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CHEMISCHE KONSTRUKTIONEN UND DEREN VERWENDUNGEN - Dokument DE69902678T2
 
PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69902678T2 24.04.2003
EP-Veröffentlichungsnummer 1119528
Titel CHEMISCHE KONSTRUKTIONEN UND DEREN VERWENDUNGEN
Anmelder Glaxo Group Ltd., Greenford, Middlesex, GB
Erfinder McKEOWN, Stephen Carl, Stevenage, Hertfordshire SG1 2NY, GB;
WATSON, Stephen Paul, Stevenage, Hertfordshire SG1 2NY, GB
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69902678
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 05.10.1999
EP-Aktenzeichen 999477482
WO-Anmeldetag 05.10.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/GB99/03284
WO-Veröffentlichungsnummer 0000020112
WO-Veröffentlichungsdatum 13.04.2000
EP-Offenlegungsdatum 01.08.2001
EP date of grant 28.08.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 24.04.2003
IPC-Hauptklasse C07B 61/00
IPC-Nebenklasse

Beschreibung[de]
Fachgebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft chemische Konstrukte zur Verwendung in der Festphasensynthese und Verfahren zum Nachweis und/oder zur Charakterisierung der Produkte der Festphasensynthese unter Verwendung der Konstrukte.

Hinterrund der Erfindung

Festphasensynthese ist seit vielen Jahren auf dem Fachgebiet der Peptidsynthese bekannt und wird seit kurzem zunehmend auch zur Synthese von Nicht-Peptiden verwendet.

Festphasensynthese fand besondere Anwendung auf dem Fachgebiet der kombinatorischen Chemie und Erstellung von chemischen Bibliotheken als potentielle Quellen von neuen Leitfäden für Arzneimittelentdeckung, siehe zum Beispiel Anthony W. Czarnik, Analytical Chemistry News and Features, I. Juni 1998, S. 378A-386A, und The Combinatorial Index, Barry A. Bunin, Academic Press, San Diego 1998. Ein Merkmal der kombinatorischen Chemieverfahren ist, dass sie ermöglichen, dass eine sehr große Zahl von unterschiedlichen Verbindungen aus einer relativ beschränkten Zahl von molekularen Aufbaublöcken in einer relativ kleinen Zahl von Reaktionen hergestellt werden kann. Die kombinatorische Chemie verwendet die "Trenn- und Sammel"-Annäherung, wobei eine Suspension von chemischer Ausgangssubstanz, gebunden an einen festen Träger, in N- Teile gespalten wird, von denen jeder mit einem unterschiedlichen Reagens umgesetzt wird. Die Produkte der N-Reaktionen werden dann gesammelt und gründlich gemischt, wobei die anschließende gesammelte Substanz in N'-Teile geteilt und wieder jeder Teil mit einem unterschiedlichen Reagens umgesetzt wird. Das Verfahren kann so viele Male wiederholt werden, wie es Schritte in der Reaktionssequenz gibt. So ist für eine Dreischrittreaktionssequenz, wenn das Reaktionsgemisch in jedem Schritt in zehn Portionen aufgeteilt wird, jede gesammelte Substanz mit einem unterschiedlichen Reagens vor erneutem Kombinieren mit anderen Teilen umgesetzt wird, die Gesamtzahl der mit dem Verfahren gebildeten Verbindungen 10³ = 1000. So ist zu erkennen, dass unter Verwendung des Trenn- und Sammelverfahrens eine große Zahl unterschiedlicher Moleküle unter Verwendung einer minimalen Zahl von Reaktionen (im vorstehend erwähnten Fall dreißig) synthetisiert werden kann.

Jeder der festen Träger (z. B. ein Harzkügelchen) weist ein einzelnes Produktmolekül daran gebunden auf, und daher kann im Prinzip jedes der Reaktionsprodukte abgetrennt und analysiert oder biologischer Untersuchung unterzogen werden, indem man einfach jeden einzelnen festen Träger isoliert und das Produkt vom Träger abspaltet. Jedoch bedeutet die Zahl der in großen Bibliotheken durch kombinatorische Verfahren erzeugten Verbindungen, dass es unpraktisch sein kann, jede Verbindung zu charakterisieren und zu identifizieren. Folglich werden die Verbindungen üblicherweise erst getestet, entweder auf dem festen Träger oder nach Abspalten vom Träger, und nur jene Verbindungen, die gewisse biologische Wirksamkeit zeigen, werden anschließend identifiziert. Um die Zahl der durchgeführten biologischen Tests zu minimieren, können die Verbindungen in Pools, die eine festgelegte Zahl von Verbindungen enthalten, getestet werden, wobei inaktive Pools verworfen werden und die aktiven Pools weiterer Untersuchung unterzogen werden. Die biologischen Wirksamkeiten der Verbindungen können unter Verwendung automatisierter Untersuchungsverfahren mit hohem Durchsatz analysiert werden, die ermöglichen, dass eine große Zahl an Verbindungen innerhalb kurzer Zeit analysiert wird.

Eines der für den Chemiker auftretenden Probleme ist die Identifikation und Charakterisierung der verschiedenen Verbindungen in einer kombinatorischen Bibliothek, da jede Verbindung in der Bibliothek nur in sehr geringen Konzentrationen vorhanden ist, und üblicherweise ist nicht ausreichend Verbindung auf einem festgelegten festen Träger vorhanden, um sowohl eine biologische Untersuchung als auch Identifikation der Verbindung zu ermöglichen. An das Problem wurde durch Bereitstellung eines festen Trägers mit einer Kodierungsmarkierung gedacht, aus der die Identität der Verbindung bestimmt werden kann. So kann zum Beispiel eine Kodierungsmarkierung in hintereinanderfolgenden Schritten auf dem festen Träger parallel zum Aufbau der gewünschten Zielverbindung aufgebaut werden, wobei die Kodierungsmarkierung die Synthesegeschichte der Produktverbindung widerspiegelt und einzigartig für jede Produktverbindung ist. Die Kodierungsmarkierung wird üblicherweise auf dem Träger unter Verwendung von chemischen Reaktionen einer Art aufgebaut, die orthogonal zur zum Aufbau der Produktverbindung verwendeten Chemie sind, wobei sichergestellt wird, dass die Kodierungseinheiten und Produktverbindungen nicht verwechselt werden. Nachdem die Produktverbindung getestet und ihre biologische Aktivität bestätigt wurde, kann die Kodierungsmarkierung dann dekodiert werden, was eine Identifikation der Verbindung ermöglicht.

Wenn eine Produktverbindung einem vorhergehenden biologischen Screening als Teil eines Pools von Verbindungen unterzogen wurde und der Pool Wirksamkeit zeigte, dann ist erforderlich, entweder kleinere Pools von Verbindungen oder einzelne Verbindungen zu betrachten, um die Identität der wirksamen Verbindung festzustellen. In vielen Testsystemen ist es erforderlich, die Verbindung vom festen Träger zu spalten, um ein biologisches Testen durchzuführen, und das kann zu Problemen mit der Pooltestannäherung führen. So enthält, wenn die gesamte aktive Verbindung vom festen Träger zum Durchführen des Testens gespalten wurde, der Pool ein Gemisch einer großen Zahl gelöster Verbindungen, wobei die Gewinnung jeder einzelnen Verbindung zum weiteren Testen ein ernstes Trennproblem bewirken würde. Um dieses Problem zu überwinden oder zu vermeiden, wurden Konstrukte mit "Differentialfreisetzung" erzeugt, in denen die Produktverbindung, z. B. ein Arzneistoffmolekül an den festen Träger durch mehrere unterschiedliche Arten von Bindungsgruppen gebunden ist, wobei jede Bindungsgruppe orthogonal und selektiv unter unterschiedlichen chemischen Bedingungen spaltbar ist. Ein solches Konstrukt (Konstrukt A) ist nachstehend schematisch gezeigt.

Konstrukt A

Beim Befolgen eines kombinatorischen Syntheseschemas können die Reaktionsprodukte in x-Pools aufgeteilt werden, die jeweils y-feste Träger enthalten, wobei jeder feste Träger ein unterschiedliches Produktarzneistoffmolekül trägt. Jeder Pool kann dann Spaltungsbedingungen unterzogen werden, die zum selektiven Abspalten der Verbindungsgruppe B geeignet sind, um so einen Anteil des gesamten auf dem festen Träger vorhandenen Arzneistoffs freizusetzen. Die festen Träger können dann entfernt werden und die restliche Lösung den erwünschten biologischen Versuchen unterzogen werden. Wenn der Pool als Gesamtes biologische Wirksamkeit zeigt, können die einzelnen teilweise gespaltenen festen Träger in dem aktiven Pool dann in einzelne Behälter getrennt und Bedingungen unterzogen werden, die wirksam sind, um die Spaltung der zweiten Verbindungsgruppe, Verbindungsgruppe C, zu bewirken. Anschließend können die einzelnen Arzneistoffe jeweils auf biologische Wirksamkeit getestet werden.

Nachdem biologische Wirksamkeit für einen Arzneistoff beobachtet wurde, der mit einem bestimmten einzelnen festen Träger verbunden ist, wird der Träger Bedingungen unterzogen, die ermöglichen, dass der Markierungscode decodiert und die Identität der Arzneistoffverbindung bestimmt wird.

Eine Alternative zur "Differentialfreisetzung" ist "Reihenfreisetzung". In einem Reihenfreisetzungssystem verwendet das Konstrukt nicht zwei orthogonale Spaltungsstellen, wie bei den Differentialfreisetzungs-Konstrukten, sondern verwendet nur eine einzelne Spaltungsstelle. Ein Anteil des Arzneistoffs oder der Testverbindung wird in einem ersten Spaltungsschritt freigesetzt, um ausreichend Verbindung für einen ersten biologischen Test bereitzustellen, und anschließend kann mehr Arzneistoff durch Spalten an der selben Spaltungsstelle für weitere biologische Tests freigesetzt werden. Solche Reihenfreisetzungssysteme verwenden Spaltungsreaktionen, die relativ langsam sind, und bei denen die Geschwindigkeit der Spaltung vernünftig gut kontrolliert werden kann. Eine photochemische Spaltung wird typischerweise in Reihenfreisetzungssystemen verwendet. Ein Konstrukt zur Verwendung in einem Reihenfreisetzungssystem ist nachstehend als Konstrukt B gezeigt.

Konstrukt B

In jedem Festphasensyntheseverfahren, ob ein Teil eines kombinatorischen Verfahrens oder nicht, ist es wichtig, die optimalen Bedingungen für einen festgelegten Reaktionsschritt in einer Reihe von Schritten bestimmen zu können. Es ist auch wichtig, den Fortschritt oder Weg einer Reaktion überwachen zu können, so dass bestimmt werden kann, ob eine bestimmte Reaktion vollständig ablief oder tatsächlich, ob eine bestimmte Reaktion überhaupt ablief. Das ist in einer Festphasensynthese mit mehreren Stufen besonders wichtig, wenn ein Fehler bei einer festgelegten Stufe zum Fortschritt der vollständigen Umsetzung zur Bildung von Nebenprodukten führen kann und dabei zu einer Komplizierung führt, was andernfalls ein relativ gerade ablaufendes Trennverfahren ist.

Obwohl sowohl invasive als auch nicht invasive Analyseverfahren zum Bestimmen der Produkte der Festphasensynthese (siehe The Combinatorial Index, idem) bekannt sind, ist eines der festgestellten Probleme mit der Festphasensynthese, dass es im Allgemeinen schwieriger ist, den Fortschritt einer Reaktion zu überwachen; siehe zum Beispiel die vorstehend zitierte Czarnik-Veröffentlichung. Das gilt besonders bei Produkten von kombinatorischen Chemieverfahren, bei denen die Verwendung schneller Verfahren mit hohem Durchsatz zum Analysieren der großen Zahl von mit solchen Verfahren erzeugten Verbindungen erforderlich ist. Verfahren, wie Massenspektrometrie, sind potentiell ideal als Maßnahme zum Bereitstellen von Analysen mit hohem Durchsatz geeignet, aber ein wesentliches Problem ist, dass nicht alle Verbindungen eine garantierte Reaktion unter massenspektrometrischen Bedingungen bewirken. Tatsächlich sind viele Verbindungen gegenüber sogenannten "weichen" Verfahren der Massenspektrometrie, wie Matrixunterstützte Laserdesorptions-Ionisation (MALDI) und Elektrospray- Massenspektrometrie, unsichtbar, die Molekülionen ohne signifikante Fragmentierung des Moleküls nachweisen sollen. Einer der Gründe dafür ist, dass unter MALDI- und Elektrospray-Bedingungen viele Verbindungen, insbesondere Peptide, nicht ausreichend gut ionisieren, um eine nachweisbare Massenspektral-Antwort zu erhalten.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Mittel zum Überwachen des Fortschritts oder Wegs einer chemischen Reaktion auf einem festen Träger, zum Beispiel in einer kombinatorischen Synthese, bereitzustellen, die den bekannten Verfahren inhärente Probleme vermeidet und eine Vorrichtung zum Nachweis und zur Identifikation der Produkte der Festphasensyntheseverfahren unter Verwendung von Massenspektroskopie bereitstellt.

Demgemäß stellt die Erfindung in einem ersten Gesichtspunkt ein chemisches Konstrukt zur Verwendung in der Festphasensynthese bereit, umfassend einen festen Träger Q mit daran gebundenen Resten Y¹R und Y²R; wobei R ein Substrat oder eine Kodierungsmarkierung ist und die Reste Y¹ und Y² Verbindungsgruppen mit jeweils einer ersten Spaltungsstelle sind, wobei mindestens einer der Reste Y¹ und Y² eine zweite Spaltungsstelle aufweist, die sich zwischen der ersten Spaltungsstelle und dem Rest R befindet, wobei die erste Spaltungsstelle orthogonal und selektiv spaltbar in Bezug auf die zweite Spaltungsstelle ist, und, wenn beide Reste Y¹ und Y² eine zweite Spaltungsstelle enthalten, die zweite Spaltungsstelle in Y¹ selektiv und orthogonal in Bezug auf die zweite Spaltungsstelle in Y² spaltbar ist; die zweite Spaltungsstelle spaltbar ist, wobei das Substrat freigesetzt wird, und die erste Spaltungsstelle selektiv spaltbar ist, wobei ein Fragment Fr freigesetzt wird, das das Substrat R und mindestens einen Teil der Verbindungsgruppe Y umfasst; und wobei:

(i) das chemische Fragment Fr eine Sensibilisierungsgruppe G enthält, die das chemische Fragment Fr für instrumentale, z. B. Massenspektroskopie-Analyse sensibilisiert und/oder:

(ii) das Fragment Fr ein Mittel enthält, um dem Massenspektrum des Fragments eine charakteristische Signatur zu verleihen.

Vorzugsweise ist mindestens ein Rest R ein Substrat, und stärker bevorzugt ist das Substrat ein Arzneistoffmolekül oder ein anderes Molekül mit biologischer Wirksamkeit.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein chemisches Konstrukt zur Verwendung in Festphasensynthese bereitgestellt, umfassend einen festen Träger Q mit daran gebundenen Resten Y¹R und Y²R; wobei R ein Substrat (wie ein Arzneistoffmolekül) ist und die Reste Y¹ und Y² Verbindungsgruppen mit jeweils einer ersten und zweiten Spaltungsstelle sind, die orthogonal und selektiv spaltbar sind, wobei die zweite Spaltungsstelle in Y¹ selektiv und orthogonal in Bezug auf die zweite Spaltungsstelle in Y² spaltbar ist; die zweite Spaltungsstelle spaltbar ist, wobei das Substrat freigesetzt wird, und die erste Spaltungsstelle sich an einer Stelle zwischen der ersten Spaltungsstelle und dem festen Träger befindet und selektiv spaltbar ist, wobei ein Fragment Fr freigesetzt wird, das das Substrat R und mindestens einen Teil der Verbindungsgruppe Y umfasst; und wobei:

(i) das chemische Fragment Fr eine Sensibilisierungsgruppe G enthält, die das chemische Fragment für instrumentale, z. B. Massenspektroskopie-Analyse sensibilisiert und/oder:

(ii) das Fragment Fr ein Mittel enthält, um dem Massenspektrum des Fragments eine · charakteristische Signatur zu verleihen.

Die erfindungsgemäßen Konstrukte können durch die allgemeine Formel:

veranschaulicht werden.

Die erfindungsgemäßen Konstrukte stellen ein Differentialfreisetzungssystem bereit, das leichter analysierbar ist, um das Ergebnis der einzelnen Reaktionen auf dem festen Träger zu bestimmen. So werden z. B., indem man das Konstrukt Spaltungsbedingungen aussetzt, die wirksam sind, um eine Spaltung selektiv an jeder der ersten Spaltungsstellen zu bewirken, chemische Fragmente hergestellt, die die Substrate R, gebunden an einen "analytischen Hebel" enthalten, in denen die Nachweisbarkeit der chemischen Fragmente und daher der Substrate erhöht ist. So kann die Spaltung an der ersten Spaltungsstelle zum Bestimmen verwendet werden, ob ein bestimmtes Substrat gebildet wurde, eine Einrichtung, die als Maßnahme zum Durchführen einer Qualitätskontrolle (QC) während eines Reaktionsschemas oder bei einer Bibliotheksbildung geeignet ist, und die ein Mittel der Analyse bereitstellt, die zur Optimierung der Bedingungen für einen festgelegten Syntheseverfahrensschritt verwendet werden kann.

Die Konstrukte können weiter Gruppen Yn enthalten, von denen jede eine zweite Spaltungsstelle aufweist, die selektiv und orthogonal in Bezug auf die zweiten Spaltungsstellen in den anderen Gruppen Y spaltbar sind. So können zum Beispiel die Konstrukte eine Gruppe Y³Q enthalten, in der die zweite Spaltungsstelle in der Gruppe Y³ unter zu den zweiten Spaltungsstellen in Y¹R und Y²R verschiedenen chemischen Bedingungen gespalten wird. So ist es mit Hilfe der Erfindung möglich, eine Differentialfreisetzung der Produkt-Substratmoleküle (z. B. Arzneistoffe) in zwei, drei, vier oder mehreren Schritten bereitzustellen, wobei das biologische Screening der Produkte von großen Kombinationsbibliotheken in Pools mit handhabbarer Größe unterstützt wird.

In einem zweiten Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein Differentialfreisetzungsverfahren zum Untersuchen einer chemischen Bibliothek auf biologische Wirksamkeit bereit, wobei das Verfahren umfasst:

(i) Aussetzen eines einen festen Träger Q mit daran gebundenen Resten Y¹R und Y²R umfassenden Konstrukts, wie vorstehend definiert, an Spaltungsbedingungen, die wirksam sind, um das Substrat R vom Rest Y¹R freizusetzen;

(ii) Testen des vom Rest Y¹R freigesetzten Substrats R in einem biologischen Test;

(iii) anschließend Aussetzen des Konstrukts an Spaltungsbedingungen, die wirksam sind, um das Substrat R vom Rest Y²R freizusetzen; und

(iv) Testen des vom Rest Y²R freigesetzten Substrats R in einem biologischen Test.

Zusätzlich zum Bereitstellen des Differentialfreisetzungsverfahren bei der Analyse einer Bibliothek stellt die Erfindung auch ein Verfahren der Reihenfreisetzungsanalyse bereit, die Konstrukte verwendet, die selektiv unter Freisetzung eines Fragments Fr spaltbar sind, das das Substrat R und mindestens einen Teil einer Verbindungsgruppe Y umfasst; und wobei:

(i) das chemische Fragment Fr eine Sensibilisierungsgruppe G enthält, die das chemische Fragment Fr für instrumentale, z. B. Massenspektroskopie-Analyse sensibilisiert und/oder:

(ii) das Fragment Fr ein Mittel enthält, um dem Massenspektrum des Fragments eine charakteristische Signatur zu verleihen.

Demgemäß stellt die Erfindung in einem weiteren Gesichtspunkt ein Reihenfreisetzungsverfahren zum Untersuchen einer chemischen Bibliothek auf biologische Wirksamkeit bereit, wobei das Verfahren umfasst:

(i) Aussetzen eines Konstrukts, das einen festen Träger Q mit einem daran gebundenen Rest Y¹R wie vorstehend definiert umfasst, an Spaltungsbedingungen, die wirksam sind, einen ersten Teil des Substrats R vom Rest Y¹R freizusetzen;

(ii) Testen des ersten Teils des vom Rest Y¹R freigesetzten Substrats R in einem biologischen Test;

(iii) Aussetzen des Konstrukts an Spaltungsbedingungen, die wirksam sind, um einen zweiten Teil des Substrats R vom Rest Y¹R freizusetzen; und

(iv) Testen des zweiten Teils des vom Rest Y¹R freigesetzten Substrats R in einem biologischen Test.

In sowohl dem vorstehenden Differentialfreisetzungs- als auch Reihenfreisetzungsverfahren der Erfindung wird der Spaltungsschritt (i) typischerweise bei einem Pool von festen Trägern durchgeführt, wobei jeder ein unterschiedliches Substrat R trägt, und nach dem Spaltungsschritt (I) wird der feste Träger typischerweise vom freigesetzten Substrat R abgetrennt. Wenn die biologische Wirksamkeit im Pool nachgewiesen wird, können die festen Träger isoliert oder zu kleineren Pools gruppiert und dann einem Spaltungsschritt (iii) unterzogen werden, um weiter das Substrat zum Testen freizusetzen, so dass die biologische Aktivität für einen bestimmten festen Träger oder kleine Gruppen von Trägern nachgewiesen werden kann.

Zum Unterstützen der Bestimmung der Identitäten der Produkte eines kombinatorischen Syntheseschemas kann jeder feste Träger eine Kodierungsmarkierung oder Kodierungssequenz enthalten, die die Information entschlüsselt, die ein Hinweis auf zumindest einen Teil der Synthesegeschichte des Konstrukts ist. Die Kodierungsmarkierung kann in den festen Träger selbst eingebaut oder eine Kodierungssequenz kann an den festen Träger gebunden werden. Die Kodierungssequenz ist vorzugsweise an den festen Träger durch eine Verbindungsgruppe Ya mit einer Spaltungsstelle gebunden, die unter Freisetzung eines Fragments Fa vom festen Träger spaltbar ist, wobei das Fragment F3 die Kodierungssequenz und gegebenenfalls mindestens einen Teil der Bindungsgruppe Ya umfasst.

Vorzugsweise:

(i) enthält das chemische Fragment Fa eine Sensibilisierungsgruppe G, die das chemische Fragment Fa für instrumentale, z. B. Massenspektroskopie-Analyse sensibilisiert und/oder:

(ii) enthält das Fragment Fa ein Mittel, um dem Massenspektrum des Fragments eine charakteristische Signatur zu verleihen.

Die Kodierungsmarkierung kann die Form einer Gruppe oder Sequenz von Kodierungsgruppen annehmen, die unter Massenspektroskopiebedingungen fragmentiert und insbesondere sequenziell fragmentiert werden können, wobei ein oder mehrere charakteristische Massenspektral-Peaks erhalten werden, die einen Code bereitstellen, aus dem das Substrat identifiziert werden kann. Zum Beispiel kann die Kodierungsmarkierung eine Sequenz unterschiedlicher Aminosäuren, z. B. zwei, drei oder vier Aminosäuren, umfassen, wobei die Identität und Reihenfolge der einen Code bildenden Aminosäuren ein Hinweis auf die Identität des Substrats ist. Unter Massenspektrometriebedingungen können die Kodierungsgruppen (z. B. Aminosäuren) sequenziell gespalten werden, wobei eine Reihe von charakteristischen Massenspektralfragmenten erhalten wird, die die Kodierungsmarkierungen betreffen, in denen zum Beispiel eine oder zwei oder mehrere Aminosäuren aus der Markierung verloren gingen. Durch Rückbezug der Massen der Fragmentpeaks auf die Massen der Stammkodierungsmarkierung ist es möglich, die einzelnen Kodierungsgruppen (z. B. Aminosäuren) und ihre Stellung an der Kodierungsmarkierung zu bestimmen, wobei ermöglicht wird, dass der Code aufgebrochen und das Substrat identifiziert wird. Durch Bereitstellen einer Sensibilisierungsgruppe G und eines Mittels, dem Massenspektrum eine charakteristische Signatur zu verleihen, stellt die vorliegende Erfindung ein Mittel bereit, erstens sicherzustellen, dass die Aminosäuren oder andere Kodierungsgruppen ausreichend ionisiert werden, wobei starke Massenspektralpeaks erhalten werden, und zweitens sicherzustellen, dass jedes der charakteristischen Massenspektralfragmente, die aus der Fragmentierung der Kodierungssequenz gebildet werden, von nicht zugehörigen Peaks unterschieden werden kann.

Demgemäß stellt die Erfindung in einem anderen Gesichtspunkt ein Verfahren zum Bestimmen der Identität eines an einen festen Träger Q gebundenen Substrats R mit massenspektrometrischen Verfahren bereit, wobei der feste Träger Q eine daran durch eine Verbindungsgruppe Ya gebundene Kodierungssequenz mit einer Spaltungsstelle aufweist, die unter Freisetzen eines Fragments Fa vom festen Träger spaltbar ist, wobei das Fragment Fa die Kodierungssequenz und mindestens einen Teil der Verbindungsgruppe Ya umfasst, wobei (i) das chemische Fragment Fa eine Sensibilisierungsgruppe G enthält, die das chemische Fragment Fa für Massenspektroskopie-Analyse sensibilisiert; und vorzugsweise

(ii) das Fragment Fa ein Mittel enthält, um dem Massenspektrum des Fragments eine charakteristische Signatur zu verleihen;

die Kodierungssequenz eine Sequenz von Kodierungsgruppen der Art und Reihenfolge umfasst, die ein Hinweis auf die Identität des Substrats R ist;

wobei das Verfahren Spalten der Verbindungsgruppe Ya, um das Fragment Fa vom festen Träger freizusetzen, Massenspektrometrie des Fragments Ya unter Bedingungen, die wirksam sind, um eine Massenspektralfragmentierung der Kodierungsgruppe und die Bildung der Massenspektral-Fragment-Ionen zu bewirken, die dem Verlust von einem oder mehreren Kodierungsresten von der Kodierungssequenz entsprechen, und danach Korrelieren der Peaks des Massenspektrums der Massenspektral-Fragmentionen mit den Molekülionen des Fragments Ya zum Identifizieren der Sequenz der einzelnen Kodierungsgruppen umfasst.

In den Verfahren und Konstrukten der Erfindung kann als Alternative oder zusätzlich zum Einschluß einer Kodierungsmarkierung, die vom Substrat chemisch verschieden ist, ein Anteil des Substrats selbst an den festen Träger derart gebunden werden, dass es vom Träger nicht unter den Bedingungen gespalten wird, die zum Entfernen des Rests des Substrats vom Träger verwendet werden. Das verbliebene Substrat kann deshalb als analytische Markierung dienen, die eine Identifikation durch ein Verfahren, wie Massenspektrometrie, ermöglicht. Insbesondere kann ein Anteil des gesamten Substrats R im Konstrukt an den festen Träger durch eine Verbindungsgruppe Yb mit einer Abspaltungsstelle gebunden werden, die unter Freisetzen eines Fragments Fb vom festen Träger spaltbar ist, wobei das Fragment Fb das Substrat und mindestens einen Teil der Verbindungsgruppe Yb umfasst; wobei die Verbindungsgruppe Yb nicht unter Freisetzen des Substrats R unter Bedingungen spaltbar ist, die wirksam sind, die zweiten Spaltungsstellen in den Gruppen Y¹R, Y²R und Ya [falls vorhanden] zu spalten, und wobei:

(i) das chemische Fragment Fb eine Sensibilisierungsgruppe G enthält, die das chemische Fragment Fa für instrumentale, z. B. Massenspektroskopie-Analyse sensibilisiert und/oder:

(ii) das Fragment Fb ein Mittel enthält, um dem Massenspektrum des Fragments eine charakteristische Signatur zu verleihen.

Deshalb kann nach Freisetzung des Hauptteils des Substrats von den Konstrukten zum biologischen Testen das Fragment Fb selektiv vom festen Träger gespalten werden, wobei ein sensibilisiertes Substrat erhalten wird, das leicht mit Verfahren, wie Massenspektrometrie, analysierbar ist. Das könnte zum Beispiel durchgeführt werden, nachdem biologische Versuche beim Hauptteil des Substrats durchgeführt wurden, biologische Wirksamkeit festgestellt wurde und die Bestimmung der Identität des Substrats erforderlich war. In einer anderen Ausführungsform kann das Fragment Fb vom festen Träger ohne das andere Substrat zuerst vom festen Träger zu entfernen gespalten werden, zum Beispiel als Teil eines Qualitätskontroll-(QC)-Verfahrens zum Testen der Qualität der Produkte der Festphasensynthese. In diesem letzteren Verfahren kann das Fragment Fb vom festen Träger zusammen mit den Fragmenten Fr und Fa gespalten werden, wobei eine Analyse der Fragmente Fr, Fa und Fb ein vollständiges Bild des Ergebnisses der Synthese liefert.

Die Spaltungsstelle der Gruppen Ya und Yb ist vorzugsweise unter Bedingungen spaltbar, die den zum Spalten der ersten Spaltungsstellen in den Gruppen Y¹R und Y²R erforderlichen entsprechen. So können das Produkt oder die substrathaltigen Fragmente und das die Kodierungsmarkierung enthaltende Fragment vom festen Träger gleichzeitig gespalten werden, was ermöglicht, dass sie gleichzeitig analysiert (z. B. durch Massenspektrometrie) werden.

Das chemische Fragment Fa enthält vorzugsweise eine Sensibilisierungsgruppe G, die das chemische Fragment Fa für instrumentale, z. B. Massenspektroskopie-Analyse sensibilisiert.

In einem bevorzugten Gesichtspunkt der Erfindung ist das Konstrukt dadurch gekennzeichnet, dass die Sensibilisierungsgruppe G durch Spaltung an der ersten Spaltungsstelle(n) der Gruppen Y¹, Y², Yn, Ya oder Yb erzeugt wird. In dieser bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine die Sensibilisierungsgruppe G enthaltende Einheit gebildet oder an der ersten Spaltungsstelle(n) durch Spalten des "Gerüsts" des Konstrukts eingeführt, verschieden zur Spaltung einer Seitenkette oder bloßen Entfernung einer Schutzgruppe.

Die Sensibilisierungsgruppe G macht das Fragment Fr, Fa oder Fb und daher das Substrat R, die Kodierungsmarkierung oder die substrathaltige Kodierungsmarkierung empfindlicher gegenüber Analyse mit einem festgelegten Analyseverfahren und insbesondere einem massenspektrometrischen Verfahren. So kann die Sensibilisierungsgruppe eine Gruppe sein, die unter den in einem Massenspektrometer und insbesondere Elektrospray-Massenspektrometrie, auftretenden Bedingungen leicht ionisierbar ist, wobei ein starkes Signal erhalten wird.

Die ionisierbare Sensibilisierungsgruppe dient dazu, sicherzustellen, dass das Fragment Fr, Fa oder Fb im Massenspektrometer ausreichend ionisiert wird, damit eine starke Reaktion erhalten wird. Das überwindet das Problem, das vielen durch Festphasenverfahren synthetisierten Molekülen inhärent ist, in denen eine geeignete ionisierende Gruppe nicht vorhanden ist und eine Analyse durch Massenspektralverfahren mit hohem Durchsatz problematisch ist.

Die ionisierbare Gruppe kann zum Beispiel eine basische Aminogruppe oder eine Carboxylatgruppe sein, ist aber vorzugsweise eine basische Aminogruppe. Es ist zu erkennen, dass der Begriff "basische Aminogruppe", wie hier verwendet, sich insbesondere auf eine Aminogruppe bezieht, die leicht protoniert wird.

Die basische Aminogruppe kann eine primäre Aminogruppe, sekundäre Aminogruppe oder tertiäre Aminogruppe sein. Wenn die basische Aminogruppe eine tertiäre Aminogruppe ist, kann sie zum Beispiel eine cyclische Aminogruppe, wie eine Piperidin-, Piperazin-, Pyrrolidin- oder Morpholingruppe sein, wobei eine Piperidin- oder Piperazin- (z. B. N-Methylpiperazin)-Gruppe gegenwärtig bevorzugt wird.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Einheit, die die Sensibilisierungsgruppe G enthält, wie eine basische Aminogruppe, gebildet oder an der Spaltungsstelle eingeführt, während das chemische Fragment Fr, Fragment Fa oder Fb (nachstehend zusammenfassend als analytisches Fragment bezeichnet) vom festen Träger gespalten wird. Der Vorteil der Bildung der Sensibilisierungsgruppe G auf diese Weise ist, dass sie das mögliche Problem einer vorher vorhandenen oder vorher gebildeten Sensibilisierungsgruppe, die die Chemie des Konstrukts beeinträchtigt, vermeidet.

Die Atome oder funktionelle Gruppe zum Bilden der Sensibilisierungsgruppe G können in einer maskierten Form im Konstrukt vor Abspalten des analytischen Fragments vom Harz vorhanden sein, wobei die Spaltungsbedingungen nur zum Demaskieren der Sensibilisierungsgruppe G dienen. In einer anderen Ausführungsform können die Atome oder funktionelle Gruppe, die die Sensibilisierungsgruppe G bilden oder enthalten, an der Spaltungsstelle während der Spaltungsreaktion eingeführt werden. Wenn zum Beispiel die Sensibilisierungsgruppe eine basische Aminogruppe ist, kann das Stickstoffatom der Aminogruppe im Konstrukt vor der Spaltung vorhanden sein oder während der Spaltungsreaktion eingeführt werden.

Wenn die Sensibilisierungsgruppe G aus einer externen Quelle während der Spaltungsreaktion eingeführt wird, kann sie einen Teil einer größeren Einheit bilden. Zum Beispiel kann die Gruppe G als Teil einer Gruppe X-G eingeführt werden, wobei X der Rest eines Nucleophils oder Elektrophils, zum Beispiel ein Nucleophil auf Stickstoffbasis oder auf Schwefelbasis, ist. Beispiele der Reste X-G schließen Reste der Formel G-Alk- Nuc ein, wobei Alk ein Alkylenrest ist und Nuc ein Nucleophil, wie eine sekundäre Aminogruppe (z. B. die sekundäre Aminogruppe in N-Methylpiperazin) oder eine Thiolatgruppe ist.

Vorzugsweise enthält das analytische Fragment ein Mittel, um dem Massenspektrum des Fragments eine charakteristische Signatur zu verleihen. Die Signatur kann vorteilhafterweise bereitgestellt werden, in dem man in das Fragment eine "peakauftrennende" isotope Markierung eingliedert. Die peakauftrennende isotope Markierung umfasst mindestens ein Atom, das in einer Reihe von stabilen isotopen Formen vorkommt. Durch isotope Markierung eines oder mehrerer bestimmter Atome im analytischen Fragment, so dass ein festgelegtes Atom mit einem Gemisch von Isotopen markiert wird, erscheinen die Massenspektren der Molekülionen als charakteristisches Muster, wobei das genaue Muster von der relativen Menge der einzelnen Isotope abhängt. So zeigt zum Beispiel, wenn ein festgelegtes Atom im Fragment Fr so markiert wird, dass 50% der Atome eine isotope Form aufweisen und 50% eine andere isotope Form aufweisen, das Massenspektrum das Molekülion als charakteristisches Dublett, in dem die Peaks etwa gleiche Höhe aufweisen.

Der Zweck des (der) peakauftrennenden Atoms(e) ist, ein charakteristisches Muster bereitzustellen, das jeden Peak im Massenspektrum charakterisiert, der aus dem analytischen Fragment Fr und/oder Fa und/oder Fb stammt, wobei solche Peaks von denen durch fremde Substanzen zu unterscheiden sind.

Die analytischen Fragmente Fr, Fa und Fb können gleich oder verschieden markiert werden, aber in einer bevorzugten Ausführungsform werden sie unterschiedlich markiert, um so unterschiedliche charakteristische Signaturen zu ergeben. Auf diese Weise können die Massenspektralpeaks aufgrund der Kodierungsmarkierung von den Massenspektralpeaks von den das Substrat enthaltenden Fragmenten unterschieden werden.

Beispiele der Atome, die als isotope peakauftrennende Markierungen verwendet werden können, schließen ¹H/²H(D), &sup7;&sup9;Br/&sup8;¹Br, ¹²C/¹³C, ¹&sup4;N/¹&sup5;N und ¹&sup6;O/¹&sup8;O ein.

Die analytischen Fragmente Fr, Fb und Fa können jeweils eine einzelne peakauftrennende isotope Markierung oder mehr als eine solche Markierung enthalten. Zum Beispiel kann die isotope Markierung ein einzelnes Bromatom sein, wobei der Peak für das Molekülion des nach Spaltung vom festen Träger freigesetzten analytischen Fragments als Dublett erscheinen wird. Durch Einführen einer zweiten oder nachfolgenden peakauftrennenden Markierung(en) wird ein komplexeres Peakmuster für das Molekülion gebildet werden.

Die isotope(n) peakauftrennede(n) Markierung(en) befindet/befinden sich vorzugsweise zwischen den ersten und zweiten Spaltungsstellen der Reste Y¹ und Y².

Die ersten und zweiten Spaltungsstellen in den Resten Y¹ können durch erste und zweite Verbindungsgruppen L¹ und L² definiert werden, die ersten und zweiten Spaltungsstellen im Rest Y² können durch erste und zweite Verbindungsgruppen L¹ und L³ definiert werden und die Spaltungsstelle im Rest Ya kann durch eine Verbindungsgruppe La definiert werden, die vorzugsweise L¹ entspricht, wobei L¹, L² und L³ selektiv und orthogonal abspaltbar sind. Eine "Abstandsgruppe" A kann sich zwischen jedem Paar der ersten und zweiten Verbindungsgruppe oder zwischen der Verbindungsgruppe La und der Kodierungsmarkierung befinden, wobei die Abstandsgruppe A typischerweise eine isotope peakauftrennende Markierung enthält.

Demgemäß kann eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung durch die Formel:

wiedergegeben werden, in der "Tag" eine Kodierungssequenz darstellt.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist das Konstrukt eine substrathaltige analytische Gruppe R-A, gebunden an den festen Träger durch eine Verbindungsgruppe L¹, auf, die orthogonal in Bezug auf die Verbindungsgruppen L² und L³ abspaltbar ist. Ein Konstrukt dieser Art kann durch die Formel wiedergegeben werden:

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Kodierungssequenz weggelassen und das Mittel zum Identifizieren des Substrats durch die Gruppe R-A-L¹ bereitgestellt, die zum Bereitstellen des sensibilisierten Substrats für Analyse durch Massenspektrometrie gespalten werden kann. Ein solches Konstrukt weist die Formel auf:

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Konstrukt zur Verwendung in einem Reihenfreisetzungsverfahren des Screenings wie vorstehend beschrieben bereit, wobei das Konstrukt eine sensibilisierte Kodierungsmarkierung enthält. Ein solches Konstrukt kann durch die Formel Tag-A-L¹-Q-L¹-A-L²-R wiedergegeben werden.

In anderen Ausführungsformen der Erfindung können die Konstrukte eine Formel aufweisen, ausgewählt aus:

in denen L¹, L², L³, A und R die vorstehend angegebene Bedeutung haben und "Tag" eine Kodierungssequenz darstellt.

Die Verbindungsgruppen L¹, L² und L³ sind orthogonal und selektiv spaltbar; d. h. die zum Durchführen der Spaltung an der Spaltungsstelle in einer Verbindungsgruppe verwendeten Bedingungen spalten nicht die andere. Eine große Reihe von unterschiedlichen Arten von Spaltungsreaktionen kann verwendet werden, von denen Beispiele Reaktionen sind, ausgewählt aus säurekatalysierter Spaltung, basenkatalysierter Spaltung, oxidativer Spaltung, reduktiver Spaltung, nucleophilem Ersetzen, elektrophilem Ersetzen und thermischer, photochemischer und enzymatischer Spaltung.

So wird in einer bevorzugten Ausführungsform ein chemisches Konstrukt wie vorstehend definiert bereitgestellt, in dem die erste Spaltungsstelle (z. B. wie durch die Verbindungsgruppe L¹ definiert) selektiv durch eine Art eines chemischen Verfahrens, ausgewählt aus einer Reihe von chemischen Verfahren, bestehend aus Spaltung unter sauren Bedingungen, basenkatalysierte Spaltung, oxidative Spaltung, reduktive Spaltung, nucleophiles Ersetzen, elektrophiles Ersetzen und thermische, photochemische und enzymatische Spaltung spaltbar, eine der zweiten Spaltungsstellen (z. B. wie durch die Verbindungsgruppe L² definiert) ist selektiv durch eine zweite und unterschiedliche Art eines chemischen Verfahrens, ausgewählt aus der genannten Reihe, spaltbar, und die andere der zweiten Abspaltungsstellen (z. B. wie durch die Verbindungsgruppe L³ definiert) ist selektiv durch eine dritte und unterschiedliche Art eines chemischen Verfahrens, ausgewählt aus der genannten Reihe, spaltbar.

Irgendeine oder mehrere der Abspaltungsstellen/Verbindungsgruppen können von der "Sicherungs"-Variante sein; d. h. die Abspaltungsstelle oder Verbindungsgruppe muss in einem ersten Schritt chemisch modifiziert werden, bevor sie der Spaltung in einem zweiten Schritt unterzogen werden kann. Ein Vorteil einer solchen Anordnung ist, dass sie die Möglichkeit, dass die Spaltung unbeabsichtigt stattfindet, verhindert oder deutlich verringert. Ein Beispiel eines "Sicherungs"-Mechanismus bezieht die Oxidation einer funktionellen Gruppe in einem ersten Schritt ein, wobei die Oxidation dazu dient, die funktionelle Gruppe zugänglicher für ein Ersetzen durch ein Nucleophil in einem anschließenden Abspaltungsschritt zu machen. Das Nucleophil kann in der Struktur beträchtlich variieren. Zum Beispiel kann in einer Ausführungsform das Nucleophil ein eine Aminogruppe enthaltendes Nucleophil sein, wobei die Aminogruppe an der nucleophilen Ersetzungswirkung beteiligt ist, so dass die Aminogruppe direkt an die Spaltungsstelle gebunden wird. Alternativ kann in einer anderen Ausführungsform die Aminogruppe (oder eine andere sensibilisierende Gruppe) in einem Rest (z. B. einem Dialkylaminoalkylthiolatanion) vorhanden sein, der ein anderes Nucleophil, wie ein Schwefelnucleophil, enthält, das an die Spaltungsstelle gebunden wird. In einer weiteren Ausführungsform kann das Nucleophil eine Einheit sein, die ein basisches Stickstoffatom, das als Nucleophil dient, und ein anderes basisches Stickstoffatom enthält, das als Sensibilisierungsgruppe G dient, wobei ein solches Beispiel eines Nucleophils eine N- Methylpiperazingruppe ist.

Beispiele der Verbindungsgruppen, die selektiv unter sauren Bedingungen gespalten werden können, schließen geeignet substituierte Benzyloxycarbonylgruppen und substituierte Diphenylmethylaminogruppen ein, die beide durch Wirkung von Trifluoressigsäure gespalten werden können.

Bestimmte Beispiele der säurespaltbaren Verbindungsgruppen sind in The Combinatorial Index, Barry A. Bunin, Academic Press, San Diego 1998 dargestellt. Verbindungsgruppen des "Rink" oder "Knorr"-Typs umfassen typischerweise eine N- geschützte 1-Amino-1,1-diphenylmethaneinheit, wobei die Aminogruppe, wenn von ihr die Schutzgruppe abgespalten wird, ein Binden an ein Substrat ermöglicht, wobei einer der Phenylringe zum Beispiel mit Dimethoxygruppen substituiert ist und der andere einen Carboxyalkyloxysubstituenten aufweist, der einen zweiten Punkt der Bindung bereitstellt. Eine Spaltung mit Trifluoressigsäure ergibt eine Substratverbindung mit einer endständigen Carboxamidogruppe. Verbindungsgruppen des "Wang"-Typs enthalten typischerweise eine substituierte Phenoxyacetylgruppe, wobei die Acetylgruppe einen Punkt der Bindung bereitstellt, und eine benzylische Hydroxylgruppe am Phenylring, die einen zweiten Punkt der Bindung bildet. Ester können zwischen einer Carboxylgruppe eines Substrats und der benzylischen Hydroxylgruppe gebildet werden, wobei die Estergruppen anschließend mit Trifluoressigsäure (TFA) unter Freisetzen einer Substratverbindung mit einer endständigen Carboxylatgruppe spaltbar sind.

Beispiele der Reste, die unter photochemischen Bedingungen selektiv gespalten werden können, schließen Carbamatgruppen, wie o-Nitrobenzyloxycarbamatgruppen, ein, in denen die anfängliche Spaltung zwischen den Benzyloxy- und Carbonylgruppen stattfindet, wobei die Abspaltung von Kohlendioxid aus dem erhaltenen Fragment eine basische Aminogruppe ergibt.

Beispiele der Reste, die durch nucleophilen Ersatz gespalten werden können, schließen "Sicherungs"-Verbindungsgruppen auf Mercaptopyrimidinbasis, wie 5- Carboxy-2-mercaptopyrimidin, ein, in denen die Spaltung durch Umsetzung unter Oxidationsbedingungen zum Erzeugen einer Sulfoxid- oder Sulfonbindung, gefolgt von Umsetzung mit einer nucleophilen Aminogruppe zum Bilden eines 2-Aminopyrimidins bewirkt werden kann. Besondere Beispiele der nucleophilen Gruppen, die zum Bewirken der Spaltung von oxidierten Verbindungsgruppen auf Mercaptopyrimidinbasis verwendet werden, können, schließen cyclische Amine, wie Piperidin und N-substituiertes Piperazin (z. B. N-Methylpiperazin) und Aminogruppen enthaltende Thiolatnucleophile (z. B. Dimethylaminoethylthiolat) ein. Beispiele der Oxidationsbedingungen sind jene erzeugten Oxidationsmittel, wie Persäuren, z. B. eine Perbenzoesäure, wie m-Chlorperbenzoesäure, und bestimmte anorganische Persalze, wie Kaliummonoperoxysulfat.

Indem man die erste und zweite Spaltungsstelle, z. B. wie durch die ersten und zweiten Verbindungsgruppen L¹ und L² oder L¹ und L³ definiert, orthogonal spaltbar macht, ist es möglich, selektiv vom Konstrukt entweder das analytische Fragment oder das Substrat R zu spalten, indem einfach unterschiedliche Spaltungsbedingungen verwendet werden. Das bedeutet, dass während der Experimente, die zum Optimieren der Bedingungen für einen bestimmten Reaktionsschritt entworfen sind, der Chemiker das Konstrukt Bedingungen aussetzen kann, die zum Abspalten des analytischen Fragments geeignet sind, wobei die Durchführung einer Analyse ermöglicht wird, um das Ergebnis jeder Testreaktion zu bestimmen. Ähnlich kann während einer Reaktion im präparativen Maßstab (z. B. eine Steigerungsreaktion oder kommerzielle Herstellung) eine Qualitätskontrolle (QC) durch Entfernen einer Reihe von festen Trägern aus dem Reaktionsbehälter, Spalten der Konstrukte an der ersten Spaltungsstelle und Analysieren des erhaltenen Fragments, um zu erkennen, ob ein bestimmter Reaktionsschritt funktionierte, durchgeführt werden. Andererseits wird durch Spalten an der zweiten Spaltungsstelle, z. B. an der zweiten Verbindungsgruppe, und nicht an der ersten das Reaktionsprodukt R vom festen Träger freigesetzt. So ist ein Vorteil der erfindungsgemäßen Konstrukte, dass sie in sowohl experimentellem Maßstab zum Optimieren eines bestimmten Verfahrensschritts als auch im präparativen Maßstab ohne Modifizieren der Verbindungsgruppen verwendet werden können.

In einer Ausführungsform der Erfindung enthalten die Fragmente Fr, Fa oder Fb und stärker bevorzugt die Abstandsgruppe A einen Alkylendiaminrest oder Aminoalkoxyrest. Die genaue Größe des Alkylenrests und sein Grad der Substitution wird gegenwärtig nicht als wichtig angesehen, aber bestimmte Beispiele sind Ethylen- oder Propylendiamin oder Aminoalkoholgruppen, die substituiert oder unsubstituiert sein können. Die Alkylendiamingruppe oder der Aminoalkohol enthält typischerweise eine peakauftrennende isotope Markierung, wie vorstehend definiert. Die zwei Aminogruppen können jeweils an die ersten bzw. zweiten Verbindungsgruppen gebunden werden. Zum Erhöhen der Masse der Abstandsgruppe A oder zum Ändern ihrer Eigenschaften kann die Alkylendiamingruppe mit einem Arylrest, zum Beispiel einem N-Arylrest, wie einer N- Benzylgruppe, substituiert werden oder die Alkylenkette kann substituiert werden (zum Beispiel mit einem oder mehreren Fluoratomen, um die Flüchtigkeit des analytischen Fragments zu ändern). Der N-Arylrest kann gegebenenfalls mit einer oder mehreren Substituentengruppen substitiuert werden.

Wenn, wie bevorzugt, die Abstandsgruppe eine oder mehrere massenspektralpeakauftrennende isotope Markierungen enthält, können sich diese entweder in der Alkylenkette oder in einem an die Alkylenkette gebundenen Substituenten befinden. Zum Beispiel kann eine an eine der zwei Aminogruppen in einem Alkylendiamin gebundene N- Benzylgruppe eine Methylengruppe aufweisen, die mit dem peakauftrennenden Atom Deuterium substituiert ist. In einer anderen Ausführungsform kann ein Arylring (z. B. eine N-Benzylgruppe), der in einem Substituenten am Alkylendiamin vorhanden ist, mit einem peakauftrennenden Bromatom substituiert sein, wobei ein bestimmtes Beispiel eines Arylrests eine N-o-Brombenzylgruppe ist.

Die Fragmente Fr, Fa oder Fb und insbesondere die Abstandsgruppe A, sowie die Bereitstellung eines Mittels zur Identifikation unter Verwendung von Massenspektrometrie, können auch mit einem oder mehreren zusätzlichen Sensibilisatoren versehen werden, um eine Charakterisierung durch andere Analyseverfahren zu ermöglichen. Zum Beispiel kann die Abstandsgruppe ein Chromophor enthalten, um eine Charakterisierung durch ultraviolette (UV) oder Fluoreszenzspektroskopie zu ermöglichen.

Obwohl Alkylendiamin- und Aminoalkoholgruppen als spezielle Beispiele der Abstandsgruppen aufgeführt sind, können alternative Abstandsgruppen verwendet werden. Zum Beispiel können die Abstandsgruppen aus Kohlenwasserstoffketten gebildet werden, die bis zu dreißig oder mehr Kohlenstoffatome in der Kette enthalten, die gegebenenfalls durch ein oder mehrere Heteroatome, wie Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel, unterbrochen werden können. Als weitere Alternative kann die Abstandsgruppe zum Beispiel eine Peptidkette sein, die eine oder mehrere Aminosäuren enthält. Die genaue Art und Länge der Abstandsgruppe wird gegenwärtig nicht als wichtig angesehen, mit der Maßgabe, dass die Abstandsgruppe die Chemie des Konstrukts nicht beeinträchtigt.

Der feste Träger Q kann jede Art von festem Träger sein, die zur Verwendung in der Festphasensynthese und insbesondere kombinatorischen Chemie, geeignet ist. So kann nur veranschaulichend der feste Träger die Form von Kügelchen, einer festen Oberfläche, festen Substraten, Teilchen, Pellets, Scheiben, Kapillaren, Hohlfasern, Nadeln, festen Fasern oder organischen oder anorganischen Gelen, wie Kieselgelen, und unlöslichen organischen Teilchen, wie aus Fullerenen gebildeten Teilchen, annehmen.

Beispiele der Kügelchen sind polymere Kügelchen, wie Cellulosekügelchen oder Harzkügelchen, wobei besondere Beispiele der Substanzen, aus denen Harzkügelchen hergestellt werden können, funktionalisierte Polymerharze, wie Polystyrolharze, Polyacrylamidharze und Dimethylacrylamidharze einschließen. Beispiele geeigneter Träger sind in The Combinatorial Index von Barry A. Bunin, vorstehend bezeichnet, aufgeführt.

In einem anderen Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Analyse der vorstehend definierten Konstrukte bereit; wobei das Verfahren Spalten der Reste Y¹ und Y² und gegebenenfalls des Rests Ya zur Freisetzung des chemischen Fragments Fr (und gegebenenfalls der Fragmente Fa und Fb) und dann Massenspektrometrie der chemischen Fragmente Fr und Fa, z. B. Elektrospray-Massenspektrometrie, umfasst.

Die Analyse des Fragments Fr liefert Information über die Reaktionsgeschichte des Konstrukts. So kann durch massenspektrometrische Analyse leicht bestimmt werden, ob das gewünschte Substrat in einer festgelegten Reaktionssequenz gebildet würde oder nicht. Eine Analyse des Fragments Fr kann daher nicht nur zur Charakterisierung des Substrats oder des Produkts der Festphasen-Reaktionssequenz, sondern auch zum Verfolgen des Fortschritts der Reaktionen verwendet werden.

In einem weiteren Gesichtspunkt stellt die Erfindung chemische Zwischenkonstrukte zur Verwendung bei der Herstellung eines chemischen Konstrukts wie vorstehend definiert bereit, wobei die Zwischenkonstrukte die Formeln Y¹'-Q-Y²', RY¹-Q-Y²' und Y¹'-Q-Y²R aufweisen, in denen Y¹' und Y²' eine reaktive oder geschützte Form des Rests Y sind; und R, Q und Y die vorstehend angegebene Bedeutung aufweisen.

In noch einem weiteren Gesichtspunkt stellt die Erfindung Zwischenkonstrukte der Formeln L²'-A-L¹'-Q-L¹-Ap, R-L²-A-L¹-Q-L¹-Ap, L³'-A-L¹-Q-L¹-Ap, R-L³-A-L¹-Q-L¹-Ap, R-L³-A-L¹-Q-L¹-A-L²', L³'-A-L¹-Q-L¹-A-L²-R bereit, wobei L¹'-, L²' und L³' reaktive oder geschützte Formen der vorstehend definierten Verbindungsgruppen L¹, L² und L³'L sind, Ap eine reaktive oder geschützte Form der Abstandsgruppe A ist, die eine peakauftrennende isotope Markierung enthält, und Q, R, A, L¹, L² und L³ die vorstehend angegebene Bedeutung aufweisen. In einer besonderen Ausführungsform weist der Rest Ap die Formel NH-Alk-NX¹ auf, wobei Alk ein Alkylenrest ist und X¹ ein Wasserstoffatom oder Aralkylrest ist. Das Zwischenkonstrukt ist vorzugsweise isotop mit einer peakauftrennenden Kombination von Atomen, wie ¹H/²H (D), &sup7;&sup9;Br/&sup8;¹Br, ¹²C/¹³C, ¹&sup4;N/¹&sup5;N und ¹&sup6;O/¹&sup8;O, markiert.

In jedem der vorstehend erwähnten Zwischenprodukte kann der feste Träger gegebenenfalls daran gebunden eine Kodierungsmarkierungssequenz L¹-A-Tag und/oder eine auf einem Substrat basierende Markierungssequenz R-A-L¹ - und Vorstufenformen davon, wie L¹-Ap, aufweisen.

Die Erfindung wird jetzt, aber nicht einschränkend, in Bezug auf die folgenden Beispiele veranschaulicht.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 veranschaulicht das Massenspektrum des Produkts der Spaltung, durch Oxidation und nucleophiles Ersetzen, eines Konstrukts der Formel Q-L¹-A-L²-R, wobei R eine Modellverbindung Benzamid ist, L¹ eine Thiopyrimidinverbindungsgruppe ist, A eine N-Brombenzyl-substituierte Ethylendiamin-"peakauftrennende Gruppe" ist und L² eine Verbindungsgruppe ist, die unter photochemischen Bedingungen spaltbar ist.

Fig. 2 veranschaulicht das Massenspektrum des Konstrukts von Fig. 1 nach photochemischer Spaltung der Verbindungsgruppe L² und anschließende Oxidation/nucleophiles Ersetzen an der Verbindungsgruppe L¹.

Fig. 3 veranschaulicht das Massenspektrum des Produkts der Spaltung durch Oxidation und nucleophiles Ersetzen eines Konstrukts der Formel Q-L¹-A-Tag, wobei L¹ eine Thiopyrimidinverbindungsgruppe ist, A die gleiche peakauftrennende Gruppe, wie im Konstrukt von Fig. 1 vorhanden, ist und Tag eine aus einem Tripeptid bestehende Kodierungssequenz ist.

Fig. 4 veranschaulicht das Massenspektrum des Spaltungsprodukts von Fig. 3, in dem aber die Bedingungen im Massenspektrometer so eingestellt wurden, dass eine Fragmentierung des Molekülions bei 716 a.m.u bewirkt wurde, um Peaks durch die Konstrukte zu bewirken, in denen eine oder mehrere Aminosäuren vom Molekülion verloren gingen.

Fig. 5 veranschaulicht das Massenspektrum des Produkts der Spaltung durch Oxidation und nucleophiles Ersetzen eines Konstrukts der Formel:

in dem "Tag" eine Allyloxyglycinkodierungsgruppe darstellt, L¹, L² und A die für die Konstrukte der Fig. 1 bis 4 angegebene Bedeutung haben und L³ eine Verbindungsgruppe des "Rink"- oder "Knorr"-Typs ist, die durch Trifluoressigsäure abspaltbar ist.

Beispiel 1 Schema 1

Experiment für Schema 1

Eine Lösung von 4-(Chlormethyl)benzoesäure (0,27 g, 1,6 mmol), Benztriazol-1- yloxytrispyrrolidinphosphonium-Hexafluorphosphat (PyBOP)® (0,83 g, 1,6 mmol) und Diisopropylethylamin (0,56 ml, 3,2 mmol) in Dimethylformamid (8 ml) wurde 20 Minuten geschüttelt und dann zu TentaGelTMNH&sub2; (Rapp Polymere)-Harz 1 (1 g, 0,32 mmol) gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 5 Stunden geschüttelt, gefolgt von Ablaufenlassen des Harzes und Waschen mit Dimethylformamid, Dichlormethan, Diethylether, Dichlormethan und schließlich Diethylether. Das Harz (2) wurde dann im Vakuum getrocknet.

Eine Aufschlämmung von Thioharnstoff (0,58 g, 7,7 mmol) in Dioxan (4 ml) und Ethanol (1 ml) wurde zu Harz 2 (1 g, 0,32 mmol) gegeben und das Ganze 16 Stunden auf 80ºC erwärmt. Man ließ das Harz ablaufen, und es wurde mit Dimethylformamid (5 ·), Dichlormethan (5 ·), Diethylether, Dichlormethan und schließlich Diethylether gewaschen, wobei Harz 3 erhalten wurde. Das Harz wurde dann im Vakuum getrocknet.

Eine Lösung von 2-(Dimethylaminomethylen)-3-oxybutansäuremethylester (0,17 g, 0,96 mmol) und Triethylamin (65 ml, 0,48 mmol) in Dimethylformamid (10 ml) wurde zu Harz 3 (1 g, 0,31 mmol) gegeben und das Gemisch 16 Stunden auf 80ºC erwärmt. Man ließ das Harz dann ablaufen, und es wurde mit Dimethylformamid, Dichlormethan, Diethylether, Dichlormethan und schließlich Diethylether gewaschen. Das gewaschene Harz (4) wurde im Vakuum getrocknet.

Harz 4 (0,5 g, 0,15 mmol) wurde dann mit einem 1 : 1-Gemisch von Tetrahydrofuran und 2 n wässrigem Natriumhydroxid (4 ml) behandelt und 2 Stunden geschüttelt. Man ließ das Harz dann ablaufen, und es wurde mit Tetrahydrofuran/H&sub2;O, 10 %iger Essigsäure/Tetrahydrofuran, Tetrahydrofuran/H&sub2;O, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid, Dichlormethan, Diethylether, Dichlormethan, Diethylether gewaschen und dann im Vakuum getrocknet, wobei Harz 5 erhalten wurde.

Eine Lösung von PyBOP® (24 mg, 0,045 mmol) und Diisopropylethylamin (16 ml, 0,09 mmol) in Dimethylformamid (1 ml) wurde zu Harz 5 (50 mg, 0,015 mmol) gegeben, gefolgt von einer Lösung von 1-tert-Butoxycarbonyl-1-(o-brombenzyl)diaminoethan (15 mg, 0,045 mmol) in Dimethylformamid (1 ml) und das Gemisch 3 Tage geschüttelt. Man ließ das Harz ablaufen, und es wurde mit Dimethylformamid, Dichlormethan, Diethylether, Dichlormethan und schließlich Diethylether gewaschen. Eine Lösung von 95 %iger wässriger Trifluoressigsäure in Dichlormethan (20%, 1 ml) wurde dann zum Harz gegeben und das Gemisch 2 Stunden geschüttelt. Man ließ das Harz ablaufen und es wurde mit Dimethylformamid, Dichlormethan, Diethylether, Dichlormethan gewaschen und dann mit 10% Diisopropylethylamin in Dimethylformamid für 10 Minuten geschüttelt. Man ließ das Harz ablaufen, und es wurde mit Dimethylformamid, Dichlormethan, Diethylether, Dichlormethan und schließlich Diethylether gewaschen. Das Harz (6) wurde dann im Vakuum getrocknet. Beispiel 2

Experiment, den restlichen Arzneistoff auf dem Konstrukt nach Photolyse zu zeigen Schema 2

Experiment für Schema 2

Eine Lösung von 4-[4-(1-(9-Fluorenylmethoxycarbonylamino)ethyl)-2-methoxy-5- nitrophenoxy)butansäure (23 mg, 0,045 mmol), Diisopropylethylamin (16 ml, 0,09 mmol) und 2-(1H-9-Azabenztriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-Hexafluorphosphat (17 mg, 0,045 mmol) in Dimethylformamid (2 ml) wurde zu Harz 6 (50 mg, 0,015 mmol) gegeben und das Ganze 3 Stunden geschüttelt. Man ließ das Harz ablaufen, und es wurde mit Dimethylformamid, Dichlormethan, Diethylether, Dichlormethan und schließlich Diethylether gewaschen. Das Harz wurde dann mit 20% Piperidin in Dimethylformamid (3 ml) behandelt und das Ganze 1 Stunde geschüttelt. Man ließ das Harz (7) dann ablaufen und es wurde mit Dimethylformamid, Dichlormethan, Diethylether, Dichlormethan und schließlich Diethylether gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Eine Lösung von Benzoesäure (11 mg, 0,09 mmol), Diisopropylethylamin (16 ml, 0,09 mmol) und 2-(1H-9-Azabenztriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium- Hexafluorphosphat (17 mg, 0,045 mmol) in Dimethylformamid (2 ml) wurde zu Harz 7 gegeen und das Gemisch 2 Stunden geschüttelt. Man ließ das Harz (8) dann ablaufen, und es wurde mit Dimethylformamid, Dichlormethan, Diethylether, Dichlormethan und schließlich Diethylether gewaschen.

Eine Analyse des Produkts der Synthese wurde durch Aussetzen des harzgebundenen Konstrukts an Thiopyrimidinspaltungsbedingungen (nachstehend beschrieben), gefolgt von Analyse des Konstrukts durch Massenspektrometrie, durchgeführt. Das Massenspektrum des Konstrukts ist in Fig. 1 gezeigt.

Eine Lösung von 0,2% Hydrazinhydrat in Dimethylsulfoxid (0,1 ml) wurde zu Harz 9 (2 mg, 0,6 mmol) gegeben und die Lösung 16 Stunden einer Photolyse ausgesetzt. Das photolysierte Harz (9) ließ man dann ablaufen, und es wurde mit Dimethylsulfoxid, Dichlormethan, Diethylether, Dichlormethan und schließlich Diethylether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das gewaschene Harz wurde Pyrimidinspaltungsbedingungen (nachstehend beschrieben) unterzogen und das erhaltene Spaltungsprodukt durch Massenspektrometrie analysiert. Das Massenspektrum ist in Fig. 2 gezeigt.

Allgemeines Verfahren der Konstruktanalyse von Harzen über die Pyrimidinverbindungsgruppe

Eine kleine Probe des Harzes (ca. 0,5 mg) wird mit 0,01 mol/l m- Chlorperbenzoesäure (0,5 ml) für 2 Stunden behandelt. Man läßt das Harz dann ablaufen, und es wird mit Dichlormethan, Diethylether und Dichlormethan gewaschen. Das Harz wird dann mit 0,02 mol/l N-Methylpiperazin in Dimethylformamid (50 ml) behandelt und das Gemisch 12 Stunden geschüttelt. Die Lösung wird dann entfernt und durch Massenspektrometrie analysiert. Beispiel 3

Identifikation einer sensibilisierten Sequenz von Aminosäuren Schema 3

Experiment für Schema 3

Harz 10 wurde durch Umsetzung von Harz 7 mit den gewünschten 9- Fluorenylmethoxycarbonyl-geschützten Aminosäuren, gefolgt von Abspalten der Schutzgruppe und dann wiederholtes Koppeln an die nächste Aminosäure und Schutzgruppenabspaltung (siehe allgemeines Verfahren) hergestellt. Die endständige Aminogruppe wurde dann unter Verwendung von Essigsäureanhydrid (siehe nachstehendes Verfahren) acyliert.

Das erhaltene Harz wurde Pyrimidinspaltungsbedingungen (vorstehend beschrieben), gefolgt von massenspektroskopischer Analyse, unterzogen. Das Massenspektrum ist in Fig. 3 gezeigt. Mit Identifikation des Molekülions bei Masse 716 wurde das Massenspektrum wieder bei einer höheren Spannung durchgeführt, um eine Fragmentierung und anschließende Spaltung der drei Aminosäuren zu bewirken. Das Massenspektrum des fragmentierten Konstrukts ist in Fig. 4 gezeigt.

Allgemeines/typisches Verfahren zur Kopplung von Aminosäuren an eine Verbindungsgruppe

Eine Lösung der 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-geschützten Aminosäure (0,14 mmol, 10 Äqu.), Diisopropylcarbodiimid (22 ml, 0,14 mmol, 10 Äqu.) und N- Hydroxybenztriazol (19 mg, 0,14 mmol, 10 Äqu.) in Dimethylformamid (1 ml) wurde zum erforderlichen Harz 7 (30 mg, ca. 0,014 mmol) gegeben. Das Gemisch wurde dann 5 Stunden geschüttelt. Man ließ das Harz dann ablaufen, und es wurde mit Dichlormethan, Dimethylformamid, Dichlormethan, Diethylether, Dichlormethan und schließlich Diethylether gewaschen. Die 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Schutzgruppen wurden dann durch die Behandlung der Harze mit 20%iger Piperidinlösung in Dimethylformamid (2 ml) und 30 Minuten Schütteln abgespalten. Man ließ das Harz dann ablaufen, und es wurde mit Dichlormethan, Dimethylformamid. Dichlormethan, Diethylether, Dichlormethan und schließlich Diethylether gewaschen. Das gewaschene Harz wurde im Vakuum getrocknet.

Acetylierung der Dipeptide

Eine Lösung von Essigsäureanhydrid (15 ml, 0,14 mmol) in Dichlormethan (1 ml) wurde zu den Harzen (30 mg, ca. 0,014 mmol) gegeben, gefolgt von 4- Dimethylaminopyridin (1 mg, 0,008 mmol), und das Gemisch 2 Stunden geschüttelt. Man ließ das Harz dann ablaufen, und es wurde mit Dichlormethan, Dimethylformamid, Dichlormethan, Diethylether, Dichlormethan und schließlich Diethylether gewaschen. Das gewaschene Harz wurde im Vakuum getrocknet. Beispiel 4

Herstellung des Differentialfreisetzungsharzes 11 Schema 4

Experiment für Schema 4

Harz 7 (0,1 g, 0,03 mmol) wurde mit einer Lösung von 9- Fluorenylmethoxycarbonylglycin (36 mg, 0,12 mmol), N-Allyloxycarbonylglycin (5,2 mg, 0,03 mmol), PyBOP (78 mg, 0,15 mmol) und Diisopropylethylamin (52 ml, 0,3 mmol) in Dimethylformamid (1 ml) behandelt und das erhaltene Gemisch 3 Stunden geschüttelt. Man ließ das Harz dann ablaufen, und es wurde mit Dimethylformamid, Dichlormethan, Diethylether, Dichlormethan und schließlich Diethylether gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Das so hergestellte Harz wurde mit 20% Piperidin in Dimethylformamid (2 ml) behandelt und 30 Minuten vor Ablaufen und Waschen wie vorstehend beschrieben geschüttelt. Das Harz wurde dann mit einer Lösung von 4-[4-(1-(9- Fluorenylmethoxycarbonylamino)ethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)butansäure (39 mg, 0,075 mmol), p-[(R,S)-α-[1-(9H-Fluoren-9-yl)methoxyformamido]-2,4- dimethoxybenzyl]phenoxybutansäure (43 mg, 0,075 mmol), PyBOP (78 mg, 0,15 mmol) und Diisopropylethylamin (52 ml, 0,3 mmol) in Dimethylformamid (1 ml) behandelt und das Gemisch 3 Stunden geschüttelt. Man ließ das Harz dann ablaufen, und es wurde mit Dimethylformamid, Dichlormethan, Diethylether, Dichlormethan und schließlich Diethylether gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Das Harz wurde dann mit 20% Piperidin in Dimethylformamid (2 ml) behandelt und 30 Minuten geschüttelt. Man ließ das Harz dann ablaufen, und es wurde wie vorstehend gewaschen. Das Harz wurde dann mit einer Lösung von Benzoesäure (18 mg, 0,15 mmol), 2-(1H-9-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium- Hexafluorphosphat (57 mg, 0,15 mmol) und Diisopropylethylamin (52 ml, 0,3 mmol) in Dimethylformamid (1 ml) behandelt und das Ganze 2 Stunden geschüttelt. Man ließ das Harz dann ablaufen, und es wurde wie vorstehend gewaschen.

Das Produktharz wurde Pyrimidinspaltungsbedingungen (vorstehend beschrieben), gefolgt von massenspektroskopischer Analyse, unterzogen, und das so erhaltene Massenspektrum ist in Fig. 4 gezeigt.

Es ist leicht zu erkennen, dass zahlreiche Modifikationen und Änderungen für die in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Konstrukte ohne Abweichen von den der Erfindung zugrunde liegenden Prinzipien gemacht werden können, und alle solchen Modifikationen und Änderungen sollen durch die angefügten Patentansprüche eingeschlossen sein.


Anspruch[de]

Chemisches Konstrukt zur Verwendung in der Festphasensynthese, umfassend einen festen Träger Q mit daran gebundenen Resten Y¹R und Y²R; wobei R ein Substrat oder eine Kodierungsmarkierung ist und die Reste Y¹ und Y² Verbindungsgruppen mit jeweils einer ersten Spaltungsstelle sind, wobei mindestens einer der Reste Y¹ und Y² eine zweite Spaltungsstelle aufweist, die sich zwischen der ersten Spaltungsstelle und dem Rest R befindet, wobei die erste Spaltungsstelle orthogonal und selektiv spaltbar in Bezug auf die zweite Spaltungsstelle ist, und, wenn beide Reste Y¹ und Y² eine zweite Spaltungsstelle enthalten, die zweite Spaltungsstelle in Y¹ selektiv und orthogonal in Bezug auf die zweite Spaltungsstelle in Y² spaltbar ist; die zweite Spaltungsstelle spaltbar ist, wobei das Substrat freigesetzt wird, und die erste Spaltungsstelle selektiv spaltbar ist, wobei ein Fragment Fr freigesetzt wird, das das Substrat R und mindestens einen Teil der Verbindungsgruppe Y umfasst; und wobei:

(i) das chemische Fragment Fr eine Sensibilisierungsgruppe G enthält, die das chemische Fragment Fr für instrumentale, z. B. Massenspektroskopie-Analyse sensibilisiert und/oder:

(ii) das Fragment Fr ein Mittel enthält, um dem Massenspektrum des Fragments eine charakteristische Signatur zu verleihen.

2. Chemisches Konstrukt nach Anspruch 1, in dem mindestens ein Rest R ein Substrat ist.

3. Chemisches Konstrukt nach Anspruch 1, umfassend einen festen Träger Q mit daran gebundenen Resten Y¹R und Y²R; wobei R ein Substrat (wie ein Arzneistoffmolekül) ist und die Reste Y¹ und Y² Verbindungsgruppen mit jeweils einer ersten und zweiten Spaltungsstelle sind, die orthogonal und selektiv spaltbar sind, wobei die zweite Spaltungsstelle in Y¹ selektiv und orthogonal in Bezug auf die zweite Spaltungstelle in Y² spaltbar ist; die zweite Spaltungsstelle spaltbar ist, wobei das Substrat freigesetzt wird, und die erste Spaltungsstelle sich an einer Stelle zwischen der zweiten Spaltungsstelle und dem festen Träger befindet und selektiv spaltbar ist, wobei ein Fragment Fr freigesetzt wird, das das Substrat R und mindestens einen Teil der Verbindungsgruppe Y umfasst; und wobei:

(i) das chemische Fragment Fr eine Sensibilisierungsgruppe G enthält, die das chemische Fragment Fr für instrumentale, z. B. Massenspektroskopie-Analyse sensibilisiert und/oder:

(ii) das Fragment Fr ein Mittel enthält, um dem Massenspektrum des Fragments eine charakteristische Signatur zu verleihen.

4. Chemisches Konstrukt nach Anspruch 1 der Formel:

5. Chemisches Konstrukt nach einem der vorstehenden Ansprüche, in dem jeder feste Träger eine Kodierungsmarkierung oder eine Kodierungssequenz enthält, die Information enthält, die ein Hinweis auf mindestens einen Teil der Synthesegeschichte des Konstrukts ist.

6. Chemisches Konstrukt nach Anspruch 5, in dem die Kodierungsmarkierung eine an den festen Träger gebundene Kodierungssequenz ist.

7. Chemisches Konstrukt nach Anspruch 6, in dem die Kodierungssequenz an den festen Träger durch eine Verbindungsgruppe Ya mit einer Spaltungsstelle gebunden ist, die unter Freisetzung eines Fragments Fa vom festen Träger spaltbar ist, wobei das Fragment Fa die Kodierungssequenz und gegebenenfalls mindestens einen Teil der Verbindungsgruppe Ya umfasst.

8. Chemisches Konstrukt nach Anspruch 7, in dem:

(i) das chemische Fragment Fa eine Sensibilisierungsgruppe G enthält, die das chemische Fragment Fa für instrumentale, z. B. Massenspektroskopie-Analyse sensibilisiert und/oder:

(ii) das Fragment Fa ein Mittel enthält, um dem Massenspektrum des Fragments eine charakteristische Signatur zu verleihen.

9. Chemisches Konstrukt nach Anspruch 7, in dem die Spaltungsstelle des Rests Ya unter Bedingungen spaltbar ist, die den zur Abspaltung der ersten Spaltungsstellen in den Resten Y¹R und Y²R erforderlichen entsprechen.

10. Chemisches Konstrukt nach Anspruch 8, in dem das chemische Fragment Fa eine Sensibilisierungsgruppe G enthält, die das chemische Fragment Fa für instrumentale, z. B. Massenspektroskopie-Analyse sensibilisiert.

11. Chemisches Konstrukt nach einem der vorstehenden Ansprüche, in dem ein Teil des gesamten Substrats R im Konstrukt an den festen Träger mit einer Verbindungsgruppe Yb mit einer Spaltungsstelle gebunden ist; die unter Freisetzung eines Fragments Fb vom festen Träger spaltbar ist, wobei das Fragment Fb das Substrat R und mindestens einen Teil der Verbindungsgruppe Yb umfasst; wobei die Verbindungsgruppe Yb zur Freisetzung des Substrats R nicht unter Bedingungen spaltbar ist, die zum Abspalten der zweiten Spaltungsstellen in den Resten Y¹R und Y²R wirksam sind; und wobei:

(i) das chemische Fragment Fb eine Sensibilisierungsgruppe G enthält, die das chemische Fragment Fb für instrumentale, z. B. Massenspektroskopie-Analyse sensibilisiert und/oder:

(ii) das Fragment Fb ein Mittel enthält, um dem Massenspektrum des Fragments eine charakteristische Signatur zu verleihen.

12. Chemisches Konstrukt nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Sensibilisierungsgruppe G durch Spaltung an der ersten Spaltungsstelle des Rests Y¹ oder Y² oder, wenn vorhanden, Ya oder der Spaltungsstelle von Yb erzeugt wird.

13. Chemisches Konstrukt nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Sensibilisierungsgruppe G eine basische Aminogruppe oder eine Carboxylatgruppe, vorzugsweise eine basische Aminogruppe, ist.

14. Chemisches Konstrukt nach Anspruch 13, in dem die Sensibilisierungsgruppe eine primäre Aminogruppe, eine sekundäre Aminogruppe oder eine tertiäre Aminogruppe ist.

15. Chemisches Konstrukt nach Anspruch 14, in dem die Sensibilisierungsgruppe eine tertiäre Aminogruppe, ausgewählt aus cyclischen Aminogruppen, wie Piperidin, Piperazin- (z. B. N-Methylpiperazin-), Pyrrolidin- oder Morpholin-, Piperidingruppen ist.

1b. Konstrukt nach einem der vorstehenden Ansprüche, in dem das Fragment Fr und (wenn vorhanden) gegebenenfalls das Fragment Fa und (wenn vorhanden) gegebenenfalls das Fragment Fb ein Mittel enthalten, um dem Massenspektrum des Fragments eine charakteristische Signatur zu verleihen.

17. Konstrukt nach Anspruch 16, in dem die Signatur durch Einmischen in das Fragment einer "peakauftrennenden" isotopen Markierung bereitgestellt wird, die mindestens ein Atom umfasst, das in einer Reihe von stabilen isotopen Formen existiert.

18. Chemisches Konstrukt nach Anspruch 17, in dem die Fragmente Fr und Fa und (wenn vorhanden) gegebenenfalls Fb unterschiedlich markiert sind, um so unterschiedliche charakteristische Signaturen zu bewirken.

19. Chemisches Konstrukt nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, in dem die isotope Markierung ein Atom oder Atome umfasst, ausgewählt aus ¹H/²H(D), &sup7;&sup9;Br/&sup8;¹Br, ¹²C/¹³C, ¹&sup4;N/¹&sup5;N und ¹&sup6;O/¹&sup8;O.

20. Chemisches Konstrukt nach einem der Ansprüche 17 bis 19, in dem die isotope(n) Markierung(en) sich zwischen den ersten und zweiten Spaltungsstellen der Reste Y¹ und Y² befindet/befinden.

21. Chemisches Konstrukt nach einem der vorstehenden Ansprüche, in dem die ersten und zweiten Spaltungsstellen in den Resten Y¹ durch die erste und zweite Verbindungsgruppe L¹ und L¹ festgelegt sind, erste und zweite Spaltungsstellen im Rest Y² durch erste und zweite Verbindungsgruppen L¹ und L³ festgelegt sind, die Spaltungsstelle im Rest Ya (wenn vorhanden) durch eine Verbindungsgruppe La festgelegt ist und die Spaltungsstelle im Rest Yb (wenn vorhanden) durch eine Verbindungsgruppe Lb festgelegt ist.

22. Chemisches Konstrukt nach Anspruch 21, in dem die Verbindungsgruppen La und Lb L¹ entsprechen.

23. Chemisches Konstrukt nach Anspruch 21 oder Anspruch 22, wobei eine Abstandsgruppe A sich zwischen jedem Paar der ersten und zweiten Verbindungsgruppe oder zwischen der Verbindungsgruppe La und der Kodierungsmarkierung oder zwischen der Verbindungsgruppe Lb und dem Substrat R befindet, wobei die Abstandsgruppe A eine isotope peakauftrennende Markierung enthält.

24. Chemisches Konstrukt nach einem der vorstehenden Ansprüche mit einer Formel, ausgewählt aus:

wobei L¹, L², L³, A und R die in einem der vorstehenden Ansprüche angegebene Bedeutung haben und "Tag" eine Kodierungssequenz bedeutet.

25. Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 24 zur Verwendung in einem Reihenfreisetzungsverfahren des Screenings, wobei das Konstrukt die Formel Tag- A-L¹-Q-L¹-A-L²-R aufweist, wobei Tag, A, L¹, Q, L² und R die in einem der vorstehenden Ansprüche angegebene Bedeutung haben.

26. Chemisches Konstrukt nach einem der vorstehenden Ansprüche, in dem die orthogonal spaltbaren Spaltungsstellen durch Reaktionen, ausgewählt aus säurekatalysierter Spaltung, basenkatalysierter Spaltung, oxidativer Spaltung, reduktiver Spaltung, nucleophilem Ersetzen, elektrophilem Ersetzen und thermischer, photochemischer und enzymatischer Spaltung, gespalten werden können.

27. Chemische Zwischenprodukt-Konstrukte zur Verwendung bei der Herstellung eines chemischen Konstrukts nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Zwischenprodukt-Konstrukte die Formeln Y¹-Q-Y², RY¹-Q-Y² und Y¹-Q-Y²R aufweisen, in denen Y¹ und Y² reaktive oder geschützte Formen des Rests Y sind und R, Q und Y die in einem der vorstehenden Ansprüche angegebene Bedeutung haben.

28. Zwischenprodukt-Konstrukte der Formeln L²-A-L¹-Q-L¹-Ap, R-L²-A-L¹-Q-L¹-Ap, L³-A-L¹-Q-L¹-Ap, R-L³-A-L¹-Q-L¹-Ap-, R-L³-A-L¹-Q-L¹-A-L² und L³-A-L¹-Q-L¹- A-L²-R, in denen L¹, L² und L³ reaktive oder geschützte Formen der Verbindungsgruppen L¹, L² und L³ sind, Ap eine reaktive oder geschützte Form der Abstandsgruppe A ist, die eine peakauftrennende isotope Markierung enthält, und Q, R, A, L¹, L² und L³ die in einem der vorstehenden Ansprüche angegebene Bedeutung haben.

29. Zwischenprodukt-Konstrukt nach Anspruch 28, in dem die Gruppe Ap die Formel NH-Alk-NX¹ aufweist, in der Alk ein Alkylenrest ist und X¹ ein Wasserstoffatom oder Aralkylrest ist.

30. Zwischenprodukt-Konstrukt nach Anspruch 28 oder Anspruch 29, in dem der feste Träger daran gebunden eine Kodierungsmarkierungssequenz L¹-A-Tag und/oder eine Sequenz R-A-L¹- oder eine Vorstufenform davon aufweist.

31. Differentialfreisetzungsverfahren zum Prüfen einer chemischen Bibliothek auf biologische Wirksamkeit, wobei das Verfahren umfasst:

(i) Aussetzen eines einen festen Träger Q mit daran gebundenen Resten Y¹R und Y²R umfassenden Konstrukts nach einem der vorstehenden Ansprüche an Spaltungsbedingungen, die wirksam sind, um das Substrat R vom Rest Y¹R freizusetzen;

(ii) Testen des vom Rest Y¹R freigesetzten Substrats R in einem biologischen Test;

(iii) anschließend Aussetzen des Konstrukts an Spaltungsbedingungen, die wirksam sind, um das Substrat R vom Rest Y²R freizusetzen; und

(iv) Testen des vom Rest Y²R freigesetzten Substrats R in einem biologischen Test.

32. Reihenfreisetzungsverfahren zum Prüfen einer chemischen Bibliothek auf biologische Wirksamkeit, wobei das Verfahren umfasst:

(i) Aussetzen eines Konstrukts nach einem der Ansprüche 1 bis 26 an Spaltungsbedingungen, die wirksam sind, einen ersten Teil des Substrats R vom Rest Y¹R freizusetzen;

(ii) Testen des ersten Teils des vom Rest Y¹R freigesetzten Substrats R in einem biologischen Test;

(iii) Aussetzen des Konstrukts an Spaltungsbedingungen, die wirksam sind, um einen zweiten Teil des Substrats R vom Rest Y¹R freizusetzen; und

(iv) Testen des zweiten Teils des vom Rest Y¹R freigesetzten Substrats R in einem biologischen Test.

33. Verfahren zur Bestimmung der Identität eines an einen festen Träger Q eines Konstrukts nach einem der Ansprüche 7 bis 26 gebundenen Substrats R durch massenspektrometrische Verfahren, wobei der feste Träger Q eine Kodierungssequenz daran durch eine Verbindungsgruppe Ya gebunden mit einer Spaltungsstelle aufweist, die unter Freisetzen eines Fragments Fa vom festen Träger spaltbar ist, wobei das Fragment Fa die Kodierungssequenz und mindestens einen Teil der Verbindungsgruppe Ya umfasst, wobei (i) das chemische Fragment Fa eine Sensibilisierungsgruppe G enthält, die das chemische Fragment Fa für Massenspektroskopie-Analyse sensibilisiert;

die Kodierungssequenz eine Sequenz von Kodierungsgruppen der Art und Reihenfolge umfasst, die ein Hinweis auf die Identität des Substrats R ist;

das Verfahren das Spalten der Verbindungsgruppe Ya, um so das Fragment Fa vom festen Träger freizusetzen; Massenspektrometrie des Fragments Ya unter effektiven Bedingungen, um eine Massenspektralfragmentierung der Kodierungsgruppe und Bildung von Massenspektrum-Fragmentionen, die dem Verlust von einem oder mehreren Kodierungsgruppen von der Kodierungssequenz entsprechen, zu bewirken, und danach Korrelieren der Peaks des Massenspektrums der Massenspektrum-Fragmentionen mit den Molekülionen des Fragments Ya zum Identifizieren der Sequenz der einzelnen Kodierungsgruppen umfasst.

34. Verfahren nach Ansprach 33, wobei das Fragment Fa ein Mittei enthält, um dem Massenspektrum des Fragments eine charakteristische Signatur zu verleihen.

35. Verfahren zum Identifizieren eines pharmazeutisch geeigneten Substrats, umfassend das Erstellen einer Bibliothek, die eine Mehrzahl von chemischen Konstrukten nach einem der vorstehenden Ansprüche enthält, und biologisches Testen der Bibliothek, um die biologisch aktiven Substrate zu identifizieren.

36. Verfahren nach Anspruch 35, das den weiteren Schritt der Formulierung eines so identifizierten biologisch wirksamen Substrats mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger unter Bilden eines Arzneimittels einschließt.







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