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Dokumentenidentifikation DE4229866C2 20.02.2003
Titel Ionenaustauscher
Anmelder Tosoh Corp., Shinnanyo, Yamaguchi, JP
Erfinder Komiya, Katsuo, Hikari, Yamaguchi, JP;
Koga, Toshikuni, Shinnanyo, Yamaguchi, JP;
Kato, Yoshio, Shinnanyo, Yamaguchi, JP
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Anmeldedatum 07.09.1992
DE-Aktenzeichen 4229866
Offenlegungstag 11.03.1993
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 20.02.2003
Veröffentlichungstag im Patentblatt 20.02.2003
IPC-Hauptklasse B01J 41/12
IPC-Nebenklasse B01J 39/18   
IPC additional class // C07H 21/00,C12N 9/36  

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft einen zur Trennung und Reinigung eines biogenen Polymers, wie einem Protein oder einer Nukleinsäure, geeigneten Ionenaustauscher. Insbesondere betrifft sie ein Packungsmaterial für die Flüssigchromatographie.

Zur Reinigung eines biogenen Polymers, insbesondere eines Proteins, wurde bisher häufig als Reinigungsverfahren die Ionenaustauscherchromatographie benutzt, wodurch die Änderung der Eigenschaften der Probe gering ist.

Als Ionenaustauscher, der für diesen Zweck benutzt wurde, sei ein polysaccharidartiger Ionenaustauscher mit einem Cellulosebasismaterial genannt. Wird ein derartiger Ionenaustauscher in eine Säule gepackt, so besitzt er schlechte Permeabilität, und sein Auflösungsvermögen ist ziemlich gering, da die Trägerteilchen nicht klein genug hergestellt werden können. Außerdem ist die Lebensdauer der gepackten Säule schlecht.

Ferner wurde ein Ionenaustauscher aus vernetzter Agarose oder einem vernetzten synthetischen Polymer als Basismaterial zu einem kommerziellen Produkt entwickelt. Ein derartiges Packungsmaterial besitzt jedoch den Nachteil, daß mit Zunahme seiner Festigkeit die Kapazität einer Probe, wie ein Protein, zu binden eher abnimmt. Zur Lösung dieser Aufgabe wurde vorgeschlagen, einen Ionenaustauscher unter Verwendung eines halbstarren oder chemisch-modifizierten Silicagels mit Hydroxylgruppen als Basismaterial herzustellen, auf das durch Pfropfpolymerisation ein Acrylamidderivat, ein Acrylsäureester oder Vinylacetat in Gegenwart eines Cer(VI)salzes als Katalysator unter Bildung eines Spacers aufgebracht wird. Es wurde angenommen, daß die Kapazität eine Probe zu binden hierdurch verbessert werden kann (EP-A- 337144). Der in dieser Veröffentlichung offenbarte Ionenaustauscher, in dem ein Oligomer eines Acrylamidderivats oder eines (Neth)acrylsäureesters als Spacer und chemisch-modifiziertes Silicagel als Basismaterial verwendet werden, wird bei Kontakt mit einer starken Säure oder einer starken Base teilweise hydrolysiert, wodurch eine Abnahme der Ionenaustauschkapazität oder der Kapazität ein Protein zu binden beobachtet wird. Das Waschen einer Trennsäule mit einer starken Säure oder einer starken Base wird häufig zur Reinigung der Säule, insbesondere bei der Trennung und Reinigung eines biogenen Polymers, benutzt. Ferner kann Vinylacetat kaum pfropfpolymerisiert werden und die entstehenden Hydroxylgruppen sind sekundäre Hydroxylgruppen und besitzen eine geringe Reaktivität, wodurch die Einführung von Ionenaustauschergruppen schwierig ist.

Unter den vorstehend erwähnten, verschiedenartigen Ionenaustauschern ist kein Ionenaustauscher, der eine hervorragende Säulenpermeabilität, eine hohe Kapazität Proteine zu binden und hervorragende chemische Stabilität gegenüber Reagentien besitzt, die zur Reinigung der Säule oder Regenerationsbehandlung verwendet werden.

Die vorstehend erwähnten, verschiedenartigen Aufgaben können dadurch gelöst werden, daß als Basismaterial für einen Ionenaustauscher ein Polymermaterial verwendet wird, das ein unlösliches, vernetztes Polymer mit alkoholischen Hydroxylgruppen ist, und dessen elektrostatischen Wechselwirkungen mit einem wasserlöslichen Protein in einer neutralen Pufferlösung im wesentlichen vernachlässigbar sind, zu dem Basismaterial ein Polyglycidylether eines Polyols oder ein Epihalohydrinaddukt eines Polyols und/oder ein durch eine Additionsreaktion oder eine Dehydrohalogenation einer derartigen Verbindung hergestelltes Oligomer als Spacer hinzugefügt wird, und daß die Ionenaustauschergruppen in den Spacer eingebaut werden.

Die vorliegende Erfindung stellt einen Ionenaustauscher zur Verfügung, der Teilchen eines unlöslichen, vernetzten Polymers mit alkoholischen Hydroxylgruppen als Basismaterial und ein Glycidyladdukt eines Polyols und/oder dessen Oligomers als Spacer umfaßt, wobei die Ionenaustauschergruppen an den Spacer gebunden sind.

Nachstehend wird die vorliegende Erfindung mit Bezug auf ihre bevorzugten Ausführungsformen näher beschrieben.

Das erfindungsgemäß verwendete, unlösliche, vernetzte Polymer ist ein unlösliches, vernetztes Polymer mit alkoholischen Hydroxylgruppen. Bevorzugt ist ein hydrophiler Gelfiltrationsträger, wie ein halbstarres Gel oder ein vernetztes Agarosegel, das hauptsächlich aus einem hydrophilen Poly(meth)acrylsäureester oder einem Polyvinylalkohol besteht.

Es ist wichtig, daß das erfindungsgemäß verwendete, unlösliche, vernetzte Polymer eine gute Permeabilität aufweist, da es oft als Packungsmaterial für Säulen verwendet wird. Demgemäß besitzt es vorzugsweise eine kugelförmige Teilchenform. Um eine angemessene Kapazität zur Bindung einer Probe sicherzustellen, sind ferner eine geeignete Porengröße und Porosität erforderlich, so daß ein aufzubereitendes Protein in die Poren im Inneren des Trägers eindringen kann. Der durchschnittliche Porendurchmesser beträgt vorzugsweise etwa 30 nm bis etwa 1000 nm. Die Porosität sollte unter Berücksichtigung des Gleichgewichts der mechanischen Festigkeit und der Oberfläche des Basismaterials gewählt werden. Die Porosität beträgt vorzugsweise 30 bis 95%, obwohl sie von den physikalischen Eigenschaften des Basismaterials abhängt. Bezüglich elektrostatischer Wechselwirkungen sind Ionenaustauschergruppen, falls sie von Anfang an auf dem Basismaterial vorhanden sind, von Einfluß auf die Ionenaustauschergruppen, die später eingebaut werden, was die Bestimmung der Trennbedingungen erschwert. Daher ist die Austauschkapazität des Basismaterials vorzugsweise nicht größer als 0,05 mEq pro ml.

In der vorliegenden Erfindung wird als Spacermaterial ein Polyglycidylether eines Polyols oder das Umsetzungsprodukt eines Epihalohydrins mit einem Polyol verwendet. Das Polyol kann beispielsweise ein nichtionischer Alkohol, wie Ethylenglykol, Glycerin, 1,4-Butandiol, Sorbit, Polyethylenglykol (Polymerisationsgrad nicht größer als 9) oder Propylenglykol (Polymerisationsgrad nicht größer als 3) sein. Zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Polyolderivaten können vorzugsweise Epihalohydrin oder Glycidol in Kombination verwendet werden, obwohl das Gewichtsverhältnis einer derartigen zusätzlichen Verbindung kleiner sein sollte als das des Polyolderivats.

Die Ionenaustauschergruppen, die in den Spacer eingebaut sind, sind vorzugsweise Anionenaustauschergruppen, wie quartäre Ammoniumgruppen oder primäre bis tertiäre Aminogruppen, oder Kationenaustauschergruppen, wie Sulfonsäuregruppen oder Carbonsäuregruppen. Solange Anionen- und Kationenaustauschergruppen nicht gemischt werden, können mehrere Arten von Ionenaustauschergruppen gemischt vorhanden sein. Werden Anionen- und Kationenaustauschergruppen gemischt, sollte die im Unterschuß verwendeten Gruppen weniger als ein Drittel Äquivalente der im Überschuß verwendeten Gruppen betragen.

Um den erfindungsgemäßen Ionenaustauscher herzustellen, werden die vernetzten Polymerteilchen des Basismaterials in Wasser oder in einem organischen Lösungsmittel dispergiert. Dann werden das Spacerrohmaterial und ein Alkalimetallhydroxid hinzufügt, woran sich eine Additionsreaktion unter stark alkalischen Bedingungen zur Epoxidaktivierung anschließt. Schließlich werden die Ionenaustauschergruppen in den Spacer eingebaut und die restlichen Epoxidringe mit Wasser unter alkalischen oder sauren Bedingungen geöffnet. Abhängig von der Art des gewünschten Ionenaustauschers können das Basismaterial, das Spacerrohmaterial und das Rohmaterial zum Einbau der Ionenaustauschergruppen gemischt werden, und die Additionsreaktion und der Einbau der Ionenaustauschergruppen können unter stark alkalischen Bedingungen durchgeführt werden.

Die auf diese Weise erhaltenen Ionenaustauscher besitzen hervorragende Säulenpermeabilität und eine hohe Kapazität zur Bindung eines Proteins. Zusätzlich weisen sie hervorragende chemische Stabilität gegenüber Reagentien auf, die zum Reinigen der Säule oder für Regenerationsbehandlung verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung wird nun näher durch Beispiele beschrieben.

Beispiel 1 Herstellung eines starken Kationenaustauschers

Als Basismaterial werden 60 ml eines hydrophilen Gelfiltrationschromatographiemediums (GFC) mit alkoholischen Hydroxylgruppen (Toyo Pearl HW65F, hergestellt von der TOSOH CORPORATION, durchschnittlicher Porendurchmesser: ungefähr 100 nm) in 70 ml Wasser suspendiert. 120 g Glycerinpolyglycidylether (Denacol EX-314, hergestellt von Nagase Kasei Kogyo K. K.) und 30 g Natriumsulfit werden hinzugefügt. Das Gemisch wird 8 Stunden bei 55°C gerührt und gemischt. Das Reaktionsprodukt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Feststoff mit Wasser gewaschen. Anschließend wird der gesamte Feststoff in 150 ml 0,1 n Salzsäure dispergiert und die Dispersion bei 50°C 2 Stunden gerührt und gemischt. Das Produkt wird abgenutscht und der dabei erhaltene Feststoff mit Wasser gewaschen. Der auf diese Weise erhaltene Ionenaustauscher weist eine Ionenaustauschkapazität von 0,08 mEq/ml auf und zeigt die Kapazität, 101 mg/ml Lysozym in einer 20 mM Phosphatpufferlösung von pH 6,0 zu binden. Wird das gebundene Lysozym mit einer 20 mM Phosphatpufferlösung, enthaltend 0,5 M Natriumchlorid, gewaschen, wird das Lysozym quantitativ zurückgewonnen.

Jeweils 20 ml dieses Ionenaustauschers werden in 60 ml 0,5 N Natriumhydroxid oder 0,5 N Salzsäurelösung getaucht und 4 Wochen bei 25°C stehengelassen. Danach wird die Ionenaustauschkapazität und die Kapazität Lysozym zu binden gemessen, wobei Änderungen kleiner als 5% gefunden werden.

Beispiel 2 Herstellung eines schwachen Anionenaustauschers

Als Basismaterial werden 50 ml vernetzte Agaroseteilchen (Sepharose CL4B, hergestellt von Pharmacia Company) in 50 ml Wasser suspendiert. 150 g Trimethylolpropantriglycidylether (Epiol TMP-100, hergestellt von Nippon Oil and Fat Company Limited), 80 g Diethylaminoethanol und Natriumhydroxid werden hinzugefügt. Das Gemisch wird bei 40°C 5 Stunden gerührt und gemischt. Das Umsetzungsprodukt wird wiederholt dekantiert, wobei der Feststoff mit Wasser gewaschen wird. Anschließend wird der gesamte Feststoff in 150 ml einer 0,1 M Natriumcarbonatlösung dispergiert und die Dispersion wird bei 30°C 8 Stunden gerührt und gemischt. Das Produkt wird filtriert. Der Feststoff wird mit Wasser gewaschen.

Der auf diese Weise erhaltene Ionenaustauscher hat eine Ionenaustauschkapazität von 0,11 mEq/ml und zeigt eine Kapazität, 120 mg/ml Rinder-Serum-Albumin (BSA) in einer 50 mM Trissalzsäurepufferlösung von pH 8,3 zu binden. Wird das gebundene BSA mit einer 50 mM Trissalzsäurepufferlösung, enthaltend 0,5 M Natriumchlorid, gewaschen, wird das BSA quantitativ zurückgewonnen. 20 ml dieses Ionenaustauschers werden in 60 ml 0,5 N Natriumhydroxidlösung getaucht und bei 25°C 4 Wochen stehengelassen. Danach werden die Ionenaustauschkapazität und die Kapazität, BSA zu binden gemessen, wobei Änderungen von weniger als 5% gefunden werden.

Beispiel 3 Herstellung eines starken Anionenaustauschers

Als Basismaterial werden 50 ml eines hydrophilen GFC-Mediums mit alkoholischen Hydroxylgruppen (Toyo Pearl HW55F, hergestellt von TOSOH CORPORATION, mittlerer Porendurchmesser: ungefähr 30 nm) in 60 ml Wasser suspendiert. 120 g Sorbitpolyglycidylether (Denacol EX-611, hergestellt von Nagase Kasei Kogyo K. K.), 20 g Trimethylaminhydrochlorid und 9 g Natriumhydroxid werden hinzugefügt. Das Gemisch wird bei 45°C 6 Stunden gerührt und gemischt. Das Reaktionsprodukt wird abgenutscht und der auf diese Weise erhaltene Feststoff mit Wasser gewaschen. Anschließend wird der gesamte Feststoff in 150 ml 0,1 N Salzsäure dispergiert und die Dispersion wird bei 50°C 2 Stunden gerührt und gemischt. Das Produkt wird abgenutscht und der auf diese Weise erhaltene Feststoff mit Wasser gewaschen.

Der auf diese Weise erhaltene Ionenaustauscher besitzt eine Ionenaustauschkapazität von 0,30 mEq/ml und zeigt eine Kapazität, BSA zu binden, von 83 mg/ml in einer 50 mM Trissalzsäurepufferlösung von pH 8,3. Wird das gebundene BSA mit einer 50 mM Trissalzsäurepufferlösung, enthaltend 0,5 M Natriumchlorid, gewaschen, wird das BSA quantitativ zurückgewonnen.

Jeweils 20 ml dieses Ionenaustauschers werden in 60 ml 0,5 N Natriumhydroxid oder 0,5 N Salzsäurelösung getaucht und bei 25°C 4 Wochen stehengelassen. Danach wird die Ionenaustauschkapazität und die Kapazität, BSA zu binden, gemessen, wobei Änderungen kleiner als 5% gefunden werden.

Beispiel 4 Herstellung eines starken Anionenaustauschers

Als Basismaterial werden 60 ml eines hydrophilen GFC-Mediums mit alkoholischen Hydroxylgruppen (Toyo Pearl HW65F, hergestellt von TOSOH CORPORATION, mittlerer Porendurchmesser: ungefähr 100 nm) mit 1,4-Dioxan gewaschen. Anschließend wird der gesamte Feststoff in 80 ml 1,4-Dioxan suspendiert. 70 g Glycerinpolyglycidylether (Denacol EX-314, hergestellt von Nagase Kasei Kogyo K. K.), 11,3 g Trimethylaminhydrochlorid und 4,6 g Natriumhydroxid werden hinzugefügt. Das Gemisch wird bei 45°C 12 Stunden gemischt und gerührt. Das Reaktionsprodukt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Feststoff mit Wasser gewaschen. Anschließend wird der gesamte Feststoff in 150 ml 0,1 N Salzsäure dispergiert und die Dispersion bei 50°C 2 Stunden gemischt und gerührt. Das Produkt wird abgenutscht und der Feststoff mit Wasser gewaschen. Der auf diese Weise erhaltene Ionenaustauscher besitzt eine Ionenaustauschkapazität von 0,26 mEq/ml und zeigt eine Kapazität, BSA zu binden, von 135 mg/ml in einer 50 mM Trissalzsäurepufferlösung von pH 8,3. Wird das gebundene BSA mit einer 50 mM Trissalzsäurepufferlösung, enthaltend 0,5 M Natriumchlorid, gewaschen, wird das BSA quantitativ zurückgewonnen.

Jeweils 20 ml des Ionenaustauschers werden in 60 ml 0,5 N Natriumhydroxid- oder 0,5 N Salzsäurelösung getaucht und 4 Wochen bei 25°C stehengelassen. Danach wird die Ionenaustauschkapazität und die Kapazität, BSA zu binden, gemessen, wobei Änderungen kleiner als 5% gefunden werden.

Beispiel 5 Herstellung eines starken Kationenaustauschers

Als Basismaterial werden 60 ml eines hydrophilen GFC-Mediums mit alkoholischen Hydroxylgruppen (Toyo Pearl HW75F, hergestellt von TOSOH CORPORATION, mittlerer Porendurchmesser: ungefähr 500 nm) in 60 ml Wasser suspendiert. 50 g Glycerinpolyglycidylether (Denacol EX-314, hergestellt von Nagase Kasei Kogyo K. K.), 9 g Epichlorhydrin und 6 g Natriumhydroxid werden hinzugefügt. Das Gemisch wird bei 50°C 3 Stunden gerührt und gemischt. Das Reaktionsprodukt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Feststoff wird aufeinanderfolgend mit Wasser, Aceton und Wasser gewaschen. Anschließend wird der gesamte Feststoff in 100 ml Wasser dispergiert und 30 g Natriumsulfit werden hinzugefügt. Das Gemisch wird bei 55°C 8 Stunden gerührt und gemischt. Das Reaktionsprodukt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Feststoff mit Wasser gewaschen.

Anschließend wird der gesamte Feststoff in 150 ml 0,1 N Salzsäure dispergiert und die Dispersion wird bei 50°C 2 Stunden gerührt und gemischt. Das Produkt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Feststoff mit Wasser gewaschen.

Der auf diese Weise erhaltene Ionenaustauscher besitzt eine Ionenaustauschkapazität von 0,13 mEq/ml und zeigt eine Kapazität, Lysozym zu binden, von 70 mg/ml in einer 20 mM Phosphatpufferlösung von pH 6,0. Wird das gebundene Lysozym mit einer 20 mM Phosphatpufferlösung, enthaltend 0,5 M Natriumchlorid gewaschen, wird das Lysozym quantitativ zurückgewonnen.

Jeweils 20 ml dieses Ionenaustauschers werden in 60 ml 0,5 N Natriumhydroxid- oder 0,5 N Salzsäurelösung getaucht und bei 25°C 4 Wochen stehengelassen. Danach wird die Ionenaustauschkapazität und die Kapazität, Lysozym zu binden, gemessen, wobei Änderungen von kleiner als 5% gefunden werden.

Beispiel 6 Herstellung eines schwachen Kationenaustauschers

Als Basismaterial werden 50 ml eines hydrophilen GFC-Mediums mit alkoholischen Hydroxylgruppen (Toyo Pearl HW65F, hergestellt von TOSOH CORPORATION, mittlerer Porendurchmesser: ungefähr 100 nm) in 50 ml Wasser suspendiert. 100 g Ethylenglycerinpolyglycidylether und 2 g Natriumhydroxid werden hinzugefügt. Das Gemisch wird bei 50°C 5 Stunden gerührt und gemischt. Das Reaktionsprodukt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Feststoff aufeinanderfolgend mit Wasser, Aceton und Wasser gewaschen. Anschließend wird der gesamte Feststoff in 50 ml Wasser dispergiert. 60 g Natriummonochloracetat und 30 g Natriumhydroxid werden hinzugefügt. Das Gemisch wird bei 50°C 4 Stunden gerührt und gemischt. Das Produkt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Feststoff mit Wasser gewaschen.

Der auf diese Weise erhaltene Ionenaustauscher besitzt eine Ionenaustauschkapazität von 0,14 mEq/ml und zeigt eine Kapazität, Lysozym zu binden, von 95 mg/ml in einer 20 mM Phosphatpufferlösung von pH 6,0. Wird das gebundene Lysozym mit einer 20 mM Phosphatpufferlösung, enthaltend 0,5 M Natriumchlorid, gewaschen, wird das Lysozym quantitativ zurückgewonnen.

Jeweils 20 ml dieses Ionenaustauschers werden in 60 ml 0,5 N Natriumhydroxid- oder 0,5 N Salzsäurelösung getaucht und 4 Wochen bei 25°C stehengelassen. Danach wird die Ionenaustauschkapazität und die Kapazität, Lysozym zu binden, gemessen, wobei Änderungen von weniger als 5% gefunden werden.

Vergleichsbeispiel 1 Herstellung eines starken Kationenaustauschers

Als Basismaterial werden 60 ml eines hydrophilen GFC-Mediums mit alkoholischen Hydroxylgruppen (Toyo Pearl HW75F, hergestellt von TOSOH CORPORATION, mittlerer Porendurchmesser: ungefähr 500 nm) in 60 ml Wasser suspendiert. 23 g Epichlorhydrin und 6 g Natriumhydroxid werden hinzugefügt. Das Gemisch wird bei 50°C 3 Stunden gerührt und gemischt. Das Reaktionsprodukt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Feststoff wird aufeinanderfolgend mit Wasser, Aceton und Wasser gewaschen. Anschließend wird der gesamte Feststoff in 100 ml Wasser dispergiert. 30 g Natriumsulfit werden hinzugefügt und das Gemisch wird bei 55°C 8 Stunden gerührt und gemischt. Das Reaktionsprodukt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Feststoff mit Wasser gewaschen. Anschließend wird der gesamte Feststoff in 150 ml 0,1 N Salzsäure dispergiert, und das Gemisch wird bei 50°C 2 Stunden gerührt und gemischt. Das Produkt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Feststoff mit Wasser gewaschen.

Der auf diese Weise erhaltene Ionenaustauscher besitzt eine Ionenaustauschkapazität von 0,13 mEq/ml und zeigt eine Kapazität, Lysozym zu binden, von 35 mg/ml in einer 20 mM Phosphatpufferlösung von pH 6,0. Die Kapazität, Protein zu binden, beträgt die Hälfte der Kapazität von Beispiel 5. Wird das gebundene Lysozym mit einer 20 mM Phosphatpufferlösung, enthaltend 0,5 M Natriumchlorid, gewaschen, wird das Lysozym quantitativ zurückgewonnen.

Jeweils 20 ml dieses Ionenaustauschers werden in 60 ml einer 0,5 N Natriumhydroxid- oder 0,5 N Salzsäurelösung getaucht und bei 25°C 4 Wochen stehengelassen. Danach wird die Ionenaustauschkapazität und die Kapazität, Lysozym zu binden, gemessen, wobei Änderungen von weniger als 5% gefunden werden.

Vergleichsbeispiel 2 Herstellung eines starken Anionenaustauschers

Als Basismaterial werden 60 ml eines hydrophilen GFC-Mediums mit alkoholischen Hydroxylgruppen (Toyo Pearl HW65F, hergestellt von TOSOH CORPORATION, mittlerer Porendurchmesser: ungefähr 100 nm) in 60 ml Wasser suspendiert. 23 g Epichlorhydrin und 6 g Natriumhydroxid werden hinzugefügt. Das Gemisch wird bei 50°C 3 Stunden gerührt und gemischt. Das Reaktionsprodukt wird abgenutscht, und der hierbei erhaltene Feststoff wird mit Wasser und 1,4-Dioxan gewaschen. Anschließend wird der gesamte Feststoff in 80 ml 1,4-Dioxan suspendiert. 22,6 g Trimethylaminhydrochlorid und 9,2 g Natriumhydroxid werden hinzugefügt. Das Gemisch wird bei 40°C 12 Stunden gerührt und gemischt. Das Reaktionsprodukt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Feststoff mit Wasser gewaschen. Anschließend wird der gesamte Feststoff in 150 ml 0,1 N Salzsäure dispergiert und die Dispersion bei 50°C 2 Stunden gerührt und gemischt. Das Reaktionsprodukt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Feststoff mit Wasser gewaschen.

Der auf diese Weise erhaltene Ionenaustauscher besitzt eine Ionenaustauschkapazität von 0,20 mEq/ml und zeigt eine Kapazität, BSA zu binden, von 50 mg/ml in einer 50 mM Trissalzsäurepufferlösung von pH 8,3. Die Kapazität, Protein zu binden, beträgt die Hälfte der Kapazität, Protein zu binden, von Beispiel 4. Wird das gebundene BSA mit einer 50 mM Trissalzsäurepufferlösung, enthaltend 0,5 M Natriumchlorid, gewaschen, wird das BSA quantitativ zurückgewonnen.

Jeweils 20 ml dieses Ionenaustauschers werden in 60 ml einer 0,5 N Natriumhydroxid- oder 0,5 N Salzsäurelösung getaucht und 4 Wochen bei 25°C stehengelassen. Danach wird die Ionenaustauschkapazität und die Kapazität, BSA zu binden, gemessen, wobei Änderungen von kleiner als 5% gefunden werden.

Vergleichsbeispiel 3 Herstellung eines starken Anionenaustauschers

Als Basismaterial werden 50 ml eines hydrophilen GFC-Mediums mit alkoholischen Hydroxylgruppen (Toyo Pearl HW65F, hergestellt von TOSOH CORPORATION, mittlerer Porendurchmesser: ungefähr 100 nm) in 700 ml Wasser suspendiert. 113 g N,N- Trimethylammoniumethylacrylamid werden hinzugefügt. Die Temperatur wird auf 25°C eingestellt, und Sauerstoff wird durch Argon im Reaktionsgefäß ersetzt. 100 ml 0,4 M Cäsiumnitratammoniumlösung in 1 N Salpetersäure werden hinzugefügt. Das Gemisch wird 3 Stunden gerührt und gemischt. Das Reaktionsprodukt wird abgenutscht und der hierbei erhaltene Feststoff aufeinanderfolgend mit Wasser, 10%iger Essigsäure, enthaltend 0,2 M Natriumsulfit, 0,2 M Natriumacetat und Wasser gewaschen.

Der auf diese Weise erhaltene Ionenaustauscher hat eine Ionenaustauschkapazität von 0,15 mEq/ml und zeigt eine Kapazität, BSA zu binden, von 70 mg/ml in einer 50 mM Trissalzsäurepufferlösung von pH 8,3. Die Kapazität, Protein zu binden, beträgt die Hälfte der Kapazität, Protein zu binden, von Beispiel 4. Wird das gebundene BSA mit einer 50 mM Trissalzsäurepufferlösung, enthaltend 0,5 M Natriumchlorid, gewaschen, wird das BSA quantitativ zurückgewonnen.

20 ml dieses Ionenaustauschers werden in 60 ml 0,5 N Natriumhydroxidlösung getaucht und 4 Wochen bei 25°C stehengelassen. Danach wird die Ionenaustauschkapazität und die Kapazität, BSA zu binden, gemessen, wobei gefunden wird, daß die Austauschkapazität um 15% abgenommen hat und die Kapazität, BSA zu binden, um 10% abgenommen hat.

Anwendungsbeispiel 1

Das in Beispiel 1 erhaltene Packungsmaterial wird in eine Glassäule (150 × 16 mm) gepackt und mit einer 20 mM Phosphatpufferlösung von pH 6,0 equilibriert. Ein Gemisch, enthaltend 10 mg Ribonuclease, 5 mg Cytochrom C und 5 mg Lysozym, wird einer linearen Gradientenelution mit 0 bis 500 mM Natriumchloridlösung unterworfen, wobei eine hervorragende Trennung erzielt wird.

Anwendungsbeispiel 2

Das im Beispiel 4 erhaltene Packungsmaterial wird in eine Glassäule (150 × 16 mm) gepackt und mit einer 20 mM Piperazinsalzsäurepufferlösung von pH 8,3 equilibriert. 2 mg eines käuflich erhältlichen β-Lactoglobulins werden einer linearen Gradientenelution mit 0 bis 300 mM Natriumchloridlösung unterworfen, wobei eine hervorragende Trennung von β-Lactoglobulin A und B erzielt wird.

Anwendungsbeispiel 3

Das in Beispiel 6 erhaltene Packungsmaterial wird in eine Glassäule (150 × 16 mm) gepackt und mit einer 20 mM Phosphatpufferlösung von pH 6,0 equilibriert. Ein Gemisch von Agiotensin I, II und III jedes in einer Menge von 0,03 mg wird einer linearen Gradientenelution mit 0 bis 500 mM Natriumchloridlösung unterworfen, wobei eine hervorragende Trennung erzielt wird.

Anwendungsbeispiel 4

Das im Beispiel 4 erhaltene Packungsmaterial wird in eine Glassäule (150 × 16 mm) gepackt und mit einer 20 mM Trissalzsäurepufferlösung von pH 8,3 equilibriert. Ein Gemisch, umfassend 4 mg einer käuflich erhältlichen Carbonsäureanhydrase, 8 mg Transferrin, 10 mg Ovoalbumin und 10 mg Trypsininhibitor werden einer linearen Gradientenelution mit 0 bis 500 mM Natriumchloridlösung unterworfen, wobei eine hervorragende Trennung erzielt wird.

Wie vorher beschrieben, besitzt der erfindungsgemäße Ionenaustauscher eine hervorragende Fähigkeit, biogene Polymere zu trennen, hervorragende Säulenpermeabilität, eine große Kapazität zum Binden von Proteinen und hervorragende chemische Stabilität.


Anspruch[de]
  1. 1. Ionenaustauscher, umfassend Teilchen eines unlöslichen, vernetzten Polymers, mit alkoholischen Hydroxylgruppen als Basismaterial und ein Glycidyladdukt aus einem Polyol und/oder dessen Oligomers als Spacer, wobei die Ionenaustauschergruppen an den Spacer gebunden sind.
  2. 2. Ionenaustauscher gemäß Anspruch 1, wobei die unlöslichen, vernetzten Polymerteilchen porös sind, einen mittleren Porendurchmesser von etwa 30 nm bis etwa 1000 nm aufweisen und eine kugelförmige Form besitzen.
  3. 3. Ionenaustauscher gemäß Anspruch 2, wobei die unlöslichen, vernetzten Polymerteilchen eine Porosität von 30 bis 95% aufweisen.
  4. 4. Ionenaustauscher gemäß Anspruch 1, wobei die Ionenaustauschkapazität des unlöslichen, vernetzten Polymers nicht größer als 0,05 mEq/ml ist.
  5. 5. Ionenaustauscher gemäß Anspruch 1, wobei das unlösliche, vernetzte Polymer ein hydrophiler Gelfiltrationsträger ist.
  6. 6. Ionenaustauscher gemäß Anspruch 1, wobei der Spacer ein Polyglycidylether eines Polyols oder das Reaktionsprodukt eines Polyols mit einem Epihalohydrin ist.
  7. 7. Ionenaustauscher gemäß Anspruch 6, wobei das Polyol ein Ethylenglykol, Glycerin, 1,4-Butandiol, Sorbit, Polyethylenglykol mit einem Polymerisationsgrad von nicht größer als 9 oder Propylenglykol mit einem Polymerisationsgrad von nicht größer als 3 ist.
  8. 8. Ionenaustauscher gemäß Anspruch 1, wobei die Ionenaustauschergruppen quartäre Ammoniumgruppen, primäre bis tertiäre Aminogruppen oder deren Gemische sind.
  9. 9. Ionenaustauscher gemäß Anspruch 1, wobei die Ionenaustauschergruppen Sulfonsäuregruppen, Carbonsäuregruppen oder deren Gemische sind.






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