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Dokumentenidentifikation DE69528295T2 08.05.2003
EP-Veröffentlichungsnummer 0872219
Titel ANWENDUNG DES BIOFREQUENZSPEKTRUMS IN DER EMBRYOTECHNOLOGIE BEI TIEREN
Anmelder Zhou, Lin, Kunming, Yunnan, CN
Erfinder Zhou, Lin, Kunming, Yunnan, CN
Vertreter Patentanwälte Eder & Schieschke, 80796 München
DE-Aktenzeichen 69528295
Vertragsstaaten DE, FR, GB
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 02.11.1995
EP-Aktenzeichen 959364167
WO-Anmeldetag 02.11.1995
PCT-Aktenzeichen PCT/CN95/00087
WO-Veröffentlichungsnummer 0096015732
WO-Veröffentlichungsdatum 30.05.1996
EP-Offenlegungsdatum 21.10.1998
EP date of grant 18.09.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 08.05.2003
IPC-Hauptklasse A61D 19/00
IPC-Nebenklasse C12N 5/06   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft die Biotechnologie, insbesondere die Anwendung eines Bio-Spektrums in der Embryonen-Technologie nicht-menschlicher Embryonen.

Der Begriff "Embryonen-Technologie", wie er in der folgenden Beschreibung verwendet wird, bezieht sich nur auf nicht- menschliche, tierische Embryonen.

Die Grundlagenforschung und technische Entwicklung in der Embryonen-Technologie tierischer Embryonen haben in den letzten Jahren große Fortschritte gemacht. Forschungen in der Embryonen-Technologie kommen schnell vom Stadium der Laborversuche zur Anwendung und Kommerzialisierung. Die Embryonen-Technologie tierischer Embryonen umfasst hauptsächlich in-vitro-Erzeugung von Embryonen, Kryokonservierung von Embryonen und Mikromanipulation von Embryonen etc.

Die Entwicklung der Technik der in-vitro-Erzeugung von Embryonen kann vollen Gebrauch von tierischen Genressourcen ermöglichen und die Verbesserung tierischer Gene beschleunigen. Diese Technik kann Unfruchtbarkeit einiger seltener Tiere überwinden und Ressourcen seltener Tiere konservieren. Diese Technik kann auch Embryonen zur Herbeiführung eines Gen-Transfers in Tieren und Geschlechtsbestimmung von Embryonen liefern. Die Effektivität der Erzeugung und die Qualität der in vitro erzeugten Embryonen sind jedoch geringer. Auch die Trächtigkeitsrate ist bei Embryotransfer geringer.

Kryokonservierung tierischer Embryonen ist die Schlüsseltechnik, die entscheidet, ob die Technik des Embryotransfers zur praktischen Anwendung gelangen kann, oder nicht. Durch die Kryokonservierungsstechnik kann zur Erleichterung des internationalen Transportes und Austausches von Tierzuchtressourcen ein Reservoir tierischer Embryonen eingerichtet werden. Zur Zeit gibt es zwei international akzeptierte Verfahren zur Kryokonservierung von Embryonen. Das eine ist das Verfahren des langsamen Einfrierens, das andere die Kryokonservierung. Die Überlebensrate gefrorener/aufgetauter, in vitro erzeugter Embryonen liegt jedoch bei 65% und die Trächtigkeitsrate der gefrorenen/aufgetauten Embryonen ist um 20% geringer, als die frischer Embryonen. Mikromanipulation von Embryonen besteht in Geschlechtsbestimmung von Embryonen, Klonen von Embryonen einschließlich Embryonenzerlegung und Kerntransfer, und Gentransfer. Ziel der Geschlechtsbestimmung von Embryonen ist die Erzeugung von Nachkommen mit bestimmtem Geschlecht. Durch Klonen von Embryonen kann eine große Zahl identischer Nachkommen von einem bestimmten tierischen Embryo erzeugt werden, was die Reproduktionseffektivität erhöht und die Tierzucht beschleunigt. Tiere mit transformierten Genen können durch Mikroinjektion und durch Verfahren mit Spermavermittlung erzeugt werden. Ziel der Gentransfertechnik ist die Erhöhung der Wachstumsrate und der Widerstandsfähigkeit der Tiere gegen Krankheiten, Erhöhung der Qualität der Tiererzeugung und daher Schaffung vieler wertvoller Medikamente für Menschen. Die Effektivität der Mikromanipulation ist jedoch sehr gering, da die Embryonen definitiv verletzt werden.

Zur Lösung der obigen Probleme wurde versucht, Laser- oder magnetische Bestrahlung zu verwenden. Beispielsweise beschreibt SU-A-1 724 204 die Anwendung von Bestrahlung mit einem Infrarotlaser bestimmter Wellenlänge während der Bearbeitung tierischen Reproduktionsspermas; SU-A-731 976 beschreibt ein Verfahren zur Verbesserung der Fruchtbarkeit von Labornagetieren, in dem die Weibchen einer cm-Band- Strahlung ausgesetzt werden; SU-A-1 757 676 beschreibt ein Verfahren zur Bestrahlung von Hühnerembryonen mit einem He-Ne-Laser der besonderen Wellenlänge 632,8 nm; SU-A-1 152 583 beschreibt ein Behandlungsvefahren, das ein reines Magnetfeld anwendet; SU-A-1 402 343 beschreibt eine Behandlung tierischen Spermas, die ein reines Magnetfeld anwendet und US 493 0505 beschreibt ein Therapieverfahren, das einen Laser mit einer bestimmten Wellenlänge anwendet.

Die Erfindung beruht auf den folgenden Erkenntnissen. Sehr wenige Leute haben Forschungen über die Regulierung von Reproduktions- und Wachstumsvermögen von Tieren mit physikalischen Methoden unternommen, insbesondere über die Anwendung physikalischer Verfahren auf die Embryonentechnologie zur Lösung technischer Probleme. Der Erfinder erkannte, dass alle lebende Materie gleichzeitig chemische und physikalische Eigenschaften hat. Die lebende Materie hat besondere physikalische Eigenschaften, wie etwa elektrische Ladung in Zellen etc. Wechselwirkungen zwischen den Substanzen in lebender Materie, die über elektrische Ladungen verfügen und dem elektromagnetischen Feld in der Umgebung können bewirkt werden, wenn das elektromagnetische Feld in der Umgebung und einige wichtige physikalische Eigenschaften lebender Materie dieselben Eigenschaften haben. Die Wechselwirkungen können gleichzeitig die Moleküle, Atome und Elektronen beeinflussen, um deutliche biologische Wirkungen hervorzurufen. Beispielsweise können Gewebe und Zellen in der chemischen und physikalischen Umgebung eines lebenden Körpers normal wachsen und sich entwickeln.

Wachstum und Entwicklung von Geweben und Zellen werden deutlich verringert, wenn sie vom lebenden Körper getrennt werden, obwohl viele Arten chemischer Schutzstoffe und Nährstoffe zur Verbesserung der Kulturbedingungen verwendet werden. Der Erfinder erkannte außerdem, dass das Wachstumsvermögen von Geweben und Zellen in Kulturbedingungen durch Anwendung eines simulierten Bio- Spektrums verbessert werden, bei dem es sich um ein schwaches elektromagnetisches Feld handelt. Es hat also eine erhebliche Bedeutung, das simulierte Bio-Spektrum in der Embryonen-Technologie anzuwenden. Das Bio-Spektrum hilft, das Reproduktionsvermögen, die Wachstumsgeschwindigkeit und die Widerstandsfähigkeit der Tiere gegen Krankheiten zu verbessern.

Die Erfindung beabsichtigt, biologische Wirkungen von Bestrahlung durch Anwendung des Bio-Spektrums in der Embryonen-Technologie tierischer Embryonen und auf Tiere herbeizuführen, umfassend:

Verbesserung der Reifungsrate von Oozyten, der Fruchtbarkeit in vitro und von Embryonen durch Bestrahlung mit Bio- Spektrum bei der in-vitro-Erzeugung von Embryonen.

Das oben erwähnte simulierte Bio-Spektrum wird in der chinesischen Patentanmeldung Nr. 91109014.2 beschrieben und ist ein synthetisches physikalisches Breitbandfeld. Seine Wellenlänge beträgt 0,2 um bis 10 cm. Das Bestrahlungssignal ist sehr schwach im Wellenlängenband von 30 um - 10 cm.

Einige Teile des physikalischen Feldes können bestimmte Wirkungen hervorrufen.

Das Ziel der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden technischen Lösungen erreicht.

Verfahren zur Anwendung von Bio-Spektrum auf die in-vitro- Erzeugung tierischer Embryonen.

1. In-vitro-Reifung gewonnener Oozyten: Oozyten, die in ein Standardmedium oder in definiertes Medium gebracht wurden, werden mit einem Bio-Spektrum-Generator 3 bis 20 Minuten lang bestrahlt. In dieser Zeit wird die Temperatur des Mediums auf nicht mehr als 40ºC gehalten.

2. Kapazitation von Spermatozoen: Mit einem Standardmedium oder definiertem Medium verdünntes Semen wird mit dem Bio- Spektrum-Generator 3 bis 20 Minuten lang bestrahlt. In dieser Zeit wird die Temperatur des Mediums auf nicht mehr als 40ºC gehalten.

3. In-vitro-Fertilisation von Oozyten: Sowohl gereifte Oozyten, als auch kapazitierte Spermatozoen werden zusammen in einem Standardmedium oder definiertes Medium enthaltenden Reagenzglas kultiviert und mit dem Bio-Spektrum-Generator ein- bis dreimal jeweils 3 bis 25 Minuten lang bestrahlt. Während der Bestrahlung beträgt die Temperatur des Mediums nicht mehr als 40ºC.

4. In-vitro-Kultur von Embryonen: In ein Standardmedium oder in definiertes Medium übertragene Zygoten werden mit dem Bio-Spektrum-Generator 3 bis 30 Minuten lang bestrahlt. Während der Bestrahlung beträgt die Temperatur des Mediums nicht mehr als 40ºC.

Durch Anwendung von Bestrahlung mit Bio-Spektrum bei der Mikromanipulation von Embryonen in vitro konnte die Entwicklungsrate von Hemimorulae und Hemiblastozysten und die Erfolgsrate der Embryoerhaltung erheblich verbessert werden. Durch Anwendung von Bestrahlung mit Bio-Spektrum in der Tierkrankheitskontrolle konnten die Krankheiten gelindert und geheilt werden.

BEISPIEL 1

Die Oozyten werden nach üblichen Verfahren aus Spenderkühen gewonnen und dann zur Reifung in gewöhnliches Medium oder Spezialmedium gegeben. Während der Reifung werden die Oozyten mit der Bio-Spektrum-Vorrichtung (Modell WS-101 D) während 15 Minuten (bei geringer Stärke) bestrahlt. Die Temperatur sollte durch Einstellung des Abstandes zwischen Embryonen-Behälter und Bestrahlungsvorrichtung auf 38-40ºC gehalten werden. Das Spezialmedium wird nach dem Verfahren von Brackett et al. bereitet. Das Rezept des Spezialmediums lautet:

Bestandteile g/l

NaCl 6,55

KCl 0,30

CaCl&sub2;·2H&sub2;O 0,33

NaH&sub2;PO&sub4;·H&sub2;O 0,11

MgCl&sub2;·6H&sub2;O 0,11

NaHCO&sub3; 3,10

Glukose 2,25

Albumin aus Rinderserum 3,00

Natriumpyruvat (oder Pyruvat) 0,14 (oder 0,11) Na-Penicillin 0,031 (50 IE/ml)

Das Medium muss durch Filtration sterilisiert werden, nachdem sich die Bestandteile vollständig in 1000 ml Wasser gelöst haben. Dieses Medium muss im Inkubator bei 38ºC und einem CO&sub2;-Gehalt der Luft von 59% äquilibriert werden. Die Osmolalität dieses Mediums beträgt ungefähr 300 mOsm/kg H&sub2;O. Das Spezialmedium wird durch Zusatz von 84 mg NaHCO&sub3; zu 100 ml der so bereiteten Lösung hergestellt. Das m-HIS wird durch Zusatz von 34 mg NaCl zu 10 ml Medium bereitet.

Spermakapazitation

Frisches Semen wird zunächst nach dem Verfahren von Brackett et al. behandelt. Semen wird in Spezialmedium vorverdünnt (350 g). Nach Zentrifugieren wird das Sperma- Pellet in m-HIS-Medium resuspendiert und für 15 Minuten in ein Wasserbad von 38ºC gestellt. Nach einer weiteren Zentrifugierung wird das Spermapellet in einem Glas in Spezialmedium resuspendiert, um mit der Bio-Spektrum-Vorrichtung bei geringer Stärke 10 Minuten lang bestrahlt zu werden. Während der Bestrahlung sollte die Temperatur des Mediums durch Einstellung des Abstandes zwischen dem Glas und der Bestrahlungsvorrichtung auf 38-40ºC gehalten werden.

In-vitro-Fertilisation von Oozyten

Die in vitro gereiften Oozyten und in vitro kapazitiertes Sperma werden zur Bestrahlung während 20 Minuten mit der Bio- Spektrum-Vorrichtung in ein Glas mit Spezialmedium gebracht. Das Glas wird zur Kultivierung während einer Stunde bei 38ºC in den CO&sub2;-Inkubator gesetzt. Danach wird das Glas erneut für 18 Minuten mit Bio-Spektrum bestrahlt und erneut für eine fünfstündige Kultur in den Inkubator gesetzt. Bei der Bestrahlung wird geringe Stärke angewendet und die Temperatur des Mediums durch Einstellung des Abstandes zwischen dem Glas und der Bestrahlungsvorrichtung auf 38-40ºC gehalten.

In-vitro-Kultur von Embryonen

Vor Kultur im Inkubator werden die in vitro fertilisierten Eier zur Bestrahlung während 25 Minuten mit Bio-Spektrum in Spezialmedium gebracht. Geringe Stärke wird angewandt. Während der Bestrahlung wird die Temperatur des Mediums durch Einstellung des Abstandes zwischen dem Medium-Behälter und der Bestrahlungsvorrichtung auf 38-40ºC gehalten.


Anspruch[de]

Verfahren zur Anwendung einer Bestrahlung mit einem Bio- Frequenzspektrum in der Embryonen-Technologie nicht- menschlicher, tierischer Embryonen, wobei das genannte Bio- Frequenzspektrum über Wellenlängen im Bereich zwischen 0,2 um und 10 cm verfügt und wobei die genannte Embryonen- Technologie nicht-menschlicher, tierischer Embryonen umfasst

(1) in-vitro-Reifung gewonnener Oozyten,

(2) Kapazitation von Spermatozoen,

(3) in-vitro-Kultur von Embryonen,

wobei während der in-vitro-Reifung Oozyten, die in einem Standardmedium oder in definiertem Medium kultiviert wurden, mit einem Bio-Spektrum-Generator 3 bis 20 Minuten lang bestrahlt werden, wobei die Temperatur des Mediums während der Bestrahlung auf nicht mehr als 40ºC gehalten wird; während der Kapazitation wird mit einem Standardmedium oder definiertem Medium verdünntes Semen mit dem Bio-Spektrum- Generator 3 bis 20 Minuten lang bestrahlt, wobei die Temperatur des Mediums während der Bestrahlung nicht mehr als 40ºC beträgt;

während der in-vitro-Fertilisation werden sowohl Oozyten, als auch in-vitro-kapazitierte Spermatozoen zusammen in einem Standardmedium oder definiertes Medium enthaltenden Reagenzglas kultiviert und mit dem Bio-Spektrum-Generator ein- bis dreimal jeweils 3 bis 25 Minuten lang bestrahlt, wobei die Temperatur des Mediums während der Bestrahlung nicht mehr als 40ºC beträgt;

während der in-vitro-Kultur von Embryonen werden potentielle Zygoten in ein Standardmedium oder in definiertes Medium übertragen und mit dem Bio-Spektrum-Generator 3 bis 20 Minuten lang bestrahlt, wobei die Temperatur des Mediums während dieser Zeit nicht mehr als 40ºC beträgt.

Verfahren nach Patentanspruch 1, in dem die Bestandteile des genannten definierten Mediums 6,55 g/l, NaCl, 0,30 g/l KCl, 0,33 g/l CaCl&sub2;·2H&sub2;O, 0,11 g/l, NaH&sub2;PO&sub4;·H&sub2;O, 0,11 g/l MgCl&sub2;·6H&sub2;O, 3,10 g/l, NaHCO&sub3;, 2,5 g/l Glukose, 0,14 g/l Natriumpyruvat (0,11 g/l Pyruvat), 3,00 g/l, Albumin aus Rinderserum, 0,031 g/l, (50 IE/ml) Natriumsalz von Penicillin sind und 84 mg NaHCO&sub3; 100 ml des genannten definierten Mediums zugesetzt werden.







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