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Dokumentenidentifikation DE69331828T2 12.12.2002
EP-Veröffentlichungsnummer 0651784
Titel HEFEART DIE DAS GEN DER LAKTATDEHYDROGENASE DER MILCH EXPRIMIERT, UND VERWENDBARE VEKTOREN ZUR HERSTELLUNG DIESER ARTEN
Anmelder Institut National de la Recherche Agronomique, Paris, FR
Erfinder DEQUIN, Sylvie, F-34000 Montpellier, FR;
BARRE, Pierre, F-34980 S.-Gely-du-Fesc, FR
Vertreter WINTER, BRANDL, FÜRNISS, HÜBNER, RÖSS, KAISER, POLTE, Partnerschaft, 85354 Freising
DE-Aktenzeichen 69331828
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument FR
EP-Anmeldetag 22.06.1993
EP-Aktenzeichen 939131710
WO-Anmeldetag 22.06.1993
PCT-Aktenzeichen PCT/FR93/00618
WO-Veröffentlichungsnummer 0009400554
WO-Veröffentlichungsdatum 06.01.1994
EP-Offenlegungsdatum 10.05.1995
EP date of grant 17.04.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.12.2002
IPC-Hauptklasse C12N 1/19
IPC-Nebenklasse C12N 15/81   C12N 15/52   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Hefen die eine gemischte alkoholische/Milchsäure-Fermentation zeigen.

Beide dieser Hauptfermentationsarten von Zuckern werden traditionell in der landwirtschaftlichen Nahrungsmittelindustrie verwendet: alkoholische Fermentation, für die Hefen des Typs Saccharomyces verantwortlich sind, führt hauptsächlich zur Bildung von Ethanol und CO&sub2;; und Milchsäurefermentation (Milchsäurebakterien) führt zur Bildung von Milchsäure.

Alkoholische- und Milchsäurefermentation besitzen metabolische Reaktionswege, die bis zum Pyruvat fast gleich verlaufen. In diesem Stadium wird das Zwischenprodukt durch zwei finale Elektronenakzeptorsysteme unterschiedlich behandelt. In der alkoholischen Fermentation wird Pyruvat zum Acetaldehyd decarboxyliert, wobei die letztere Verbindung durch eine Alkoholdehydrogenase zu Ethanol reduziert wird; in der Milchsäurefermentation wird Pyruvat direkt durch eine Laktatdehydrogenase (LDH) zum Laktat reduziert.

Die Mikroorganismen, die in der landwirtschaftlichen Nahrungsmittelindustrie verwendet werden, besitzen den einen oder den anderen dieser zwei metabolischen Reaktionswege und führen ausschließlich die eine oder die andere dieser zwei Fermentationen aus.

Die Erfinder nahmen sich vor, einen Hefestamm herzustellen, der in der Lage ist, sowohl die alkoholische Fermentation als auch die Milchsäurefermentation durchzuführen, was in einer Fermentation mit einem Ergebnis resultiert, das zwischen diesen beiden Arten liegt.

Das Prinzip der Herstellung, das von den Erfindern ausgeführt wurde, bestand aus dem Klonieren des Gens für Laktatdehydrogenase aus einem GRAS Milchsäurebakterium (Lactobacillus casei) und darin, die Expression dieses Gens in Saccharomyces zu erreichen, um hierin am Ende des Kohlenstofffluxes ein Elektronenakzeptorsystem zu etablieren, welches mit dem "wild type" System im Wettbewerb steht.

Solch eine Konstruktion wurde noch nie im Stand der Technik vorgeschlagen, da es generell akzeptiert war, daß drei Hauptgruppen von Hindernissen dem Funktionieren dieses Systems im Wege stehen könnten:

- keine oder eine nicht ausreichende Expression des bakteriellen Gens in Saccharomyces;

- ein nicht kompetitives Funktionieren des eingeführten Akzeptorsystems;

- eine Inkompatibilität zwischen dem Funktionieren des Systems und der Lebensfähigkeit und Fermentationsaktivität von Saccharomyces, was beispielsweise aus einem Problem der Membrantranslokation des Laktats resultiert.

Nun haben es die Erfinder überraschenderweise geschafft, ein lebensfähiges und funktionales System zu erhalten, welches zu der Abspaltung eines großen Teiles des Kohlenstofffluxes zum Laktat führt.

Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Hefestämme, welche mindestens eine Kopie eines für die LDH eines Milchsäurebakteriums kodierenden Genes, unter der Kontrolle von Sequenzen, die die Expression dieses Gens in Hefe regulieren, enthalten.

Mit "Sequenzen, die die Expression eines, Gens regulieren" sind Sequenzen des Promoter- oder Terminatortyps gemeint, die in Hefe aktiv sind. Die Promoter oder Terminatoren unterschiedlicher Gene können kombiniert in verschiedenen Kombinationen verwendet werden. Die per se bekannten Promotoren und Terminatoren von Alkoholdehydrogenase I (ADHI), Phosphorglyceratkinase (PGH) und Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) Gene können im Rahmen eines nicht limitierenden Beispiels genannt werden.

Die Erfindung umfaßt ebenso die Expressionskassette, die durch Kombination der Regulationssequenzen und des LDH-Gens erhalten werden; diese Kassette kann durch ein Plasmid getragen werden oder in die chromosomale DNA des Hefewirts integriert werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gehören diese Hefen zu dem Genus Saccharomyces.

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das exprimierte Gen das für Lactobacillus casei LDH.

Damit das integrierte Gen in Hefe exprimiert wird, wird das GTG Initiierungskodon vorher zu ATG modifiziert.

Die Erfindung umfaßt ebenso Expressionsvektoren, die eine Expressionskassette, wie oben definiert, umfassen und welche verwendet werden können, um die gemäß der Erfindung transformierten Hefestämme zu erhalten.

Diese Vektoren können auf der Basis der Art und Stärke der Regulationselemente, die die Expressionskassette ausmachen, ausgewählt werden. Es ist möglich, die Promotoren und Terminatoren, die oben beschrieben sind oder irgend eine andere Sequenz, die die Kontrolle der Expression eines Gens in Hefe ermöglicht, auszuwählen.

Ein anderes Kriterium für die Wahl der Vektoren liegt in deren copynumber des letzteren, welche durch die Wahl des Replikationsorigins bedingt ist.

Es ist möglich zu erwählen, das mit seinen Kontrollsequenzen ausgerüstete LDH-Gen in das Hefegenom zu integrieren, im welchen Fall ein Integrationsvektor (YIp), der kein Replikationsorigin in Hefe besitzt, beispielsweise ausgewählt werden kann; es ist auch möglich, dieses Gen unter Verwendung anderer Techniken, z. B. Co-Transformation, zu integrieren.

Falls es für das LDH Gen vorzuziehen ist, durch ein Plasmid getragen zu werden, kann eine Wahl zwischen den folgenden Vektoren getroffen werden:

Replikativer high-copy-number-Vektor (YEp), der einen Teil des endogenen 2 u-Plasmids als Replikationsorigin in Hefe besitzt;

Replikativer high-copy-number-Vektor (YRp), der eine chromosomale ARS Sequenz als Replikationsorigin besitzt;

Replikativer, linearer high-copy-number-Vektor (YLp), der Telomersequenzen als Replikationsorigin besitzt; Replikativer low-copy-number-Vektor (YCp), der eine chromosomale ARS Sequenz und eine zentromerische Sequenz besitzt.

Vorzugsweise enthalten die erfindungsgemäßen Vektoren auch Marker, die in Hefe auswählbar sind, wie Marker für Auxotrophie: URA&sub3;, LEU&sub2;, HIS&sub3;, TRP&sub1;, ADE und ähnliches und/oder Resistenzmarker gegen Antibiotika (G418, Hygromycin B, Chloramphenikol, Phleomycin), gegen Herbicide (Sulfometuronmethyl), gegen Kupfer und ähnliches.

Vorteilhafterweise sind die erfindungsgemäßen Vektoren Shuttle-Vektoren, die auch einen bakteriellen Replikationsorigin und einen in Bakterien selektierbaren Marker (z. B. ein Antibiotikaresistenzgen) besitzen.

Die erfindungsgemäßen Plasmide, die das für die LDH eines Milchsäurebakteriums kodierende Gen tragen, können durch verschiedene Transformationstechniken in alle Hefestämme eingeführt werden.

Unter den geläufigsten Transformationstechniken kann die Protoplasttechnik, die Technik, bei der Zellen für Lithiumsalze durchlässig gemacht werden, und Elektroporation erwähnt werden.

Es ist möglich, den Expressionslevel des für LDH kodierenden Genes und damit das Ethanol/Laktat-Verhältnis durch Variation von insbesondere der Anzahl der Kopien des in die Hefe eingeführten LDH-Gens und/oder der Stärke der hiermit verbundenen Regulationselemente zu modulieren.

Die Herstellung verschiedener, erfindungsgemäßer Stämme, die LDH in verschiedenen Ausmaßen exprimieren, kann entsprechend der erwünschten Verwendung durchgeführt werden, welche das erwünschte Ethanol/Laktat-Verhältnis festlegt.

In allen Fällen umfaßt das Verfahren für die Herstellung die folgenden Schritte:

Herstellung einer Expressionskassette, die das LDH Gen und Regulationselemente von variabler Stärke gemäß des erwünschten Ethanol/Laktat-Vehältnisses umfaßt;

Einführung dieser Kassette, entweder als einfache oder als vielfältige Kopie (entsprechend dem erwünschten Ethanol/Laktat-Verhältnis) in Hefe.

Die erfindungsgemäßen Hefestämme haben viele Anwendungen in der landwirtschaftlichen Nahrungsmittelindustrie. Sie können überall da verwendet werden, wo alkoholische Fermentation durch biologische Ansäuerung (z. B. Herstellung von Cidre aus nicht ausreichend sauren Äpfeln, Herstellung von sogenannten Sauerteig-Brotteigen, Kefir-artige Milchprodukte, u.s.w.) oder durch Senkung des Ethanoloutputs begleitet ist.

Dies ist insbesondere auf dem Gebiet der Weinkunde vorteilhaft:

um den Mangel an Säure einer ansteigenden großen Anzahl von Weinen, insbesondere in warmen Regionen, auszugleichen;

um in der Lage zu sein, von den Vorteilen der malolaktischen Fermentation (biologische Stabilisierung des Produktes) zu profitieren, auch wenn dies zu einer exzessiv-extensiven Entsäuerung führt, durch dessen Kompensation durch eine Ansäuerung;

um Weine oder Getränke mit einem reduzierten Ethanolgehalt herzustellen.

Zusätzlich, wenn die Abweichung von der alkoholischen Fermentation zum Äußersten getrieben wird, würden transformierte, erfindungsgemäße Saccharomyces-Hefen es ermöglichen, Bakterien zu ersetzen, die die Laktatfermentation ausführen. Diese Hefen würden die folgenden Vorteile besitzen: Unempfindlichkeit gegenüber Phagen, Wachstum in einem nahrungsmittelarmen Medium, Wachstum in einem saurem Medium, Wachstum bei niedrigeren Temperaturen. Sie könnten auch für die industrielle Produktion von Milchsäure eingesetzt werden.

Ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung wird durch die folgende zusätzliche Beschreibung erreicht werden, welche sich auf Beispiele für die Konstruktion transformierter, erfindungsgemäßer Hefestämme, ebenso wie auf die Demonstration der Fermentationsaktivität, bezieht.

Es ist jedoch selbstverständlich, daß diese Beispiele nur zur Illustration des Gegenstands der Erfindung gegeben sind und in keiner Weise eine Limitierung desselben darstellen.

Beispiel 1 Klonieren des Gens der L. casei I DNA A) Konstruktion einer L. casei I DNA Bibliothek in E. coli a) Extraktion von L. casei DNA

Der Lactobacillus casei Stamm ATCC 393 wurde verwendet. Er wurde in MRS Medium kultiviert, dessen Zusammensetzung wie folgt war: Polypeptone 10 g/l, Hefeextrakt 5 g/l, Fleischextrakt 10 g/l, Glukose 2 g/l, Dikaliumphosphat 2 g/l, Natriumazetat 5 g/l, Ammoniumzitrat 2 g/l, Magnesiumsulphat 0,2 g/l, Mangansulphat 0,05 g/l, Tween 80 /ml/l.

15 ml MRS Medium wurden mit L. casei inokuliert und bei 37ºC über Nacht inkubiert. 500 ml desselben Mediums wurden mit den 15 ml der hierbei erhaltenen Vorkultur inokuliert und bei 37ºC bei sanftem Schütteln bis zu einem OD (550 nm) von 3,9 inkubiert.

Die DNA wurde gemäß LERCH et al. [Yeast. 7: 253- 263,(1989)] extrahiert und auf einem Cäsiumchloridgradienten in der Gegenwart von Ethidiumbromid [MANIATIS et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)] aufgereinigt.

Das Ethidiumbromid wurde mit Isobutanol (2x) und mit Isoamylalkohol (2x) extrahiert. Nach Verdünnung mit dem 2-fachen Volumen Wasser, wurde die DNA mit 6 Volumen Ethanol präzipitiert.

Das Präzipitat wurde unter Verwendung eines Stabes zurückgewonnen und in 2 ml TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5) gelöst.

Die Konzentration der DNA in Lösung wurde durch Messung des ODs bei 260 nm bestimmt.

b) Verdauen von L. casei DNA

60 ug L. casei DNA werden mit 8 units Sau3A Enzym für 40 Min. bei 73ºC partiell verdaut.

Die Mischung wird mit Phenol, Phenol-Chloroform und Chloroform extrahiert und mit Alkohol präzipitiert.

Nach der Zentrifugation wird die DNA in 300 ul TE aufgenommen und die Fragmente werden auf einem Sukrose- Gradienten für 15 Stunden bei 25000 U/min getrennt.

0.5 ml Fraktionen werden geerntet und auf einem 0,8% Agarose-Gel analysiert. Die Fraktion, die 2-4 kb Fragmente enthält, wird gegen TE 4 Stunden lang dialysiert.

c) Ligation der verdauten DNA in den Vektor pUC18

Die verdaute DNA wird dann in den dephosphorylierten Vektor pUC18Bam HI (Appligene) zur Herstellung der Bibliothek unter den folgenden Bedingungen ligiert:

UC18BdP 5 ul (250 ng)

DNA verdaut 10 ul (1 ug)

APPLIGENE T Ligation 5X 10 ug

APPLIGENE Ligase 5 ul

Wasser 20 ul

Die Mischung wird 18 Stunden lang bei 14ºC inkubiert.

d) Transformation von E. coli

Der E. coli Stamm DH5α (GIBCO BRL) des Genotyps: F&supmin;; endA1; hsdR17 (K&supmin;, mK&supmin;); supE44; Thi-1; λ&supmin;; recA1; gyrA96; relA1, wurde verwendet.

Die Protokolle, die für die Herstellung der kompetenten Bakterien und die, die für die Transformation verwendet worden sind, sind durch HANAHAN beschrieben [in DNA Cloning, vol. 1 DM Glover (ed) IRL Press, 109-135 (1985)].

Die Ligationsmischung wurde verwendet, um kompetente DH5α Bakterien zu transformieren. Die erhaltenen Kolonien wurden auf LB Platten selektiert (Bactotrypton 10 g/l, Hefeextrakt 5 g/l, Natriumchlorid 10 g/l) + Ampizillin (50 ug/ml). 92% der Klone hatten ein Insert der erwarteten Größe (2-4 kb)

B) Amplifizierung eines Fragmentes des LDH Genes durch PCR

Auf der Basis der Proteinsequenzen von Lactobacillus casei L-LDH, publiziert durch HENSEL et al. [Eur. J. Biochem. 134; 503-511, (1983)], wurden zwei Mischungen von Oligonukleotiden synthetisiert. Der Primer 4122 ist von den Aminosäuren 5 bis 10 abgeleitet: Asp-Lys-Asp-His- Gln-Lys und der Primer 5036 ist von den Aminosäuren 262 bis 267 abgeleitet: Tyr-Met-Asp-Gly-Tyr (Kim et al. 1991).

4122:

5'-GA(C,T)-AA(G,A)-GA(C,T)-CA(C,T)-CA(G,A)-A-(A)-3'

5036:

5'-TA-(C,T)TG-(ACTG)CC-(G,A)TC-CAT-(G,A)TA-3'

Die zwei Primer wurden verwendet, um ein Fragment des L. casei L-LDH-Gens aus der aus dem Stamm isolierten Gesamt-DNA zu amplifizieren; die Größe des amplifizierten Fragmentes ist 785 Basenpaare. Die Amplifizierung wurde wie folgt durchgeführt:

Primer 4122 5 ul (100 pmoles)

Primer 5036 7,2 ul (100 pmoles)

Taq Buffer 10X 10 ul

Taq (BECICMAN) 5 u/ul 0,5 ul

dNTP (2 mM) 10 ul

DNA L. casei (10 ng/ul) 10 ul (100 ng)

Wasser 57 ul

Taq Buffer 10X: 100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 500 mM KCl, 15mM MgCl&sub2;

Amplifizierungsbedingungen:

Eine Minute bei 94ºC, eine Minute bei 55ºC, 2 Minuten bei 72ºC, 30 Zyklen lang auf einem TECHNE PHC2 Amplifier.

Das Amplifizierungsprodukt wird auf einem 1,5% Agarosegel analysiert und die entsprechende Bande (785 Basenpaare) wird entfernt. Die DNA wird aus einer MILLIPORE-ULTRAFREE-Säule eluiert, aufgereinigt durch konventionelle Phenolextraktionen, präzipitiert mit Alkohol, dann zentrifugiert und in TE-Puffer aufgenommen.

C) Screenen der Bibliothek a) Markieren des 785 Basenpaarfragmentes

Das amplifizierte Fragment wird mit ³²P durch die Multiprimetechnik unter Verwendung des "Rapid hybridization system Multiprime"-Kits (AMERSHAM) markiert. Die DNA wird bei 100ºC für 3 Minuten denaturiert und dann sofort eisgekühlt. Die Markierung wird unter den folgenden Bedingungen ausgeführt:

DNA 785 Basen 12 ul (100 ng)

Markierungspuffer 10 ul

Hexanukleotide 5 ul

dCTP (³²P) (3000 ci/mmol) 4 ul

Klenow 2 ul

H&sub2;O 17 ul

für 2 Stunden bei 37ºC.

Die markierte Sonde wird aus den Nukleotiden durch Filtration durch eine NENSORB-Säule (NEN) abgetrennt. Die Radioaktivität der eluierten Fraktionen wird durch Zählen in einem Scintillationszähler bestimmt.

b) Herstellung der Filter

Nach der Transformation der DH5α-Bakterien mit einem Aliquot der Ligationsmischung, die die Bibliothek enthält, wurden 4000 Ampr Klone auf LB + Ampizillin- Platten erhalten, was etwa die dreifache Größe des Genoms darstellt.

Die bakteriellen Kolonien werden auf Nylonmembranen übertragen (HYBOND N, AMERSHAM) und die DNA gemäß der GRUNSTEIN- und HOGNESS-Technik denaturiert [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3961-3965 (1975)]. Die Membranen werden dann 2 Stunden bei 80ºC inkubiert.

c) Hybridisierung

Die Hybridisierung wird unter Verwendung des "Rapid hybridization system Multiprime"-Kits gemäß dem Protokoll des Herstellers (AMERSHAM) durchgeführt. Die Membranen werden in dem Hybridisierungspuffer für 15 Minuten bei 65ºC prehybridisiert. Die denaturierte Sonde wird auf der Basis von 10&sup6; cpm/ml dem Puffer zugefügt.

Die Hybridisierung wird bei 65ºC über Nacht durchgeführt.

Nach der Hybridisierung werden die Membranen gewaschen:

- 2 Mal 10 Minuten bei 65ºC mit 2 · SSPE, 0,1% SDS

- 1 Mal 15 Minuten bei 65ºC mit 1 · SSPE, 0,1% SDS

- 2 Mal 15 Minuten bei 65ºC mit 0,7 · SSPE, 0,1% SDS

(20 · SSPE: 3,6 M NaCl; 0,2 M NaH&sub2;PO&sub4;; 0,02 M EDTA)

Die Membranen werden der Autoradiographie mit einem XRAY-Film (FUJI) für 12 Stunden bei -80ºC ausgesetzt.

Am Ende der Hybridisierung wurde ein positiver Klon, der pG4 genannt wird, erhalten. Der Plasmid wurde aus diesem Klon durch Miniprep extrahiert (MANIATIS, 1989, Referenz oben zitiert) und durch Verdau mit Restriktionsenzymen analysiert. Plasmid pG4 enthält ein 3,5 kb-Insert von L. casei DNA.

Die Laktatproduktion in E. coli wurde für den Klon pG4 bestimmt. Nach dem Wachstum von pG4 in 10 ml LB, das 1% Glukose und Ampizillin (50 mg/ml) enthält, bei 37ºC, wurde eine Laktatproduktion durch einen enzymatischen Essay unter Verwendung des L-Laktat Kits (BOEHRINGER) demonstriert.

Dies bestätigt, daß das L. casei L-LDH-Gen in seiner Gesamtheit auf dem isolierten 3,5 Kilobasenfragment vorhanden ist.

BEISPIEL 2. - MODIFIZIERUNG DES GENS DURCH MUTAGENESE

Die Sequenz des L. casei LDH-Gens wurde kürzlich publiziert [KIM et all, Appl. Environ. Microbiol. 57: 2413-2417, (1991)].

Es wurde verifiziert, daß die von der publizierten Sequenz abgeleitete Restriktionskarte identisch zu der eines zentralen Fragmentes des 3,5 kb-Inserts des Plasmids pG4 ist.

Da das Translationsinitiierungskodon des L. casei LDH-Gens GTG ist, welches ein Kodon ist, das nicht durch Saccharomyces cerevisiae als Initiierungskodon verwendet wird, wurde GTG durch ATG per Mutagenese ersetzt.

Die detaillierte Mutagenesestrategie ist in Fig. 1 zusammengefaßt.

1. Erhalten des mutagenisierten Fragmentes

Das in Plasmid pG4 enthaltene 3,5 kb-Insert ist in Fig. 1 gemeinsam mit der kodierenden Region des LDH-Gens (GTG Startkodon, TAA Stopkodon) gezeigt.

Der Austausch von GTG durch ATG wurde durch PCR Amplifizierung des 5' Fragmentes des Gens von Plasmid pG4 und unter Verwendung zweier Primer, deren Position und Sequenz in Fig. 1 gezeigt ist, durchgeführt:

Der Primer 1 besteht aus 13 Basen, die komplementär zu der kodierenden Region an dem 5' Ende sind und aus 9 unterschiedlichen Basen:

- wobei eine ein A ist, um das GTG durch ATG zu ersetzen, die anderen 8 ermöglichen, daß eine XhoI Site auf der 5' Seite des Initiierungskodon entsteht;

- der Primer 2 besteht aus 22 Basen, die komplementär zu einer Region innerhalb der kodierenden Region sind und die BglII Site, die in dem Gen vorhanden ist, umfassen.

Diese 2 Primer erlauben die Amplifizierung eines 335 Basenfragmentes.

Die Amplifizierung wurde wie folgt ausgeführt:

Primer 1 4 ul (20 moles)

Primer 2 4 ul (20 moles)

Taq Buffer 10x 10 ul

Taq 5 u/ul 0,5 ul

dNTP (2 mM) 10 ul

G4A 10 ul 100 ng

Wasser 70,5 ul

Amplifizierungsbedingungen: 30 Sekunden bei 94ºC, 30 Sekunden bei 55ºC, 1 Minute bei 72ºC, für 30 Zyklen.

Die Größe des Amplifizierungsfragmentes (335 Basen) wurde durch Analyse eines Aliquots auf einem 1,5% Agarosegel verifiziert.

1,5 ul des Amplifizierungsproduktes wurden mit XhoI- BglII verdaut, und das verdaute Fragment wurde in Plasmid pBSLDH&sub3; wie unten beschrieben (2.b) subkloniert.

2. Rekonstruktion des Gens

Die verschiedenen Schritte dieser Konstruktion sind schematisch in Fig. 2 gezeigt.

a) Konstruktion des Plasmids pBSLDH&sub3;

Das XbaI Fragment (2,2 kb), begrenzt durch eine sitedownstream des TAA Stopkodons und eine site in dem Polylinker des Plasmids pG4, wurde durch XbaI Verdau aus pG4 isoliert, und die Trennung der Fragmente wurde auf einem NIUSIEVE Niedrigschmelztemperaturagarosegel (FMC) und durch Ausschneiden der 2,2 kb-Bande durchgeführt.

Dieses Fragment wurde in Plamid pBS (pBluescript II SK+ STRATAGENE) durch Ligation von 200 ng des XbaI Fragmentes (in NIUSIEVE erhitzt auf 65ºC) in 50 ng des Plasmid pBS, verdaut mit XbaI und dephosphoryliert, subkloniert.

Der erhaltene rekombinante Plasmid wird pBSLDH&sub3; genannt.

b) Einführung des modifizierten Fragmentes

Plasmid pBSLDH&sub3; wurde mit BglII (in der kodierenden Region) und XhoI (Polylinkersite) verdaut und dann dephosphorylisiert.

100 ng des durch PCR amplifizierten und BglII-XhoI (wie beschrieben in 1 oben) verdauten Fragmentes wurden in 50 ng so behandelten pBSLDH&sub3; ligiert.

Der erhaltene Plasmid pBSLDH*&sub1; besitzt die kodierende Region des rekonstituierten LDH-Gens, mit einem ATG Kodon als Initiierungskodon, begrenzt durch eine XhoI site direkt upstream des ATG und durch eine XbaI site direkt downstream des TAA Stopkodons.

Das XhoI-BglII Fragment dieses Plasmides wurde sequenziert, um einerseits den Austausch des GTG durch ATG und andererseits, daß kein Fehler durch Taq Polymerase während der Amplifikation gemacht wurde, zu verifizieren.

BEISPIEL 3. EINFÜHRUNG DES MODIFIZIERTEN GENS IN EXPRESSIONSVEKTOREN

Um eine Expression des mutagenisierten L. casei LDH- Gens in Hefe zu erhalten, wurde die kodierende Region, die das geschaffene ATG Kodon umfaßt, unter der Kontrolle von Heferegulationselementen in einem Hefe/E. coli Shuttle-Vektor angeordnet.

1) Einführung des LDH-Gens in den Multicopyplasmid pVT 100-U (Fig. 3)

Der verwendete Expressionsplasmid ist Plasmid pVT100- U, der den 2 u Origin, den URA3 Marker und die starken ADH 3 Regulationselemente (Promoter und Terminator) ebenso wie die bakteriellen Elemente (Origin- und Ampizillinresistenzgene) enthält.

Der Plasmid wurde durch VERNET et al. [Gene 52: 225- 233, (1987)] beschrieben.

Das XhoI-XbaI Fragment des Plamids pBSLDH*&sub1; wurde durch XhoI-XbaI Verdau und Trennung der Fragmente auf einem NIUSIEVE Niedrigschmelztemperatur-Agarosegel isoliert. Das dem Gen entsprechende XhoI-XbaI Fragment (1 kb) wurde ausgeschnitten.

100 ng dieses Fragmentes wurden in 50 ng des Vektors pVT-100-U ligiert, wobei der letztere mit XbaI und XhoI verdaut (die sites sind in dem Polylinker vorhanden) und dephosphoryliert ist.

Der rekombinante Vektor pVT-100-ULDH* wurde erhalten.

2) Einführung des LDH-Gens in den singlecopy-Plasmid YCp50 (Fig. 4)

Der singlecopy zentromerische Plasmid YCp50 wurde durch ROSE [S. L. BERGER and A. R. KIMMEL (Ed), Academic Press, 481-501 (1987)] beschrieben.

Dieser Vektor trägt eine ARS Sequenz und eine zentromerische Sequenz und den URA3 Marker ebenso wie die bakteriellen Elemente (Replikationsorigin und Ampizillinresistenz).

Das SphI Fragment von pVT 100-U-LDH*, das die pADH- LDH*-tADH Expressionskassette enthält, wurde durch SphI Verdau und durch Trennung der Fragmente auf einem NIUSIEVE Niedrigschmelztemperatur-Agarosegel isoliert. Das die Expressionkassette enthaltende SphI Fragment (1,7 kb) wurde ausgeschnitten. 100 ng dieses Fragmentes wurden in 50 ng des Vektors YCp50 ligiert, wobei der letztere mit SphI verdaut und dephosphorylisiert ist. Der rekombinante Vektor YCp50-LDH* wurde erhalten.

BEISPIEL 4 TRANSFORMATION VON HEFE

Saccharomyces cerevisiae Hefestamm SCVSM wurde mit Plasmid pVT100-U-LDH* einerseits und andererseits mit Plasmid YCp50-LDH* transformiert.

Der Stamm SCV5M wurde am 18. Juni 1992 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [National Collection of Microorganism Cultures], getragen durch das Pasteur-Institut, unter Nummer I-1222 hinterlegt. Der Organismus ist ein haploider Laborstamm, auxotroph für Urazil (ura3), MAT a, abgeleitet von einem weinkundlichem Stamm. Dieser Stamm ist in der Lage, eine Fermentation unter weinkundlichen Bedingungen, vergleichbar zu denen industrieller Stämme, zu entwickeln.

Das verwendete Transformationsverfahren ist das Lithiumacetatverfahren, das durch GIETZ und SCHIESTL beschrieben wurde [Yeast, 7: 253-263, (1991)].

Das verwendete Selektivmedium ist YNB (Yeast nitrogen base 7 g/l DIFCO, Glukose 20 g/l). Die Abwesenheit von Urazil ermöglicht einen Selektionsdruck, der sich erhaltend auf den Plasmid auswirkt.

EXAMPLE 5. Fermentationstests 1) Multicopy-Plasmid pVT100-U-LDH*

Fermentationstests wurden mit den folgenden Stämmen ausgeführt:

- V5/pVT100-U: Stamm SCVSM transformiert mit Plasmid pVT100-U ohne Insert als Kontrolle

- V5/pVT100-U-LDH*: Stamm SCV5M transformiert mit dem multicopy-Plasmid pVT-100-U, der das modifizierte LDH-Gen enthält.

Einige Transformanten wurden separat getestet.

Die Fermentationen wurden in YNB (yeast nitrogen base 7 g/l DIFCO) minimalsynthetischem Medium, das 50 g/L Glukose enthält und auf pH 5,1 mit 6,3 g/l Zitronensäure und Natronlauge gepuffert ist, durchgeführt.

Das Vorkultivieren der Stämme V5/pVT100-U und V5/pVT- 100-U-LDH* wurde 20 Stunden lang in 10 ml Medium bei 28ºC durchgeführt.

Das Kultivieren wurden in 50 ml durch Inokulieren mit 7 · 10&sup5; Zellen/ml aus den Vorkulturen durchgeführt. Die Zellanzahl wurde mit einem Apparat des Typs COULTER COUNTER Modell ZBI bestimmt.

Die Kulturen wurden bei 28ºC bei mittelmäßigem Rührem mit einem Rührfisch inkubiert.

Der initiale pH wurde gemessen: 5 für V5/pVT100-U und 4,9 für V5/pVT100-U-LDH*.

1 ml Proben wurden in regelmäßigen Intervallen entnommen, um festzulegen:

- die Zellanzahl durch Zählen der Zellen (COULTER COUNTER);

- den pH des Kulturmediums;

- die Glukose-, Ethanol- und Laktatkonzentration des Kulturmediums durch enzymatischen Essay (BOEHRINGER Essaykit);

- die spezifische Laktatdehydrogenaseaktivität; diese Aktivität wurde aus cruden Zellextrakten bestimmt, die erhalten wurden wie folgt: 10&sup8; Zellen wurden entnommen, 5 Minuten bei 6000 rpm zentrifugiert und in 5 ml 80 mM Acetatpuffer, pH 5,5 (0,2 M Acetatpuffer: 2,73 g Natriumacetat in 100 ml Wasser; pH 5,5 mit Essigsäure) gewaschen. Das Zellpellet wird in 0,5 ml desselben Puffers aufgenommen. Die Zellen werden auf einem Vortexmixer unter Verwendung von Glasperlen 4 mal eine Minute lang im kalten Stadium zerrieben. Diese Zerreibepräparation wird 5 Minuten lang bei 15000 rpm zentrifugiert, und der zurückgewonnene Überstand wird als crude Extrakt verwendet. Der LDH-Essay wird wie durch HENSEL et al. beschrieben ausgeführt. [Arch. Microbiol. 112, 81-93 (1977)] Die LDH Aktivität wird in U/mg Protein des Extraktes ausgedrückt.

Die Ergebnisse der durchgeführten Essays sind wie folgt:

- Ethanol- und Laktatproduktion:

Die Laktatproduktion von V5/pVT100-U-LDH* variiert, abhängig von den getesteten Transformanten, zwischen 6 und 25 g/l Laktat, wobei die produzierte Menge in den meisten Fällen im Bereich von 10 g/l liegt; die unten detailliert angegebenen und in Fig. 5 illustrierten experimentiellen Ergebnisse wurden mit einem V5/pVT100-U- LDH* Transformanten erhalten, der ungefähr 10 g/l Laktat produziert. Während der Kontrollstamm Ethanol produziert, aber keinerlei detektierbare Laktatproduktion (Fig. 5D) zeigt, produziert der Transformant gleichzeitig Laktat und Ethanol (Fig. 5C), was ungefähr der Degradierung von 25 bis 30% der im Kulturmedium vorhandenen Glukose zum Laktat entspricht.

Die gleichzeitige Produktion von Laktat und Ethanol wird weiterhin während der exponentiellen Wachstumsphase und am Anfang der stationären Phase demonstriert. Während der stationären Phase stoppt die Laktatproduktion.

- Zellwachstum:

Das Wachstum des Transformanten V5/pVT100-U-LDH * (Fig. 5A) ist vergleichbar mit dem des Kontrollstammes (Fig. 5B). Das Abflachen des Wachstums (Beginn der stationären Phase) beginnt bei dem transformierten Stamm jedoch früher als bei der Kontrolle, und die finale Zellanzahl ist ungefähr 20% niedriger als für den Kontrollstamm beobachtet.

- Messung des pHs des Kulturmediums

Die Abflachung des Wachstums kann durch eine substantielle Ansäuerung des Kulturmediums erklärt werden. Eine deutlich größere Absenkung des pHs wird tatsächlich im Falle des transformierten Stammes (Fig. 5A) im Vergleich zum Kontrollstamm (Fig. 5B) beobachtet. Diese substantielle Ansäuerung korreliert vollständig mit der beobachteten Laktatproduktion.

- Essay der LDH-Aktivität:

Die Ergebnisse, die für den crude Extrakt des transformierten Stammes (Fig. 5E) erhalten wurden, zeigen, daß die LDH spezifische Aktivität maximal ist, wenn die Zellen in die stationäre Phase eintreten und dann während dieser selben Phase absinkt.

- Andere Kulturmedien:

Die Ergebnisse, die für das YNB Medium erhalten wurden, wurden zusätzlich mit Traubensaft (185 g/l Glukose) und Apfelsaft (93 g/l Glukose) bestätigt.

Das Erhalten einer gemischten Laktat/Ethanol- Produktion kann daher mit verschiedenen Medien (synthetisch, minimal oder vollständig, natürlich), die variierende Glukosekonzentrationen enthalten, unabhängig von dem Ausgangs-pH erreicht werden. Der Temperaturbereich, der verwendet werden kann, ist derjenige, der das Wachstum der Hefen erlaubt (ungefähr 14ºC bis 35ºC).

2) Singlecopy-Plasmid YCp50-LDH*

Fermentationstests wurden mit dem Stamm V5/YCp50-LDH* auf YNB Medium, enthaltend 50 g/l Glukose, gepuffert auf pH 5,1, durchgeführt. Eine Laktatproduktion der Größe von 1 g/l wurde für diesen Stamm erhalten.

Die LDH spezifische Aktivität, bestimmt wie oben beschrieben, zeigt ähnliche Variationen, wie diejenigen, die für die Multicopy-Transformanten beobachtet wurden. Im Kontrast hierzu ist die maximale Aktivität, die am Ende der exponentiellen Phase/Anfang der stationären Phase beobachtet wird im Rahmen von etwa 1,5 U/mg Proteine äquivalent zu einem Siebtel der maximalen Aktivität, die mit den Multicopy-Transformanten erhalten wird (10 U/mg prot).

Die Laktatproduktion der Singlecopy-Transformanten korreliert daher mit dem Level der LDH spezifischen Aktivität.

Dies zeigt, daß die Laktatproduktion moduliert, werden kann, insbesondere in Übereinstimmung mit der Anzahl der LDH Gene, die in die Hefe eingeführt sind.

Wie aus dem Vorangehenden offensichtlich ist, ist die Erfindung keinesfalls auf diese ihre Ausführungsformen, Arten ihrer Implementierung und Anwendungen limitiert, die soeben genauer beschrieben wurden; es umfaßt im Gegensatz alle Varianten, die der Fachmann ersinnen kann, ohne vom Kontext oder dem Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen.


Anspruch[de]

1. Hefestämme, dadurch gekennzeichnet, daß sie wenigstens eine Kopie eines für eine LDH von Milchsäurebakterien codierenden Gens unter Kontrolle von Sequenzen enthalten, welche die Expression dieses Gens in der Hefe regulieren.

2. Stämme nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hefen zur Gattung Saccharomyces gehören.

3. Stämme, nach irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das exprimierte Gen dasjenige für die LDH von Lactobacillus casei ist.

4. Expressionskassette, dadurch gekennzeichnet, daß sie das Gen für eine LDH von Milchsäurebakterien in Verbindung mit in der Hefe aktiven Regulationssequenzen umfaßt.

5. Expressionsvektoren, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Expressionskassette nach Anspruch 4 umfassen und zum Erhalt der transformierten Hefestämme nach Anspruch 1 verwendbar sind.

6. Vektoren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Shuttle-Vektoren handelt, die sowohl einen bakteriellen Replikationsursprung als auch einen Selektionsmarker in einem Bakterium besitzen.







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