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Dokumentenidentifikation DE69623786T2 15.05.2003
EP-Veröffentlichungsnummer 0842267
Titel Mch2, EINE APOPTOTISCHE CYSTEIN-PROTEASE, ZUSAMMENSETZUNGEN FÜR IHRE PRÄPARATION UND METHODEN FÜR IHRE VERWENDUNG
Anmelder Thomas Jefferson University, Philadelphia, Pa., US
Erfinder LITWACK, Gerald, Wynnewood, US;
ALNEMRI, S., Emad, Ambler, US;
FERNANDEZ-ALNEMRI, Teresa, Ambler, US
Vertreter Uexküll & Stolberg, 22607 Hamburg
DE-Aktenzeichen 69623786
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 16.05.1996
EP-Aktenzeichen 969202340
WO-Anmeldetag 16.05.1996
PCT-Aktenzeichen PCT/US96/07010
WO-Veröffentlichungsnummer 0096036698
WO-Veröffentlichungsdatum 21.11.1996
EP-Offenlegungsdatum 20.05.1998
EP date of grant 18.09.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 15.05.2003
IPC-Hauptklasse C12N 5/16
IPC-Nebenklasse C12N 9/64   C12N 15/12   C12N 15/85   C07H 21/02   C07H 21/04   C07K 16/40   C12Q 1/37   C12Q 1/68   A61K 31/70   A61K 38/43   

Beschreibung[de]
GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft die Identifizierung und Klonierung von Mch2, einem neuen Mitglied der apoptotischen Ced-3/Ice-Cysteinprotease-Genfamilie, und Verfahren zur Herstellung und Verwendung desselben.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Unlängst sind mehrere Mitglieder einer neuen Klasse von Cysteinproteasegenen als Regulatoren des programmierten Zelltods oder der Apoptose entdeckt worden. Diese Gene umfassen die Säugetiergene Ice, Ich-1 (Nedd2) und Cpp32 (Mch1) wie auch das C. elegans-Zelltodgen Ced-3. Mit Ausnahme von ICE ist die Proteinstruktur von Ich-1, Cpp32 oder Ced-3 noch nicht bestimmt worden. Jedoch haben diese Enzyme basierend auf struktureller Homologie eine ähnliche und einzigartige Struktur, die in keiner Beziehung zu klassischen Cysteinproteasen steht. Sie alle enthalten ein Pentapeptid QACRG (SEQ ID NO: 1) im aktiven Zentrum. Darüber hinaus legt eine Strukturanalyse nahe, dass diese Enzyme als inaktive Proenzyme synthetisiert werden. Die Proenzyme werden durch proteolytische Spaltung an konservierten Asparaginsäure-Spaltstellen, wodurch zwei Polypeptiduntereinheiten erzeugt werden, aktiviert. Bei ICE sind diese Untereinheiten als p20- und p10-Untereinheiten, die miteinander unter Bildung des aktiven heteromeren Komplexes assoziieren, bekannt.

Der apoptotische Zelltod ist für die Homöostase von normaler Entwicklung und Aufrechterhaltung von normaler Gewebegröße in mehrzelligen Organismen essentiell. Es gibt zunehmende Beweise dafür, dass eine Dysregulation der Apoptose zu mehreren Krankheiten beim Menschen, einschließlich Krebs und degenerativen neuronalen Erkrankungen, wie Alzheimer'- und Parkinson'- Krankheit, führen kann. Dementsprechend ist es wahrscheinlich, dass ICE-artige Cysteinproteasen eine signifikante Rolle bei der Pathogenese dieser Krankheiten spielen.

Es besteht ein Bedarf, Mitglieder der apoptotischen Ced-3/Ice- Cysteinprotease-Genfamilie zu identifizieren. Es besteht ein Bedarf an isolierten Mitgliedern der apoptotischen Ced-3/Ice- Cysteinprotease-Genfamihie und an Zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung und Isolierung von Mitgliedern der apoptotischen Ced-3/Ice-Cysteinprotease-Genfamilie. Es besteht ein Bedarf an isolierten Proteinen, die Mitglieder der apoptotischen Ced-3/Ice-Cysteinprotease-Genfamilie sind. Es besteht ein Bedarf an isolierten Nukleinsäuremolekülen, die Mitglieder der apoptotischen Ced-3/Ice-Cysteinprotease-Genfamilie kodieren. Es besteht ein Bedarf an Verbindungen, die die Aktivität von Mitgliedern der apoptotischen Ced-3/Ice-Cysteinprotease- Genfamilie hemmen. Es besteht ein Bedarf an Kits und Verfahren zur Identifizierung solcher Verbindungen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft im wesentlichen reine Proteine, die die in SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 gezeigten Aminosäuresequenzen aufweisen.

Die Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein Protein, das die in SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen.

Die Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäuremoleküle, die Nukleinsäuresequenzen umfassen, die ein Protein kodieren, das eine in SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.

Die Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen, die Nukleinsäuremoleküle, die Nukleinsäuresequenzen umfassen, die ein Protein, das eine in SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, kodieren, in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen.

Die Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäuremoleküle, die aus SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 oder einem Fragment davon, das mindestens 5 Nukleotide aufweist, bestehen.

Die Erfindung betrifft einen rekombinanten Expressionsvektor, der das Nukleinsäuremolekül umfasst, das eine Nukleotidsequenz, die SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 umfasste aufweist.

Die Erfindung betrifft eine Wirtszelle, die einen rekombinanten Expressionsvektor umfasst, der das Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz, die SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 umfasst, aufweist, umfasst.

Die Erfindung betrifft ein Oligonukleotidmolekül, das eine zu einer Nukleotidsequenz von mindestens 5 Nukleotiden von SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 komplementäre Nukleotidsequenz umfasst.

Die Erfindung betrifft isolierte Antikörper, die an ein Epitop auf SEQ ID NO: 5 und/oder SEQ ID NO: 7 binden.

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung von Substraten, Aktivatoren oder Inhibitoren von Mch2α.

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Hemmung der Expression von Mch2 durch Inkontaktbringen von Zellen, die Mch2 exprimieren, mit einem Nukleinsäuremolekül, das eine Antisense-Nukleotidsequenz, die eine Transkription von Mch2-Gensequenzen oder eine Translation von Mch2-mRNA verhindert, umfasst.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Es wurde eine PCR-Technik entwickelt, um neue Cysteinproteasen zu isolieren und zu charakterisieren. DNA-Sequenzen, die die hochgradig konservierten Aminosäuresequenzen, die in ICE-artigen apoptotischen Cysteinproteasen vorhanden sind, kodieren, werden unter Verwendung von PCR-Primern, die basierend auf spezifischen Sequenzen, die mit solchen Proteasen assoziiert sind, gestaltet sind, amplifiziert. Die Klonierungsstrategie setzte degenerierte Oligonukleotide ein, die die hochgradig konservierten Pentapeptide QACRG (SEQ ID NO: 1) und GSWFI (SEQ ID NO: 2), die in allen bekannten apoptotischen Cysteinproteasen vorhanden sind, kodieren. Die PCR wurde unter Verwendung von mRNA aus menschlichen Jurkat-T-Lymphozyten ausgeführt. Das neue Gen kodiert ein ~34 kDa-Protein, das hochgradig homolog zu menschlichem Cpp32, dem C. elegans-Zelltodprotein CED-3, Ice-1 (Nedd2) aus Säugetieren und dem Interleukin-1-β- umwandelnden Enzym (ICE) aus Säugetieren ist. Aufgrund von dessen hoher Homologie zu dem Ced-3-Gen von C. elegans wurde das neue zu Ced-3 homologe Säugetiergen ("mammalian Ced-3 homolog"-Gen) Mch2 genannt und umfasst zwei Isoformen.

Mch2-mRNA ist in zellulärer Gesamt-RNA, die aus den folgenden menschlichen Tumorzelllinien isoliert worden ist, nachgewiesen worden: Peer, SupT1, CEM C7, CEM C1, Molt4 und Jurkat, T-Lymphozyten; 697 und 380, Prä-B-Lymphozyten; K562, einem Promyelozyt; HeLa, einem Zervixkarzinom; A431, einem Vulvakarzinom; Colo320, einem Colonadenokarzinom; MCF7, einem Brustkarzinom; A173, einem Glioblastom; 293, einem Ad-5-transformierten embryonalen Nierenfibroblast.

In Jurkat-T-Lymphozyten und anderen Zelllinien wurden zwei Mch2-Transkripte (Mch2α = 1,7 kb und Mch2β = 1,4 kb) nachgewiesen. Es wird angenommen, dass das Mch2α-Transkript das Volllängen-Mch2 kodiert, wohingegen angenommen wird, dass das Mch2β- Transkript eine kürzere Mch2-Isoform, wahrscheinlich als Ergebnis eines alternativen Spleißens, kodiert.

Wie ICE und Cpp32 weist rekombinantes Mch2α, nicht aber Mch2β Proteaseaktivität auf, wie anhand von dessen Fähigkeit, das fluorogene Peptid DEVD-AMC (SEQ ID NO: 3) zu spalten, bestimmt wurde. Mch2 und CPP32 können auch Poly(ADP-Ribose) (PARP) in vitro spalten, was nahelegt, dass diese Enzyme an der PARP- Spaltung, die während der zellulären Apoptose beobachtet wird, beteiligt sind. Zusätzlich induziert eine Überexpression von rekombinantem Mch2α, nicht aber von Mch2β, eine rasche Apoptose in SF9-Insektenzellen. Basierend auf diesen Daten ist Mch2 als eine Ced-3/ICE-artige Cysteinprotease und als ein Apoptose- Mediator-Kandidat in Säugetierzellen charakterisiert worden.

Die Entdeckung von Mch2 und dessen zwei Isoformen stellt die Mittel bereit, um spezifische Inhibitoren, Aktivatoren und Substrate dieser apoptotischen Cysteinprotease zu gestalten und zu entdecken. Gemäß der Erfindung kann Mch2α verwendet werden, um Verbindungen in Hinblick auf Inhibitoren, Aktivatoren oder Substrate zu screenen. Inhibitoren sind als Anti-Apoptose-Mittel nützlich. Aktivatoren sind als apoptotische Mittel, die zytotoxische Wirkungen, wie Antitumoraktivität, haben, nützlich. Substrate sind als Reagenzien in Assays zur Identifizierung von Inhibitoren und Aktivatoren nützlich. Es werden Kits für das Screenen von Verbindungen in Hinblick auf Mch2α- Inhibitoren bereitgestellt. Es werden Kits für das Screenen von Verbindungen in Hinblick auf Mch2α-Aktivatoren bereitgestellt. Es werden Kits für das Screenen von Verbindungen in Hinblick auf Mch2α-Substrate bereitgestellt. Die Nukleotidsequenzen, die die Mch2-Isoformen kodieren, werden hier offenbart und ermöglichen die Produktion von reinem Protein, die Gestaltung von Sonden, die spezifisch an Nukleinsäuremoleküle, die die Mch2-Isoformen kodieren, hybridisieren, und von Antisense-Verbindungen, um die Transkription von Mch2-Isoformen zu hemmen. Es werden anti-Mch2α- und anti-Mch2β-Antikörper bereitgestellt. Anti-Mch2α-Antikörper können Inhibitoren von Mch2α sein und können in Verfahren zur Isolierung von reinem Mch2 und Verfahren zur Hemmung von Mch2α-Aktivität verwendet werden. Anti-Mch2β-Antikörper können Inhibitoren von Mch2β sein und können in Verfahren zur Isolierung von reinem Mch2 und Verfahren zur Hemmung von Mch2β-Aktivität verwendet werden.

Die Erfindung stellt im wesentlichen gereinigte Mch2-Isoformen Mch2α und Mch2β bereit, die Aminosäuresequenzen, bestehend aus: SEQ ID NO: 5 bzw. SEQ ID NO: 7, aufweisen. Die Mch2-Isoformen Mch2α und Mch2β können aus natürlichen Quellen isoliert, durch DNA-Rekombinationsmethoden produziert oder durch Standardproteinsynthesetechniken synthetisiert werden.

Antikörper, die an eine spezielle Mch2-Isoform spezifisch binden, können verwendet werden, um das Protein aus natürlichen Quellen unter Verwendung von wohlbekannten Techniken und leicht erhältlichen Ausgangsmaterialien zu reinigen. Solche Antikörper können auch verwendet werden, um die Mch2-Isoform aus Material, das vorhanden ist, wenn das Protein mittels der DNA-Rekombinationsmethodiken produziert wird, zu reinigen. Die Erfindung betrifft Antikörper, die an ein Epitop binden, das auf einer Mch2-Isoform, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Mch2α - SEQ ID NO: 5 und Mch2β - SEQ ID NO: 7, vorhanden ist. Wie hier verwendet, soll der Begriff "Antikörper" sich auf vollständige, intakte Antikörper und Fab-Fragmente und F(ab)&sub2;-Fragmente davon beziehen. Vollständige, intakte Antikörper umfassen monoklonale Antikörper, wie monoklonale Antikörper von der Maus, chimäre Antikörper und humanisierte Antikörper. In einigen Ausführungsformen binden die Antikörper spezifisch an ein Epitop von nur einem von: Mch2α - SEQ ID NO: 5 und Mch2β - SEQ ID NO: 7. Antikörper, die an ein Epitop binden, das auf einer Mch2-Isoform vorhanden ist, sind nützlich, um die Mch2-Isoform sowohl aus natürlichen Quellen als auch aus rekombinanten Expressionssystemen unter Verwendung von wohlbekannten Techniken, wie Affinitätschromatographie, zu isolieren und zu reinigen. Solche Antikörper sind nützlich, um die Anwesenheit eines solche Proteins in einer Probe nachzuweisen und zu bestimmen, ob Zellen das Protein exprimieren.

Die Produktion von Antikörpern und die Proteinstrukturen von vollständigen, intakten Antikörpern, Fab-Fragmenten und F(ab)&sub2;- Fragmenten und die Organisation der genetischen Sequenzen, die solche Moleküle kodieren, sind wohlbekannt und sind beispielsweise in Harlow, E. und D. Lane (1988) ANTIBODIES: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, das in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben. Kurz zusammengefasst, wird beispielsweise das Mch2-Isoform-Protein oder ein immunogenes Fragment davon Mäusen injiziert. Die Milz der Maus wird entfernt, die Milzzellen werden isoliert und mit immortalisierten Mäusezellen fusioniert. Die hybriden Zellen oder Hybridome werden kultiviert und es werden jene Zellen, die Antikörper sekretieren, selektiert. Die Antikörper werden analysiert und es wird, wenn festgestellt wird, dass sie spezifisch an die Mch2-Isoform binden, das Hybridom, das diese produziert, kultiviert, um einen kontinuierlichen Nachschub an Antikörpern zu produzieren.

Unter Verwendung von Standardtechniken und leicht erhältlichen Ausgangsmaterialien kann ein Nukleinsäuremolekül, das jede der Mch2-Isoformen kodiert, aus einer cDNA-Bibliothek unter Verwendung von Sonden oder Primern, die unter Verwendung der in SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 offenbarten Nukleocidsequenzinformation gestaltet sind, isoliert werden. Die Erfindung betrifft ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die eine Mch2-Isoform ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mch2α und Mch2β, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 5 bzw. SEQ ID NO: 7 umfasst, kodiert. In einigen Ausführungsformen besteht das Nukleinsäuremolekül aus einer Nukleotidsequenz, die Mch2α oder Mch2β kodiert. In einigen Ausführungsformen umfassen die Nukleinsäuremoleküle die Nukleotidsequenz, die aus der kodierenden Sequenz in SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 besteht. In einigen Ausführungsformen besteht das Nukleinsäuremolekül aus der in SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 aufgeführten Nukleotidsequenz. Die isolieren Nukleinsäuremoleküle der Erfindung sind nützlich, um Konstrukte und rekombinante Expressionssysteme für die Herstellung der Mch2- Isoformen der Erfindung herzustellen.

Eine cDNA-Bibliothek kann durch wohlbekannte Techniken erzeugt werden. Ein cDNA-Klon, der eine der aufgeführten Nukleotidsequenzen enthält, wird identifiziert unter Verwendung von Sonden, die mindestens einen Abschnitt der in SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 offenbarten Nukleotidsequenz umfassen. Die Sonden weisen mindestens 16 Nukleotide, vorzugsweise 24 Nukleotide auf. Die Sonden werden verwendet, um die cDNA-Bibliothek unter Verwendung von Standardhybridisierungstechniken zu screenen. Alternativ können genomische Klone unter Verwendung von genomischer DNA aus einer beliebigen menschlichen Zelle als Ausgangsmaterial isoliert werden. Die Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäuremoleküle, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die identisch oder komplementär zu einem Fragment von SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6, das aus mindestens 10 Nukleotiden besteht, ist. In einigen Ausführungsformen bestehen die isolierten Nukleinsäuremoleküle aus einer Nukleotidsequenz, die identisch oder komplementär zu einem Fragment von SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6, das aus mindestens 10 Nukleotiden besteht, ist. In einigen Ausführungsformen umfassen die isolierten Nukleinsäuremoleküle eine Nukleotidsequenz, die identisch oder komplementär zu einem Fragment von SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6, das aus 15-150 Nukleotiden besteht, ist, oder bestehen daraus. In einigen Ausführungsformen umfassen die isolierten Nukleinsäuremoleküle eine Nukleotidsequenz, die identisch oder komplementär zu einem Fragment von SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6, das aus 15-30 Nukleotiden besteht, ist, oder bestehen daraus. Isolierte Nukleinsäuremoleküle, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die identisch oder komplementär zu einen Fragment von SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6, das aus mindestens 10 Nukleotiden besteht, ist, oder daraus bestehen, sind nützlich als Sonden zur Identifizierung von Genen und cDNA-Sequenzen mit SEQ ID NO: 4 bzw. SEQ ID NO: 6, PCR-Primer zur Amplifizierung von Genen und cDNA mit SEQ ID NO: 4 bzw. SEQ ID NO: 6 und Antisense- Moleküle zur Hemmung von Transkription und Translation von Genen bzw. cDNA, die Mch2-Isoformen mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 5 bzw. SEQ ID NO: 7 kodieren.

Die cDNA, die eine Mch2-Isoform kodiert, kann als ein molekularer Marker in Elektrophoreseassays verwendet werden, bei denen cDNA aus einer Probe auf einem Elektrophoresegel aufgetrennt wird und Mch2-Isoform-Sonden verwendet werden, um Banden zu identifizieren, die mit solchen Sonden hybridisieren. Speziell können SEQ ID NO: 4 oder Abschnitte davon oder SEQ ID NO: 6 oder Abschnitte davon als ein molekularer Marker in Elektrophoreseassays verwendet werden, in denen cDNA aus einer Probe auf einem Elektrophoresegel aufgetrennt wird und Mch2- Isoform-spezifische Sonden verwendet werden, um Banden zu identifizieren, die mit diesen hybridisieren, was anzeigt, dass die Bande eine Nukleotidsequenz aufweist, die zu der Sequenz der Sonden komplementär ist. Das als ein Größenmarker bereitgestellte isolierte Nukleinsäuremolekül wird als eine positive Bande aufscheinen, die bekanntermaßen mit den Sonden hybridisiert, und kann folglich als ein Referenzpunkt für die Größe von cDNA, die Mch2α bzw. Mch2β kodiert, verwendet werden. Elektrophoresegele, die in einem solchen Assay nützlich sind, umfassen Standard-Polyacrylamidgele, wie sie in Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Press (1989), das in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben sind.

Die Nukleotidsequenzen in SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 6 können verwendet werden, um Sonden, Primer und komplementäre Moleküle zu gestalten, die spezifisch mit den einzigartigen Nukleotidsequenzen von Mch2α bzw. Mch2β hybridisieren. Sonden, Primer und komplementäre Moleküle, die spezifisch mit einer Nukleotidsequenz, die Mch2α und Mch2β kodiert, hybridisieren, können durch normal qualifizierte Fachleute auf diesem Gebiet routinemäßig gestaltet werden.

Die Erfindung umfasst auch markierte Oligonukleotide, die als Sonden für die Ausführung von Oligonukleotidhybridisierungsmethoden zur Identifizierung von Mch2α und Mch2β nützlich sind. Dementsprechend umfasst die Erfindung Sonden, die markiert und mit einzigartigen Nukleotidsequenzen von Mch2α und Mch2β hybridisiert werden können. Die markierten Sonden der Erfindung sind mit radioaktiv markierten Nukleotiden markiert oder sind auf andere Weise durch leicht erhältliche nicht-radioaktive Detektionssysteme detektierbar. In einigen bevorzugten Ausführungsformen umfassen Sonden Oligonukleotide, die aus zwischen 10 und 100 Nukleotiden bestehen. In einigen Bevorzugten umfassen Sonden Oligonukleotide, die aus zwischen 10 und 50 Nukleotiden bestehen. In einigen Bevorzugten umfassen Sonden Oligonukleotide, die aus zwischen 12 und 20 Nukleotiden bestehen. Die Sonden enthalten vorzugsweise eine Nukleotidsequenz, die vollständig identisch oder komplementär zu einem Fragment einer einzigartigen Nukleotidsequenzen von Mch2α und Mch2β ist.

Durch normal qualifizierte Fachleute auf diesen Gebiet wird die PCR-Technik routinemäßig ausgeführt und ihre Verwendungen in der Diagnostik sind wohlbekannt und akzeptiert. Verfahren zur Ausführung der PCR-Technik werden offenbart in "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Innis, M. A., et al., Hrsg., Academic Press, Inc. San Diego, CA (1990). Anwendungen der PCR-Technik werden offenbart in "Polymerase Chain Reaction", Erlich, H. A., et al., Hrsg., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). Einige einfache Regeln helfen bei der Gestaltung von effizienten Primern. Typische Primer sind 18-28 Nukleotide lang mit einer Zusammensetzung von 50 bis 60% g+c. Vorzugsweise ist der vollständige Primer komplementär zu der Sequenz, mit der er hybridisieren muss. Primer erzeugen vorzugsweise PCR-Produkte von 100 Basenpaaren bis 2000 Basenpaaren. Es ist jedoch möglich, Produkte von 50 Basenpaaren bis zu 10 kb und mehr zu erzeugen.

Die PCR-Technik erlaubt die schnelle Erzeugung einer Mehrzahl von Kopien von Nukleotidsequenzen, indem 5'- und 3'-Primer, die mit Sequenzen, die in einem Nukleinsäuremolekül vorhanden sind, hybridisieren, bereitgestellt werden und des weiteren freie Nukleotide und ein Enzym, das die zu der Nukleotidsequenz zwischen den Primern komplementären Basen mittels der freien Nukleotide auffüllt, wodurch einer komplementärer DNA- Strang erzeugt wird, bereitgestellt werden. Das Enzym wird die an die Primer angrenzenden komplementären Sequenzen auffüllen. Wenn sowohl der 5'-Primer als auch der 3'-Primer mit Nukleotidsequenzen auf den komplementären Strängen desselben Nukleinsäurefragments hybridisieren, resultiert eine exponentielle Amplifizierung eines spezifischen doppelsträngigen Produkts. Wenn nur ein einzelner Primer mit den Nukleinsäuremolekül hybridisiert, erzeugt eine lineare Amplifizierung einzelsträngige Produkte von variabler Länge.

Ein normal qualifizierter Fachmann auf diesem Gebiet kann das Nukleinsäuremolekül, das Mch2α oder Mch2β kodiert, isolieren und dieses in einen Expressionsvektor insertieren, indem Standardtechniken und leicht erhältliche Ausgangsmaterialien verwendet werden.

Die Erfindung betrifft einen rekombinanten Expressionsvektor, der eine Nukleotidsequenz umfasst, die Mch2α oder Mch2β, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 5 bzw. SEQ ID NO: 7 umfasst, kodiert. Wie hier verwendet, soll sich der Begriff "rekombinanter Expressionsvektor" auf ein Plasmid, einen Phagen, ein Viruspartikel oder einen andersartigen Vektor beziehen, das bzw. der, wenn es bzw. er in einen geeigneten Wirt eingeschleust wird, die erforderlichen genetischen Elemente enthält, um die Expression der kodierenden Sequenz, die die Mch2- Isoformen der Erfindung kodiert, zu dirigieren. Die kodierende Sequenz ist in funktionsfähiger Weise oder operativ mit den erforderlichen regulatorischen Sequenzen verknüpft. Expressionsvektoren sind wohlbekannt und leicht erhältlich. Beispiele von Expressionsvektoren umfassen Plasmide, Phagen, virale Vektoren und andersartige Nukleinsäuremoleküle oder ein Nukleinsäuremolekül, das Vehikel enthält, die nützlich sind, um Wirtszellen zu transformieren und die Expression von kodierenden Sequenzen zu vereinfachen. In einigen Ausführungsformen umfasst der rekombinante Expressionsvektor die in SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargelegte Nukleotidsequenz. Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung sind nützlich, um Wirte zu transformieren, um rekombinante Expressionssysteme für die Herstellung der Mch2-Isoformen der Erfindung herzustellen.

Die Erfindung betrifft eine Wirtszelle, die den rekombinanten Expressionsvektor umfasst, der eine Nukleotidsequenz umfasst, die eine Mch2-Isoform, die SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 umfasst, kodiert. In einigen Ausführungsformen umfasst die Wirtszelle einen rekombinanten Expressionsvektor, der SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 umfasst. Wirtszellen für eine Verwendung in wohlbekannten rekombinanten Expressionssystemen für die Produktion von Proteinen sind wohlbekannt und leicht erhältlich. Beispiele von Wirtszellen umfassen Bakterienzellen, wie E. coli, Hefezellen, wie S. cerevisiae, Insektenzellen, wie S. frugiperda, nicht-menschliche Säugetier-Gewebekulturzellen Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO) und menschliche Gewebekulturzellen, wie HeLa-Zellen.

Die Erfindung betrifft ein transgenes nicht-menschliches Säugetier, das den rekombinanten Expressionsvektor umfasst, der eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die die Mch2-Isoform, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 umfasst, kodiert. Transgene nicht-menschliche Säugetiere, die zur Herstellung von rekombinanten Proteinen nützlich sind, sind wohlbekannt ebenso wie die erforderlichen Expressionsvektoren und die Techniken zur Erzeugung von transgenen Tieren. Allgemein umfasst das transgene Tier einen rekombinanten Expressionsvektor, in dem die Nukleotidsequenz, die eine Mch2- Isoform der Erfindung kodiert, funktionsfähig oder operativ mit einem Mammazellen-spezifischen Promotor verknüpft ist, wodurch die kodierende Sequenz nur in Mammazellen exprimiert wird und das so exprimierte rekombinante Protein aus der Milch des Tiers gewonnen wird. In einigen Ausführungsformen ist die kodierende Sequenz, die eine Mch2-Isoform kodiert, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6.

In einigen Ausführungsformen kann ein normal qualifizierter Fachmann auf diesem Gebiet unter Verwendung wohlbekannter Techniken solche DNA-Moleküle beispielsweise in einen kommerziell erhältlichen Expressionsvektor für eine Verwendung in wohlbekannten Expressionssystemen insertieren. Beispielsweise kann das kommerziell erhältliche Plasmid pSE420 (Invitrogen, San Diego, CA) für die Produktion von Collagen in E. coli verwendet werden. Das kommerziell erhältliche Plasmid pYES2 (Invitrogen, San Diego, CA) kann beispielsweise für die Produktion in S. cerevisiae-Hefestämmen verwendet werden. Das kommerziell erhältliche vollständige Baculovirus-Expressionssystem MAXBACTM (Invitrogen, San Diego, CA) kann beispielsweise für eine Produktion in Insektenzellen verwendet werden. Das kommerziell erhältliche Plasmid pcDNA I (Invitrogen, San Diego, CA) kann beispielsweise für eine Produktion in Säugetierzellen, wie Eierstockzellen des chinesischen Hamsters, verwendet werden. Ein normal qualifizierter Fachmann auf diesem Gebiet kann diese kommerziellen Expressionsvektoren und -systeme oder andere verwenden, um eine Mch2-Isoform der Erfindung unter Verwendung von Routinetechniken und leicht erhältlichen Ausgangsmaterialien zu produzieren. (Siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Press (1989), das in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird). Folglich können die gewünschten Proteine sowohl in prokaryotischen als auch eukaryotischen Systemen hergestellt werden, was zu einem Spektrum von prozessierten Formen des Proteins führt.

Ein normal qualifizierter Fachmann auf diesem Gebiet kann andere kommerziell erhältliche Expressionsvektorer und -systeme verwenden oder Vektoren unter Verwendung von wohlbekannten Methoden und leicht erhältlichen Ausgangsmaterialien herstellen. Expressionssysteme, die die erforderlichen Kontrollsequenzen, wie Promotoren und Polyadenylierungssignale und vorzugsweise Verstärkersequenzen (Enhancer) enthalten, sind für eine Vielzahl von Wirten leicht erhältlich und in diesem Fachgebiet bekannt. Siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Press (1989).

Es steht jetzt auch ein breites Spektrum von eukaryotischen Wirten für die Produktion von rekombinanten Fremdproteinen zur Verfügung. Wie bei Bakterien können eukaryotische Wirte mit Expressionsystemen, die das gewünschte Protein direkt produzieren, transformiert werden; häufiger aber werden Signalsequenzen bereitgestellt, um die Sekretion des Proteins zu bewirken. Eukaryotische Systeme haben den zusätzlichen Vorteil, dass sie in der Lage sind, Introns, die in den genomischen Sequenzen, die Proteine von höheren Organismen kodieren, auftreten können, zu prozessieren. Eukaryotische Systeme stellen auch verschiedene Prozessierungsmechanismen bereit, die beispielsweise zur Glycosylierung, carboxyterminalen Amidierung, Oxidation oder Derivatisierung von bestimmten Aminosäureresten, Konformationskontrolle u. s. w. führen.

Üblicherweise verwendete eukaryotische Systeme umfassen Hefe, Pilzzellen, Insektenzellen, Säugetierzellen, Vogelzellen und Zellen von höheren Pflanzen, sind aber nicht auf diese beschränkt. Es stehen geeignete Promotoren zur Verfügung, die für eine Verwendung in jedem dieser Wirtstypen verträglich (kompatibel) und funktionsfähig sind, ebenso wie Terminationssequenzen und Verstärkungssequenzen (Enhancer), z. B. der Baculovirus-Polyhedronpromotor. Wie oben können Promotoren entweder konstitutiv oder induzierbar sein. In Säugetiersystemen kann beispielsweise der Maus-Metallothioneinpromotor durch die Zugabe von Schwermetallionen induziert werden.

Die Einzelheiten für die Konstruktion von Expressionssystemen, die für gewünschte Wirte geeignet sind, sind den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt. Kurz zusammengefasst, wird für eine rekombinante Produktion des Proteins die das Polypeptid kodierende DNA in geeigneter Weise in den Expressionsvektor der Wahl ligiert. Die DNA wird funktionsfähig oder operativ mit allen regulatorischen Elementen verknüpft, die für eine Expression der DNA in dem ausgewählten Wirt erforderlich sind. Ein normal qualifizierter Fachmann auf diesem Gebiet kann unter Verwendung von wohlbekannten Techniken Expressionsvektoren für eine rekombinante Produktion des Polypeptids herstellen.

Der Expressionsvektor, der die DNA, die die Mch2-Isoform kodiert, umfasst, wird verwendet, um den kompatiblen Wirt zu transformieren, der dann kultiviert und unter Bedingungen gehalten wird, unter denen die Expression der fremden DNA stattfindet. Das so produzierte Protein der Erfindung wird aus der Kultur entweder durch Lysieren der Zellen oder aus dem Kulturmedium, wie geeignet und den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt, gewonnen. Ein normal qualifizierter Fachmann auf diesem Gebiet kann unter Verwendung von wohlbekannten Techniken die Mch2-Isoform, die unter Verwendung solcher Expressionsysteme produziert wird, isolieren. Die Verfahren zum Reinigen von Mch2-Isoformen aus natürlichen Quellen unter Verwendung von Antikörpern, die spezifisch an die Mch2-Isoform binden, wie oben beschrieben, können gleichermaßen für das Reinigen von Mch2-Isoformen, die durch die Technik der in vitro-DNA- Rekombination produziert worden sind, angewendet werden.

Beispiele von genetischen Konstrukten umfassen die die Mch2- Isoform kodierende Sequenz funktionsfähig oder operativ verknüpft mit einem Promotor, der in der Zelllinie, die mit den Konstrukten transfiziert wird, funktionsfähig ist. Beispiele von konstitutiven Promotoren umfassen Promotoren aus dem Zytomegalievirus oder SV40. Beispiele von induzierbaren Promotoren umfassen Maus-Mamma-Leukämievirus- oder -Metallothioneinpromotoren. Die normal qualifizierten Fachleute auf diesem Gebiet können ausgehend von leicht erhältlichen Ausgangsmaterialien leicht genetische Konstrukte herstellen, die für das Transfizieren von Zellen mit DNA, die eine Mch2-Isoform kodiert, nützlich sind. Solche Genkonstrukte sind für die Produktion der Mch2-Isoform nützlich.

In einigen Ausführungsformen der Erfindung werden transgene nicht-menschliche Tiere erzeugt. Die erfindungsgemäßen transgenen Tiere enthalten SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 unter der regulatorischen Kontrolle eines Mamma-spezifischen Promotors. Ein normal qualifizierter Fachmann auf dem Gebiet kann unter Verwendung von Standardtechniken, wie jenen, die in dem am 10. Oktober 1989 an Wagner erteilten U.S.-Patent Nr. 4,873,191 und dem am 12. April 1988 an Leder erteilten U.S.-Patent Nr. 4,736,866, die beide in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen werden, gelehrt werden, transgene Tiere erzeugen, die die Mch2-Isoform produzieren. Bevorzugte Tiere sind Nagetiere, insbesondere Ziegen, Ratten und Mäuse.

Zusätzlich zur Produktion dieser Proteine durch Rekombinationstechniken können auch automatisierte Peptidsynthetisierapparate eingesetzt werden, um Mch2-Isoformen der Erfindung herzustellen. Solche Techniken sind den normal qualifizierten Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt und sind nützlich im Falle von Derivaten, die Substitutionen aufweisen, die bei einer DNA-kodierten Proteinproduktion nicht vorgesehen sind.

Mch2β ist inaktiv. Mch2-Aktivität kann auf diese Weise reguliert werden, d. h. Mch2β kann mit Mch2α in Wettbewerb treten (kompetitieren) und erhöhte Konzentrationen an Mch2β können die Mch2-Gesamtaktivität verringern. Die biologische Signifikanz der Expression einer alternativ gespleißten Mch2-Isoform wird anhand ihrer Fähigkeit, die Mch2-Aktivität zu modulieren, realisiert.

Dementsprechend kann Mch2β als Arzneimittel verwendet werden, um die Mch2β-Aktivität, die an der Apoptose beteiligt ist, zu hemmen. In ähnlicher Weise können Nukleinsäuremoleküle, die Mch2β kodieren, als Teil von pharmazeutischen Zusammensetzungen für eine Gentherapie verwendet werden. Durch Apoptose charakterisierte Krankheiten umfassen eine HIV-Infektion und Alzheimer'-Krankheit. Die normal qualifizierten Fachleute auf diesem Gebiet können unter Verwendung von Standard-Diagnosetechniken leicht Individuen identifizieren, von denen vermutet wird, dass sie unter solchen Krankheiten, Leiden und Störungen leiden.

Mch2α kann als ein Arzneimittel verwendet werden, um Apoptose in Zellen, deren Eliminierung wünschenswert ist, zu induzieren. In ähnlicher Weise können Nukleinsäuremoleküle, die Mch2α kodieren, als Teil von pharmazeutischen Zusammensetzungen für eine Gentherapie verwendet werden. Krankheiten, bei denen eine Eliminierung von Zellen durch Induktion von Apoptose, umfassen Krebs und Autoimmunerkrankungen. Die normal qualifizierten Fachleute auf diesem Gebiet können unter Verwendung von Standard-Diagnosetechniken leicht Individuen identifizieren, von denen vermutet wird, dass sie unter solchen Krankheiten, Leiden und Störungen leiden.

Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß der Erfindung umfassen einen pharmazeutisch akzeptablen Träger in Kombination mit Mch2α oder Mch2β. Pharmazeutische Formulierungen sind wohlbekannt und pharmazeutische Zusammensetzungen, die Mch2α oder Mch2β umfassen, können routinemäßig durch einen normal qualifizierten Fachmann auf diesem Gebiet formuliert werden. Geeignete pharmazeutische Träger sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, einem Standardreferenztext auf diesem Gebiet, der in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben. Die Erfindung betrifft eine injizierbare pharmazeutische Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und Mch2α oder Mch2β umfasst. Einige Ausführungsformen der Erfindung betreffen injizierbare pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 umfassen. Mch2α oder Mch2β ist vorzugsweise steril und mit einem sterilen pharmazeutischen Träger kombiniert.

In einigen Ausführungsformen kann Mch2α oder Mch2β beispielsweise als eine Lösung, Suspension, Emulsion oder als lyophilisiertes Pulver in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Vehikel formuliert werden. Beispiele von solchen Trägern oder Vehikeln sind Wasser, Kochsalzlösung, Ringer-Lösung, Dextroselösung und 5% menschliches Serumalbumin. Liposome und nicht-wässrige Vehikel, wie nicht-flüssige oder fette Öle, können ebenfalls verwendet werden. Das Vehikel oder das lyophilisierte Pulver können Additive enthalten, die Isotonie (z. B. Natriumchlorid, Mannitol) und chemische Stabilität (z. B. Puffer und Konservierungsmittel) bewahren. Die Formulierung wird durch üblicherweise verwendete Techniken sterilisiert.

Eine injizierbare Zusammensetzung kann Mch2α oder Mch2β in einem Verdünnungsmittel, wie beispielsweise sterilem Wasser, Elektrolyten/Dextrose, Fettölen pflanzlichen Ursprungs, Fettestern oder Polyolen, wie Propylenglykol und Polyethylenglykol, umfassen. Das injizierbare Präparat muss steril und frei von Pyrogenen sein.

Nukleinsäuremoleküle, die Mch2α oder Mch2β kodieren, können unter Verwendung einer beliebigen von verschiedenen Abgabekomponenten, wie rekombinanten viralen Expressionsvektoren oder anderen geeigneten Abgabemitteln, so dass deren Einschleusung und Expression in kompatiblen Wirtszellen bewirkt wird, abgegeben werden. Virale Vektoren können allgemein DNA-Viren, wie rekombinante Adenoviren und rekombinante Vacciniaviren, oder RNA-Viren, wie rekombinante Retroviren, sein. Andere rekombinante Vektoren umfassen rekombinante Prokaryoten, die Zellen infizieren und rekombinante Gene exprimieren können. Zusätzlich zu rekombinanten Vektoren werden auch andere Abgabekomponenten in Betracht gezogen, wie eine Verkapselung in Liposomen, eine Transferrin-vermittelte Transfektion und andere Rezeptor-vermittelte Maßnahmen. Die Erfindung soll solche anderen Formen von Expressionsvektoren und andere Abgabemittel oder -maßnahmen, die äquivalenten Funktionen dienen und die in diesem Fachgebiet nachfolgend hierzu bekannt werden, mit umfassen.

In einer Ausführungsform der Erfindung wird DNA an kompetente Wirtszellen mittels eines Adenovirus abgegeben. Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird diese Technik zum Abgeben von DNA an eine Wirtszelle durch solche Mittel leicht verstehen. Obwohl die Erfindung vorzugsweise Adenoviren umfasst, soll die Erfindung ein jegliches Virus, das äquivalenten Funktionen dient, umfassen.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird RNA an kompetente Wirtszellen mittels eines Retrovirus abgegeben. Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird diese Technik zum Abgeben von RNA an eine Wirtszelle durch solche Mittel leicht verstehen. Ein jegliches Retrovirus, das dazu dient, das von der RNA kodierte Protein zu exprimieren, soll von der Erfindung umfasst sein.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird Nukleinsäure mittels des Folatrezeptors abgegeben. Die an eine Zelle abzugebende Nukleinsäuresequenz wird mit Polylysin verknüpft und der Komplex wird an Zellen mittels des Folatrezeptors abgegeben. Das am 28. April 1992 an Low et al. erteilte U.S.- Patent 5,108,921, das in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, beschreibt solche Abgabekomponenten.

Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen Abgabekomponenten in Kombination mit Nukleinsäuremolekülen, die Mch2α oder Mch2β kodieren, welche ferner pharmazeutisch akzeptable Träger oder Vehikel, wie beispielsweise Kochsalzlösung, umfassen. Es kann ein jegliches Medium verwendet werden, das eine erfolgreiche Abgabe der Nukleinsäure ermöglicht. Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird leicht die Vielzahl von pharmazeutisch akzeptablen Medien, die in der Erfindung verwendet werden können, erfassen.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können durch ein jegliches Mittel oder eine jegliche Maßnahme, das bzw. die es ermöglicht, dass das aktive Mittel den Wirkort des Mittels im Körper eines Säugetiers erreicht, verabreicht werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen können parenteral, d. h. intravenös, subkutan, intramuskulär verabreicht werden. Eine intravenöse Verabreichung ist die bevorzugte Route.

Die Dosierung variiert abhängig von bekannten Faktoren, wie den pharmakodynamischen Eigenschaften des speziellen Mittels und dessen Verabreichungsweise und -weg; Alter, Gesundheit und Gewicht des Empfängers; Natur und Ausmaß der Symptome, Art einer gleichzeitig erfolgenden Behandlung, Häufigkeit der Behandlung und der gewünschten Wirkung.

Gemäß einem Aspekt der Erfindung können Verbindungen gescreent werden, um Mch2α-Inhibitoren, -Aktivatoren oder -Substrate zu identifizieren. Inhibitoren von Mch2α sind als Anti-Apoptose- Mittel nützlich. Aktivatoren von Mch2α sind als zytotoxische Mittel nützlich. Substrate von Mch2α sind als Reagenzien in Assays zum Screenen von Verbindungen mit Mch2α-Aktivität nützlich.

Inhibitoren von Mch2α können durch Screenen von Verbindungen, um deren Wirkung auf die Mch2α-Aktivität sicherzustellen, identifiziert werden. In einigen Ausführungsformen der Erfindung werden Verbindungen gescreent, um Inhibitoren zu identifizieren, indem Mch2α an Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung abgegeben wird. Unter Assaybedingungen werden die Zellen in Abwesenheit von Testverbindung apoptotisch werden. Wenn in Gegenwart der Testverbindung die Zellen nicht apoptotisch werden, ist die Testverbindung eine Mch2α- Inhibitor-Kandidatenverbindung. Antikörper, die die Mch2α-Aktivität hemmen, sind als Inhibitoren und dementsprechend als Positivkontrollen in dem Assay nützlich. In einigen Ausführungsformen wird das Mch2α an die Zelle als ein Protein abgegeben. In einigen Ausführungsformen wird das Mch2α an die Zelle als ein Nukleinsäuremolekül, das das Protein kodiert, abgegeben. In einigen Ausführungsformen der Erfindung werden Verbindungen gescreent, um Inhibitoren zu identifizieren, indem Mch2α mit einem Substrat in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wird. Unter Assaybedingungen wird das Substrat in Abwesenheit von Testverbindung gespalten. Wenn das Substrat in Gegenwart der Testverbindung nicht prozessiert wird, aber unter den Negativkontroll-Bedingungen, bei denen die Testverbindung nicht anwesend ist, prozessiert wird, ist die Testverbindung ein Inhibitor von Mch2α. Die normal qualifizierten Fachleute auf diesem Gebiet können leicht nachweisen, ob Substrat prozessiert worden ist oder nicht. Antikörper, die die Mch2α-Aktivität hemmen, sind als Inhibitoren und dementsprechend als Positivkontrollen in dem Assay nützlich.

Aktivatoren von Mch2α können identifiziert werden, indem Verbindungen gescreent werden, um deren Wirkung auf die Mch2α-Aktivität sicherzustellen. In einigen Ausführungsformen der Erfindung werden Verbindungen gescreent, um Aktivatoren zu identifizieren, indem Mch2α an Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung abgegeben wird. Unter Assaybedingungen werden die Zellen in Abwesenheit von Testverbindung apoptotisch werden. Wenn in Gegenwart der Testverbindung die apoptotische Aktivität verstärkt, vervielfacht oder beschleunigt wird, ist die Testverbindung eine Mch2α-Aktivator-Kandidatenverbindung. In einigen Ausführungsformen wird das Mch2α an die Zelle als ein Protein abgegeben. In einigen Ausführungsformen wird das Mch2α an die Zelle als ein Nukleinsäuremolekül, das das Protein kodiert, abgegeben. In einigen Ausführungsformen der Erfindung werden Verbindungen gescreent, um Aktivatoren zu identifizieren, indem Mch2α mit einem Substrat in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wird. Unter Assaybedingungen wird das Substrat in Abwesenheit von Testverbindung gespalten. Wenn das Substrat schneller oder effizienter prozessiert wird in Gegenwart der Testverbindung verglichen mit dem Ausmaß an Prozessierung, das unter den Kontrollbedingungen, bei denen die Testverbindung nicht anwesend ist, auftritt, ist die Testverbindung ein Aktivator von Mch2α.

Die normal qualifizierten Fachleute auf diesem Gebiet können die Rate, mit der ein Substrat prozessiert worden ist, leicht detektieren.

Wie hier verwendet, soll der Begriff Substrat sich auf ein Peptid beziehen, das durch Mch2α gespalten werden wird. Beispiele von Substraten umfassen das fluorogene ICE-Peptidsubstrat DEVD-AMC (SEQ ID NO: 3) oder ein Peptid, das die gleiche proteolytische Spaltstelle wie das fluorogene Peptidsubstrat DEVD-AMC (SEQ ID NO: 3) aufweist und durch Mch2α gespalten werden wird. Die Erfindung kann Verfahren und Kits zum Identifizieren von anderen Substraten, die durch Mch2α prozessiert werden können, umfassen. Die normal qualifizierten Fachleute auf diesem Gebiet können leicht Substrate, die prozessiert werden, identifizieren.

In einigen Ausführungsformen der Erfindung liegt die bevorzugte Konzentration der Testverbindung zwischen 1 uM und 500 uM. Eine bevorzugte Konzentration ist 10 ptM bis 100 uM. Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen ist es wünschenswert, eine Reihe von Verdünnungen von Testverbindungen zu verwenden.

Es werden Kits mit umfasst, die Behälter mit Reagenzien, die für das Screenen von Testverbindungen notwendig sind, umfassen. Solche Kits enthalten Mch2α und/oder ein Nukleinsäuremolekül, das Mch2α kodiert, und Anweisungen zum Ausführen des Assays. Kits können Zellen oder ein Substrat, wie das fluorogene Peptidsubstrat DEVD-AMC (SEQ ID NO: 3), und ein Mittel, um prozessiertes Substrat von ungespaltenem Substrat zu unterscheiden, umfassen. Gegebenenfalls wird Mch2β und/oder ein Nukleinsäuremolekül, das Mch2β kodiert, als eine Kontrolle bereitgestellt und/oder es werden anti-Mch2α-Antikörper als eine Kontrolle bereitgestellt.

Die Mittel zur Unterscheidung von prozessiertem Substrat von ungespaltenem Substrat umfassen beispielsweise Antikörper, die an prozessiertes Substrat, nicht aber ungespaltenes Substrat binden, Antikörper, die an ungespaltenes Substrat, nicht aber prozessiertes Substrat binden, und Freisetzungsassay-Reagenzien, bei markiertes ungespaltenes Substrat an eine feste Phase gebunden wird und die Markierung nach einer Prozessierung des Substrats durch das Enzym von der festen Phase freigesetzt wird, zu welchem Zeitpunkt sie entweder als ungebunden nachgewiesen wird oder ihr Fehlen von dem gebundenen Material nachgewiesen wird. Die normal qualifizierten Fachleute auf diesem Gebiet können leicht Kits gestalten, um die Assays der Erfindung praktisch auszuführen und das Vermögen von Testverbindungen, Mch2α-Aktivität zu hemmen, zu messen. Inhibitoren sind als Anti-Apoptose-Mittel nützlich. Aktivatoren sind als Apoptosemittel nützlich.

Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung werden transgene Tiere, insbesondere transgene Mäuse, erzeugt. In einigen Ausführungsformen enthalten die erfindungsgemäßen transgenen Tiere ein Nukleinsäuremolekül, das Mch2 kodiert. Solche transgenen Mäuse können als Tiermodelle verwendet werden für die Untersuchung der Überexpression von Mch2 und für eine Verwendung bei der Arzneimittelauswertung und bei Entdeckungsbemühungen, um Verbindungen zu finden, die wirksam sind, um die Aktivität von Mch2 zu hemmen oder zu modulieren. Ein normal qualifizierter Fachmann auf diesem Gebiet kann unter Verwendung von Standardtechniken, wie jenen, die in dem am 10. Oktober 1989 an Wagner erteilten U.S.-Patent Nr. 4,873,191 und dem am 12. April 1988 an Leder erteilten U.S.-Patent Nr. 4,736,866, von denen beide in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen werden, gelehrt werden, transgene Tiere, die das Mch2 produzieren, herstellen und die Tiere bei der Arzneimittelauswertung und bei Nachweisprojekten verwenden.

Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft "Knock-out"-Mäuse und Verfahren zur Verwendung von diesen. Es können insbesondere transgene Mäuse erzeugt werden, die hinsichtlich eines mutierten, nicht-funktionellen Mch2-Gens, das in diese unter Verwendung von wohlbekannten Techniken eingeschleust wird, homozygot sind. Die Mäuse produzieren kein funktionsfähiges Mch2 und sind nützlich, um die Funktion von Mch2 zu studieren. Darüber hinaus können die Mäuse in Assays verwendet, werden, um die Wirkung von Testverbindungen auf einen Mch2-Mangel zu untersuchen. Die Mäuse mit Mch2-Mangel können verwendet werden, um zu bestimmen, ob, wie und in welchem Ausmaß sich Mch2-Inhibitoren auf das Tier auswirken werden, und dadurch Befürchtungen ansprechen, die mit dem Hemmen der Aktivität des Moleküls verbunden sind.

Verfahren zur Erzeugung von genetisch defizienten "knock out"- Mäusen sind wohlbekannt und werden in Capecchi, M. R. (1989) Science 244: 1288-1292, und Li, P. et al. (1995) CELL 80: 401- 411, die jeweils in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen werden, offenbart. Der menschliche Mch2-cDNA-Klon kann verwendet werden, um einen genomischen Maus-Mch2-Klon zu isolieren. Der genomische Klon kann verwendet werden, um ein Mch2 zielgerichtet ansteuerndes Konstrukt (Mch2-"Targeting"-Konstrukt) herzustellen, das das Mch2-Gen in der Maus durch homologe Rekombination zerstören kann.

Das "Targeting"-Konstrukt enthält einen nicht-funktionsfähigen Abschnitt des Mch2-Gens, der sich anstelle des funktionsfähigen Abschnitts des nativen Mäusegens insertiert. Das nicht- funktionsfähige Insert enthält im allgemeinen eine Insertion in dem Exon, das das aktive Zentrum von Mch2 kodiert. Das "Targeting"-Konstrukt kann Marker sowohl für eine positive als auch negative Selektion enthalten. Der positive Selektionsmarker ermöglicht die selektive Eliminierung von Zellen ohne diesen, während der negative Selektionsmarker die Eliminierung von Zellen, die diesen tragen, ermöglicht.

Ein erster selektierbarer Marker ist beispielsweise ein positiver Marker, der das Überleben von Zellen, die diesen tragen, ermöglichen wird. In einigen Ausführungsformen ist der erste selektierbare Marker ein Antibiotikum-Resistenzgen, wie das Neomycinresistenzgen, kann innerhalb der kodierenden Sequenzen des Mch2-Gens plaziert werden, um dieses nicht-funktionsfähig zu machen, während zusätzlich das Konstrukt selektierbar gemacht wird. Das Antibiotikumresistenzgen liegt innerhalb der homologen Region, die mit nativen Sequenzen rekombinieren kann. Folglich werden bei einer homologen Rekombination die nicht-funktionsfähigen und selektierbaren Antibiotikumresistenzgen-Sequenzen aufgenommen werden.

Das "Targeting"-Konstrukt enthält auch einen zweiten selektierbaren Marker, der ein negativer selektierbarer Marker ist. Zellen mit dem negativen selektierbaren Marker werden eliminiert werden. Der zweite selektierbare Marker befindet sich außerhalb des Rekombinationsbereichs. Folglich werden, wenn das gesamte Konstrukt in der Zelle vorhanden ist, beide Marker vorhanden sein. Wenn das Konstrukt mit nativen Sequenzen rekombiniert hat, wird der erste selektierbare Marker in das Genom eingebaut werden und der zweite wird verlorengehen. Das Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase (HSV tk)-Gen ist ein Beispiel eines negativen selektierbaren Markers, der als ein zweiter Marker verwendet werden kann, um Zellen, die diesen tragen, zu eliminieren. Zellen mit dem HSV-tk-Gen werden in Gegenwart von Gangcyclovir selektiv getötet.

Zellen werden mit "Targeting"-Konstrukten transfiziert und dann hinsichtlich der Anwesenheit des ersten Selektionsmarkers und des Fehlens des Zweiten selektiert. Klone werden dann in die Blastozysten injiziert und in scheinschwangere Weibchen implantiert. Chimäre Nachkommenschaft, die in der Lage ist, die rekombinanten Gene in ihrer Keimbahn weiterzugeben, werden ausgewählt, gepaart und ihre Nachkommenschaft wird hinsichtlich heterozygoten Trägern der rekombinierten Gene untersucht. Ein Paaren der heterozygoten Nachkommenschaft kann dann verwendet werden, um vollständig homozygote Nachkommenschaft, die die "Knock-out"-Maus mit Mch2-Mangel darstellt, zu erzeugen.

die Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zur Hemmung der Expression von Mch2 in Zellen. In einer Ausführungsform werden Antisense-Oligonukleotide bereitgestellt, die eine Nukleotidsequenz haben, die zu einer Nukleotidsequenz von mRNA, die Mch2 kodiert, komplementär ist.

Die Antisense-Oligonukleotide der Erfindung umfassen Sequenzen, die zu Bereichen von Mch2-mRNA komplementär sind. Die Oligonukleotide umfassen eine Sequenz, die zu einem aus der Sequenz von Mch2-mRNA ausgewählten Bereich komplementär ist. Die Antisense-Oligonukleotide umfassen einzelsträngige DNA- Sequenz und ein ausgehend von einem Expressionsvektor produziertes Antisense-RNA-Oligonukleotid. Jedes der Antisense- Oligonukleotide der Erfindung ist komplementär zu Bereichen der Mch2-mRNA-Sequenz.

Die Antisense-Oligonukleotide der Erfindung umfassen eine Sequenz, die zu einem Fragment von SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 komplementär ist. Siehe Ullrich et al., EMBO J., 1986, 5: 2503, die in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird. Von dieser Definition mit umfasst werden Fragmente von Oligos innerhalb der Mch2 kodierenden Sequenz. Oligonukleotide sind vorzugsweise komplementär zu einer Nukleotidsequenz, die 5-50 Nukleotide, in einigen Ausführungsformen 8-40, mehr bevorzugt 12-25 Nukleotide, in einigen Ausführungsformen 10-15 Nukleotide und in einigen Ausführungsformen 12-20 Nukleotide lang ist.

Zusätzlich werden auch Fehlpaarungen innerhalb der oben identifizierten Sequenzen, die die Verfahren der Erfindung erzielen, so dass die fehlgepaarten Sequenzen im wesentlichen komplementär zu den Mch2-Sequenzen sind, im Umfang der Offenbarung mit berücksichtigt. Fehlpaarungen, die substantielle Komplementarität zu den Mch2-Sequenzen ermöglichen, werden den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sein, sind sie erst einmal mit der vorliegenden Offenbarung ausgestattet. Die Oligos können auch unmodifiziert oder modifiziert sein.

Die Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Hemmung von Mch2- Expression in Säugetieren gerichtet, das umfasst, das Säugetier mit einer wirksamen Menge eines Antisense-Oligonukleotids mit einer Sequenz, die zu einem Bereich der Mch2-mRNA komplementär ist, in Kontakt zu bringen.

Verfahren zur Verabreichung der Antisense-Oligos der Erfindung umfassen Techniken, die in diesem Fachgebiet wohlbekannt sind, wie Liposome, Plasmidexpression oder virale Vektoren, einschließlich retroviraler Vektoren, sind allerdings nicht auf diese beschränkt. Bei der Verabreichung von Oligos über Vektoren oder Plasmide wird bevorzugt ein nicht-kodierender RNA- Strang von Mch2 verwendet, um Antisense-RNA-Oligos, die durch die Zelle exprimiert werden, zu produzieren. Die RNA-Oligos binden dann an Mch2-Sinn- oder -kodierende RNA-Sequenzen.

Verfahren zur Verabreichung der Oligos an Säugetiere umfassen Liposome und können in einer Mischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, ausgewählt in Hinblick auf die beabsichtigte Verabreichungsroute und die pharmazeutische Standardpraxis, vorliegen. Zusätzlich können Antikörper, Liganden und ähnliches in die Liposome eingebracht werden, wodurch verschiedene Weisen zur Hemmung der Mch2-Expression bereitgestellt werden. Dosierungen werden in Hinblick auf Gewicht und den klinischen Zustand des Patienten festgelegt werden. Das anteilsmäßige Verhältnis von Wirkstoff zu Träger wird natürlicherweise von der chemischen Natur, Löslichkeit und Stabilität der Verbindungen wie auch von der in Betracht gezogenen Dosierung abhängen. Die Oligos der Erfindung werden für eine Zeitspanne verabreicht werden, die ausreicht, so dass die Säugetiere frei von undifferenzierten Zellen und/oder Zellen mit einem abnormalen Phänotyp sind.

Die Oligos der Erfindung können in dem Verfahren der Erfindung einzeln oder in Kombination mit anderen Verbindung eingesetzt werden. Die zu verabreichende Menge wird auch von solchen Faktoren, wie dem Alter, Gewicht und klinischen Zustand des Patienten abhängen. Siehe Gennaro, Alfonso, Hrsg., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage, 1990, Mack Publishing Co., Easton PA.

Die Verbindungen der Erfindung können über eine jegliche geeignete Route, einschließlich Inokulation und Injektion, beispielsweise intravenöse, orale, intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane, topisch, und durch Absorption durch Epithel- oder Schleimhautauskleidungen, beispielsweise nasale, orale, vaginale, rektale und gastrointestinale, verabreicht werden.

Die Verabreichungsweise der Oligos kann die Orte in dem Organismus, an die die Verbindung abgegeben werden wird, bestimmen. Eine topische Anwendung kann beispielsweise in Cremes, Salben, Gelen, Ölen, Emulsionen, Pasten, Lotionen und ähnlichem verabreicht werden. Die Oligos der Erfindung können allein verabreicht werden oder werden im allgemeinen in einer Mischung mit einem pharmazeutischen Träger, der in Hinblick auf die beabsichtigte Verabreichungsroute und pharmazeutische Standardpraxis ausgewählt wird, verabreicht. Für eine parenterale Verabreichung werden sie am besten in Form von sterilen wässrigen Lösungen, die andere gelöste Stoffe, beispielsweise ausreichend Salze, Glucose oder Dextrose, um die Lösung isotonisch zu machen, enthalten können, verabreicht. Für eine orale Verabreichungsweise kann die Erfindung in Form von Tabletten, Kapseln, Pastillen ("lozenges"), Pastillen ("troches"), Pulvern, Sirupen, Elixiren, wässrigen Lösungen und Suspensionen und ähnlichem verwendet werden. Es können verschiedene Aufschlussmittel, wie Stärke, und Gleitmittel verwendet werden. Für eine orale Verabreichung in Kapselform sind nützliche Verdünnungsmittel Lactose und Polyethylenglykole mit hohem Molekulargewicht. Wenn wässrige Suspensionen für eine orale Verwendung benötigt werden, können bestimmte Süß- und/oder Geschmackstoffe zugesetzt werden. Vierzig ug/ml Antisense-Oligo wurden für in vitro-Methoden zur Bereitstellung von Oligos in Medien für eine Zellvermehrung in Kultur verwendet. Diese Konzentration kann für eine Verwendung in vivo extrapoliert werden. Die Konzentration an Antisense-Oligonukleotiden für eine Verwendung in vivo beträgt ungefähr 40 u/g Körpergewicht. Die in vivo-Verwendung des RNA-Oligonukleotide exprimierenden Expressionsvektors wird durch die Anzahl von transfizierten Zellen bestimmt.

Für eine Verwendung in vivo kann das Antisense-Oligonukleotid mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, wie einem geeigneten flüssigen Träger oder Exzipiens, und einem gegebenenfalls eingesetzten Hilfsadditiv oder Hilfsadditiven kombiniert werden. Die flüssigen Träger und Exzipientien sind konventionell und im Handel erhältlich. Beispiele dafür sind destilliertes Wasser, physiologische Kochsalzlösung, wässrige Dextroselösung und ähnliches. Für eine antineoplastische Verwendung in vivo können die Antisense-Oligonukleotide intravenös verabreicht werden.

Zusätzlich zu einer Verabreichung mit herkömmlichen Trägern können Antisense-Oligonukleotide durch verschiedene spezialisierte Oligonukleotidabgabetechniken verabreicht werden. Oligonukleotide sind beispielsweise erfolgreich in unilamellaren Liposomen verkapselt worden. Rekonstituierte Sendaivirus- Hüllen sind erfolgreich verwendet worden, um RNA und DNA an Zellen abzugeben. Arad et al., Biochem. Biophy. Acta., 1986, 859, 88-94.

BEISPIEL MATERIALIEN UND METHODEN Klonierung von Mch2.

Indem eine PCR-Strategie eingesetzt wurde, die dazu ausgelegt war, um neue Mitglieder der Ced-3/ICE-artigen apoptotischen Cysteinproteasen zu identifizieren und zu klonieren, wurde eine partielle cDNA-Sequenz mit hoher Homologie zu CPP32 und Ced-3 identifiziert. Die neue partielle cDNA wurde als eine Sande verwendet, um die originale menschliche Jurkat-T- Lymphozyten-cDNA-Bibliothek zu screenen. Dies führte zu der Isolierung von mehreren cDNA-Klonen. Die Sequenzen von zwei von diesen Klonen sind in SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 6 gezeigt.

Diese zwei cDNAs werden als die Säugetier-Ced-2-Homologe Mch2α und Mch2β bezeichnet. Mch2α enthält ein offenes Leseraster von 879 bp, das ein Protein von 293 Aminosäuren mit einer vorhergesagten Molekülmasse von ~34 kDa kodiert. Das Initiator- Methionin bei Nukleotid 79 entspricht der Kozak-Consensus- Translationsinitiationssequenz. Mch2β enthält eine Deletion entsprechend den Nukleotiden 119-385 der Mch2α-Sequenz (Aminosäuren 14-102) und es hat eine längere 3'-und translatierte Sequenz.

Die Deletion in Mch2β könnte auf ein alternatives Spleißen der parentalen Mch2-mRNA zurückzuführen sein. Mch2β enthält eine alternative Spleiß-Donor/Akzeptor-Stelle innerhalb von dessen kodierender Sequenz, die der GT/AG-Regel entspricht (bp 119- 385). Diese Stelle befindet sich genau an der Spleißstelle. Eine Northern-Blot-Analyse der Expression von Mch2 enthüllte zwei mRNA-Spezies von ~1,7 kb und ~1,4 kb in den menschlichen 380-Prä-B-Lymphozyten und den menschlichen Jurkat-T-Lymphozyten. Es scheint jedoch einen Unterschied in dem relativen Expressionsniveau jeder mRNA-Spezies in den zwei Zelllinien zu geben und diese könnten die zwei mRNA-Spezies sein, die Mch2α bzw. Mch2β entsprechen.

Mch2β-cDNA behielt ein offenes Leseraster von 612 bp bei, das ein 204 Aminosäuren-Protein mit einer vorhergesagten Molekülmasse von ~23 kDa kodiert. Mch2β fehlt ungefähr die Hälfte von dessen mutmaßlicher p20-Untereinheit und ist wahrscheinlich inaktiv. Die inaktive Isoform könnte die Aktivität des parentalen Enzyms regulieren, indem es als ein dominanter Inhibitor wirkt. Da aktive ICE-artige Cysteinproteasen durch proteolytische Spaltung, gefolgt von einer Heterodimerisierung von deren p20- und p10-Untereinheiten erzeugt werden, könnten inaktive, alternativ gespleißte Isoformen mit diesem Prozess interferieren, indem sie inaktive heteromere Komplexe mit dem parentalen Volllängenenzym bilden.

Mch2 ist eine neue Ced/ICE-artige Cysteinprotease.

Die vorhergesagte Mch2α-Proteinsequenz ist ähnlich zu menschlichem CPP32, dem C. elegans-CED-3-Protein, den Ich-1- (NEDD2) und ICE-Proteinen aus Säugetieren. Das Volllängen-Mch2α-Protein zeigt die höchste Homologie zu CPP32. Insgesamt weisen die Leiden Proteine 38% Identität und 56% Ähnlichkeit auf. Jedoch ist Mch2α wie CPP32 enger mit CED-3 als mit den restlichen Cysteinproteasen verwandt: Mch2α zeigt 35% Identität (56% Ähnlichkeit) mit CED-3, 29% Identität (52% Ähnlichkeit) mit menschlichem Ich-1 und 29% Identität (52% Ähnlichkeit) mit menschlichem ICE. CED-3, ICE oder Ich-1 sind untereinander zu weniger als 29% identisch. Die vorhergesagte Struktur von Mch2α scheint ähnlich zu ICE und CPP32 zu sein. Eine proteolytische Spaltung von Mch2α von Mch2α bei Asp176, Asp175, Asp186 und/oder Asp193 würde zwei Polypeptide erzeugen, die äquivalent zu den p20- und p10-Untereinheiten von ICE und CPP32 sind. Wie CPP32 fehlt Mch2α das lange N-terminale Propeptid, das bei anderen Cysteinproteasen vorhanden ist. Jedoch gibt es drei potentielle Asparaginsäure-Spaltstellen an den Positionen 23, 32 und 40, die verwendet werden könnten, um ein kurzes Propeptid während der Prozessierung von Mch2α zu dem aktiven Enzym zu entfernen. Obwohl Mch2α und CPP32 gleichermaßen mit Ced-3 verwandt sind, ist die mutmaßliche p20-Untereinheit von Mch2α (Aminosäuren 1-179) mit der mutmaßlichen p20-Untereinheit von Ced-3 enger verwandt (36% Identität) als mit: der mutmaßlichen p20-Untereinheit von CPP32 (33% Identität) Wenn die p20- Untereinheit oder deren Äquivalent die Enzymspezifität zum größten Teil bestimmt, dann ist Mch2α folglich funktionell enger mit Ced-3 als mit CPP32 verwandt.

Expression und Autoprozessierung von Mch2, CPP32 und ICE in E. coli.

Um die enzymatische Aktivität von Mch2, CPP32 oder ICE zu bestimmen, wurden diese Enzyme in E. coli als Fusionsproteine mit Glutathion-S-transferase (GST) exprimiert. Ein GST-CPP32- p20-Fusionsprotein, das die Aminosäuren 1-175 von CPP32 enthält, und ein GST-Nichtfusionsprotein wurden als Kontrollen verwendet. Nach Induktion mit IPTG wurden Bakterienextrakte ausgehend von E. coli, die die rekombinanten Fusionsproteine exprimierten, hergestellt. Die Extrakte wurden an Glutathion- Sepharose-Harz absorbiert, mehrere Male gewaschen und dann durch SDS-PAGE analysiert. Die ICEγ-, CPP32- und Mch2α-Präparate, die GST-Fusionsproteine enthielten, lagen in einem Größenbereich von ~28-35 kDa. Die GST-Nichtfusionsproteinkontrolle wanderte als ein ~27-28 kDa-Protein. Obwohl die vorhergesagte Molekülmasse von GST-ICEγ-Fusionsprotein 61,5 kDa beträgt, wurden in dem ICEγ-Präparat zwei Banden von ~28 kDa und ~31 kDa festgestellt. Dies legt nahe, dass ICEγ eine Autoprozessierung ausführen kann, um aktives ICE zu erzeugen, indem das N- terminale GST-Propeptid an einem von zwei Asp-Spaltstellen abgespalten wird. Aps26 von ICEγ, das Asp 119 von ICEα entspricht, ist eine Stelle, die während der ICE-Aktivierung gespalten wird. Eine Spaltung an dieser Stelle würde ein GST- Fusionsprotein mit einer vorhergesagten Molekülmasse von ~29 kDa erzeugen, das der 31 kDa-Bande entsprechen könnte. Eine Spaltung an Asp 3 von ICEγ, obwohl dies keine bekannte ICE- Spaltstelle ist, könnte die 28 kDa-Bande erzeugen (Bahn 2). Ahnlich zu dem GST-ICEγ-Präparat enthalten die GST-CPP32- und GST-Mch2-Präparate kleinere GST-Fusionsprodukte als vorhergesagt. Das GST-CPP32-Fusionsprodukt wandert als ein ~29-30 kDa- Protein. Eine Spaltung an Asp9 oder Asp28 von CPP32 würde Produkte mit vorhergesagten Molekülmassen von ~27,3 kDa bzw. ~29,4 kDa erzeugen. Basierend auf der beobachteten Größe des GST-CPP32-Produkts wird CPP32 mit der höchsten Wahrscheinlichkeit an Asp28 gespalten, obwohl es möglich ist, dass während der CPP32-Autoprozessierung beide Stelle gespalten werden. Anders als das GST-CPP32, das Volllängen-CPP32 enthält, wandert das GST-CPP32-p20-Produkt, das ein verkürztes CPP32 enthält, als ein ~46 kDa-Protein, das mit seiner vorhergesagten Molekülmasse übereinstimmte. Da diesem rekombinanten Protein die p11-Untereinheit (Aminosäuren 176-277) fehlt, ist es inaktiv und führt keine Autoprozessierung durch, um das ~29-30 kDa- GST-CPP32-Spaltprodukt, das beobachtet wird, wenn das Volllängen-CPP32 verwendet wurde, zu erzeugen. Wenn CPP32 an Asp28 gespalten wird, scheint CPP32 dementsprechend aus zwei Untereinheiten von jeweiligen Molekülmassen von 17 kDa und 11 kDa aufgebaut zu sein. Jedoch müssen die genauen Asp-Spaltstellen, die benutzt werden, um aktives CPP32 zu erzeugen, noch durch Aminosäuresequenzierung bestimmt werden. Das GST-Mch2α-Präparat enthält zwei Hauptbanden, die als ~31-32 kDa- und ~34-35 kDa- Proteine wandern. Dies stimmt überein mit einer Spaltung an Asp23, Asp32 oder Asp40 von Mch2α. Diese GST- Mch2α-Spaltprodukte sind größer als das GST-CPP32-Produkt aufgrund der Anwesenheit von zusätzlichen 33 Aminosäuren in dem GST-Mch2α- Fusionskonstrukt, die von der 5'-untranslatierten Region von Mch2α abgeleitet sind. Eine geringfügigere Bande von ~27 kDa ist in diesem Präparat ebenfalls vorhanden, die auf eine Spaltung an einer Stelle nahe dem C-Terminus des GST-Peptids selbst zurückzuführen sein könnte. Die Hauptmenge von GST-Mch2β wurde in E. coli in Einschlusskörpern exprimiert und wurde nicht gespalten.

Analyse der enzymatischen Aktivitäten von Mch2, CPP32 und ICE unter Verwendung von fluorogenen Tetrapeptiden.

Nach der Ermittlung, dass Mch2 und CPP32 in Bakterien eine Autoprozessierung durchführen können, wurden ihre enzymatischen Aktivitäten unter Verwendung von zwei fluorogenen Peptidsubstraten YVAD-AMC (SEQ ID NO: 8) und DEVD-AMC (SEQ ID NO: 3) getestet. Das YVAD (SEQ ID NO: 8)-Pentapeptid ist die ICE-Spaltstelle in pro-IL1β und das DEVD (SEQ ID NO: 9)-Tetrapeptid ist eine in PARP vorhandene Stelle, die durch ein ICE-artiges Protein während der Apoptose gespalten wird. Die enzymatischen Aktivitäten von Mch2α, Mch2β, CPP32 und ICEγ in Gesamtbakterienextrakten ausgehend von Zellen, die diese Enzyme als GST- Fusionsproteine exprimieren, wurden unter Verwendung der YVAD- AMC- (SEQ ID NO: 8) und DEVD-AMC (SEQ ID NO: 3)-Tetrapeptide als Substrate untersucht. Sowohl ICEγ als auch CPP32 waren in der Lage, das YVAD (SEQ ID NO: 10)-Substrat zu spalten, obwohl ICEγ hinsichtlich der Spaltung dieses Substrats ungefähr 3-fach aktiver als CPP32 war. Gegenüber diesem Substrat wurde bei Mch2α oder Mch2β keine nachweisbare enzymatische Aktivität beobachtet. Andererseits waren Mch2α (nicht aber Mch2β), ICEγ und CPP32 in der Lage, das DEVD-Substrat (SEQ ID NO: 9) zu spalten. CPP32 ist gegenüber diesem Substrat viel aktiver als ICEγ oder Mch2α. Unter der Annahme, dass die Bakterienextrakte ähnliche Mengen an jedem Enzym enthalten, wurde festgestellt, dass CPP32 hinsichtlich der Spaltung des DEVD-Substrats (SEQ ID NO: 9) 150-mal aktiver als ICEγ oder Mch2α ist, wie aus der anfänglichen Rate der Reaktionen bestimmt wurde. Die gereinigten GST-Fusionsprodukte oder der GST-Kontrollextrakt wiesen mit keinem der Substrate eine enzymatische Aktivität auf.

Mch2 und CPP32 können PARP spalten.

In apoptotischen Zellen werden nukleäre Proteine, wie PARP, Lamine und die 70 kDa-Proteinkomponente des kleinen nukleären U1-Ribonukleoproteins, spezifisch durch eine unbekannte ICE- artige Cysteinprotease(n) gespalten. Eine Spaltung von menschlichem PARP an der DEVD (SEQ ID NO: 9)-Stelle (Aminosäuren 211- 214) würde ein großes Proteinprodukt mit einer vorhergesagten Molekülmasse von 89,3 kDa (Aminosäuren 215-1014) erzeugen. Es wurde eine Western-Blot-Analyse von menschlichem PARP nach einer Inkubation mit rekombinantem Mch2α, Mch2β, ICEγ oder CPP32 unter Verwendung des 4C10-5-Antikörpers ausgeführt. Dieser Antikörper erkennt ein Epitop in dem C-terminalen 41-kDa- Chymotrypsin-Fragment von PARP. CPP32 spaltete PARP unter Erzeugung einer Hauptbande von ~90 kDa und einer geringfügigeren Bande von 57 kDa. Die 90 kDa-Bande wurde höchstwahrscheinlich erzeugt, indem die DEVD (SEQ ID NO: 9)-Stelle an Rest 214 von PARP gespalten wurde. Es wird angenommen, dass dieses Spaltprodukt einem 85 kDa-PARP-Spaltprodukt, das in apoptotischen Zellen beschrieben worden ist, entspricht. Das 57 kDa- S. paltprodukt wird wahrscheinlich durch Spaltung an einer Stelle C-terminal zu der DEVD (SEQ ID NO: 9)-Stelle erzeugt. Dieses Produkt wurde mit dem C-2-10-Antikörper, der in einer früheren Studie verwendet worden war, nicht nachgewiesen. Dies beruht wahrscheinlich darauf, dass dieser ein Epitop erkennt, das sich N-terminal zu dem Epitop, das von dem 4C10-5-Antikörper, der in der vorliegenden Studie verwendet wurde, erkannt wird, befindet. Auch Mch2α spaltete PARP unter Erzeugung eines Hauptprodukts von ~83 kDa und eines geringfügigeren Produkts von ~57 kDa ähnlich zu jenen, die mit CPP32 erhalten worden waren. PARP wurde durch Mch2β oder ICEγ nicht gespalten. Diese Daten legen nahe, dass sowohl CPP32 als auch Mch2α PARP spalten können. Das mit Mch2α erhaltene Hauptspaltprodukt ist von kleinerer Größe als jenes, das mit CPP32 erhalten worden war, was nahelegt, dass die Mch2α-Spaltstelle sich C-terminal zu der CPP32-Spaltstelle befindet. Darüber hinaus eliminiert die Deletion in Mch2β dessen enzymatische Aktivität.

Eine Expression von Mch2α in Sf9-Zellen induziert Apoptose.

Um zu untersuchen, ob eine Expression von Mch2α eine ähnliche apoptotische Wirkung hat, wurden Sf9-Zellen mit einem rekombinanten Baculovirus, das Mch2α oder Mch2β unter dem Polyhedron- Promotor exprimierte, infiziert. Zellen wurden auch mit dem Wildtyp-Virus und dem rekombinanten ICE-Baculovirus als Kontrollen infiziert. Morphologische, biochemische und Lebensfähigkeits-Analysen enthüllten, dass mit ICE oder Mch2α, nicht aber mit dem Wildtyp-Virus oder Mch2β infizierte Zellen mehrere charakteristische Anzeichen von Apoptose, einschließlich Bläschenbildung der Zytoplasmamembran, Zellkernfragmentierung und -kondensation und internukleosomale DNA-Spaltung, aufwiesen. Eine Abnahme der Lebensfähigkeit ähnlich zu jener, die zuvor mit Zellen, die ICE oder CPP32 exprimierten, beobachtet worden war, wurde ebenfalls bei Zellen, die Mch2α, nicht aber Mch2β exprimieren, beobachtet.

Die neue, als Mch2 bezeichnete apoptotische Cysteinprotease wurde unter Verwendung einer PCR-Strategie, die dazu ausgelegt war, neue Mitglieder der Ced3/ICE-artigen apoptotischen Cysteinproteasefamilie zu identifizieren und zu klonieren, kloniert. Die Aminosäuresequenz und vorhergesagte Struktur von Mch2 ist ähnlich zu jener von ICE und den anderen Mitgliedern dieser Familie, wie CED-3, CPP32 und Ich-1. Mch2α und CPP32 benötigen einen Asp-Rest an der P1-Position des Peptidsubstrats DEVD-AMC (SEQ ID NO: 3), was nahelegt, dass sie ein ähnliches Substraterfordernis wie ICE haben.

Die Daten zeigen klar, dass PARP ein Substrat sowohl für Mch2α als auch CPP32 ist. Ähnlich zu ICE und Ich-1 könnte die Aktivität von Mch2 durch alternatives Spleißen reguliert werden. Eine alternativ gespleißte Isoform, Mch2β, wurde ebenfalls isoliert. Wie Ich-1s könnte Mch2β ein dominanter Inhibitor von Mch2α sein und könnte als ein negativer Apoptose-Regulator wirken. Wenn diese Form unter Erzeugung einer funktionsfähigen p11-Untereinheit gespalten würde, könnte sie dann alternativ als ein Aktivator von Mch2 dienen.

Die alternativ gespleißten Isoformen dieser Enzyme könnten folglich eine kritische Rolle bei ihrer Aktivierung oder Hemmung spielen. Eine gewebespezifische Regulation des Expressionsniveaus dieser Isoformen könnte für Empfindlichkeit oder Resistenz gegenüber der Induktion von Apoptose verantwortlich sein. Die Isolierung und Charakterisierung von neuen Mitgliedern dieser wichtigen Klasse von Cysteinproteasen wird die Anstrengungen verstärken, um deren endogene Substrate und Regulatoren zu identifizieren und um spezifische Arzneimittel, die deren Aktivität regulieren werden, zu gestalten.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER: Litwack, Gerald

Alnemri, Emad S.

Fernandex-Alnemri, Teresa

(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Mch2, EINE APOPTOTISCHE CYSTEIN-PROTEASE, ZUSAMMENSETZUNGEN FÜR IHRE PRÄPARATION UND METHODEN FÜR IHRE VERWENDUNG

(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 10

(iv) KORRESPONDENZADRESSE:

(A) ADRESSE: Woodcock, Washburn, Kurtz, Mackiewicz & Norris

(B) STRASSE: One Liberty Place, 46th floor

(C) ORT: Philadelphia

(D) STAAT: PA

(E) LAND: Vereinigte Staaten von Amerika

(F) POSTLEITZAHL: 19103

(v) COMPUTER-LESBARE FORM:

(A) DATENTRÄGER: Floppy disk

(B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: WordPerfect 5.1

(vi) EINREICHUNGSDATEN:

(A) ANMELDER:

(B) ANMELDETAG:

(C) KLASSIFIKATION:

(vii) EINREICHUNGSDATEN:

(A) ANMELDER: 08/446, 925

(B) ANMELDETAG: 18. Mai 1995

(C) KLASSIFIKATION:

(viii) ANWALTSINFORMATIONEN:

(A) NAME: DeLuca, Mark

(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 33,229

(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: TJU-1882

(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATIONEN:

(A) TELEFON: (2159 568-3100

(B) TELEFAX: (215) 568-3439

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) MOLEKÜLTYP: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:

(1) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) MOLEKÜLTYP: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) MOLEKÜLTYP: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 1545 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGART: doppel

(D) TOPOLOGIE: unbekannt

(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA

(ix) MERKMALE:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) STANDORD: 79..957

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 293 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) MOLEKÜLTYP: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 6:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 1313 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGART: doppel

(D) TOPOLOGIE: unbekannt

(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA

(ix) MERKMALE:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) STANDORD: 1..612

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 7:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 204 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) MOLEKÜLTYP: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) MOLEKÜLTYP: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 9:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) MOLEKÜLTYP: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 10:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:

(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) MOLEKÜLTYP: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:


Anspruch[de]

1. Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7.

2. Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein aufgereinigt ist.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Protein nach Anspruch 1 oder 2 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.

4. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche für ein Protein nach Anspruch 1 kodiert.

5. Isoliertes Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung, die das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 4 oder 5 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.

7. Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 179 von SEQ ID NO: 5 umfasst.

8. Polypeptid nach Anspruch 7, wobei das Polypeptid die zusammenhängende Aminosäuresequenz der Positionen 14 bis 102 von SEQ ID NO: 5 umfasst.

9. Isoliertes, proteolytisch aktives Fragment des Polypeptids nach Anspruch 7, das zusammenhängende Aminosäuresequenzen umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus Positionen 1 bis 176 von SEQ ID NO: 5, Positionen 1 bis 179 von SEQ ID NO: 5, Positionen 1 bis 186 von SEQ ID NO: 5, Positionen 1 bis 193 von SEQ ID NO: 5, Positionen 24 bis 176 von SEQ ID NO: 5, Positionen 24 bis 179 von SEQ ID NO: 5, Positionen 24 bis 186 von SEQ ID NO: 5, Positionen 24 bis 193 von SEQ ID NO: 5, Positionen 33 bis 176 von SEQ ID NO: 5, Positionen 33 bis 179 von SEQ ID NO: 5, Positionen 33 bis 186 von SEQ ID NO: 5, Positionen 33 bis 193 von SEQ ID NO: 5, Positionen 41 bis 176 von SEQ ID NO: 5, Positionen 41 bis 179 von SEQ ID NO: 5, Positionen 41 bis 186 von SEQ ID NO: 5, und Positionen 41 bis 193 von SEQ ID NO: 5, ausgewählt sind.

10. Isoliertes Fragment des Polypeptids mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 5, das zusammenhängende Aminosäuresequenzen umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus Positionen 177 bis 293 von SEQ ID NO: 5, Positionen 180 bis 293 von SEQ ID NO: 5, Positionen 187 bis 293 von SEQ ID NO: 5 und Positionen 194 bis 293 von SEQ ID NO: 5, ausgewählt sind.

11. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für ein Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 13 kodiert.

12. Rekombinanter Expressionsvektor, der das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 5 umfasst.

13. Wirtszelle, die den rekombinanten Expressionsvektor nach Anspruch 12 umfasst.

14. Oligonukleotidmolekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die identisch oder komplementär zu einer Nukleotidsequenz von mindestens 24 Nukleotiden von SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 ist.

15. Isolierter Antikörper, der spezifisch an ein Epitop von SEQ ID NO: 5 und/oder SEQ ID NO: 7 bindet.

16. Antikörper nach Anspruch 15, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

17. Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren der Aktivität des Proteins mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 5, bei dem man:

einen Testassay durchführt, indem man ein Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 5 umfasst, oder ein proteolytisch aktives Fragment desselben in Gegenwart einer Testverbindung unter Bedingungen mit einem Substrat zusammenbringt, bei denen das Protein das Substrat in Abwesenheit der Testverbindung prozessiert, und man bestimmt, ob das Substrat prozessiert wurde.

18. Verfahren zur Identifizierung von Aktivatoren der Aktivität des Proteins mit der in SEQ ID NO: 5 angegebenen Aminosäuresequenz, bei dem man:

einen Testassay durchführt, indem man ein Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 5 umfasst, oder ein proteolytisch aktives Fragment desselben in Gegenwart einer Testverbindung unter Bedingungen mit einem Substrat zusammenbringt, bei denen das Protein das Substrat in Abwesenheit der Testverbindung prozessiert, wobei man die Prozessierungsgeschwindigkeit (-rate) des Substrates in Gegenwart der Testverbindung mit der Prozessierungsgeschwindigkeit (-rate) des Substrates in Abwesenheit der Testverbindung vergleicht.







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