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Dokumentenidentifikation DE69902246T2 27.02.2003
EP-Veröffentlichungsnummer 1069819
Titel VERFAHREN ZUR SELEKTIVEN ERHÖHUNG DES ANTICARCINOGENEN GLUCOSINOLATE BEI BRASSICA SORTEN
Anmelder Plant Bioscience Ltd., Norwich, Norfolk, GB
Erfinder MITHEN, Richard, Norwich, Norfolk NR9 5MS, GB;
FAULKNER, Kathy, East Dereham, Norfolk MR19 2UA, GB
Vertreter Dr. Weber, Dipl.-Phys. Seiffert, Dr. Lieke, 65183 Wiesbaden
DE-Aktenzeichen 69902246
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, GB, GR, IE, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 08.04.1999
EP-Aktenzeichen 999158868
WO-Anmeldetag 08.04.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/GB99/01079
WO-Veröffentlichungsnummer 0009952345
WO-Veröffentlichungsdatum 21.10.1999
EP-Offenlegungsdatum 24.01.2001
EP date of grant 24.07.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 27.02.2003
IPC-Hauptklasse A01H 5/10

Beschreibung[de]
TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur selektiven Erhöhung von anti-karzinogenen Glucosinolatderivaten in Brassica-Spezies und Brassica-Spezies mit erhöhten Mengen an anti- karzinogenen Glucosinolatderivaten und insbesondere eßbare Brassica-Gemüse mit erhöhten Mengen der anti-karzinogenen Glucosinolatderivate 4-Methylsulfinylbutylisothiocyanat und/oder 3-Methylsulfinylpropylisothiocyanat. Die vorliegende Erfindung liefert auch Verfahren für die Selektion von genetischen Kombinationen von Broccoli, der hohe Mengen an anti-karzinogenen Glucosinolatderivaten enthält, und Verfahren zur Bewertung der anti-karzinogenen Eigenschaften dieser genetischen Kombinationen. Die Erfindung betrifft weiterhin Zusammensetzungen der Art, welche Brassica-Gemüse mit Konzentrationen an 4-Methylsulfinylbutylglucosinolat und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolat zwischen 10 und 100 uMol/g Trockengewicht umfassen.

STAND DER TECHNIK

Die vorliegende Erfindung liefert Verfahren für die Herstellung von Brassica-Gemüsen mit erhöhten Mengen an speziellen Glucosinolaten und Derivaten davon. Insbesondere liefert die Erfindung Verfahren für die Herstellung und Selektion von Brassica-Gemüsen mit erhöhten Mengen an 3-Methylsulfinylpropyl- und/oder 4-Methylsulfinylbutylglucosinolaten. Diese Glucosinolate werden mittels der Aktivität des Enzyms Myrosinase in Isothiocyanatderivate überführt, von denen gezeigt wurde, daß sie wirksame Induktoren für Phase-II-Entgiftungsenzyme sind, deren erhöhte Aktivität mit verminderter Empfänglichkeit für die neoplastischen Wirkungen von Karzinogenen einhergeht. Die Erfindung liefert genetische Kombinationen, die 1.) erhöhte Mengen an 4- Methylsulfinylbutylglucosinolat und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolat aufweisen und 2.) niedrige Aktivität der GSL-ALK-Allele zeigen, welche eine Aktivität codiert, die in der Lage ist, diese Glucosinolate in die Alkenylderivate zu überführen, welche nicht die anti-karzinogenen Eigenschaften der Isothiocyanatderivate dieser Glucosinolate besitzen, und 3.) geeignete Myrosinase-Aktivität haben, die in der Lage ist, Isothiocyanatderivate der genannten Glucosinolate herzustellen. Dementsprechend liefern diese genetischen Kombinationen erhöhte Mengen an spezifischen Glucosinolaten, eine verminderte Herstellung von Alkenylderivaten dieser Glucosinolate und eine bevorzugte Herstellung von Isothiocyanatderivaten der genannten Glucosinolate. Die Erfindung betrifft weiter die Verwendung von genetischen Markern zur Selektion der oben beschriebenen genetischen Kombinationen.

Es ist bekannt, daß eine Kost, die reich an Gemüse ist, mit einer Verminderung des Risikos für bestimmte Arten von Krebs verbunden ist, und daher ist es erwünscht, eine erhebliche Menge an Gemüse in die Kost des Menschen einzubeziehen. Die anti-karzinogene Aktivität von Gemüsen wurde mit dem Vorhandensein mehrerer Klassen von Sekundärmetaboliten in Verbindung gebracht. Die Beweisanzeichen nehmen zu, daß einige dieser Sekundärmetaboliten in die Verminderung des Risikos für bestimmte Arten von Krebs involviert sind, und sie werden daher als anti-karzinogen angesehen. Dementsprechend liefert die Erhöhung der Menge an anti-karzinogenen Metaboliten eine geeignete Strategie für die Verringerung des Krebsrisikos in Ergänzung zu dem Ernährungsratschlag, den Konsum von Gemüse zu erhöhen.

Der genaue Mechanismus, durch den Gemüse ein verringertes Risiko für viele Arten von Krebs liefern, ist nicht mit Bestimmtheit bekannt, aber es gibt viele Beweisanzeichen, welche die Beteiligung von Gemüsen an der Vorbeugung gegen Krebs stützen. Insbesondere wird die Rolle von Kreuzblütlergemüsen bei der Vorbeugung gegen Krebs in breitem Maße durch epidemiologische Studien und jüngere biochemische Studien gestützt. Eine Klasse von Sekundärmetaboliten, die in die vorteilhaften Wirkungen von Kreuzblütlergemüsen verwickelt sind, sind die. Isothiocyanatderivate bestimmter Glucosinolate. Vier sich ergänzende Stücke von Beweisanzeichen legen nahe, daß Isothiocyanate, die aus der Hydrolyse von Methylsulfinylalkylglucosinolaten stammen, die man in Kreuzblütlern findet, in der menschlichen Ernährung für die Reduzierung des Krebsrisikos wichtig sein können. (1.) Ernährungstechnische Bereitstellung von Kreuzblütlergemüsen schützt Nager gegen chemisch induzierten Krebs (Wattenberg, L. W. (1985), Cancer Res. 45, 1-8). (2.) Methylsulfinylalkylisothiocyanate sind dafür bekannt, daß sie wirksame Induktoren für Phase-11- Entgiftungsenzyme in Maus-Hepatom-Hepa 1c1c7-Zellen in Kultur sind (Zhang, Y., Talalay, P., Cho, C.-G. & Posner, G. H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 2399-2403 und Tawfiq, N., Heaney, R. K., Plumb, J. A., Fenwick, G. R., Musk, S. R. R. & Williamson, G. (1995) Carcinogenesis 16, 1191-1194), die mit verminderter Empfänglichkeit von Säugern und Säugerzellkulturen für die toxischen und neoplastischen Wirkungen von Karzinogenen verbunden sind. (3.) Sulforaphan (4-Methylsulfinylbutylisothiocyanat) blockiert die Bildung von Brusttumoren in Sprague-Dawley-Ratten, die mit 9,10-Dimethyl-1,2-benzanthracen behandelt wurden (Zhang, Y., Kensler, T. W., Cho, C.-G., Posner, G. H. & Talalay, P. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3147-3150). (4.) Epidemiologische Studien zeigen, daß Menschen mit hohen Mengen an Gemüse in ihrer Ernährung weniger empfänglich für Krebs sind (Block, G., Patterson, B. & Suber, A. (1992) Nutr. and Cancer 18, 1-19). Somit können die vorteilhaften Wirkungen einer Diät, die reich an bestimmten Glucosinolaten ist, eine Verminderung des Krebsrisikos umfassen. Es scheint jedoch, daß nur bestimmte Glucosinolate und genauer bestimmte Derivate spezieller Glucosinolate in erster Linie für die vorteilhafte Wirkung verantwortlich sein können.

Es gibt viele individuelle Glucosinolate in Kreuzblütlerpflanzen. Carlson et al. (1987) (J. Amer. Soc. Hort. Sci. 112, 173-178) bestimmte die relativen Konzentrationen von 13 Glucosinolaten in den eßbaren Teilen von 30 Kulturformen. Glucosinolate haben einen gemeinsamen Glyconrest und eine variable Aglycon-Seitenkette. Die Struktur der Glucosinolat-Seitenkette variiert bezüglich Länge und chemischer Zusammensetzung.

Glucosinolate werden durch die Aktivität einer Anzahl von Enzymen hergestellt, die von einer geringen Anzahl von Glucosinolat-Biosyntheseallelen (GSL-Allelen) codiert werden. In der Glucosinolat-Reaktionskette wird Methionin durch die Aktivität der GSL-ELONG-Allele in Homo-Methionin und Dihomo-Methionin überführt. Homo-Methionin wird schließlich in 3-Methylthiopropylglucosinolat überführt, gefolgt von einer Umwandlung in 3-Methylsulfinylpropylglucosinolat durch die Aktivität der GSL-OXID-Allele und schließlich in 2-Propenylglucosinolat durch die Aktivität der GSL-ALK-Allele. Dihomo-Methionin wird in 4-Methylthiobutylglucosinolat umgewandelt, anschließend durch die Aktivität der GSL-OXID-Allele in 4-Methylsulfinylbutylglucosinolat, dann durch die Aktivität der GSL-ALK- Allele in 3-Butenylglucosinolat und dies wird schließlich durch die Aktivität der GSL-OH-Allele in 2-Hydroxy-3-butenylglucosinolat überführt.

Im allgemeinen erzeugen die 3-Methylsulfinylpropylglucosinolate und die 4-Methylthiobutylglucosinolate nichtflüchtige Isothiocyanate, und daher tragen diese speziellen Glucosinolate wenig zum Geschmack bei. Im Gegensatz dazu können die flüchtigen Alkenylderivate sowohl positiv als auch negativ zum Geschmack beitragen, abhängig von der Pflanzenspezies und dem bestimmten Glucosinolatderivat.

In B. oleracea-Gemüse haben Glucosinolate eine Seitenkette mit entweder drei oder vier Kohlenstoffatomen. Glucosinolate können durch die Aktivität von Myrosinase hydrolysiert werden, die häufig nach einem Gewebeschaden induziert wird. Viele Gemüse haben Alkenyl-(2-propenyl- und 3-butenyl-) Glucosinolate, die zur Erzeugung von flüchtigen Produkten bei der Hydrolyse durch die Aktivität von Myrosinase führen. Einige Gemüse enthalten ein 2-Hydroxy-3-butenylglucosinolat genanntes Progoitrin. Dieses Glucosinolat erzeugt ein instabiles Isothiocyanat, das spontan unter Erzeugung von Oxazolidon-2-thionen zyklisiert, die aufgrund ihrer goitrogenen Eigenschaften in der Nahrung unerwünscht sind. Isothiocyanate, die von Alkenyl- und Hydroxyalkenylglucosinolaten stammen, können sowohl positive als auch negative Wirkungen auf den Geschmack haben.

Broccoli sammelt geringe Mengen an Glucosinolaten mit 4-Methylsulfinylbutyl- und 3- Methylsulfinylpropyl-Seitenketten an, da Broccoli eine stark verminderte Aktivität der GSL-ALK-Allele hat, die für die Überführung von Glucosinolaten in Alkenylderivate verantwortlich ist. Man nimmt an, daß die Beliebtheit von Broccoli als ein Gemüse zum Teil auf den relativ dezenten Beitrag zum Geschmack von 4-Methylsulfinylbutyl- und 3-Methylsulfinylpropylglucosinolatderivaten zurückzuführen ist, im Gegensatz zu dem starken Geschmack, der von anderen Glucosinolaten verliehen wird, insbesondere den flüchtigen Derivaten von Glucosinolaten.

Daher können Verfahren zur Erhöhung der ernährungstechnischen Menge an speziellen Isothiocyanatderivaten bestimmter Glucosinolate Gemüse mit erhöhten anti-karzinogenen Eigenschaften liefern, ohne den Geschmack und/oder die Genießbarkeit des Gemüses zu verändern. Jedoch stellt der Stand der Technik kein Mittel zur einfachen Erhöhung der Mengen der speziellen Glucosinolate in Kreuzblütlergemüsen bereit. Darüber hinaus liefert der Stand der Technik kein einfaches Mittel, um sicherzustellen, daß diese Glucosinolate nicht in die Alkenylderivate, sondern vielmehr in die Isothiocyanatderivate, welche anti-karzinogene Eigenschaften haben, umgewandelt werden. Unter den vielen Glucosinolaten, die von Brassica-Gemüsen hergestellt werden können, wurden 4-Methylsulfinylbutylglucosinolat und 3-Methylsulfinylpropylglucosinolat als die Vorläuferverbindungen für die wirksamsten anti-karzinogenen Isothiocyanatderivate identifiziert. Der Stand der Technik bietet kein einfaches Mittel, diese speziellen Glucosinolate in einer spezifischen Art und Weise zu erhöhen, während die Bildung anderer Glucosinolate oder Glucosinolatderivate, die unerwünschte Geschmackseigenschaften haben können, verhindert wird.

4-Methylsulfinylbutylglucosinolat- und 3-Methylsulfinylpropylglucosinolat-Glucosinolate findet man in mehreren Kreuzblütlergemüsen, aber sie sind am reichhaltigsten vorhanden in Broccoli- Unterarten (syn. calabrese: Brassica oleracea L. var. ifalica), denen eine funktionale Allele an dem GSL-ALK-Lokus fehlt. Das Vorhandensein einer funktionalen GSL-ALK-Allele überführt diese Glucosinolate in ihre Alkenylhomologe, welche schlechte Induktoren für Phase-II-Enzyme sind (Tawfiq, N., Heaney, R. K., Plumb, J. A., Fenwick, G. R., Musk, S. R. R. & Williamson, G. (1995) Carcinogenesis 16, 1191-1194). Daher schließt das Vorhandensein einer funktionalen GSL-ALK-Allele die Möglichkeit aus, eine Unterart mit hohen Mengen dieser anti-karzinogenen Isothiocyanate herzustellen, da die Glucosinolate in Alkenylderivate umgewandelt werden. Darüber hinaus erfordert die Herstellung von Isothiocyanaten aus Glucosinolaten die Aktivität des Enzyms Myrosinase. Daher hängt die verstärkte Produktion dieser speziellen Isothiocyanate sowohl von den Mengen an Glucosinolat- Vorläuferverbindungen (welche von der Aktivität beeinflußt werden, die von der GSL-ALK-Allele codiert wird) als auch den Mengen oder der Aktivität von Myrosinase, welche die Isothiocyanatderivate von Glucosinolaten herstellt, ab.

Dementsprechend ist eine genetische Kombination wünschenswert, welche die Herstellung hoher Mengen an 4-Methylsulfinylbutylglucosinolat und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolat spezifiziert, jedoch erfordert die Herstellung der anti-karzinogenen Isothiocyanatderivate dieser Glucosinolate zusätzliche genetische Kombinationen. Somit liefern Verfahren für das Erreichen dieser genetischen Zusammensetzungen neue Zusammensetzungen der Art, die man zur Zeit in kommerziell gezüchteten Kreuzblütlergemüsen nicht findet. Die vorliegende Erfindung führt Verfahren zum Erreichen dieser genetischen Kombinationen auf.

Die Mengen an Glucosinolaten in kommerziell gezüchtetem Broccoli sind relativ gering, verglichen mit denjenigen, die man in Salatkulturen findet, wie Rakete (Eruca safiva), welche 4- Methylthiobutylglucosinolat anhäuft, und Wasserkresse (Rorippa nasturtium-aquaticum), welche Phenetylglucosinolat anhäuft (Fenwick, G. R., Heaney, R. K. & Mullin, W. J. (1983) Crif. Ref. Food ScL Nutr. 18, 123-201). Man würde erwarten, daß ein Aussetzen an erhöhte Mengen von 4- Methylsulfinylbutylglucosinolat und/oder 3-Methylsulfinylprapylglucosinolat in Broccoli die Wirksamkeit der Induktion von Phase-II-Enzymen verstärkt, wenn er aufgenommen wird. Somit wäre Broccoli mit erhöhten Mengen des anti-karzinogenen 4-Methylsulfinylbutylisothiocyanats und/oder 3- Methylsulfinylpropylisothiocyanats eine wertvolle Ergänzung zu einer Ernährung, die dafür ausgelegt ist; das Krebsrisiko zu mindern. Darüber hinaus wäre es unwahrscheinlich, daß solche Veränderungen zu einer verminderten Genießbarkeit führen würden, da Methylsulfinylalkylglucosinolate nicht- flüchtig sind und einen relativ geringen Beitrag zum Geschmack leisten im Gegensatz zu dem Großteil anderer Isothiocyanate, die man in Gemüsen und Salatkulturen findet (Fenwick, G. R., Heaney, R. K. & Mullin, W. J. (1983) Crit. Ref. Food Sci. Nutr. 18-123-201). Daher würde eine Veränderung der Mengen dieser speziellen Glucosinolate den Geschmack der Kreuzblütlergemüse, welche die genetischen Kombinationen tragen, die diese Eigenschaft codieren, nicht verändern.

Viele wilde Mitglieder des Brassica oleracea-Artenkomplexes (Chromosom Nr., n = 9) haben hohe Mengen individueller aliphatischer Glucosinolate (Mithen, R., Lewis, B. G., Giamoustaris, A. & Mithen, R. (1996) Theor. Appll. Genef. 93, 1006-1010). Studien der Genetik von Glucosinolaten in diesen Taxonomien waren der Aufklärung der genetischen Reaktionskette für die Glucosinolat- Biosynthese dienlich. Es ist deutlich, daß bestimmte Spezies in dieser Taxonomie für Brassica- Zuchtprogramme wertvoll sein könnten, welche für eine spezifische Erhöhung von 4- Methylsulfinylbutylglucosinolat und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolat ausgelegt sind, und, indem man dies vornimmt, für das anti-karzinogene Potential der Pflanze. Jedoch liefert der Stand der Technik keine Verfahren zur Erhöhung der Konzentration von 4-Methylsulfinylbutylglucosinolat und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolat durch genetische Kombinationen, noch liefert er ein einfaches Mittel, mit dem die anti-karzinogenen Eigenschaften der Gemüse, welche diese genetischen Kombinationen enthalten, beurteilt werden können. Die vorliegende Erfindung liefert diese Verfahren und genetischen Kombinationen.

An vorderster Stelle unter diesen stehen genetische Kombinationen, welche die Gene von Mitgliedern des B. villosa-rupestris-Komplexes von Sicily enthalten, die über eine nicht funktionale GSL-ALK-Allele verfügen und die wilden Vorfahren von kultiviertem Broccoli sein können. Daher verwendet die vorliegende Erfindung wilde Verwandte und Vorfahren von kommerziellem Broccoli als Quelle für die Gene, die benötigt werden, um eine genetische Kombination abzuleiten, die in der Lage ist, hohe Mengen an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten und die genetische Kombination, welche eher die Produktion von Isothiocyanatderivaten von diesen Glucosinolaten als Alkenylderivate begünstigt, abzuleiten.

4-Methylsulfinylbutylisothiocyanat (welches auch als Sulforaphan bezeichnet wird), das von dem entsprechenden Glucosinolat abgeleitet ist, welches man in einigen Brassica-Spezies findet, wurde zuvor als ein wirksamer Induktor für Phase-II-Entgiftungsenzyme (z. B. QR; Chinonreduktase [NADP (H): Chinon-Akzeptor] Oxidoreduktase) in Maus-Hepatom-Hepa 1c1c7-Zellen identifiziert. In ähnlicher Weise ist 3-Methylsulfinylpropylisothiocyanat ein starker Induktor für Phase-II-Enzyme. Eine Messung der Induktion von QR in Maus-Hepatom-Hepa 1c1c7-Zellen liefert einen schnellen und zuverlässigen Indikator für die Fähigkeit von Gemüseextrakten, Phase-II-Enzyme in Säugerzellen zu induzieren (Prochaska, H. J., Santamaria, A. B. & Talalay, P. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 2394-2398) und daher für vermeintliche anti-karzinogene Aktivität. Dieser Test wurde verwendet, um das Potential von synthetischen Isothiocyanaten (Zhang, Y., Talalay, P., Cho, C.-G. & Posner, G. H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 2399-2403 und Talalay, P., De Long, M. J. & Prochaska, H. J. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8261-8265), von Extrakten aus Kreuzblütlergemüse (Tawfiq, N., Wanigatunga, S., Heaney, R. K., Musk, S. R. R., Williamson, G. & Fenwick, G. R. (1994) Exp. J. Cancer Prev. 3, 285-292) und von mit Myrosinase behandelten Glucosinolaten (Tawfiq, N., Heaney, R. K., Plumb, J. A., Fenwick, G. R., Musk, S. R. R. & Williamson, G. (1995) Carcinogenesis 16, 1191-1194) einzuschätzen. Jedoch wurden weder der Glucosinolat-/Isothiocyanatgehalt der Gemüseextrakte generell noch das relative anti-karzinogene Potential verschiedener Kreuzblütlergemüse beschrieben.

In der vorliegenden Erfindung wurde dieser Test verwendet, um das Verhältnis zwischen der Fähigkeit, QR-Aktivität (anti-karzinogenes Potential) zu induzieren, und dem Glucosinolatgehalt von drei wilden Mitgliedern des B. oleracea-Komplexes, welche hohe Mengen an 3-Methylthiopropyl- (B. drepanensis), 3-Methylsulfinylpropyl- (B. villosa) bzw. 2-Propenyl- (B. atlantica) Glucosinolaten aufweisen, zu bestimmen, wenn man sie mit kommerziellen Broccolikulturen durch herkömmliche Kreuzungen und Hybride zwischen den wilden Zugängen und einer kommerziellen doppelt haploiden Broccoli-Zuchtlinie kombiniert. Dementsprechend wurden Verfahren und Zusammensetzungen erhalten, welche die genetischen Zusammensetzungen ermitteln, die für die stabile Produktion spezieller Glucosinolate (z. B. von 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten) und die Produktion der entsprechenden Isothiocyanatderivate erforderlich sind. Diese genetischen Kombinationen liefern brauchbare Zuchtlinien für die Herstellung von kommerziellen Unterarten von Broccoli und anderen Kreuzblütlergemüsen, die das 10-100fache der Mengen dieser anti- karzinogenen Verbindungen aufweisen als man sie derzeit in kommerziell gezüchteten Unterarten findet.

Es wurde z. B. herausgefunden, daß eine 10fache Zunahme der Menge an 4- Methylsulfinylbutylglucosinolat durch Kreuzen von Broccolikulturen mit ausgewählten wilden Taxonomien des Brassica oleracea-Komplexes (Chromosom Nr., n = 9) erzielt wird. In ähnlicher Weise werden Zunahmen der Mengen an 3-Methylsulfinylpropylglucosinolat beobachtet. Gewebe aus diesen Hybriden zeigten gegenüber kommerziell gezüchteten Broccolikulturen eine 100fache Zunahme in der Fähigkeit Chinonreduktase in Hepa 1c1c7-Zellen zu induzieren, aufgrund sowohl einer Zunahme an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten als auch der erhöhten Umwandlung von 4-Methylsulfinylbutylglucosinolat in Sulforaphan. Dementsprechend liefert die Erfindung Verfahren und genetische Zusammensetzungen für die Herstellung von kommerziell wertvollen Kreuzblütlergemüsen, die hohe Mengen an anti-karzinogenen Sekundärmetaboliten enthalten. Die Erfindung erwägt weiterhin die Entwicklung von Broccoli-Zuchtlinien mit verstärkter anti-karzinogener Aktivität.

Die Auswahl von Zuchtlinien mit hohen Mengen an anti-karzinogenen Verbindungen wird weiter erleichtert durch die Verwendung von molekularen Markern zur Festlegung des chromosomalen Ortes der Glucosinolat-Biosynthesegene und zur Unterstützung der Auswahl von Rückkreuzungslinien, welche die genetische Zusammensetzung mit der größten Brauchbarkeit zu Zwecken der Erhöhung der Mengen an anti-karzinogenen Verbindungen in Broccoli enthalten.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung liefert Verfahren zur Erhöhung der Mengen an 4- Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten in Brassica-Gemüsen durch genetische Mittel. Diese Mittel umfassen das Kreuzen von wilden Brassica-Spezies mit Broccoli-Spezies, Auswahl von Linien mit erhöhten 4-Methylsulfinylbutyl- und 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten und Einschätzung der anti-karzinogenen Eigenschaften der genetischen Kombinationen durch Messen des Potentials von Pflanzenzellextrakten, Phase-II-Enzyme zu induzieren. RFLP-Marker können dazu verwendet werden, Linien in Kreuzungen auszuwählen, die einen hohen Anteil an genetischem Hintergrund von Broccoli haben, und die Position der relevanten Glucosinolat-Biosynthesegene auf der Karte des Brassica-Genoms festzulegen.

Hybride zwischen kommerziellen Broccoli-Kulturen und den zwei wilden Spezies B. villosa und B. drepanensis sind vollständig fruchtbar, und es werden Rückkreuzungspopulationen hergestellt. Broccoli-Linien mit erhöhten Mengen an 4-Methylsulfinylbutyl- und 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten und damit einhergehender anti-karzinogener Aktivität werden aus diesen Populationen entwickelt. Die Effizienz der Entwicklung dieser Linien wird durch die Verfügbarkeit von molekularen Markern zur Auswahl von sowohl dem Glucosinolatgehalt als auch dem gewünschten genetischen Hintergrund beträchtlich verbessert.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 Genetisches Modell der aliphatischen Glucosinolat-Biosynthese in Brassica.

Fig. 2 Induktion von QR-Aktivität (Phase-II-Enzymen) in Maus-Hepatom-Hepa 1c1c7-Zellen unter Verwendung von Extrakten aus der Kultur Marathon und synthetischem Sulforaphan (4-Methylsulfinylbutylisothiocyanat).

Fig. 3 Wirkung von Extrakten aus B. drepanensis, B. villosa und B. atlantica auf die Induktion von QR (Phase-II-Enzymen) in Maus-Hepatom-Hepa 1c1c7-Zellen.

Fig. 4 Die Wirkung von Extrakten der Kultur GD DH und der Hybride, die aus Kreuzungen mit wilden Spezies [GD DH x B. drepanensis], [GD DH x B. villosa] und [GD DH x B. aflantica] gewonnen wurden, auf die Induktion von QR (Phase-II-Enzymen) in Maus- Hepatom-Hepa 1c1c7-Zellen.

Fig. 5 Gaschromatographisches Profil der Glucosinolate von einem Extrakt aus einem Hybrid [GD DH x B. drepanensis].

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein eßbares Kreuzblütlergemüse mit hohen Mengen an anti-karzinogenen Verbindungen, nämlich 4-Methylsulfinylbutylisothiocyanat und/oder 3-Methylsulfinylpropylisothiocyanat, bereitzustellen.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren für die selektive Erhöhung von anti-karzinogenen Glucosinolatderivaten in Brassica-Spezies und die Bereitstellung von Brassica-Spezies mit erhöhten Mengen an anti-karzinogenen Glucosinolatderivaten und insbesondere von eßbaren Brassica-Gemüsen mit erhöhten Mengen der anti-karzinogenen Glucosinolatderivate 4-Methylsulfinylbutylisothiocyanat und/oder 3-Methylsulfinylpropylisothiocyanat.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren zur Selektion von genetischen Kombinationen von Broccoli, welche hohe Mengen an anti-karzinogenen Glucosinolatderivaten enthalten, und von Verfahren zur Bestimmung der anti-karzinogenen Eigenschaften dieser genetischen Kombinationen.

Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Zusammensetzungen der Art, welche Brassica-Gemüse mit Konzentrationen an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten zwischen 10 und 100 uMol/g Trockengewicht enthalten.

Diese und andere Aufgaben der Erfindung werden durch eine oder mehrere der nachfolgend beschriebenen Ausführungsformen gelöst.

Die Auswahl von Broccoli mit erhöhten Mengen an anti-karzinogenen Glucosinolaten ist unter dem vorhandenen kommerziellen genetischen Hintergrund, der zur Entwicklung kommerzieller Broccolikulturen verwendet wird, nicht möglich. Basierend auf dem genetischen Modell der Glucosinolatbiosynthese, welches in Fig. 1 gezeigt ist, hängt die Herstellung von 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten von einer Anzahl genetischer Faktoren ab. Diese umfassen eine niedrige Aktivität der GSL-ALK-Allele und geeignete Mengen an Aktivität, die von den GSL-OXID-Allelen und anderen Allelen, die für die Herstellung von Glucosinolat-Vorläuferverbindungen verantwortlich sind, codiert werden. Es wird angenommen, daß der relativ milde Geschmack von Broccoli allgemein mit relativ niedrigen Mengen an Glucosinolaten und speziell niedrigen Mengen an flüchtigen Glucosinolaten zusammenhängt. Dies wird deutlich, wenn man die Gesamtglucosinolat-Profile von kommerziellem Broccoli und wilden Verwandten vergleicht.

Daher müssen Verfahren, um Broccoli mit gewünschten Geschmackseigenschaften und erhöhten Mengen an anti-karzinogenen Glucosinolaten zu erhalten, die Auswahl von Linien mit der geeigneten genetischen Kombination umfassen, welche keine stark schmeckenden Alkenylglucosinolate herstellen. Es ist auch erwünscht, niedrige Mengen anderer Glucosinolate aufrechtzuerhalten, um eine Produktion ohne Geschmack zu vermeiden. Daher dürfen Verfahren, um die spezifische Erhöhung von 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten zu erreichen, nicht zu einer Gesamtherstellung von Glucosinolaten oder einer Herstellung von Alkenylglucosinolaten führen. Die vorliegende Erfindung liefert Verfahren, um diese Ziele zu erreichen.

Unter normalen Feldbedingungen nimmt man an, daß Wildtyp-B. oleracea sich wahrscheinlich nicht mit kultivierter B. oleracea kreuzbefruchtet. Man nimmt an, daß Kompatibilitätseigenschaften abgeschaltet werden, wenn die Kulturen blühen.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von genetischen Markern zur Erleichterung der Auswahl von Linien, welche die gewünschte genetische Kombination enthalten. Die Verwendung von RFLP-Markern oder DNA-Sonden, welche spezifische Eigenschaften aussondern, ist auf dem Gebiet gut bekannt, jedoch beschreibt die vorliegende Erfindung spezifische DNA- Sonden, von denen gezeigt wurde, daß sie für die Selektion derjenigen genetischen Kombinationen geeignet sind, die zu erhöhten Mengen an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten in Brassica oleracea führen. Darüber hinaus liefert die RFLP-Analyse ein geeignetes Mittel zur Beurteilung desjenigen Anteils des Genoms aus einer Hybridpflanze, der aus Broccoli oder einer wilden Spezies erhalten wurde. Somit findet die Verwendung von RFLP oder DNA-Sonden Verwendung in der schnellen Selektion von Pflanzen, welche den gewünschten Anteil von Genomen von wilder Spezies und Broccoli enthalten. Daher wird die Selektion von Broccoli mit erhöhten Men gen an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten, die einen hohen Prozentsatz des gewünschten kommerziellen Genoms enthalten, durch die Verwendung von DNA- Markern zur Analyse von Hybridpflanzen, gefolgt von dem Kreuzen von Broccoli mit einer wilden Spezies, erheblich erleichtert.

Die vorliegende Erfindung beschreibt auch Verfahren für die Beurteilung der anti- karzinogenen Eigenschaften von Broccoli, der erhöhte Mengen an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3- Methylsulfinylpropylglucosinlaten enthält, durch Tests für die Induktion von Phase-II-Enzymen. Obwohl die anti-karzinogenen Langzeitwirkungen von speziellen Derivaten von 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten nicht präzise bestimmt werden können und darüber hinaus von vielen zusätzlichen Faktoren ernährungstechnischer und anderer Art abhängig sein werden, liefert die Verwendung des Induktionstests bezwingende Beweisanzeichen für die anti- karzinogenen Wirkungen der Isothiocyanatderivate der speziellen Glucosinolate.

Somit beschreibt die vorliegende Erfindung Verfahren, welche die Selektion von Brassica sp. mit erhöhten Mengen an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten zulassen, Verfahren zur Bewertung der anti-karzinogenen Wirkungen der genannten Pflanzenspezies und Verfahren und Zusammensetzungen, welche die Herleitung von Broccoli-Linien mit anti- karzinogenen Eigenschaften erlauben.

Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Selektion von Broccoli-Linien mit erhöhten Mengen an speziellen Glucosinolaten eingesetzt, welches die folgenden Stufen umfaßt:

I.) Kreuzen einer wilden Spezies mit doppelt haploiden Broccoli-Zuchtlinien;

II.) Analysieren von F1-Hybriden, Auswählen der Hybride mit der höchsten Menge an 4- Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten und Rückkreuzen mit Broccoli- Zuchtlinien;

III.) Analyse von Glucosinolaten in einzelnen Pflanzen der B1-(Rückkreuzung 1)Generation;

IV.) Durchführen einer oder zweier weiterer Runden der Rückkreuzung (B2, B3) unter Selektion von Pflanzen mit der höchsten Menge an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3- Methylsulfinylpropylglucosinolaten, Anti-Karzinogenese-Durchmusterung ausgewählter Individuen durch Induktion von Phase-II-Enzymen;

V.) Analyse der B3-(Rückkreuzung 3)Population unter Selektion von Pflanzen mit der höchsten Menge an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten, Anti- Karzinogenese-Durchmusterung ausgewählter Individuen durch Induktion von Phase-II-Enzymen;

VI.) Auswahl einer Broccoli-Linie mit erhöhten Mengen an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten, welche die anti-karzinogene Eigenschaft tragen, in der Lage zu sein, eine starke Induktion von Phase-II-Enzymen zu bewirken.

Somit erlaubt das Verfahren die Selektion von Broccoli-Linien mit erhöhten Mengen an 4- Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten. Die erhöhten Mengen dieser speziellen Glucosinolate werden mit der anti-karzinogenen Eigenschaft durch Bestimmung der Induktion von Phase-II-Enzymen in Korrelation gesetzt. Durch Verwendung von Rückkreuzung werden genetische Kombinationen hergeleitet, welche die anti-karzinogene Eigenschaft in einem genetischen Hintergrund enthalten, den man in kommerziellem Broccoli findet. Dementsprechend wird die Herstellung von 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten in kommerziellen Broccoli-Kulturen durchgeführt, was zu einer neuen und wertvollen Broccoli-Zusammensetzung führt.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die anti- karzinogene Fähigkeit der Linien weiter kombiniert mit speziellen Allelen für Selbstinkompatibilität, welche für Samenherstellungsstrategien nützlich ist. Es ist bekannt, daß bestimmte Kreuzblütlerspezies verschiedene Allele für Selbstinkompatibilität tragen, und diese Allele werden häufig zur Hybridsamenherstellung verwendet. Somit kann Hybridbroccoli hergestellt werden, welcher die genetische Kombination trägt, die erhöhte Mengen an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3- Methylsulfinylpropylglucosinolaten herstellt. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Broccoli-Linien mit hohen Mengen an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3- Methylsulfinylpropylglucosinolaten und einer speziellen Kombination von Selbstinkompatibilitätsallelen (SI) auszuwählen. In einigen Fällen kann es möglich sein, eine molekulare Sonde zur Identifizierung von SI-Allelen zu verwenden, wie die Sonde pW150 (erhältlich von Dr. Tom Osborne, Department of Agronomy, University of Wisconsin, Madison, WI, 53706, und beschrieben in Toroser et al., Theoretical and Applied Genetics, 91: 802-808, 1995), oder eine Analyse des tatsächlichen SI- Proteins kann eine Selektion der gewünschten SI-Allele liefern.

Daher wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Selektion von Broccoli-Linien mit hohen Mengen an speziellen Glucosinolaten und SI-Allelen eingesetzt, welches die folgenden Schritte umfaßt:

I.) Kreuzen einer wilden Spezies mit doppelt haploiden Broccoli-Zuchtlinien, die spezielle SI-Allele enthalten;

II.) Analysieren der F1-Hybride, Auswählen der Hybride mit der höchsten Menge an 4- Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten und Rückkreuzen mit Broccoli- Zuchtlinien, Durchmustem hinsichtlich SI-Allelen mit RFLP-Markern, Selektion von Individuen mit einer gewünschten Kombination von gegensätzlichen SI-Allelen;

III.) Analyse von Glucosinolaten in einzelnen Pflanzen der B1-(Rückkreuzung 1)Generation;

IV.) Durchführen einer oder zweier weiterer Runden der Rückkreuzung unter Selektion von Pflanzen mit der höchsten Menge an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3- Methylsulfinylpropylglucosinolaten, Durchmustern hinsichtlich geeigneter SI-Allele mit RFLP- Markern, Anti-Karzinogenese-Durchmusterung von ausgewählten Individuen durch Induktion von Phase-II-Enzymen;

V.) Analyse der B3-(Rückkreuzung 3)Population unter Selektion von Pflanzen mit der höchsten Menge an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten, Anti- Karzinogenese-Durchmusterung von ausgewählten Individuen durch Induktion von Phase-II- Enzymen;

VI.) Selektion einer Broccoli-Linie mit erhöhten Mengen an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten und geeigneten SI-Allelen, welche die anti- karzinogene Eigenschaft tragen, die in der Lage ist, eine starke Induktion von Phase-II-Enzymen zu bewirken.

Somit werden Broccoli-Linien hergeleitet, welche spezielle SI-Allele tragen, die für eine Kreuzung in einem Hybridsamenherstellungsschema geeignet sind. Dementsprechend kann ein Hybridbroccolisamen, der die genetische Kombination für erhöhte Mengen an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten trägt, durch Kreuzen mit dem geeigneten Eltemteil hergestellt werden. Der Samen ist wertvoll, da Hybridbroccoli auch viele genetische Kombinationen trägt, die für die agronomische Leistung wichtig sind.

Als eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren beschrieben, welches die Verwendung von DNA-Markern einsetzt, die mit spezifischen Glucosinolatprofilen segregieren. Bei diesem Verfahren werden DNA-Marker oder spezieller Marker, die als QTLs (Quantitative Trait Loci) bekannt sind, eingesetzt, um diejenige genetische Kombination in Broccoli zu selektieren, welche zu erhöhten Mengen an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten führt. Insbesondere wird die Verwendung der Marker beschrieben, die als pW176, pW207 und pW141, lokalisiert auf Chromosom 2, bekannt sind, und der Marker, die als pW224, pW114, pW145, pW123, pW138, pW197, pW228 und pW106, lokalisiert auf Chromosom 5, bekannt sind (erhältlich von Dr. Tom Osborne, Department of Agronomy, University of Wisconsin, Madison, WI, 53706, und beschrieben in Toroser et al., Theoretical and Applied Genetics, 91: 802-808, 1995, und beschrieben in Ferreira et al., Theoretical and Applied Genetics, 89: 615-621, 1994). Man hat herausgefunden, daß zwei Bereiche des Genoms (das man auf Chromosom 2 und 5 findet) von wilder Brassica oleracea für die Expression erhöhter Mengen an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten erforderlich sind. Die Verwendung der Marker erleichtert erheblich die Selektion von Linien aus Hybriden und Rückkreuzungen zwischen Broccoli und wilden Spezies, welche die genetische Kombination enthalten, die für die Herstellung von erhöhten Mengen an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten verantwortlich sind. Darüber hinaus hat man herausgefunden, daß der auf Chromosom 5 lokalisierte QTL spezifisch die Mengen an 3-Methylsulfinylpropylglucosinolat reguliert und wenig Wirkung auf die Mengen an 4- Methylsulfinylbutylglucosinolat hat. Daher ist es möglich, die Mengen an 3-Methylsulfinylpropylglucosinolat und 4-Methylsulfinylbutylglucosinolat unabhängig voneinander durch die Verwendung von molekularen Sonden zusätzlich zur einfachen Selektion von Linien zu manipulieren.

Dementsprechend ist in dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Broccoli mit erhöhten Mengen an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3- Methylsulfinylpropylglucosinolaten beschrieben, welches die folgenden Stufen umfaßt:

I.) Kreuzen wilder Spezies mit doppelt haploiden Broccoli-Zuchtlinien;

II.) Analysieren von F1-Hybriden und Auswählen der Hybride mit der höchsten Menge an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten mittels Durchmusterung mit RFLP-Sonden, einhergehend mit der Herstellung von 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3- Methylsulfinylpropylglucosinolaten, und Rückkreuzen ausgewählter Linien mit Broccoli-Zuchtlinien;

III.) Analyse von Glucosinolaten in einzelnen Pflanzen der B1-(Rückkreuzung 1)Generation;

IV.) Durchführen einer oder zweier weiterer Runden der Rückkreuzung unter Selektion von Pflanzen mit der höchsten Menge an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten mittels Durchmusterung mit RFLP-Sonden, einhergehend mit der Herstellung von 4- Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten, Anti-Karzinogenese-Durchmusterung ausgewählter Individuen durch Induktion von Phase-II-Enzymen;

V.) Analyse der B3-(Rückkreuzung 3)Population unter Selektion von Pflanzen mit der höchsten Menge an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten mittels Durchmusterung mit RFLP-Sonden, einhergehend mit der Herstellung von 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten, und Analyse von Glucosinolatprofilen, Anti- Karzinogenese-Durchmusterung von ausgewählten Individuen durch Induktion von Phase-II- Enzymen;

VI.) Selektion einer Broccoli-Linie mit erhöhten Mengen an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten, welche die anti-karzinogene Eigenschaft trägt, die in der Lage ist, eine starke Induktion von Phase-II-Enzymen zu bewirken.

Somit erleichtert die Vervendung von RFLP-Sonden zur Identifizierung spezifischer Bereiche des wilden Brassica oleracea-Genoms (z. B. sogenannte QTLs), die für die Herstellung erhöhter Mengen an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten verantwortlich sind, in hohem Maße die Herstellung von eßbarem Broccoli mit anti-karzinogenen Eigenschaften.

Die vorangegangenen Ausführungsformen erlauben die Selektion von Broccoli-Linien mit erhöhten Mengen an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten, vorzugsweise von Broccoli mit einer Zusammensetzung mit Konzentrationen an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten zwischen 10 und 100 uMol/g Trockengewicht. Darüber hinaus ermöglichen die vorangegangenen Ausführungsformen die Selektion von Broccoli- Linien mit erhöhten Mengen an 4-Methylsulfinylbutyl- und/oder 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten, die in der Lage sind, einen 10-100fachen Anstieg der Induktion von Phase-II-Enzymen zu verursachen, wenn man es mit Broccoli-Kulturen vergleicht, die man allgemein im Handel findet.

Der Fachmann würde in Betracht ziehen, daß die hierin beschriebenen Verfahren auch angewendet werden können, um andere B. oleracea-Kreuzblütlergemüse als Broccoli zu erhalten, einschließlich Kohl, wie Weißkohl, Grünkohl, wie Wirsing, Blumenkohl, Rosenkohl, Krauskohl, Kohlrabi und ähnliches. Es wird weiterhin in Betracht gezogen, daß Kohlrübe (B. napus) und Steckrübe (B. rapa) ebenfalls gemäß dem Verfahren und den genetischen Kombinationen der vorliegenden Erfindung manipuliert werden könnten.

Die folgenden Beispiele erläutern das Verfahren, jedoch beschränken sie in keiner Weise den Schutzumfang der Erfindung.

Beispiel 1 Verfahren zur Messung des Glucosinolatgehalts in wilden und kommerziellen Brassica-Spezies und Hybriden davon

Eine doppelt haploide Broccoli-Zuchtlinie, hergeleitet aus der Kulturform Green Duke (bezeichnet als GD DH, Bouhuon, E. J. R., Keith, D. J., Parkin, I. A. P., Sharpe, A. G. & Lydiate, D. J. (1996) Theor. Appl. Genet. 93, 833-839), drei kommerzielle Kulturformen (Trixie, Green Comet und Marathon) und drei wilde Brassica-Spezies, B. drepanensis Caruel (syn. B. villosa Biv. subsp drepanenals), B. villosa Biv. und B. atlantica (Coss.), O. E. Schultz, wurden in einem Gewächshaus unter Standardbedingungen gezüchtet, wie sie früher beschrieben wurden (Magrath, R., Herron, C., Giamoustaris, A. & Mithen, R. (1993) Plant Breed 111, 55-72). Jede der wilden Spezies wurde mit der GD DH-Zuchtlinie gekreuzt, und F1-Samen wurden erhalten und unter Standardbedingungen gezüchtet. Die Hinterlegung von Samen des Kulturformderivats GD DH erfolgte am 11. Februar 1999 bei der Natioäal Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) in Aberdeen, Schottland, und erhielt die Hinterlegungsnummer NCIMB 41008. Die Infloreszenz wurde nach 8-12 Wochen von den Kulturformen und nach 12-16 Wochen von den Hybriden geerntet und unmittelbar in flüssigem Stickstoff' eingefroren und gefriergetrocknet. Synthetisches Sulforaphan wurde freundlicherweise von Professor P. Talalay, The John Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, geliefert.

Glucosinolate wurden aus dem gefriergetrockneten Material extrahiert, in Desulfoglucosinolate überführt und mittels HPLC analysiert, wie es zuvor beschrieben wurde (Magrath, R., Herron, C., Giamoustaris, A. & Mithen, R. (1993) Plant Breed. 111, 55-72), wobei Benzylglucosinolat als interner Standard verwendet wurde.

Extrakte aus dem gefriergetrockneten Material wurden hinsichtlich ihrer Induktionsaktivität in Maus-Hepatom-Hepa 1c1c7-Zellen bewertet. Etwa 0,1 g gemahlenes gefriergetrocknetes Material wurde durch Zugabe von Wasser (2 ml) angefeuchtet, homogenisiert und bei Raumtemperatur für eine Stunde unter gelegentlichem Mischen stehen gelassen. Heißer 70% (v/v) Methanol (3 ml) wurde hinzugefügt und sorgfältig gemischt vor einer Inkubation für 15 Minuten bei +70ºC. Die Homogenisate wurden auf Raumtemperatur gekühlt und für 5 Minuten bei 3000 U. p. M. zentrifugiert. Die Überstände wurden abgenommen und das Volumen in einer Vakuumzentrifuge auf etwa ein Fünftel des anfänglichen Volumens vermindert. Die erhaltenen Konzentrate wurden durch sterile, nicht pyrogene Filter (0,22 mm) filtriert und vor der Untersuchung bei -70ºC gelagert. Die Konzentrationen jedes der Extrakte wurden als Trockengewicht des ursprünglichen Materials zu jedem ml Kulturmedium ausgedrückt.

Die Induktion wurde gemäß veröffentlichten Verfahren gemessen (Tawfiq, N., Heaney, R. K., Plumb, J. A., Fenwick, G. R., Musk, S. R. R. & Williamson, G. (1995) Carcinogenesis 16, 1191-1194, Prochaska, H. J. & Santamaria, A. B. (1988) Anal. Biochem. 169, 328-336, Williamson, G., Plumb, G. W., Uda, Y., Price, K. R. & Rhodes, M. J. C. (1996) Carcinogenesis 17, 2385-2387), wobei die folgenden Modifikationen vorgenommen wurden. Jede Probe wurde bei acht Konzentrationen analysiert, wobei für jede Konzentration vier Replikate verwendet wurden. b-Naphthoflavon wurde als eine Positivkontrolle mit einer Konzentration von 0,2 mM eingesetzt. Dieses erzeugte typischerweise eine dreifache Konzentration (CD; 0,02 mM) und war mit vorangegangenen Bestimmungen vergleichbar. Jedes Kulturform/Hybrid wurde separat zu drei Zeitpunkten extrahiert und analysiert.

Nicht flüchtige und flüchtige Bestandteile der hydrolytischen Abbauprodukte der Kulturformen, wilden Spezies und der Hybride wurden mittels GC-MS unter Verwendung einer HP Chemstation GP800A, ausgestattet mit einer 30 m · 0,25 mm HP1 vernetzten Methylsilan-Säule (Hewlett Packard Co., Palo Alto, CA, USA), analysiert. Typischerweise wurde die Säule von +60ºC auf +250ºC mit 20ºC/min erhitzt, und Massenspektren wurden von 35-250 m/z abgetastet. Etwa 0,1 g gefriergetrocknetes Material wurde mit Wasser angefeuchtet, sorgfältig gemischt und für eine Stunde unter gelegentlichem Mischen inkubiert. Nichtflüchtige hydrolytische Produkte wurden mit Methylenchlorid aus den Proben extrahiert und vor der Analyse filtriert. Um flüchtige Produkte zu analysieren, wurde gefriergetrocknetes Material (0,1 g) mit Wasser (0,5 ml) angefeuchtet, das Glasgefäß sofort abgedichtet und flüchtige Produkte aus dem oberen Raum des Gefäßes mit einer Festphasenmatrixextraktionssonde (SPME) (Supelco Inc., Bellefonte, PA, USA) gesammelt.

Beispiel 2 Glucosinolatgehalt der Brassica-Linien

Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt den Glucosinolatgehalt der kommerziellen Broccoli- Kulturformen Green Comet, Marathon und Trixie, wilder B. oleracea-Spezies und von Hybriden zwischen einer doppelt haploiden Linie der kommerziellen Kulturform Green Duke und wilder Brassica- Spezies.

TABELLE 1

Individueller und gesamter Gehalt an aliphatischem Glucosinolat (uMol/g Trockengewicht ± 1 Standardfehler) von Broccoli-Kulturformen, wilden Brassica-Spezies und Hybriden, hergestellt aus Kreuzungen zwischen GD DH und den wilden Brassica-Spezies.

*MSP: 3-Methylsulfinylpropyl, MSB: 4-Methylsulfinylbutyl, PROP: 2-Propenyl, BUT: 3-Butenyl, MTP: 3- Methylthiopropyl, OH-BUT: 2-Hydroxy-2-butenyl, GD: GD DH

Die Mengen an 4-Methylsulfinylbutylglucosinolat in den Broccoli-Kulturformen waren denjenigen ähnlich, die zuvor beschrieben wurden (Carlson, D. G., Daxenbichler, M. E., von Etten, C. H., Kwolek, W. F. & Williams, P. H. (1987) J. Amer. Soc. Hort. Sci. 112, 173-178). Wilde Spezies hatten etwa eine 10fach größere Menge an gesamten aliphatischen Glucosinolaten als die Kulturformen. B. villosa, B. drepanensis und B. atlantica hatten vornehmlich 3-Methylsulfinylpropyl-, 3- Methylthiopropyl- und 2-Propenylglucosinolate. Die Unterschiede in den Glucosinolatprofilen wurden den Unterschieden in den Allelen an den GSL-OXID- und GSL-ALK-Loki zugeschrieben (Giamoustaris, A. & Mithen, R. (1996) Theor. Appl. Genet. 93, 1006-1010). In den Hybriden aus [GD DH x B. drepanensis] und [GD DH x B. villosa] war 4-Methylsulfinylbutyl das häufigste Glucosinolat aufgrund der dominanten Natur der GSL-ELONG- und GSL-OXID-Allele, die man in GD DH findet, und der Null-GSL-ALK-Allele in beiden Eltern. In dem [GD DH x B. atlantica]-Hybrid war 3- Butenylglucosinolat das vorherrschende Glucosinolat. 2-Hydroxy-3-butenylglucosinolat war ebenfalls vorhanden aufgrund der Aktivität einer funktionalen GSt-OH-Allele in der GD DH-Linie (unveröffentlicht), was aufgrund der Null-GSL-ALK-Allele, welche die Biosynthese von 3-Butenylglucosinolat verhindert, normalerweise nicht deutlich wird.

Beispiel 3 Induktion von Phase-II-Enzymen

Synthetisches Sulforaphan wurde als Positivkontrolle verwendet, um die Induktion von QR in Hepa 1c1c7-Zellen zu quantifizieren. Es handelte sich um einen wirksamen Induktor, und er erzeugte eine dreifache Induktion bei 1,6 mM (CD; 0,4 mM), vergleichbar mit früheren Bestimmungen. Bei keiner der untersuchten Konzentrationen wurde für irgendeine der Proben Zytotoxizität beobachtet. Extrakte aus sämtlichen der Kulturformen waren schlechte Induktoren über den Konzentrationsbereich von 0,001 mg/ml bis 0,125 mg/ml. Jedoch war die Induktion geringer als erwartet, wenn 100% der Glucosinolate in Isothiocyanate und nicht in andere Produkte, wie Thiocyanat- oder Nitrilderivate überführt worden waren (Fenwick, G. R., Heaney, R. K. & Muflin, W. J. (1983) Crit. Ref. Food Sci. Nufr. 18, 123-201).

Zum Beispiel enthielt Marathon 5,4 mMol 4-Methylsulfinylbutylglucosinolat/g Trockengewicht (Tabelle 1). Daher würde man erwarten, daß ein Extrakt mit 75 mg/ml von Marathon eine Konzentration an 4-Methylsulfinylbutylisothiocyanat von 0,4 mM aufweist, was zu einer zweifachen Induktion führen würde. Jedoch wurde bei dieser Konzentration keine signifikante Induktion beobachtet. Tatsächlich wurden 2,5 mg/ml Marathon-Extrakt für eine zweifache Induktion benötigt, was, wenn 100% des Glucosinolats in Isothiocyanat überführt werden, 13,5 mM 4-Methylsulfinylbutylisothiocyanat entspricht. Somit wurde entweder ein geringer Anteil des Glucosinolats in 4- Mefhylsulfinylbutylisothiocyanat überführt, oder die Induktion von QR-Aktivität wurde durch andere Bestandteile in dem Gemüseextrakt vermindert.

Zum Testen auf das Vorhandensein eines Inhibitors wurde Marathon-Extrakt (0,125 mg/ml) vor der Anwendung auf die Hepa 1c1c7-Zellen mit synthetischem Sulforaphan versetzt. Die beobachtete Induktion war ähnlich derjenigen von reinem Sulforaphan alleine (Fig. 2), was zeigte, daß es in den Extrakten keinen hemmenden Effekt durch andere Bestandteile gab. In Fig. 2 ist die Induktion von QR in Hepa 1c1c7-Zellen unter Verwendung von Sulforaphan ( ), Marathon-Extrakt (0,125 mg/ml) mit zugefügtem Sulforaphan ( ) oder Marathon-Extrakt (0,001 mg/ml bis 0,125 mg/ml) ( ) gezeigt. Die geschätzte Isothiocyanatkonzentration des Marathon-Extrakts basierte auf der Annahme, daß 100% des Elternglucosinolats in das Isothiocyanat überführt werden. Somit ist der Marathon-Extrakt (1 mg/ml) äquivalent zu 5,4 uM 4-Methylsulfinylbutylisothiocyanat. Ergebnisse für Marathon (0,125 mg/ml) mit zugefügtem Sulforaphan wurden nur in Bezug auf die zugefügte Konzentration an synthetischem Sulforaphan aufgetragen, da der Marathon-Extrakt alleine keine signifikante Wirkung auf die Induktionsaktivität hat. Daher ist es möglich, daß in Marathon (und auch in anderen Kulturformen) nur ein Anteil des Glucosinolats in das Isothiocyanat überführt wurde.

Extrakte aus B. villosa und B. drepanensis waren wirksame Induktoren für QR-Aktivität. Im Gegensatz dazu induzierten Extrakte aus B. atlantica keine QR-Aktivität trotz des hohen Glucosinolatgehalts (Fig. 3). In Fig. 3 sind die Wirkungen der Extrakte von B. drepanensis ( ), B. villosa ( ) und B. atlantica ( ) auf die Induktion von QR in Maus-Hepatom-Hepa 1c1c7-Zellen gezeigt. Wenn man annimmt, daß 100% des Glucosinolats in diesen Taxonomien in das Isothiocyanat und nicht in andere mögliche hydrolytische Abbauprodukte (Thiocyanat- und Nitrilderivate) überführt worden waren, betragen die offensichtlichen CD-Werte für 3-Methylthiopropylisothiocyanat und 3- Methylsulfinylpropylisothiocyanat 1,6 mM bzw. 0,5 mM. Diese Werte sind beide niedriger als diejenigen, die für synthetische Isothiocyanate mit 3,5 mM und 2,4 mM beschrieben wurden, wie es in Tabelle 2 gezeigt ist. Tatsächlich wären die offensichtlichen CD-Werte sogar geringer, wenn weniger der Glucosinolate in Isothiocyanate überführt wurden. Die nachfolgende Tabelle 2 erläutert die Induktion von QR-Aktivität (Phase-II-Enzymen) in Hepa 1c1c7-Zellen durch Gemüseextrakte.

TABELLE 2 Potential zur Induktion von QR in Maus-Hepa-1c1c7-Zellen durch Gemüseextrakte

*CD-Wert: Konzentration von Elternglucosinolat, die erforderlich ist, die Induktionsaktivität von QR zu verdoppeln.

angegebene Werte wurden unter der Annahme von 100% Überführung der Elternglucosinolate in das entsprechende Isothiocyanat berechnet. GD: GD DH. § Andere Studien haben einen CD-Wert von 0,2 um angegeben. Siehe Prochaska (10).

Der Unterschied in der Wirkung könnte entweder an den chemischen Unterschieden zwischen natürlichen und synthetischen Isothiocyanaten (z. B. der Art der Stereoisomere) oder an anderen Faktoren in den Pflanzenextrakten, welche synergistische Effekte von niedrigen Mengen an anderen Isothiocyanaten umfassen, liegen. Das Fehlen von Aktivität aus Extrakten von B. atlantica unterstreicht die Bedeutung der Struktur der Glucosinolat-Seitenkette.

Extrakte sowohl aus [GD DH x B. villosa] als auch aus [GD DH x B. drepanensis] waren wirksame Induktoren der QR-Induktivität (Fig. 4). In Fig. 4 ist die Wirkung von Extrakten der Kulturform GD DH ( ) und der Hybridkreuzungen (GD DH x B. drepanensis] ( ), [GD DH x B. villosa] ( ) und [GD DH x B. atlantica] ( ) auf die Induktion von QR in Maus-Hepatorn-Hepa 1c1c7-Zellen gezeigt. Basierend auf 100% Überführung der Glucosinolate in Isothiocyanate betrugen die auftretenden CD-Werte beider Extrakte 0,3 mM (4-Methylsulfinylbutylgfucosinolatäquivalent), was denjenigen von reinem Sulforaphan (oben) und denjenigen, die in früheren Studien berichtet wurden, ähnlich ist. Während es einen ungefähr 10fachen Anstieg der Mengen an 4- Methylsulfinylbutylglucosinolat in [GD DH x B. villosa] und [GD DH x B. drepanensis] im Vergleich zu Marathon und GD DH gab, gab es einen mehr als 100fachen Unterschied in der Fähigkeit, QR- Aktivität zu induzieren (d. h. es ist wenigstens die 100fache Menge an Marathon-Gewebe erforderlich, um äquivalente QR-Aktivität zu induzieren, verglichen mit den GD DH-Hybriden).

Um die Zusammensetzung und Art der hydrolytischen Produkte zu untersuchen, wurden Extrakte mittels GC-MS analysiert (Fig. 5). In Fig. 5 ist ein gaschromatographisches Profil eines Extrakts aus GD DH x B. drepanensis gezeigt. Massenspektrometrie bestätigte die Peaks als (1)3- Methylsulfinylpropylnitril, (2) 4-Methylsulfinylbutylnitril, (3) 3-Methylsultinylpropylisothiocyanat und (4) 4-Methylsulfinylbutylisothiocyanat. Hydratisierung von gefriergetrockneten Rückständen von B. drepanensis und B. atlantica führten zu der Herstellung großer Mengen flüchtiger 3-Methylthiopropyl- und 2-Propenylisothiocyanate. 3-Methylsulfinylpropylisothiocyanat wurde in Methylenchloridextrakten aus B. villosa festgestellt, was mit den Glucosinolatprofilen übereinstimmte. In Extrakten von [GD DH x B. villosa] und [GD DH x B. drepanensis] war das vorherrschende Isothiocyanat 4- Methylsulfinylbutylisothiocyanat, wie erwartet. Relativ geringe Mengen an 3- Methylsulfinylpropylisothiocyanat und Nitrilderivaten wurden ebenfalls festgestellt. Im Gegensatz dazu wurden in den Kulturformen nur sehr geringe Mengen an 4-Methylsulfinylbutylisothiocyanat festgestellt. Dies zeigte, daß der 100fache Unterschied zwischen den zwei Hybriden und den Kulturformen in der Fähigkeit, QR-Aktivität zu induzieren, sowohl auf die Zunahme an 4- Methylsulfinylbutylglucosinolat als auch auf eine größere Umwandlung in das Isothiocyanat zurückzuführen ist.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Herstellung von Brassica oleracea mit erhöhten Mengen an 4-Methyl-sulfinylbutyl-glucosinolaten oder 3-Methyl-sulfinyl-propyl-glucosinolaten oder beidem, bei dem man

a) wilde Brassica oleracea-Spezies mit Brassica oleracea-Zuchtlinien kreuzt und

b) Hybride mit Mengen an 4-Methyl-sulfinyl-butyl-glucosinolaten oder 3-Methyl-sulfinylpropyl-glucosinolaten oder beidem auswählt, die über diejenigen erhöht sind, die man anfänglich in Brassica oleracea-Zuchtlinien findet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man weiterhin

c) mit Broccoli-Zuchtlinien rückkreuzt und

d) Pflanzen mit erhöhten Mengen an 4-Methyl-sulfinyl-butyl-glucosinolaten oder 3- Methyl-sulfinyl-propyl-glucosinolaten oder beidem auswählt, wobei Brassica oleracea-Zuchtlinien Broccoli-Zuchtlinien sind.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem man weiterhin

e) eine Broccoli-Linie mit erhöhten Mengen an 4-Methyl-sulfinyl-butyl-glucosinolaten oder 3-Methyl-sulfinyl-propyl-glucosinolaten oder beidem auswählt, welche in der Lage ist, eine starke Induzierung von Phase-II-Enzymen zu bewirken.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man weiterhin

c) mit RFLP-Markern hinsichtlich der spezifischen SI-Allelen durchmustert,

wobei die Brassica oleracea-Zuchtlinien doppelt haploide Broccoli-Zuchtlinien sind, welche spezifische SI-Allele enthalten.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man weiterhin

c) Pflanzen mit erhöhten Mengen an 4-Methyl-sulfinyl-butyl-glucosinolaten oder 3- Methyl-sulfinyl-propyl-glucosinolaten oder beidem rückkreuzt und auswählt,

d) mit RFLP-Markern hinsichtlich der spezifischen SI-Allelen durchmustert und

e) eine Broccoli-Linie mit erhöhten Mengen an 4-Methyl-sufinyl-butyl-glucosinolaten oder 3-Methyl-sulfinyl-propyl-glucosinolaten oder beidem und geeigneten SI-Allelen auswählt, welche in der Lage sind, eine starke Induzierung von Phase-II-Enzymen zu bewirken,

wobei die Brassica oleracea-Zuchtlinien doppelt haploide Broccoli-Zuchtlinien sind, welche spezifische SI-Allele enthalten.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man weiterhin

c) Pflanzen mit der genetischen Kombination, welche die Expression von erhöhten Mengen an 4-Methyl-sufinyl-butyl-glucosinolaten oder 3-Methyl-sulfinyl-propylglucosinolaten oder beidem kodiert, rückkreuzt und auswählt und

d) eine Broccoli-Linie mit erhöhten Mengen an 4-Methyl-sulfinyl-butyl-glucosinoiaten oder 3-Methyl-sulfinyl-propyl-glucosinolaten oder beidem auswählt, welche in der Lage ist, eine starke Induzierung von Phase-II-Enzymen zu bewirken,

wobei die Brassica oleracea-Zuchtlinien doppelt haploide Broccoli-Zuchtlinien sind und DNA- Sonden dazu verwendet werden, Hybride mit einer genetischen Kombination auszuwählen, welche Expression von erhöhten Mengen an 4-Methyl-sulfinyl-butyl-glucosinolaten oder 3- Methyl-sulfinyl-propyl-glucosinolaten oder beidem kodiert.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei nur 4-Methyl-sulfinyl-butyl-glucosinolat erhöht ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei nur 3-Methyl-sulfinyl-propyl-glucosinolat erhöht ist.

9. Genießbare Brassica-Pflanze, hergestellt nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6.

10. Genießbarer Teil einer Broccoli-Pflanze, hergestellt nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6.

11. Samen einer Broccoli-Pflanze, hergestellt nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6.

12. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die verwendeten DNA-Sonden aus der Gruppe ausgewählt sind, welche pW176, pW141, pW207, pW224, pW 114, pW145, pW123, pW138, pW197, pW228 und pW106 enthält.

13. Broccoli-Pflanze mit erhöhten Mengen an 3-Methyl-sulfinyl-propyl-gucosinolaten oder 4- Methyl-sulfinyl-butyl-glucosinolaten oder beidem, wobei die Broccoli-Pflanze nach dem Kreuzen von Broccoli-Zuchtlinien mit wilden Spezies eine Hybridpflanze ist und die Mengen an 4- Methyl-sulfinyl-butyl-glucosinolaten oder 3-Methyl-sulfinyl-propyl-glucosinolaten oder beidem über diejenigen erhöht sind, die man anfänglich in Broccoli-Zuchtlinien findet.

14. Broccoli-Pflanze nach Anspruch 13, wobei die Konzentration von 3-Methyl-sulfinyl-propylglucosinolaten oder 4-Methyl-sulfinyl-butyl-glucosinolaten oder beidem zwischen 10 und 100 umol pro Gramm Trockengewicht liegt.

15. Broccoli-Infloreszenz mit erhöhten Mengen an 3-Methyl-sulfinyl-propyl-glucosinolaten oder 4- Methyl-sulfinyl-butyl-glucosinolaten oder beidem, wobei die Broccoli-Infloreszenz aus einer Hybridpflanze nach dem Kreuzen von Broccoli-Zuchtlinien mit wilden Spezies erhalten wird und die Mengen an 4-Methyl-sulfinyf-butyl-glucosinolaten oder 3- Methylsulfinylpropylglucosinolaten oder beidem über diejenigen erhöht sind, die man anfänglich in Broccoli-Zuchtlinien findet.

16. Broccoli-Infloreszenz nach Anspruch 15, wobei die Konzentration von 3- Methylsulfinylpropylglucosinolaten oder 4-Methylsulfinylbutylglucosinolaten oder beidem zwischen 10 und 100 umol pro Gramm Trockengewicht liegt.

17. Brassica-Pflanzenzelle mit erhöhten Mengen an 3-Methyl-sulfinyl-propyl-glucosinolaten oder 4-Methyl-suflinyl-butyl-glucosinolaten oder beidem, wobei die Brassica-Pflanzenzelle aus einer Hybridpflanze nach dem Kreuzen von Broccoll-Zuchtlinien mit wilden Spezies erhalten wird und die Mengen an 4-Methyl-suflinyl-butyl-glucosinolaten oder 3-Methyl-sulfinyl-propylglucosinolaten oder beidem über diejenigen erhöht sind, die man anfänglich in Broccoli- Zuchtlinien findet.

18. Pflanzenzelle nach Anspruch 17, wobei die Zelle eine Infloreszenzzelle ist.







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