die Adsorptionszeit von Virus und Zellen, die erzielte Zellkontaktinhibierung und die Erntezeit von Virusflüssigkeiten nach Animpfung.

Ein attenuierter Lebend-CCV wird in Verbindung entweder mit primären Zellkulturen oder einer etablierten entweder von Hund oder Katze stammenden Zellinie verwendet. Inkubationstemperaturen von 28 bis 40ºC werden angewandt, wobei 35 bis 38ºC bevorzugt werden. Ein MEM-Earles- Gewebekulturmedium, ergänzt mit einem Tierserum, wie Rinderserum, wird verwendet. Eine Mindestkonzentration von 5 bis 10% wird für das Zellkulturwachstum verwendet und eine Konzentration von nicht weniger als 1% wird im Erhaltungsmedium verwendet. Eine minimale Konzentration von 0,5 ml eines Enzyms, wie rohes oder gereinigtes Trypsin, pro 1 Gewebekulturmedium wird verwendet. Zellkulturen werden entweder in stationären oder Rollkulturflaschen gehalten.

Im Fall von Zellmonoschichten wird eine Zellpopulation von nicht weniger als 150 000 Zellen pro cm² verwendet. Die Monoschicht zeigt sich dicht und konfluent, wodurch die erforderliche Zellkontaktinhibierung gegeben ist. Das Zellkulturwachstumsmedium wird entfernt und Impfvirus zugesetzt. Gefrorene CCV-Impfkulturen werden in kaltem Wasser aufgetaut und in ausreichendem Volumen (wie 50 ml) auf die Zellmonoschicht während einer Adsorptionsperiode von mindestens 90 Minuten bei Temperaturen von 35 bis 38ºC gegeben. Ein Mindestverhältnis von Virus zu Zellen von 1 Virusteilchen auf jeweils 100 Zellen ist wesentlich.

Im Falle einer Zellsuspension werden ausreichend Zellen pro spezifischem Oberflächenbereich verwendet, um zu gewährleisten, daß eine dichte konfluente Monoschicht in 24 Stunden oder weniger erhalten wird. Eine Zellkultur-Passage von 1 Behälter nicht-angeimpften Zellen bis 1 oder 2 Behältern für infizierte Zellen kann verwendet werden.

Die Erntezeit ist für die Erzielung zum Vakzinmischen ausreichender CCV-Titer kritisch. Ein Infektiositätstiter von mindestens 3,3 log Virus pro ml wird benötigt. Die Erntezeiten, die zum Erzielen von Virustitern dieses Größenbereiches erforderlich sind, betragen 24 Stunden nach Infizieren der Zellpopulation bis 96 Stunden nach Zellpopulationsinfektion. Virusinfektiositätstiter erreichen nach 48 Stunden ein Maximum und fallen danach ab. Jedoch bleibt ausreiched infektiöses Virus bis zu etwa 96 Stunden bestehen.

Virusinfektiositätstiter können um mindestens das 2-fache durch Entfernen der verbliebenen Zellmonoschicht durch enzymatische Einwirkung oder durch Gefrieren und Auftauen und Zugabe der Zellsuspension zu den vorher geernteten Virusflüssigkeiten erhöht werden.

Ein weiterer Hauptbefund dieser Erfindung ist, daß das Vakzinvirus humoralen, systemischen Schutz, gemessen durch den Spiegel neutralisierender Serum-Antikörper, und lokalisierten Darmschutz, gemessen durch Vakzinations-Reizuntersuchungen, wenn das Vakzin parenteral verabreicht wird, bewirkt. Unerwarteterweise wurde gefunden, daß die Induktion von lokalisierter Immunität mit anderen Vakzinationswegen als dem parenteralen assoziiert war, und die Möglichkeit, den Darmtrakt durch parenterale Vakzination mit CCV mit Immunität zu versehen, wurde als unwahrscheinlich angesehen. Die systemische Immunität ist wahrscheinlich in erster Linie auf die Anwesenheit von γ-Immunoglobulin (IgG) und die lokale Immunität im Darmtrakt wahrscheinlich zumindest teilweise auf die Anwesenheit von α-Immunoglobulin (IgA) sowie IgG zurückzuführen.

Versuche mit verschiedenen Dosierungsstufen von CCV- Vakzin, auf parenteralem Vakzinationsweg verabreicht, demonstrierten Vakzinvirusreplikation im Darmtrakt sogar schon 5 Tage nach Verabreichung und eine serologische Reaktion sogar schon 7 Tage nach Verabreichung. Vakzinierte Hunde zeigten bei Exposition eine Verminderung der Krankheitssymptome und eine bis zu 95%ige Verminderung der Darminfektion im Vergleich mit nicht-vakzinierten Kontrollen. Die Daten unterstützen somit die Einmaligkeit dieses Teiles der Erfindung, daß parenteral verabreichte CCV-Vakzine systemischen humoralen Schutz sowie lokale Immunität im Darmtrakt bewirken.

Ein weiterer Befund dieser Erfindung umfaßt die Mittel zur Vakzinbewertung in Hunden. Das Vakzin ist dazu bestimmt, durch CCV hervorgerufene systemische und lokalisierte Gastroenteritisinfektionen zu verhindern. Bestimmungen zirkulierender oder humoraler Antikörper wurden an Blutproben durchgeführt, die 7 bis 21 Tage nach parenteraler Vakzination mit einer Dosis von 1 ml Vakzin pro Hund genommen wurden. 21 Tage nach Vakzination wurden die vakzinierten Hunde und die nicht-vakzinierten Hunde intranasal-oral mit virulentem Hundecoronavirus gereizt. Das Einsetzen der Krankheit erfolgt rasch und plötzlich. Krankheitssymptome sind bereits 24 Stunden nach Reizung in anfälligen Hunden zu sehen. Die Dauer der Symptome beträgt gewöhnlich 24 bis 96 Stunden, kann sich aber bis zu 10 Tage erstrecken. Beim Bestimmen der Wirksamkeit der Vakzine werden die Tiere am 5., 6. oder 7. Tage nach der Reizung eingeschläfert. Der Darmtrakt vom Pförtner bis zum Dickdarm wird entfernt. Der Darm wird behandelt und durch Ausstriche untersucht oder es wird abgeschilfertes Darmepithel verwendet.

Die Ausstriche werden durch systematisches Abschaben der Epithealauskleidung an verschiedenen Stellen des Darms hergestellt. Das Geschabsel wird auf Objektträger gegeben und für direkte Fluoreszenzantikörperanfärbung behandelt, um mit CCV infizierte Zellen festzustellen. Die gleiche Epithelabschabung kann abgeschilfert werden, indem das Geschabsel in phosphatgepufferte Kochsalzlösung gegeben wird. Die Epithel-Kochsalzmischung wird gerührt, um die einzelnen Zellen in der Kochsalzlösung zu suspendieren. Dann werden Proben der Suspensionen für direkte Fluoreszenzantikörper (FA)- Anfärbung zur Bestimmung von CCV auf Objektträger aufgebracht.

Die Prüfung der Objektträger ergibt das Ausmaß von spezifischer Fluoreszenz als Maß der Virusinfektion. Der Fluoreszenzgrad, basierend auf der Zahl von infizierten Zellen pro Feld in Verbindung mit der Zahl von pro Hund geprüften Proben, ergibt einen numerischen Infektionswert, der jedem einzelnen Tier zugeordnet werden kann. Auf diese Weise bestimmt man Grad oder Ausmaß der CCV-Infektion im Darmtrakt. Ein Vergleich der Werte von vakzinierten und nicht-vakzinierten Hunden stellt ein Mittel zum Bestimmen der Wirksamkeit der Vakzine bei der Prävention von Darminfektion dar.

Um das Wesen der vorliegenden Erfindung deutlicher zu offenbaren, sind im nachstehenden spezifische Ausführungsbeispiele der Erfindung angegeben. Es sollte jedoch klar sein, daß dies lediglich beispielhaft erfolgt und weder den Umfang der Erfindung genau umgrenzen noch den Schutzbereich der beigefügten Ansprüche beschränken soll. In den Beispielen sind alle Temperaturen in ºC angegeben, log bedeutet log zur Basis 10 und die folgenden Abkürzungen werden verwendet: g für Gramm, mcg für Mikrogramm ml für Milliliter, min für Minuten und h für Stunden.

Beispiel 1:

Dieses Beispiel illustriert die Vakzinherstellung.

Der Produktionsstamm wurde ursprünglich von einem Hund isoliert, der an CCV-Enteritis gestorben war. Das Virus wurde in Crandall-Katzennierengewebe (CRFK)-Kultur seriell vermehrt. Das erhaltene Virus wurde als CCV-MSV bezeichnet, woraus man durch einmalige Passage das Master-Seed CCV-MSV(X) erhielt. Die CCV-NSV (Hundecornonavirus-Master-Seed-Virus)-Kultur wurde bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, hinterlegt und erhielt die ATCC-Hinterlegungsnummer VR 2068. Bei der Vakzinherstellung wurden die Zellkulturen in dynamischen Kulturen gezüchtet. In einigen vorhergehenden Versuchen wurden statische Kulturen verwendet. Zellkulturen wurden in essentiellem Minimal-Medium (MEM), ergänzt mit Vitaminen, nicht-essentiellen Aminosäuren, Natriumpyruvat, Natriumbicarbonat und L-Glutamin, gezüchtet. Eine Menge von 30 mcg/ml Gentamicin wurde als Konservierungsmittel zugesetzt. Rinderserum in einer Konzentration von 5 bis 10 Gew.-% wurde für Zellwachstum zugesetzt. Die Serumkonzentration wurde auf nicht mehr als 1% für ein Aufrechterhaltungsmedium vermindert. Trypsin wurde in einer Konzentration von 0,5 ml/l Medium zugesetzt, um Virusinfektiosität zu fördern.

Konfluente Kulturen von CRFK-Zellen wurden trypsinisiert und in Rollkulturen gepflanzt, so daß nach 24 h eine Dichte von 150 000 Zellen pro cm² erhalten wurde. Die Kulturen wurden bei 28 bis 40ºC, vorzugsweise 35 bis 38ºC, gezüchtet. Das Wachstumsmedium wurde entfernt.

Das Produktionsvirus wurde in kaltem fließenden Wasser aufgetaut. Ausreichend Virus wurde zugesetzt, um ein Mindestinfektionsmultiplizitäts(MOI)-Verhältnis von 1 : 100 zu erzielen. Eine 2000 cm³-Flasche enthielt 300 bis 500 Millionen Zellen. Bei 1 : 50 MOI (300 · 106 dividiert durch 50) wurde in minimales infektiöses Virusinokulum von 6 · 10&sup6; oder 106,8 FAID&sub5;&sub0; pro Rollkultur erhalten. Viruskeime und Produkternten ergaben 105,5 bis 107,0 FAID&sub5;&sub0; pro ml. So wurden gewöhnlich 20 ml unverdünnten bis 1 ml unverdünnten Impfguts pro Flasche verwendet. Das Impfgut wurde pro Rollflasche mit Kulturmedium auf ein Volumen von 50 ml gebracht. Das Virus ließ man auf Monoschichten oder in Suspension 2 h bei 35 bis 38ºC absorbieren.

In einem spezifischen Beispiel wurden 15 ml eines Impfguts mit einem Titer 105,7 FAID&sub5;&sub0; pro ml Rollflasche als Inokulum verwendet. 32 Rollflaschen wurden, wie beschrieben, angeimpft. Die Flaschen wurden mit 2 l MEM mit 1% FCS und 0,5 ml Trypsin aufgefüllt. Die Flüssigkeiten wurden zusammen mit dem Zellmaterial 48 h nach Infektion geerntet, verteilt und bei -40ºC oder weniger eingefroren.

Die Flaschen ergaben 66,5 l Virusflüssigkeiten. Der Titer der Flüssigkeiten betrug 105,0 FAID&sub5;&sub0; pro ml. Das Material wurde später aufgetaut und mit Medium und

Saccharosephosphatglutamatalbumin (SPGA)-Stabilisator gemischt und gefriergetrocknet.

Beispiel 2:

Dieses Beispiel illustriert die Vermehrung im Darm durch parenterale Impfung.

Der Zweck der Untersuchung war, zu bestimmen, ob das CCV- Vakzin das Replikat im Darmtrakt lokalisieren würde, wenn es intranasal oder intramuskulär gesunden anfälligen Hunden verabreicht wird.

4 Hunde wurden in zwei Gruppen geteilt und isoliert und vor der Vakzination wurde ihnen Blut entnommen. Die Hunde Nr. 63 und 64 wurden intramuskulär mit einer 10 ml Dosis (106,3 FAID&sub5;&sub0;/Dosis) CCV (x + 1)-Impfgut (Impfgut hergestellt durch eine zusätzliche Passage der Master-Kultur) vakziniert. Die beiden anderen Hunde Nr. 62 und 65 wurden intranasal mit einer 2 ml Dosis (10516 FAID&sub5;&sub0;/Dosis) des gleichen CCV-Impfguts vakziniert. Am Tag 5 nach Vakzination wurde den Hunden Blut entnommen, von den Fäkalien wurden Abstiche zur Virusisolierung in CRFK-Zellkultur gemacht und die Tiere wurden eingeschläfert. Gewebegeschabsel von Trachea, Duodenum, Jejunum und Zökum wurde auf Objektträger gegeben. Diese Ausstriche wurden dann durch die direkte Fluoreszenzantikörpertechnik auf Virusreplikation beobachtet.

Virusisolierung von Fäkalien

Aus den Fäkalien konnte kein Coronavirus isoliert werden.

Direkte FA-Anfärbung von Abstrichen

Die Ergebnisse von Fluoreszenzantikörperanfärbung von Gewebeabstrichen sind in Tabelle 2-1 gezeigt.

Tabelle 2-1 CCV direkte FA von Abstrichen

IN = intranasal NA = nicht anwendbar

100% der von den intranasal geimpften Hunden genommenen Darmabstriche waren Virusreplikation-positiv, während 70% der Darmabstriche von den intramuskulär geimpften Hunden Virusreplikation-positiv waren.

Virusreplikation erfolgte in allen drei Teilen des Darmtraktes. Virusreplikation wurde auch in der Trachea der intranasal vakzinierten Hunde festgestellt.

Der Grad von Virusentwicklung im Darm von intranasal geimpften Tieren und die Tatsache, daß die Trachea ebenfalls Virusreplikation zeigte, kann als Hinweis gelten, daß dieser Impfweg die natürliche Eintrittspforte für Infektion ist.

Schlußfolgerung

Virusreplikation im Darmtrakt kann 5 Tage nach intramuskulärer oder intranasaler Verabreichung hoher Dosisspiegel des Virus erzielt werden.

Beispiel 3:

Dieses Beispiel illustriert die parenterale Verabreichung eines niedrigen Virusinokulum zur Darmreplikation.

Der Zweck dieser Untersuchung war, zu bestimmen, ob das CCV-Vakzin bei intramuskulärer Verabreichung in geringer Dosis lokalisiert und im Darmtrakt replizieren würde.

Zwei Hunde, Nr. 60 und 68, wurden mit 1 ml CCV-MSV (x + 3)- Impfkultur verdünnt auf 103,0 FAID&sub5;&sub0;/ml intramuskulär vakziniert. Am Tag 5 nach Vakzination wurde den Tieren Blut entnommen und die Tiere wurden eingeschläfert. Ausstriche von Villigeschabsel wurden vom Duodenum, Jejunum und Zökum für direkte FA- Beobachtung zum Nachweis von Virusreplikation angefertigt. Diese Abstriche wurden behandelt und mit CCV-spezifischem FITC (Fluorisothiocyanat)-gebundenem Konjugat angefärbt und durch FA untersucht.

Direkte CCV-FA von Villigeschabsel

Die Gewinnung von positivem CCV aus Villigeschabselabstrichen ist in Tabelle 3-1 gezeigt.

Tabelle 3-1 CCV direkte FA von Villi

CCV-Replikation wurde in allen Bereichen des Darmtraktes beider Hunde 5 Tage nach der intramuskulären Verabreichung von 3 log Virus gefunden. Ein Durchschnitt von 79% der beobachteten Proben war Virusreplikation-positiv. Dieser Prozentsatz läßt sich in vorteilhafter Weise mit den zu 70% positiven Proben vergleichen, die mit Hunden erhalten wurden, denen in einer anderen Untersuchung 5,6 log Virus verabreicht worden war.

CCV-Replikation kann im Darmtrakt von empfindlichen Hunden, die mit 103,0 FAID&sub5;&sub0;/Dosis CCV-Vakzine parenteral vakziniert wurden, 5 Tage nach Vakzination gezeigt werden.

Beispiel 4:

Vorläufige Vakzin- und Reizbewertung Der Zweck dieser Untersuchung war, ein Hundecoronareizvirus zu bewerten und festzustellen, ob das Vakzinvirus irgendwelche durch das Reizvirus induzierte Symptome verhindert und Darminfektion durch das Reizvirus vermindert oder verhindert.

Zwei für Hundecoronavirus anfälligen Hunden, Nr. 61 und 66, wurde Blut entnommen und sie wurden mit 3 log CCV MSV (x + 3)-Impfgut intramuskulär vakziniert. Diese Tiere wurden bis zum Zeitpunkt der Reizung isoliert gehalten.

21 Tage nach Vakzination wurde den beiden mit CCV vakzinierten Hunden zusammen mit den vier für CCV anfälligen Hunden Nr. 75, 79, 74 und 76 Blut entnommen, sie wurden anästhesiert und je Hund mit 5 ml CCV-Reizvirus gereizt. Jeder Hund erhielt 2 ml oral und 3 ml intranasal. Jeder Hund erhielt 105,7 FAID&sub5;&sub0; Reizvirus.

Die Hunde Nr. 74 und 76 wurden 7 Tage nach der Reizung auf Temperaturreaktion, WBC (weiße Blutkörperchen)-Zahl, Lymphozytenzahlreaktion und andere Symptome beobachtet. 5 Tage nach der Reizung wurden die beiden CCV-vakzinierten Hunde Nr. 61 und 66 zusammen mit den beiden Reizkontrollhunden Nr. 75 und 79 eingeschläfert. Darmgeschabselausstriche wurden vom Duodenum, Jejunum und Zökum jedes Hundes angefertigt. Fluoreszenzantikörperanfärbung wurde an diesen Ausstrichen durchgeführt, um das Ausmaß der Virusreplikation im Darmtrakt zu bestimmen.

Tabelle 4-1 CCV SN-Untersuchung

*vakzinierter Hund

** Reizkontrolle

Beide vakzinierten Tiere waren vor der Vakzination seronegativ und 21 Tage nach der Vakzination auf einen Grad von 1 : 1122 serokonvertiert.

Durchschnittlich 95,6% aller in den Kontrollen beobachteten Darmproben zeigten einen 4(+) Virusreplikationsgrad. Keines der vakzinierten Tiere zeigte einen 4(+) Virusinfektionsgrad in den Darmproben. Daher wurde eine: 100%ige Verminderung beim 4(+) Infektionsgrad erzielt.

Insgesamt 17,4% der vakzinierten Proben waren positiv mit einem 1(+) Infektionsgrad, während insgesamt 100% der Reizkontrollproben positiv waren (95,6% bei 4+, 4,4% bei 1+). Eine prozentuale Gesamtverminderung der Darminfektion von 82,6% wurde in den vakzinierten Tieren erzielt.

Eine weitere Analyse dieser Daten kann durchgeführt werden, die dem 4+ Infektionsgrad im Vergleich mit einem 1+ Infektionsgrad Signifikanz verleiht. Diese Analyse kann in Tabelle 4-2 gefunden werden.

Tabelle 4-2
CCV-Reizbestimmungsergebnisse und Diskussion
1. Temperaturreaktion Temperaturreaktion (100ºF) nach CCV-Reizung

* kritisch hohes Fieber

Die CCV-Reizung rief ein kritisch hohes Fieber (103,5ºF) in den CCV anfälligen Reizkontrollhunden am Tag 3, 4 bzw. 5 hervor. Alle vier Reizkontrollhunde zeigten an zwei aufeinanderfolgenden Tagen Temperaturen von 103,5ºF. Die mittlere Temperatur der Hunde 74 und 76 betrug 103,8 bzw. 104,3ºF am Tag 3 nach der Reizung und 104ºF am Tag 4 nach der Reizung. Hund 75 zeigte eine verzögerte Temperaturreaktion von 104 und 103,5ºF an den Tagen 4 und 5 nach Reizung.

Die CCV-vakzinierten Hunde zeigten während der 3 Tage, an denen sie beobachtet wurden, während der kritischen Fieberperiode keine Temperatur über 103ºC. Die CCV-Reizung bewirkte in CCV anfälligen Hunden eine signifikante fiebrige Reaktion und das CCV-Vakzin verhinderte diesen Temperaturanstieg.

2. WBC-Reaktion WBC-Zahl nach CCV-Reizung (x100)

Die kritische Phase für einen WBC-Abfall nach CCV-Reizung war an den Tagen 3, 4 und 5. Diese Daten zeigen, daß WBC- Beobachtung ein kritischer Parameter für das Hundecoronaviruskrankheitssyndrom sein kann.

3. Lymphozytenzahl Lymphozytenzahl nach CCV-Reizung (x100)

* kritische Tage

In den CCV-Reizkontrollhunden entwickelte sich eine Lymphopenie beginnend am Tag 1 mit Hund 76 und am Tag 3 mit Hund 74. Die Lymphopenie hielt bis zum Tag 5 nach Reizung an. Die weitere Analyse des prozentualen Lymphozytenabfalls ist im nachstehenden angegeben.

%Lymphozyten-Abfall nach CCV-Reizung

* kritische Tage

Lymphopenie mit über 50%iger Verminderung der Lymphozyten trat in 6 von 12 Beobachtungen der Reizkontrollhunde auf mit den schwersten Ereignissen an den Tagen 4 und 5 nach der Reizung. Hund 74 zeigte eine über 50%ige Lymphopenie an den Tagen 4 und 5 nach der Reizung. Hund 76 zeigte eine Lymphopenie von über 50% an den Tagen 3, 4, 5 und 7 nach Reizung und hatte den stärksten Abfall von 78% an den Tagen 4 und 5 nach Reizung.

4. Symptome

Symptome einer CCV-Infektion zeigten sich am Tag 3 nach Reizung und verliefen gleichzeitig mit der fiebrigen Reaktion und Lymphopenie. Symptome von Nasenausfluß, Anorexie, Entwässerung und Augenausfluß dauerten bis zum Tag 7 nach Reizung, dem letzten Tag der Beobachtung, an. Die CCV-Reizung rief signifikante CCV-Symptome in CCV anfälligen Hunden hervor.

Bestimmung von Virusreplikation im Darmtrakt von vakzinierten Tieren und Kontrollen 5 Tage nach Reizung

Insgesamt wurden 8 Stellen in der Trachea für Abstrichpräparate und 23 Stellen längs des Darmtraktes für die Bestimmung gewählt. Darmgeschabsel wurde auf Objektträger gegeben, mit Aceton fixiert und mit spezifischem Hundecoronavirus FA-Konjugat angefärbt. Der Replikationsgrad wurde bewertet als 4+ Infektion, 1+ Infektion oder kein Virus vorhanden. Die Ergebnisse dieser Bewertungen sind in den Tabellen 4-3 und 4-4 gezeigt.

Tabelle 4-3 Probenbewertung auf Hundecoronavirusreplikation

In keinem der Hunde wurde Tracheavirusreplikation festgestellt. Bei weiteren Bestimmungen des Prozentsatzes positiver Proben wurden die Tracheaproben ausgeschlossen.

Tabelle 4-4

Ein Infektionsindex von 178 für die Kontrollen gegenüber 8 der vakzinierten Tiere zeigt eine Verminderung der Infektion von 95,5% an.

Die Untersuchung beweist somit, daß die CCV-Reizung schwere, meßbare klinische Symptome von CCV-Erkrankung hervorrief und die CCV-Exposition im Darm festgestellt werden kann. Das CCV-Vakzin senkt den Infektionsgrad im Darm des vakzinierten Hundes und eliminiert die klinischen Symptome und das Fieber nach CCV-Exposition im Vergleich mit CCV anfälligen Reizkontrollhunden.

Beispiel 5:

Dieses Beispiel illustriert die Wirksamkeit der Vakzine.

Junge Hunde erwiesen sich in einem Serumneutralisationstest unter Verwendung von FA als CCV seronegativ. 22 der Tiere wurden mit einer Mindestdosis des Vakzins vakziniert. Einer Hälfte der Gruppe wurde das Vakzin subkutan und der anderen Hälfte der Gruppe das Vakzin intramuskulär verabreicht. Die vakzinierten Hunde wurden dann einzeln untergebracht, aber zusammen mit drei weiteren jungen Hunden, die als Umgebungskontrollen dienten, im gleichen Bereich gehalten. Die Tiere wurden 3 Wochen lang beobachtet. Es zeigten sich keine nachteiligen Wirkungen des Vakzins und es gab keine Anzeichen von Virusexposition der Umgebung.

Jedes vakzinierte Tier wurde so gehalten, um einen direkten Kontakt von Hund zu Hund zu verhindern. Diese Vorgehensweise wurde gewählt, um zu verhindern, daß ein vakzinierter Hund, der für Ausbreitung sorgen kann, unabsichtlich einen anderen vakzinierten Hund exponiert, der zum Zeitpunkt der Vakzination nicht immunisiert sein könnte. Die Umgebungskontrollen wurden im gleichen Bereich untergebracht, aber von den vakzinierten Tieren physisch getrennt gehalten. Diesen Tieren wurde während der Beobachtungsphase periodisch Blut entnommen und sie wurden am Tag 21 eingeschläfert. Darmgeschabselabstriche wurden angefertigt und durch direkte Fluoreszenzantikörperanfärbung untersucht. Durch serologische Auswertung der entnommenen Serumproben und Ausweiterung der Darmgeschabselabstriche wurde bestimmt, ob Hundecoronavirusexposition in der Umgebung erfolgt war.

21 Tage nach Vakzination wurden die vakzinierten Tiere und die Kontrollen anästhesiert, Blut wurde entnommen und die Tiere wurden intranasal-oral mit virulentem Reizvirus gereizt. Das Reizvirus wurde titriert, um die Viruszufuhr zu bestimmen. Die vakzinierten Tiere, die Kontrollen und die Reizumgebungskontrollen wurden im gleichen Gebäude untergebracht. Die vakzinierten Tiere und die Kontrollen wurden täglich auf Temperaturerhöhung, Lymphopenie, Leukopenie und andere Symptome von Corona-induzierter Erkrankung beobachtet.

Eine zufällige Auswahl von vakzinierten Tieren und Kontrollen zum Einschläfern und Bestimmen des Grades der Reizvirusreplikation im Darmtrakt erfolgte an den Tagen 5, 6 und 7 nach Reizung. Die Reizumgebungskontrollen wurden eingeschläfert und Abstriche von Darmtraktgeschabsel an den Tagen 6 und 7 untersucht.

Alle Versuchstiere wurden in Räumen untergebracht, wo die Temperatur nach der Reizung 50 bis 70ºF betrug.

Ergebnisse: A. Viruszufuhr (siehe Tabelle 2-1)

10 Replikattitrationen wurden für dem zum Vakzinieren der ersten Gruppe von vakzinierten Tieren verwendeten Virus durchgeführt. Ein mittlerer geometrischer Titer von 2,9 log Virus wurde verwendet.

B. Vergleich von Antikörperreaktion und geometrischem Gesamtdurchschnitt

Ein mittlerer geometrischer Titer von 1 : 138 491 wurde durch den subkutanen Vakzinationsweg erhalten. Der intramuskuläre Impfweg bewirkte eine serologische Reaktion mit einem geometrischen Mittelwert von 1 : 113 761. Zwischen den Verabreichungswegen und der erzielten serologischen Reaktion war kein signifikanter Unterschied erkennbar.

C. Vakzin-Umgebungskontrollen (siehe Tabelle 5-1 und 5-2)

Die drei als Umgebungskontrollen verwendeten Hunde erwiesen sich am Tag 0 und am Ende der Untersuchung als seronegativ.

Diese drei Hunde wurden eingeschläfert und ihre Darmtrakte durch Anfärben von Darmgeschabselabstrichen mit fluoreszierendem Antikörper auf Infektion untersucht. Die für jedes Tier untersuchten 18 Proben waren Hundecoronavirusnegativ.

Es wurde gefolgert, daß kein Hundecoronavirus vom "Wildtyp" die Einrichtung kontaminierte und die Untersuchung ungültig machte.

D. Titration des Reizvirus

Ein Isolat von Hundecoronavirus wurde für intranasal-orale Verabreichung an jeden vakzinierten und Reizkontrollhund hergestellt. Ein geometrischer Durchschnitt von 5,47 log pro ml wurde aus 7 Titrationen erhalten. Jedes Tier erhielt 2 ml Virus intranasal und 3 ml oral. Daher wurde jedes Tier mit 6,2 log Virus gereizt.

E. Beobachtungen und Bestimmungen nach Reizung 1. Temperaturreaktion

Es erfolgten 131 Beobachtungen für die subkutan und intramuskulär vakzinierten Gruppen. Es wurde keine Temperaturreaktion von über 103ºF festgestellt.

An den Reizkontrollhunden erfolgten 57 Temperaturbeobachtungen. Insgesamt 5 Beobachtungen oder 9,5% der Beobachtungen ergaben Werte über 103ºF. Diese Temperaturen waren 103,2, 103,2, 103,4, 103,6, 104,0 bzw. 105,0.

Das geringe Ausmaß der in den Reizkontrollhunden festgestellten Temperaturreaktion war in den vakzinierten Tieren nicht festzustellen.

2. Weiße Blutkörperchen (WBC)-Reaktion

Es wurde weder in den vakzinierten Hunden noch in den Reizkontrollhunden ein signifikanter WBC Abfall festgestellt.

3. Lymphozytenreaktion

Für die Reizkontrollhunde schien es einen signifikanten Abfall an Lymphozyten zu geben. 7 von 10 Reizkontrollhunden oder 70% hatten Lymphozytenabfälle von größer als oder gleich 60%. Nur 3 der gereizten vakzinierten Hunde (13%) hatten einen Lymphozytenabfall von über 60%, der in den vakzinierten Hunden 5,2-fach geringer war; ein 2,7-fach geringerer Abfall an Lymphozyten in den vakzinierten Hunden wurde festgestellt, wenn ein Lymphozytenabfall von 35% oder mehr in Betracht gezogen wurde, und ein 2,16-fach geringerer Abfgall der Lymphozyten in vakzinierten Hunden wurde festgestellt, wenn ein Lymphozytenabfall von 25% oder mehr in Betracht gezogen wurde.

Die Daten zeigten, daß das Reizvirus eine Wirkung auf die Reizkontrollhunde hatte und daß die Vakzination einen derartigen schweren Abfall an Lymphozyten in den immunisierten Tieren verhinderte.

4. Symptome der Krankheit

Die in diesem Reizversuch festgestellten Krankheitssymptome waren nicht so häufig wie in vorhergehenden Versuchen. Jedoch zeigten die Reizkontrollhunde mehr Symptome als die vakzinierte Gruppe. Ein Krankheitssymptom-Index wurde ermittelt durch Dividieren der Zahl von pro Testgruppe beobachteten Symptomen durch die Gesamtzahl von erfolgten Beobachtungen. Beispielsweise wurden 3 Symptome in den intramuskulär vakzinierten Hunden festgestellt. Insgesamt erfolgten 61 Beobachtungen. Daher betrug der Symptomindex 3/61 oder 0,049. In Tabelle 5-1 sind die Symptomindices für die Gruppen zusammengefaßt.

Tabelle 5-1

Eine Verminderung des Symptomindex von 92,8% wurde beim Vergleich der gesamten vakzinierten Gruppe mit den Reizkontrollhunden erhalten. Obwohl die Krankheitssymptome in den Kontrolltieren nicht häufig auftreten, verhinderte das Vakzin viele Symptome in den immunisierten Tieren signifikant.

Jedes der 10 Reizkontrolltiere zeigte Symptome, so daß der Symptomindex ein schweres Krankheitssyndrom in nur wenigen Kontrollhunden nicht reflektiert. 7 der 23 vakzinierten Hunde zeigten jeweils ein Krankheitssymptom.

5. Darminfektion - Bestimmung durch das FA- Ausstrichverfahren

Die Bestimmung des Infektionsgrades des Darmtraktes durch Reizvirus in den Kontrollhunden und den vakzinierten Hunden ist der kritischste Parameter zum Bestimmen der Wirksamkeit eines Hundevoronavirusvakzins. Die Gedärme wurden entfernt und in kaltem Leitungswasser leicht gewaschen. Die Teile wurden mit einem Skalpell geöffnet und Geschabsel entnommen. Das Geschabsel vom Darmepithel der Versuchstiere wurde direkt oder abgeachilfert auf Glasobjektträger gegeben. Die Probeentnahme erfolgte in jedem Tier an ungefähr derselben Stelle. Die Abstriche wurden 30 min bei 25ºC zweimal in 100% Aceton fixiert. Spezifisch markiertes Hundecoronaviruskonjugat wurde zum Anfärben jedes Abstriches während 1 h bei 37ºC verwendet.

Die Abstriche wurden in Carbonatpufferwaschflüssigkeit gewaschen und mit einer 50 W Quecksilber (HOB)-Lichtquelle beobachtet. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 5-2 bis 5-6 angegeben. Jedes Feld wurde beobachtet und ein Fluoreszenzwert im Bereich von Negativ bis 4+ wurde angegeben.

Tabelle 5-2 Beobachtungen von Darmgeschabselausstrichen von Reizkontrollhunden
Tabelle 5-3 Beobachtung von Darmgeschabselausstrichen von Hunden, eingeschläfert 5 Tage nach Reizung
Tabelle 5-4 Beobachtung von Darmgeschabselausstrichen von Hunden. eingeschläfert 5 Tage nach Reizung
Tabelle 5-5 Beobachtung von Darmgeschabselausstrichen von Hunden, eingeschläfert 5 Tage nach Reizung
Tabelle 5-6 Vergleich des infektiösen Index, der die Verminderung der Darminfektion anzeigt

Der infektiöse Index der Reizkontrollen betrug 1,47 bis 3,73 mit einem Durchschnitt von 2,345, während die kombinierte vakzinierte Gruppe von 22 Hunden einen infektiösen Index von 0,103 aufwies. Diese Daten zeigen, daß in den vakzinierten Hunden eine Verminderung der Darminfektion von 95,6% erzielt wurde.

Beispiel 6:

Dieses Beispiel illustriert Hundecoronavirus als ein Kombinationsprodukt.

Eine Pilotvakzinreihe wurde mit Hundecoronavirus und Hundeparvovirus als Komponenten wie folgt chargiert:

CCV-Flüssigkeiten 4,5 l

CPV-Flüssigkeiten 2,0 l

Stabilisator 2,2 l

fötales Kälberserum 0,1 l

in NaOH 0,08 l.

Die Materialien wurden unter Kühlen gemischt und aseptisch in einer Dosis von 1 ml in Flaschen gefüllt. Die Vakzinflaschen wurden dann getrocknet. Die Virusausbeuten waren wie folgt:

CCV 105,4 FAID&sub5;&sub0;/Dosis

CPV 106,5 FAID&sub5;&sub0;/Dosis

Es ist durchaus praktikabel, CCV als Kombinationsprodukt routinemäßig herzustellen und zu chargieren.

Dieser Teil der Untersuchung diente dazu, zu bestimmen, ob Antigenbeeinträchtigung auftritt, wenn Hundecoronavirus und Hundeparovirus zur Verabreichung als Kombinationsvakzin kombiniert werden.

Der Versuchsplan kann Tabelle 6-1 entnommen werden. Drei Gruppen von Hunden wurden verwendet. Gruppe I wurde mit einer vollen Dosis Hundecoronavakzin (1 ml) vakziniert. Gruppe II wurde mit einer vollen Dosis Hundecorona-Parvovirusvakzin (1 ml) vakziniert. Die dritte Gruppe wurde mit einer vollen Dosis Hundeparvovirus (1 ml) vakziniert. Ein Teil jeder Gruppe wurde intramuskulär (IM) vakziniert, während die übrigen Hunde subkutan (SC) vakziniert wurden. Den Hunden wurde am Tag 0 und auch 21 Tage nach Vakzination Blut entnommen.

Umgebungskontrollen wurde am Tag 0 und am Tag 21 ebenfalls Blut entnommen.

Tabelle 6-1 Versuchsplan für Antigenblockierungsuntersuchung

Fünf Replikattitrationen wurden mit jeder Virusfraktion durchgeführt. Die Daten zeigten eine Viruszufuhr von 4,5 log Coronavirus für Gruppe I, 5,5 log Hundeparvovirus für Gruppe III und 4,4 log Hundecoronavirus mit 5,5 log Hundeparvovirus für Gruppe II.

1. Testgruppe I - mit Hundecoronavirus vakziniert

Die Daten zeigten, daß ein mittlerer geometrischer Titer von 1 : 6498 gegen Hundecoronavirus erhalten wird.

2. Testgruppe II - mit Hundecorona-Parvovirus vakziniert

Die Hunde in Testgruppe II reagierten mit einem mittleren geometrischen Titer von 1 : 87 222 gegen Hundecoronavirus und einem mittleren geometrischen Titer von 1 : 58 579 gegen Hundeparvovirus 21 Tage nach Erhalt 1 Feld-Dosis Vakzine.

3. Testgruppe III - mit Hundeparvovirus vakziniert

Ein mittlerer geometrischer Titer von 1 : 65 893 wurde in dieser Testgruppe gegen Hundeparvovirus erhalten.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 6-2 zusammengefaßt.

Tabelle 6-2 Postserologische Hundecorona- und Parvoreaktion Zusammenfassung arithmetischer und geometrischer Durchschnitte

* Arithmetischer Durchschnitt

** geometrischer Durchschnitt '

Analyse auf Antigenblockierung a. Hundecoronavirus (siehe Tabelle 6-2)

Für das Hundecoronavirus wurde keine Antigenblockierung festgestellt. Ein mittlerer geometrischer Antikörpertiter von 1 : 87 222 wurde mit dem Kombinationsprodukt erzielt im Vergleich mit einer mittleren geometrischen Antikörperhöhe von 1 : 6498 mit dem Einzelprodukt gegen Hundecoronavirus. Ein Verstärkungseffekt wird mit dem Hundecoronavirus in Kombination erzielt. Eine 13,4-fache Erhöhung des Hundecoronavirusantikörpertiters wird bei Vergleich des Kombinationsproduktes mit dem Einzelprodukt erhalten.

b. Hundeparvovirus

Es gab keinen signifikanten Unterschied der Antikörpertiter gegen Hundeparvovirus, als das Kombinationsprodukt mit dem Einzelprodukt verglichen wurde. Ein mittlerer geometrischer Titer von 1 : 58 579 für das Kombinationsprodukt läßt sich gut mit einem mittleren geometrischen Titer von 1 : 65 893 für das Einzelprodukt vergleichen. Es wurde keine Antigenblockierung festgestellt.

Beispiel 7:

Dieses Beispiel illustriert ein Inaktivierungsverfahren.

Nicht-gefrorene Hundecoronavirusflüssigkeiten, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden durch binäre Äthyleniminaktivierung (BEI) inaktiviert. Eine Vorratslösung A von 0,2 molarem Bromäthylaminhydrobromid wurde durch Zugabe von 40,98 g zu entionisiertem Wasser hergestellt und auf 1000 ml gebracht. Die Lösung B war Natriumhydroxid, 0,4 molar. Diese wurde durch Zugabe von 16 g NaOH zu entionisiertem Wasser und Auffüllen auf 1000 ml hergestellt. Die Vorratslösungen wurden bei Raumtemperatur gelagert, bis sie zur Verwendung fertig waren. Vor der Verwendung wurden gleiche Volumina der Lösung A und B gemischt und zum Cyclisieren bei 37ºC inkubiert. Die cyclisierte Lösung wurde dann in einer Konzentration von 2% V/V den CCV-Flüssigkeiten zugesetzt. Die Flüssigkeiten wurden gründlich gemischt und 72 h bei 37ºC inkubiert. Am Ende dieser Inkubation wurden 20 ml sterile 1 molare Natriumthiosulfatlösung zugesetzt, um Neutralisation des BEI zu gewährleisten. Verdünnte und unverdünnte Proben der inaktivierten Flüssigkeiten wurde in anfällige Gewebekultur gegeben, um nicht-inaktiviertes Virus nachzuweisen. Mit der Gewebekultur wurden drei Passagen durchgeführt. Sie wurden mit fluoreszierenden Antikörper unter Verwendung von spezifischem CCV-Konjugat geprüft. Versuche ergaben vollständige Inaktivierung.

Beispiel 8:

Dieses Beispiel erläutert ein anderes Inaktivierungsverfahren.

Nicht-gefrorene Hundecoronavirusflüssigkeiten, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden mit β-Propiolacton (BPL) inaktiviert. Die Virusflüssigkeiten (in einem Volumen von 1 l) wurden mit 5 ml 1 n Natriumhydroxid gepuffert, um die aus den von der β-Propiolactonhydrolysierung freigesetzten sauren Produkten resultierende pn-Änderung zu kompensieren. Eine Hälfte von 1 ml konzentriertem BPL wurde den Flüssigkeiten zugesetzt. Die Flüssigkeiten wurden 24 h bei 4ºC ± 1ºC unter periodischem Rühren gehalten. Nach dieser Zeit wurden Flüssigkeitsproben entnommen, mit Gewebekultur inkubiert und mit einem Fluoreszenzantikörpertest auf nicht-inaktiviertes Virus getestet. Versuche ergaben eine vollständige Inaktivierung.

Beispiel 9:

Dieses Beispiel illustriert die Zugabe von Adjuvans zum aktivierten Virus.

Adjuvans 9A, Äthylenmaleinsäureanhydrid, wurde auf folgende Weise hergestellt. 150 g EMA 31 von Monsanto Artikel LC07 wurden in 3l entionisiertem Wasser gelöst und auf 85ºC erhitzt. Die Mischung wurde gerührt, bis das EMA 31 sichtbar gelöst war. Phenolrot, Artikel 7715, ICN Pharmaceuticals, wurde in einer Menge von 0,03 g zugesetzt. Der pH der Zubereitung wurde mit 174 ml 10 n Natriumhydroxid, Eastman Kodak Co., auf 6,8 eingestellt. Das Adjuvans wurde in 6 Glasflaschen mit Schraubverschluß in einer Menge von jeweils 500 ml verteilt und bei 15 psi Druck und einer Temperatur von 121ºC 2 h lang dampfsterilisiert.

Adjuvans 9B, eine wässerige CSMA-Suspension wurde auf folgende Weise hergestellt. 7,5 l Neocryl A-640, Artikel RL-414, wurden mit 7,5 l entionisiertem Wasser mit einem Gehalt von 70 g Natriumchlorid, Artikel KMPA, Mallinckrodt, gemischt. Die Zubereitung wurde gemischt und in 30 500 ml-Glasbehälter mit Schraubverschluß verteilt. Diese wurden 2 h bei einem Druck von 15 psi und einer Temperatur von 121ºC dampfsterilisiert.

25 l abgetötetes Hundecoronavirusantigen wurden mit 271,7 ml Adjuvans 9A vereinigt. Es gab eine pH-Verschiebung in den sauren Bereich und es erfolgte eine Einstellung mit 21 ml 1 n Natriumhydroxid, was zu einem pH von 7,5 führt. Der Mischung wurden 1902,6 ml Adjuvans 48 zugesetzt. Das gesamte Vakzin wurde gemischt und zum Testen und Bestimmen in 18 850 13 mm-Miniampullenvakzinbehälter, Endtyp I, gefüllt.

Beispiel 10:

Dieses Beispiel illustriert einen anderen Adjuvanszusatz zum inaktivierten Virus.

1 l Hundecoronavirusflüssigkeiten, die mit 2% BEI inaktiviert waren, wurden in diesem Verfahren verwendet. Die Adjuvantien wurden auf folgende Weise hergestellt:

Adjuvans 10A: Eine Äthylen-Maleinsäureanhydrid (EMA)- Lösung wurde auf folgende Weise hergestellt. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) wurde bei 0,01 M in entionisiertem Wasser hergestellt. 8 g Natriumchlorid (NaCl) pro 1 wurden mit 0,2 g Kaliumchlorid (KCl), 1,15 g dibasischem Natriumphosphat (Na&sub2;HPO&sub4;) und 0,2 g monobasischem Kaliumphosphat (KH&sub2;PO&sub4;) versetzt. 6300 ml PBS wurden zur Herstellung von EMA verwendet. PBS wurde auf 100ºC erhitzt. 315 g EMA 31 #LC07329 (Monsanto Co., 800 N. Lindberg Blvd., St. Louis, Missouri 63166) wurden zugesetzt und in PBS gelöst. 0,05 g Phenolrot wurden zugesetzt, um Gesamt-pH-Einstellungen zu erleichtern. Nach dem Lösen wurde der pH der Lösung mit 260 ml 10 n Natriumhydroxid (NaOH) auf 6,8 eingestellt. Die Lösung wird in 500 ml-Flaschen mit Schraubverschluß verteilt und durch Behandlung im Autoklaven während 2 h bei 121ºC und 15 psi sterilisiert.

Adjuvans 10B: Eine CSMA-Suspension, verdünnt in PBS, wurde auf folgende Weise hergestellt, 5 Gallonen der gleichen PBS, wie oben mit bezug auf Adjuvans 10A beschrieben, wurden mit 5 Gallonen Neocryl A640, Artikel RC-4570 (Polyvinyl Chemical Industries, 730 Main Street, Wilmington, Mass. 01887) gemischt. Die Suspension wurde gründlich gemischt und in 500 ml-Flaschen mit Schraubverschluß und 12 l-Krüge verteilt. Diese Behälter wurden zum Sterilisieren 3 h lang bei 121ºC und 15 psi im Autoklaven behandelt.

1 l der inaktivierten CCV-Flüssigkeiten wurde mit einem Magnetmischer gründlich gemischt. 60 ml Adjuvans 10A wurden zugesetzt. Unmittelbar danach wurden 10 ml 1 n NaOH zugesetzt, um den pH auf 7,34 einzustellen (bestimmt durch ein Orion pH- Meter). 100 ml Adjuvans 10B wurden zugesetzt. Die Mischung wurde 10 min gemischt und dann für Tierversuche in aliquote Teile: geteilt.

Beispiel 11:

Dieses Beispiel illustriert die Wirksamkeit verschiedener Adjuvantien mit inaktivierten Hundecoronaviren (CCV) KV.

52 Hunde, seronegativ und für CCV anfällig, wurden verwendet, um die Wirksamkeit verschiedener Adjuvanssysteme mit einem abgetöteten Hundecoronavirusvakzin zu demonstrieren. Alle Versuchshunde wurden mit einer Dosis des Produkts parenteral geimpft. Es wurde ein 2-Dosis-Vakzinationsschema verwendet. Neutralisierende Serum-Antikörperspiegel wurden 3 Wochen nach einer Impfung und 2 Wochen nach einer zweiten Impfung bestimmt.

Reziproke geometrische Mittelwerte für neutralisierende Serumantikörperspiegel

Alhydrogel und Reheis sind Markennamen für Aluminiumhydroxid. Die Daten zeigen, daß jede Zahl klassischer Adjuvanssysteme verwendet werden kann, um mit dem CCV KV- Produkt eine gute systemische Antikörperreaktion zu induzieren. Die Daten zeigen, daß das kombinierte Adjuvanssystem von EMA-31 und Neocryl-A640 hervorragend ist.

Beispiel 12:

Dieses Beispiel erläutert das Verfahren zur Vakzinbewertung.

Diese Untersuchung war dazu bestimmt, die Eignung und den Grad der Wirksamkeit eines inaktivierten Coronavirusvakzins zu bestimmen. Das in Beispiel 10 beschriebene Produkt mit Adjuvanszusatz wurde für diese Untersuchungen verwendet. Die Untersuchung würde auch bestimmen, ob eine Dosis oder zwei erforderlich wären, um den Hund adäquat zu schützen. 10 Hunde, die durch Serumneutralisationsversuche als CCV-seronegativ bestimmt wurden, wurden in der zweiteiligen Untersuchung verwendet. 6 der Hunde, Nr. 214, 222, 219, 220, 212 und 213, wurde eine 1 ml-Dosis Vakzin intramuskulär verabreicht. Diesen Hunden wurde an den Tagen 4, 7, 11, 14 und 21 nach der ersten Vakzination Blut entnommen, um die Reaktion auf das Vakzin serologisch zu beobachten. Die Hunde 214 und 222 zusammen mit Reizkontrollen, 244 und 245, wurden intranasal-oral mit I-171 Virus (ATCC VR-809) gereizt. 5 Tage nach der Reizung wurden die vier Tiere eingeschläfert und auf Anzeichen einer Coronavirusinfektion untersucht. Die Gesamtpathologie zeigte eine auffallende Entzündung des Dünndarmes in den Reizkontrollen (244 und 245). Die geimpften Tiere zeigten jedoch, wenn überhaupt, nur geringe Entzündungsanzeichen. Das gleiche traf bei Prüfung des Pankreas zu. Proben des Gehirns, der Hirnhäute, der Lunge, der Leber, der Milz, des Mesenteriums, der Mesenteriumlymphknoten, des Pankreas und 10 Proben in gleichem Abstand und von gleichen Stellen in den Gedärmen wurden von jedem Hund zum CCV-Nachweis durch Flureszenzantikörper-Exfoliation genommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12-1 angegeben. Tabelle 12-1

CCV-Hundeuntersuchung Eine Dosis abgetötete Hundecoronavirusvakzine CCV-FA-Exfoliationsergebnisse 5 Tage nach Reizung

Bei Vergleich des Infektionsgrades, wie durch Fluoreszenzantikörper-Exfoliation bewiesen, war ersichtlich, daß das Vakzin eine Virusinfektion der Gedärme wirksam verminderte. Ein Gesamtfluoreszenzantikörper (FA)-Durchschnitt von 52 1/4+ wurde in den Reizkontrollen gezeigt. Es zeigte sich, daß die vakzinierten Tiere einen FA Durchschnitt von 1/4 + aufwiesen. Dies ergab eine 99,5%ige Verminderung in den vakzinierten Tieren im Vergleich mit den Reizkontrollen. Ein modifiziertes Lebendvakzin ergab daher eine 95%ige Verminderung, was beweist, daß der durch das inaktivierte Vakzin gelieferte Schutz vergleichbar wäre.

Serumneutralisations (SN)-Versuche am Tag 14 und 21 nach der Vakzination und Blutentnahmen am Tag 5 nach der Reizung wurden durchgeführt. "KV" steht für "abgetötetes Virus". Die Ergebnisse sind in Tabelle 12-2 angegeben.

Tabelle 12-2 SN Ergebnisse nach einer Dosis KV CCV und Vergleich mit Reizkontrollen

Aus Tabelle 12-2 ist ersichtlich, daß ein 1 : 59 SN- Antikörperspiegel zum Schutz ausreichend ist. Beide vakzinierten Tiere reagierten mit einer Dosis Vakzin so, daß sie einen ausreichenden Serumneutralisationsantikörpertiter zusammen mit lokaler Zielimmunität aufwiesen, so daß Schutz vor Infektion gegeben ist. Die Reizkontrollen reagierten bei Reizung serologisch, was ein weiterer Beweis für ihre Reizung war. Die vakzinierten Tiere reagierten 5 Tage nach der Reizung in den ersten Stadien einer amnestischen Reaktion.

Die zweite Dosisphase der Untersuchung begann 21 Tage nach der ersten Vakzination. Den vier übrigen Hunden wurde eine zweite 1 ml-Dosis des inaktivierten CCV-Vakzins, intramuskulär verabreicht, gegeben.

Zwei Wochen nach der zweiten Vakzination wurden die vier vakzinierten Hunde 212, 213, 219 und 220 zusammen mit zwei anfälligen Coronakontrollhunden, 270 und 271, gereizt. Das I-171 (ATCC VR-809) Coronavirus wurde als Reizvirus verwendet. 5 ml pro Hund wurden intranasal und oral verabreicht. 5 Tage nach der Reizung wurden alle sechs Hunde eingeschläfert und Proben des Darms, der Milz, des Gehirns und der Hirnhäute für Exfoliation-Fluoreszenzantikörperuntersuchung zum Hundecoronavirusnachweis genommen. 10 Proben des Darms wurden genommen, aber nur einzelne Proben der anderen Organe. Die Exfoliationsergebnisse sind in Tabelle 12-3 zusammengefaßt.

Tabelle 12-3 Exfoliation CCV FA-Ergebnisse nach Reizung

Der Durchschnitt für die beiden Kontrollen auf CCV- Infektiosität betrugt 24,3. Der Durchschnitt für die vier vakzinierten Hunde betrug 1,25. Im Vergleich von vakzinierten Hunden mit Kontrollen betrug die Gesamtverminderung der Infektiosität 94,9%. Es wurde festgestellt, daß CCV- Virusreplikation in den Hirnhäuten der Kontrollen auftrat. Kein Anzeichen von Virus wurde in den Hirnhäuten der vakzinierten Tiere nach Reizung gefunden. Daher wurde den vakzinierten Tieren Schutz vor Hirnhautinfektion verliehen.

Beispiel 13:

Dieses Beispiel zeigt die Verträglichkeit von CCV KV mit anderen Virusfraktionen.

Ziel dieser Untersuchung war es, zu zeigen, daß das abgetötete Hundecoronavirusvakzin in Kombination mit Hundestaupevirus-, Hundeadenovirus Typ 2-, Hundeparainfluenza- und Hundeparvovirusvakzinen verwendet werden kann.

Versuchsplan 1. Vakzination

21 seronegative Hunde wurden mit einem 1 ml-Volumen der Immunogen-Serie vakziniert. 10 Hunde wurden subkutan vakziniert und 11 Hunde wurden intramuskulär vakziniert.

Den 21 vakzinierten Hunden und den sieben Umgebungskontrollen wurde zur Zeit der Vakzination, 21 Tage nach der Vakzination, zu welcher Zeit die vakzinierten Hunde wieder geimpft wurden, und 14 Tage nach der zweiten Vakzination Blut entnommen.

An allen vakzinierten Hunden erfolgten Antikörperspiegelbestimmungen für alle fünf Virusmittel, um die Höhe der Antikörperreaktion zu zeigen, die mit dem Kombinationsprodukt [DA2PC(KV)-CPV(MLV)] erwartet werden kann. Anhand dieser Daten sollte bestimmt werden, ob Antigenblockierung erfolgt.

Antigenverträglichkeit (siehe Tabelle 13-1)

Tabelle 13-1 ist eine zusammenfassende Tabelle, die die geometrischen Mittelwerte der Antikörpertiter für jede der im Kombinationsprodukt enthaltenen fünf Fraktionen angibt.

Die Daten belegen die Antikörpertiter, die für eine KV Kombinationsreihe mit einer Mindeststärke zu erwarten sind. Die Daten zeigen, daß alle vakzinierten Tiere auf Vakzination reagierten und daß keine Antigenblockierung auftrat. Die Reizdaten beweisen, daß die immunologischen Eigenschaften der KV CCV-Fraktion durch die vier anderen Virusfraktionen (CDV, CAV-2, CPI, CPV), die in dem Vakzin vorhanden waren, nicht beeinträchtigt wurden.

Tabelle 13-1 Geometrischer Mittelwert der Antikörpertiter

Beispiel 14:

Dieses Beispiel illustiert Hundecoronavirus-Kreuzneutralisation zwischen fünf verschiedenen Isolaten.

Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um die Kreuzneutralisationsbeziehungen (Serumneutralisation des Virus) zwischen verschiedenen Isolaten von Hundecoronavirus zu bestimmen. Spezifisches Antiserum für jedes einzelne Isolat wurde in anfälligen Hunden hergestellt. Serumneutralisations (SN)-Tests mit den verschiedenen Isolaten bei konstantem Gehalt oder Titer wurden gegenüber Zweifachverdünnungen der spezifischen Antisera durchgeführt. Mit anderen Worten, der Antikörper, der in den Hunden durch ein spezifisches Isolat induziert wurde, wurde hinsichtlich seiner Fähigkeit bewertet, verschiedene andere Virusisolate sowie das identische Virusisolat, das zum Induzieren des Antikörpers verwendet wurde, zu neutralisieren. Ein Virusisolat, das Antikörper induziert, welche die meisten Virusisolate neutralisieren, ist der beste Vakzinvirusanwärter. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der folgenden Tabelle gezeigt. Die spezifischen Antisera sind vertikal gegen die verschiedenen horizontal angegebenen Isolate aufgeführt. Der reziproke SN-Wert ist angegeben.

Die Daten wurden vom Standpunkt des Antikörpers analysiert, der alle fünf Viren neutralisieren würde. Der durch das Virusisolat mit der ATCC Nr. VR2068 induzierte Antikörper neutralisierte die anderen vier Viren in signifikantem Ausmaß.

A76-5 Antiserum und Virus erwiesen sich als am wenigsten kreuzreaktiv mit den fünf getesteten Isolaten. Es erwies sich, daß ATCC VR 2068 ein signifikantes Maß an Querreaktivität mit diesem Virusisolat zeigte.

Die Daten zeigen auch, daß es keine größeren serologischen Unterschiede zwischen diesen fünf Hundecoronaviren gibt. Die I-171- und ATCC VR 2068-Viren gelten als beste Wahl für Vakzinstämme, jedoch könnte auf Grund der Kreuzneutralisation zwischen allen Isolaten jedes der Hundecoronaviren als ein Antigen verwendet werden.

Beispiel 15:

Dieses Beispiel illustriert die Wirksamkeit des Vakzins.

28 CDV, CAV&sub2;, CPI, CCV und CPV seronegative Hunde wurden als vakzinierte Tiere und als Umgebungskontrollen verwendet. 21 Hunde wurden als geimpfte Tiere und 7 Hunde als Umgebungskontrollen verwendet. Die 7 Umgebungskontrollen zusammen mit 3 weiteren CCV-seronegativen Hunden wurden als Reizkontrollhunde verwendet. 31 Hunde wurden für die gesamte Untersuchung verwendet.

21 seronegative Hunde wurden mit einem 1 ml Volumen der Immunogen-Serie vakziniert. 10 Hunde wurden subkutan vakziniert und 11 Hunde wurden intramuskulär vakziniert. Den 21 vakzinierten Hunde und den 7 Umgebungskontrollen wurde zur Zeit der Vakzination, 21 Tage nach der Vakzination, zu welchem Zeitpunkt die vakzinierten Hunde wieder geimpft wurden, 14 Tage nach der zweiten Vakzination und 28 Tage nach der zweiten Vakzination, dem Tag der Reizung, Blut entnommen.

An allen Umgebungskontrollen wurden für alle 5 viralen Mittel Antikörperspiegelbestimmungen vorgenommen, um zu zeigen, daß während des Verlaufes der Untersuchung keine Fremdvirus- Exposition stattfand. Antikörperspiegelbestimmungen vor der Reizung wurden vorgenommen, um die Anfälligkeit der Reizkontrollhunde auf CCV zu zeigen.

Den 21 vakzinierten und den 10 Kontrollhunde wurde Blut entnommen, sie wurden anästhesiert und mit dem CCV I-171- Reizvirus gereizt. Jeder Hund erhielt 2 ml pro Nasenloch und 3 ml oral oder 5 ml Reizsubstanz pro Hund. 2 Tage vor der Reizung und 6 bis 7 Tage nach der Reizung erfolgten Zählungen der weißen Blutzellymphozyten.

Fünf auf subkutanem Weg vakzinierte Hunde, fünf auf intramuskulären Weg vakzinierte Hunde und fünf Reizkontrollhunde wurden 6 Tage nach der Reizung eingeaschläfert. Am 7. Tag nach der Reizung wurden fünf auf subkutanem Weg, sechs auf intramuskulärem Weg und fünf Reizkontrollhunde eingeschläfert.

Der Dünndarm wurde entfernt und 10 bis 13 Inch-Stücke von jedem Hund wurden zum Testen verwendet. Die zehn Teile wurden bei jedem Hund aus den gleichen Bereichen entnommen. Der erste Teil (Probe 1) wurde unmittelbar unter dem Magen genommen und der letzte Teil (Probe 10) wurde unmittelbar oberhalb der Verbindung Dünndarm-Dickdarm erhalten. Jeder Teil wurde abgeschabt und die Darmproben wurden in PBS suspendiert. Die die Zellsuspension enthaltenden Gläser wurden insgesamt auf Aussehen überprüft. Zellproben von jedem Glas wurden auf Objektträger gegeben, luftgetrocknet, mit Aceton fixiert und mit Hundecoronavirusantikörperkonjugat angefärbt. Diese Objektträger wurden dann untersucht, um das Ausmaß der Virusinfektion zu bestimmen, das in den Zellen bestand.

Ergebnisse und Diskussion A. Zählungen von weißen Blutzellen nach Reizung

Eine Verminderung der Zahl der weißen Blutkörperchen um mehr als 45% vom Grundwert wurde zum Zweck der Bewertung dieser Untersuchung verwendet.

Vakzinierte Tiere

Sechs Beobachtungen von WBC-Abnahmen um mehr als 45% des Grundwerts wurden bei den 65 WBC-Zählungen, durchgeführt an den subkutan geimpften Hunden, aufgezeichnet. Die WBC-Index (6 dividiert durch 65) betrug 0,092.

Drei Beobachtungen von WBC-Abnahmen um mehr als 45% des Grundwerts wurden bei den 72 WBC-Zählungen, durchgeführt an den intramuskulär geimpften Hunden, aufgezeichnet. Die WBC-Index-(3 dividiert durch 72) betrug 0,942.

Kontrollen

20 Beobachtungen von WBC-Abnahmen um mehr als 45% des Grundwerts wurden bei den 65 WBC-Zählungen, durchgeführt an den Reizkontrollhunden, aufgezeichnet. Die WBC-Index (20 dividiert durch 65) betrug 0,308 für die Reizkontrollen. Ein anderer Weg diese Daten auszudrücken ist: 30,8% der WBC-Zählungen, durchgeführt an den Reizkontrollhunden lagen 45% unterhalb der Grundwertzahlen vor der Reizung.

Diskussion

Die prozentuale Prävention der WBC-Abnahme unter 45% bei Vergleich der vakzinierten Tiere mit den Kontrollen beträgt 79,6%. Die WBC-Abnahme erfolgte zum Großteil an den Tagen 2 und 3. Tabelle 15-1 vergleicht den WBC-Abfall von vakzinierten Tieren gegenüber Kontrollen an verschiedenen Tagen.

Tabelle 15-1

Daher verleiht das Vakzin den vakzinierten Tieren einen signifikanten Schutz durch Verhinderung eines Abfallens der WBC-Zahlen.

B. Abfall der Zahl der Lymphozytenzellen nach Reizung

Eine Lymphozytenzellenzahlverminderung von mehr als 50% des Grundwerts wurde für die Zwecke der Auswertung dieser Untersuchung verwendet.

Vakzinierte Tiere

Sechs Beobachtungen einer Lymphozytenabnahme von mehr als 50% des Grundwerts wurden bei 65 Lymphozyten-Zählungen, durchgeführt an den Reizkontrollhunden, aufgezeichnet. Der Lymphozyten-Index (16 dividiert durch 65) betrug 0,246 für die Kontrollhunde.

Drei Beobachtungen einer Lymphozytenabnahme um mehr als 50% des Grundwerts wurden bei den 72 Lymphozyten-Zählungen, durchgeführt an den intramuskulär geimpften Hunden, aufgezeichnet. Die Lymphozytenzahlindex (3 dividiert durch 72) betrug 0,042 für diese Gruppe.

Kontrollen

16 Beobachtungen von Lymphozytenabnahme um mehr als 50% des Grundwerts wurden bei den 65 Lymphozyten-Zählungen, durchgeführt an den Reizhkontrollhunden, aufgezeichnet. Die Lymphozytenzahlindex (16 dividiert durch 65) betrug 0,246 für die Kontrollhunde.

Die Lymphozytenabnahmen traten am häufigsten am Tag 4 nach der Reizung bei 7 von 10 Hunden (70%) auf, die einen Abfall der Lymphozyten zeigen. Zwei andere Tage, die eine hohe Frequenz von Lymphozytenabfällen nach Reizung zeigten, waren Tag 3 mit 5 von 10 Hunden (50%) und Tag 2 mit 3 von 10 (30%).

Diskussion

Die prozentuale Verhinderung von Lymphozytenzahlabnahmen unter 50% bei Vergleich der vakzinierten Tiere mit Kontrollen betrug 73,2%.

Die Lymphozytenabnahme erfolgte zum Großteil an den Tagen 2, 3 und 4 nach Reizung. Tabelle 15-2 vergleicht die Lymphozytenabnahmen von vakzinierten Tieren im Vergleich zu Kontrollen an den Tagen 2, 3 und 4 nach Reizung.

Tabelle 15-2

Die Daten zeigen, daß das abgetötete CCV-Vakzin den vakzinierten Tieren einen signifikanten Schutz bei der Verhinderung der Lymphozytenabnahme nach Reizung verliehen hatte.

C. Darminfektion mit Hundecoronavirus nach Reizung Vakzinierte Tiere

Die 210 Darmproben wurden durch Anfärben mit fluoreszierendem Antikörper auf Anwesenheit von CCV-Virus untersucht.

In den Hirnhäuten keines der vakzinierten Tiere wurde eine Fluoreszenz, die typisch für das CCV-Virus ist, festgestellt.

Die Zahlen positiver Proben pro Infektionsgrad (4+ bis 1/8+) wurden addiert und für jeden Hund wurde die Gesamt-FA+ bestimmt. Der Infektions-Index für jeden Hund wurde nach folgender Methode berechnet.

Ein Gruppen-Infektionsindex wurde durch Addieren der Infekitions-Indeces der einzelnen Hunde und Dividieren durch die Gesamtzahl der Hunde in jeder Gruppe erhalten.

Der Infektions-Index für die subkutan vakzinierten Hunde betrug 0,0025, während der Infektions-Index für die intramuskulär vakzinierten Hunde 0,0034 betrug.

Der Infektions-Index variierte nicht signifikant zwischen den vakzinierten Tieren, die am Tag 6 und am Tag 7 untersucht wurden.

Kontrollen

Die 100 Darmproben wurden durch Anfärben mit fluoreszierendem Antikörper auf die Anwesenheit von CCV-Virus untersucht. 81 der 100 Proben (81%) waren viruspositiv. Der Infektionsgrad betrug 4+ (hochinfizierte Proben) bis negativ. Alle 10 Reizkontrollhunde (100%) zeigten CCV-Infektion des Darmtraktes.

3 der 10 Reizkontrollhunde (30%) zeigten in ihren Hirnhäuten CCV-typische Fluoreszenz.

Die Zahl von positiven Proben pro Infektionsgrad (4+ bis 1/8+) wurde verglichen. Die gleichen oben angewandten Berechnungsmethoden wurden für diese Daten verwendet.

Der Infektions-Index für die Reizkontrollhunde betrug 1,594. Der Infektions-Index variierte in gewissem Ausmaß zwischen Reizkontrollhunden, die am Tag 6 und am Tag 7 untersucht wurden. 90% der Proben der am Tag 6 untersuchten Kontrollhunde waren positiv, während 72% der Proben der Kontrollhunde, die am Tag 7 untersucht wurden, positiv waren. Der Infektionsgrad war am Tag 7 gegenüber dem Tag 6 um 36,5% niedriger. Alle Kontrollhunde waren mit CCV infiziert.

Diskussion

Es wurde ein Vergleich der vakzinierten Tiere und der Kontrollen betreffend die Schwere und das Auftreten von Darminfektion vorgenommen. Die Daten wurden auch zwischen dem 6. und 7. Tag nach den Beobachtungsphasen analysiert. Die Ergebnisse zeigen, daß der verliehene Schutzgrad nicht vom Vakzinationsweg abhängig ist.

Das Vakzin verminderte den Infektionsgrad in den vakzinierten Tieren um mindestens 99,7%. Die Daten basierend auf der Inzidenz von positiven Proben pro Testgruppe unabhängig vom Infektionsgrad zeigen, daß das Vakzin den Infektionsgrad in den vakzinierten Tieren um mindestens 96,5% verminderte. Die Daten, die von den am Tag 6 und 7 nach der Reizung beobachteten Proben erhalten wurden zeigen, daß durch das Vakzin eine 98,1%ige Verminderung der Darminfektion, in Bezug auf Schwere und Inzidenz, bewirkt wurde. Eine 97%ige Verminderung der Darminfektion, in Bezug auf Inzidenz, wurde durch das Vakzin bewirkt. Die Testparameter Temperaturreaktion, Reaktion der weißen Blutkörperchen und Lymphozytenreaktion sowohl für vakzinierte Tiere als auch für Kontrolltiere nach Reizung wurden zusammengefaßt. Es sei darauf verwiesen, daß CCV-Virus in den Hirnhäuten von 30% der Kontrollen festgestellt wurde, während kein CCV-Virus in den Hirnhäuten der vakzinierten Tiere festgestellt wurde.

D. Serologische Daten Umgebungskontrollen

Antikörperspiegelbestimmungen mit den sieben Umgebungskontrollen zeigten, daß keine Exposition mit fremdem CDV-, CAV-2-, CPI- oder CPV-Virus im Verlauf des Versuches erfolgte. Diese Antikörperspiegelversuche wurden mit Blutproben durchgeführt, die 5 Wochen nach der ersten Vakzination, entsprechend einem Zeitraum von 2 Wochen nach der zweiten Vakzination, entnommen worden waren.

Antikörperspiegel gegen Hundecoronavirus vor und nach Vakzination Vakzinierte Tiere

Die Antikörpertiter der vakzinierten Tiere zum Zeitpunkt der Vakzination, 3 Wochen nach der ersten Vakzination, 2 Wochen nach der zweiten Vakzination, 4 Wochen nach der zweiten Vakzination und 6 oder 7 Tage nach der Reizung zeigen, daß alle vakzinierten Tiere vor der Vakzination seronegativ waren. Die Daten zeigen, daß 20 von 21 vakzinierten Tieren (95,2%) auf die erste Vakzination serologisch reagierten. Der mittlere geometrische Titer betrug 1 : 7,9. Der mittlere geometrische Titer 2 Wochen nach der zweiten Vakzination stieg um das 7,6- fache auf einen Titer von 1 : 59,7. Alle vakzinierten Tiere hatten SN-Titer von mehr als oder gleich einem SN-Titer von 1 : 9. Der mittlere geometrische Titer 4 Wochen nach der zweiten Vakzination stieg weiter um das 1,57-fache auf einen Titer von 1 : 93,9. Der nierigste aufgezeichnete Antikörpertiter 4 Wochen nach der zweiten Vakzination betrug 1 : 34. Der subkutane Vakzinationsweg schien einen etwas höheren Antikörpertiter zu bewirken als der intramuskuläre Vakzinationsweg.

Die SN-Antikörperspiegel nach Reizung zeigen, daß in den vakzinierten Tieren nach Reizung ein niedrigerer Antikörperspiegel festgestellt wurde. Der Blutentnahmezeitpunkt 5 und 6 Tage nach Reizung ist wahrscheinlich zu früh für ein Auftreten von Amnesie. Möglicherweise könnte die Reizvirus- Antikörperwechselwirkung die beobachteten geringeren SN- Reaktionen erklären.

Kontrollen

7 der 10 Kontrollhunde dienten als Umgebungskontrollen sowie als Reizkontrollhunde. Die Hunde waren zum Zeitpunkt der Reizung seronegativ, was beweist, daß während der Untersuchung keine Umgebungsexposition mit CCV-Lebendvirus erfolgte. Dies bewies auch deren Anfälligkeit auf das Reizvirus.

Die Antikörperspiegel 6 und 7 Tage nach Reizung blieben niedrig. Dies ist nicht unerwartet. Eine Antikörperreaktion auf parenterale CCV-Impfung erfolgt nach 6 bis 9 Tagen. Die FA- Beobachtungen der Darmtraktproben zeigen, daß das Virus in den Hunden vorhanden war, doch war keine Serokonversion in einem 7 Tage-Intervall zwischen Reizung und Blutentnahme vor dem Einschläfern der Hunde erfolgt.

Die obigen Ergebnisse demonstrieren die zufriedenstellende Immunisierungsfähigkeit eines abgetöteten Hundecoronavirus (CCV)-Vakzins.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Herstellung einer Veterinärvakzin- Zusammensetzung, enthaltend eine ausreichende Menge von Hundecoronavirus(CCV)-Antigen zur Erzeugung einer Immunreaktion beim Hund, einen pharmazeutisch akzeptablen veterinärmedizinischen Träger und mindestens ein Adjuvans, welches Verfahren die Gewinnung des CCV-Antigens durch Inokulieren von Gewebezellkulturen von Säugern mit CCV, die Kultivierung der Zellen in eine dichte konfluente Einzelzellschicht vor dem Inokulationsschritt oder innerhalb von 24 Stunden ab dem Inokulationsschritt, das Ernten der Zellen innerhalb von 96 Stunden ab der Inokulation und die Inaktivierung sämtlicher Viren in den geernteten Flüssigkeiten, wobei der Präinaktivierungsvirustiter in dem Verfahren mindestens etwa 1000 Virusteilchen pro ml, gemessen durch die FAID&sub5;&sub0;- Methode, beträgt, und das Formulieren des erhaltenen CCV- Antigens mit dem Träger und dem Adjuvans umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Präinaktivierungstiter etwa 4,010 g Virusteilchen pro ml beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin etwa zur Inokulationszeit die Zellen in einer Menge vorhanden sind, die zur Bildung einer Einzelzellschicht mit mindestens 100000 Zellen pro cm² ausreicht.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Zellen in einer Menge vorhanden sind, die zur Bildung einer Einzelzellschicht mit etwa 150000 Zellen pro cm² ausreicht.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Zellen in einem Verhältnis von CCV-Viren, gemessen durch die FAID&sub5;&sub0;-Methode, zu Zellen von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 500 mit CCV inokuliert werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Zellen in einem Verhältnis von CCV-Viren, gemessen durch die FAID&sub5;&sub0;-Methode, zu Zellen von etwa 1 : 100 mit CCV inokuliert werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das inokulierte Virus vor der Kultivierung weniger als 300 Minuten in einem Kulturmedium auf den Zellen absorbiert wird.

8. Verfahren zur Herstellung einer Veterinärvakzin- Zusammensetzung, enthaltend eine ausreichende Menge von Hundecoronavirus(CCV)-Antigen zur Erzeugung einer Immunreaktion beim Hund, einen pharmazeutisch akzeptablen veterinärmedizinischen Träger und mindestens ein Adjuvans, welches Verfahren die Gewinnung des CCV-Antigens durch Inokulieren von Gewebezellkulturen von Säugern mit CCV, das Ernten der Zellen, nachdem Virustiter von mindestens 2000 Teilchen pro ml, gemessen durch die FAID&sub5;&sub0;-Methode, erreicht worden sind, das Sammeln des von Lebendvirus freien CCV- Antigens und die Formulierung des erhaltenen CCV-Antigens mit dem Träger und dem Adjuvans umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Zellen in einer Menge vorhanden sind, die zur Bildung einer Einzelschicht mit mindestens etwa 100000 Zellen pro cm² ausreicht, und die Zellen in einem Verhältnis von CCV-Viren, gemessen durch die FAID&sub5;&sub0;-Methode, zu Zellen von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 500 mit CCV inokuliert werden.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, worin die Zellen geerntet werden, nachdem Virustiter von mindestens 410 g Virusteilchen, gemessen durch die FAID&sub5;&sub0;-Methode, erhalten sind.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, worin die Zellen innerhalb von 96 Stunden oder weniger nach der Inokulierung geerntet werden.

12. Verfahren zur Herstellung einer Veterinärvakzin- Zusammensetzung, enthaltend einen pharmazeutisch akzeptablen veterinärmedizinischen Träger, zumindest ein Adjuvans zur Förderung der Immunreaktion und eine ausreichende Menge Coronavirusantigen zur Erzeugung einer protektiven Immunreaktion bei Hunden, die bei einer späteren virulenten Hundecoronavirus(CCV)-Exposition eine Reduktion der Darminfektion von mindestens etwa 80% bewirkt, welches Verfahren die Gewinnung des CCV-Antigens durch Inokulieren von Gewebezellkulturen von Säugern mit einem Impfvirus zur Erzeugung von CCV-Antigen, die Kultivierung der Zellen zu einer dichten konfluenten Einzelzellschicht vor dem Inokulationsschritt oder innerhalb von 24 Stunden ab dem Inokulationsschritt in einer Menge, die zur Bildung einer Einzelzellschicht mit mindestens 100000 Zelle pro cm² ausreicht, gegebenenfalls das Absorbieren des Impfvirus an den Zellen über einen Zeitraum von bis zu 300 Minuten, das Ernten der Zellen, nachdem Virustiter von mindestens 410 g Teilchen pro ml, gemessen durch die FAID&sub5;&sub0;-Methode, erreicht worden sind, das Sammeln des von Lebendvirus freien Antigens und das Formulieren des erhaltenen CCV-Antigens mit dem Träger und dem Adjuvans umfaßt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin die Zellen zum Zeitpunkt der Inokulation in einer Menge vorhanden sind, die zur Bildung einer Einzelzellschicht mit mindestens 100000 bis 1.000.000 Zellen pro cm² ausreicht.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 13, worin die Zellen mit ausreichendem Virus inokuliert werden, um ein minimales Infektionsmultiplizitätsverhältnis von etwa 1 : 500 zu erreichen.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, worin das Impfvirus 60 Minuten lang an den Zellen absorbiert wird.

16. Verfahren zur Herstellung eines Hundecoronavirus(CCV)- Vakzins, umfassend die folgenden Schritte:

a) Inokulieren von Gewebekulturzellen von Säugern mit einer CCV-Menge (gemessen durch die FAID&sub5;&sub0;-Methode), die zur Erzielung eines minimalen Infektionsmultiplizitätsverhältnisses (MOI) von etwa 1 : 500 ausreicht;

b) Kultivieren der Zellen zu einer dichten konfluenten Einzelzellschicht vor dem Inokulationsschritt oder innerhalb von etwa 12 bis 48 Stunden ab dem Inokulationsschritt, wobei die Zellen zur Zeit der Inokulation in einer Menge von mindestens etwa 100000 Zellen pro cm² vorhanden sind;

c) Ernten der Zellen innerhalb von 96 Stunden ab der Inokulation zur Gewinnung des CCV-Antigens;

d) Inaktivieren des mit den Zellen geernteten CCV-Virus zur Gewinnung einer inaktivierten CCV-Antigenzusammensetzung;

e) Zusetzen mindestens eines Adjuvans zur inaktivierten CCV- Antigenzusammensetzung; und

f) Herstellen des CCV-Vakzins, enthaltend die inaktivierte CCV-Antigenzusammensetzung, einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und zumindest ein Adjuvans.

17. Veterinärvakzinzusammensetzung, umfassend ein von Lebendvirus freies Hunde-Coronavirusantigen in einer parenteral wirksamen Menge zur Erzeugung systemischer Immunität und lokaler Immunität im Darm von Hunden gegen eine Infektion mit virulentem Hundecoronavirus, einen pharmazeutisch akzeptablen veterinärmedizinischen Träger und zumindest ein Adjuvans.

18. Veterinärvakzinzusammensetzung, umfassend ein von Lebendvirus freies Hunde-Coronavirusantigen in einer zur Erzeugung von alpha-Immunglobulin(IgA)-Antikörpern und zur Induktion von lokaler Immunität im Darm gegen infektiösen Hundecoronavirus ausreichenden Menge, einen pharmazeutisch akzeptablen veterinärmedizinischen Träger und zumindest ein Adjuvans.







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