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Dokumentenidentifikation DE69622799T2 28.05.2003
EP-Veröffentlichungsnummer 0757251
Titel Abschätzung der Veränderung von Knochen-Mineraldichten und Diagnose von Osteoporose
Anmelder Tosoh Corp., Shinnanyo, Yamaguchi, JP
Erfinder Shiraki, Masataka, Minamiazumi-gun, Nagano, JP;
Chen, Jui-Tung, Tokyo, JP;
Morita, Ikuo, Tokyo, JP;
Maruo, Naoko, Yokohama-shi, Kanagawa, JP
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69622799
Vertragsstaaten DE, FR, GB, IT
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 23.02.1996
EP-Aktenzeichen 961027372
EP-Offenlegungsdatum 05.02.1997
EP date of grant 07.08.2002
Veröffentlichungstag im Patentblatt 28.05.2003
IPC-Hauptklasse G01N 33/566
IPC-Nebenklasse G01N 33/543   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abschätzung der Veränderung von Knochen-Mineraldichte und ein Verfahren zur Diagnose von Osteoporose.

Es wird berichtet, dass Interieukin-6 (IL-6) ein multifunktionales Cytokin ist, und es wurde kürzlich bekannt, dass eine der Funktionen von IL-6 die Stimulierung der Knochen- Absorption ist. Andererseits ist auch bekannt, dass ein Rückgang der Sekretion von Östradiol in der Phase nach der Menopause eine Zunahme der Produktion von IL-6 zur Folge hat, und auf der Basis dieser Ergebnisse wurde erklärt, dass die Möglichkeit besteht, dass IL-6 an der Verursachung von Osteoporose beteiligt ist.

Interleukin-6-Rezeptor (U-6R) ist ein Protein, das ein Molekulargewicht von etwa 80 kDa hat und mit IL-6 bindet, was die Bildung eines Liganden-Rezeptor-Komplexes zur Folge hat. Der Komplex von IL-6 und IL-6R wiederum bindet mit einem Protein, welches gp130- Protein genannt wird, das ein Molekulargewicht von etwa 130 kDa hat und das für die IL-6- vermittelte Signaltransduktion verantwortlich ist (Japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 4-29997).

IL-6R ist ein Membranprotein, das eine intramembrane Domäne, einen Membran durchdringenden Abschnitt und eine extrazelluläre Domäne besitzt, und es ist bekannt, dass die extrazelluläre Domäne, die ein Molekulargewicht von etwa 55 kDa hat, in Serum und in Urin nachgewiesen wird (Eur. J. Immunol. Bd. 23, S. 820-824, 1993).

Von der Herstellung von Antikörpern gegen menschlichen IL-6-Rezeptor wurde berichtet (EP-A-0 409 607).

Es wurde berichtet, dass lösliches IL-6R (sIL-6R), das ein Teil von IL-6R ist und in Serum und in Urin nachgewiesen wird, bei einem Patienten mit einem Myelom oder AIDS zunimmt, und deshalb wird in Betracht gezogen, dass das sIL-6R bei Krankheiten, die mit IL- 6R in Verbindung stehen, eine wichtige Rolle spielt (Guilard J. P. et al., Eur. J. Immunol. Bd. 23, S. 820-824, 1993; und Honda M. et al. J. Immunol. Bd. 148, S. 2175-2180, 1992).

Mit dem Kommen der sogenannten überalterten Gesellschaft nimmt die Anzahl der Patienten, die an Osteoporose leiden, zu, und die Vorhersage und die Behandlung desselben werden zu einer wichtigen Angelegenheit. Eines der wichtigsten Dinge, die mit Osteoporeose in Verbindung stehen, ist es, die Risiken von Osteoporose so leicht wie möglich zu bestimmen und sein Auftreten zu verhindern.

Ein Faktor, der am direktesten mit der Häufigkeit der Bildung von Knochenfrakturen in Verbindung steht, ist die Menge an Knochen (Knochen-Mineraldichte), und die Knochen- Mineraldichte wird durch Bild-Diagnose und Röntgenabsorptionsverfahren gemessen. Von diesen ist momentan die duale Röntgenabsorptiometrie (DXA) das populärste Verfahren und seine Verlässlichkeit ist hoch. Die Geräte für DXA sind jedoch so teuer, dass nur wenige Krankenhäuser die Geräte haben, und deshalb ist es schwierig, DXA routinemäßig zu verwenden. Darüber hinaus kann DXA, da es Strahlung verwendet, bei schwangeren Frauen nicht angewendet werden. Zusätzlich kann das DXA-Verfahren, obwohl es zu dem Zeitpunkt, an dem die Messung durchgeführt wird, zur Messung von Knochendichte verwendet werden kann, nicht zur Abschätzung einer zukünftigen Abnahme der Knochen-Mineraldichte verwendet werden; mit anderen Worten, DXA kann den Stoffwechselumsatz von Knochen nicht zeigen.

Auf der anderen Seite wird berücksichtigt, dass die Osteoporose nach der Menopause durch ein Missverhältnis zwischen Knochenbildung und Knochenresorption verursacht wird, was eine Zunahme der Knochenresorption zur Folge hat, und auf die Messung eines Knochen- Stoffwechselmarkers, der den Knochenstoffwechsel wiederspiegelt, wird aufmerksam gemacht. Auf Desoxypyridinolin wird, obwohl es ein biochemischer Marker des Knochenstoffwechsels ist, der zur selektiven Abschätzung der Knochenresorption verwendet werden kann, aufmerksam gemacht; und als Marker für den Knochenstoffwechsel, der zur Abschätzung der Knochenbildung verwendet werden kann, wird auf Osteocaicin aufmerksam gemacht, wobei Ersteres insofern nachteilig ist, als dass es in einer Urinprobe gemessen wird, wobei die Ergebnisse innerhalb eines Tages variieren und durch Nieren-Clearance- Funktionen beeinflusst werden. Die gewonnenen Daten sollten unter Verwendung der Kreatinin-Konzentration korrigiert werden. Auf der anderen Seite ist Letzteres insofern nachteilig, als dass ein Probenserum verschiedene Abbauprodukte von Osteocaicin einschließt, und der Bestandteil, der gemessen wird, nicht eindeutig ist.

Eine Beteiligung von IL-6 und anderen Cytokinen bei der Osteoporose nach der Menopause sowie der Beitrag dieser Cytokine zum Knochenverlust diesem Zustand erscheint möglich (Chemical Abstracts. Bd. 123, No. 9 (1995) Columbus, Ohio, US, Abstract No. 103618v, S. H. Ralston).

Wie aus dem Vorstehenden ersichtlich ist, gibt es, obwohl die Wichtigkeit der Abschätzung und der Diagnose von Osteoporose erkannt wurde, zum jetzigen Zeitpunkt kein Routineverfahren zur Messung eines Knochen-Stoffwechselmarkers.

In Anbetracht des vorstehend erwähnten Stands der Technik forschten die hier genannten Erfinder nach Stoffen, deren Konzentration sich zusammen mit dem Verlust beziehungsweise der Zunahme der Knochen-Mineraldichte, die die Osteoporose verursacht, verändert, und fanden als Ergebnis heraus, dass die Konzentration von sIL-6R in einer Blutprobe mit einem Verlust an Knochen-Mineraldichte zunimmt, und vervollständigten die vorliegende Erfindung.

Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Abschätzung der Veränderung von Knochen-Mineraldichte bereit, umfassend den Schritt der Messung der Konzentrationsänderung des löslichen Interleukin-6-Rezeptors (sIL-6R) in einer Blutprobe.

Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren ein Verfahren zur Diagnose von Osteoporose bereit, umfassend den Schritt der Messung einer sIL-oR-Konzentration in einer Blutprobe.

Fig. 1 stellt eine Standardkurve für ein Sandwich-Testsystem für IL-6R dar, das in Beispiel 1 beschrieben ist, worin die vertikale Achse die Absorption zeigt und die horizontale Achse die IL-eR-Konzentration (ng/ml) zeigt. Diese Figur zeigt, dass das Sandwich- Testsystem IL-6R im Konzentrationsbereich von 0,39 bis 25 ng/ml messen kann. Die Linie wird durch die Gleichung

Y = 2,9577 · 10&supmin;² X - 4,0200 · 10&supmin;&sup5; dargestellt, wobei Y die Absorption und X die sIL- 6R-Konzentration darstellt.

Fig. 2 stellt eine Graphik dar, die die Ergebnisse von Messungen, die in Beispiel 2 durchgeführt wurden, von EL-6 und sIL-6R in Serumproben von Frauen vor, während und nach der Menopause zeigt, wobei die vertikale Achse die Konzentration von sIL-6R (ng/ml) oder IL-6 (pg/ml) zeigt und die horizontale Achse die Ergebnisse von Proben vor der Menopause (preM), während der Menopause (periM) und nach der Menopause (postM) klassifiziert. Diese Figur zeigt, dass die Konzentration von sIL-6R (schraffierte Balken) bei Frauen vor der Menopause und bei Frauen nach der Menopause signifikant unterschiedlich ist, wohingegen die Konzentrationen von IL-6 (weiße Balken) zwischen Frauen vor der Menopause und Frauen nach der Menopause nicht signifikant unterschiedlich sind.

Fig. 3 zeigt die Korrelation zwischen der Konzentration an sIL-6R, das gemäß der vorliegenden Erfindung gemessen wurde, und der Knochen-Mineraldichte, die nach dem herkömmlichen DXA-Verfahren gemessen wurde, wobei die vertikal Achse die Knochen- Mineraldichte (g/cm²) zeigt und die horizontale Achse die Konzentration von sIL-6R (ng/ml) zeigt. Wie an Hand dieser Figur zu sehen ist, ist die Konzentration von sIL-6R niedriger, wenn der DXA-Wert, der die Knochen-Mineraldichte darstellt, höher ist, und die Konzentration von sIL-6R ist höher, wenn der DXA-Wert, der die Knochen-Mineraldichte darstellt, niedriger ist.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Abschätzung der Veränderung der Knochen-Mineraldichte und ein Verfahren zur Diagnose von Osteoporose, umfassend die Schritte der Messung einer Konzentration von sIL-6R in einer Blutprobe. Da bekannt ist, dass IL-6 und IL-6R in nicht-menschlichen Säugern vorkommen (vgl. zum Beispiel für Mäuse, Japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 3-155795), kann die vorliegende Erfindung angewendet werden, um die Veränderung der Knochen- Mineraldichte bei nicht-menschlichen Säugern abzuschätzen. Die vorliegende Erfindung wird jedoch bevorzugt angewendet, um die Veränderung der Knochen-Mineraldichte im Menschen abzuschätzen oder zur Diagnose von Osteoporose beim Menschen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich das sIL-6R auf jedes IL-6R-Fragment, das eine funktionelle Domäne umfasst, welche die Funktion von IL-6R aufweist, d. h. eine essenzielle Domäne der Signaltransduktion, die durch IL-6 vermittelt wird. Genauer gesagt ist die funktionelle Domäne für menschliches IL-6R in der Region der 123. bis 323. Aminosäurereste vorhanden, gezählt von der N-terminalen Aminosäure von menschlichem IL-6R, welche 468 Aminosäuren umfasst. Deshalb umfasst das sIL-6R jene IL-6R-Fragmente, die mindestens die funktionelle Domäne enthalten, von der Zellmembran freigesetzt werden und unterschiedliche Molekulargewichte haben (zum Beispiel siehe USP 5, 171, 840). Ein repräsentatives sIL-6R ist das vorstehend erwähnte IL-6R-Fragment, das ein Molekulargewicht von etwa 55 kDa hat.

Die Blutprobe der vorliegenden Erfindung ist jede Blutprobe, die in einem Immuntest verwendet wird, und ist typischerweise eine Serumprobe. Um die Veränderung der Knochen- Mineraldichte im Menschen abzuschätzen oder um Osteoporose bei Menschen zu diagnostizieren, wird eine menschliche Blutprobe, vorzugsweise eine menschliche Serumprobe, verwendet. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann sIL-6R durch jeden herkömmlichen Immuntest wie einen Sandwich-Test oder einen Kompetitivtest gemessen werden. Im Falle eines Sandwich-Tests werden zum Beispiel ein Anti-sIL-6R-Antikörper, der auf einem festen Träger immobilisiert ist, und ein Anti-sIL-6R-Antikörper, der an einen nachweisbaren Marker gebunden ist oder fähig ist, an einen nachweisbaren Marker zu binden, verwendet. Zusätzlich werden zum Beispiel im Falle eines Kompetitivtests ein Anti-sIL-6R- Antikörper, der auf einem festen Träger immobilisiert ist, sowie ein sIL-6R, das an einen nachweisbaren Marker gebunden ist oder fähig ist, an einen nachweisbaren Marker zu binden, verwendet.

Im Sandwich-Test wird ein Anti-IL-oR-Antikörper auf der Oberfläche eines festen Trägers immobilisiert. Der feste Träger kann eine Mikrotiter-Platte, Kügelchen, etc. sein. Der Anti-IL-oR-Antikörper wird durch ein herkömmliches Verfahren auf der Oberfläche eines festen Trägers immobilisiert, zum Beispiel durch Inkontaktbringen eines festen Trägers mit einer wässrigen Lösung eines Anti-IL-oR-Antikörpers und Inkubieren des festen Trägers und der Lösung zum Beispiel bei Raumtemperatur 1-24 Stunden lang, und vorzugsweise 12 bis 16 Stunden lang. Die wässrige Lösung ist vorzugsweise eine Pufferlösung wie ein Phosphatpuffer, Tris-HCL oder ein Carbonatpuffer bei pH 6 bis pH 10.

Als Nächstes wird eine Probe mit dem festen Träger, der mit einem Anti-IL-6R- Antikörper als erstem Antikörper beschichtet ist, in Kontakt gebracht, und das Ganze wird zum Beispiel bei Raumtemperatur 10 bis 240 Minuten lang inkubiert, vorzugsweise 60 bis 120 Minuten lang. Auf diese Weise bindet sIL-6R in der Probe, wenn vorhanden, an den Anti- IL-6R-Antikörper, der auf dem festen Zustand immobilisiert ist, so dass das sIL-6R in der Probe auf dem festen Träger durch den Anti-IL-6R-Antikörper immobilisiert wird, der zuvor auf dem festen Träger immobilisiert wurde. Als Nächstes wird ein anderer Anti-IL-6R- Antikörper (zweiter Antikörper), der an einen Marker gebunden ist, dem festen Träger zugesetzt, um die Bindung des Anti-IL-6R-Antikörpers, der mit dem Marker markiert wurde, an das sIL-6R, das auf dem festen Träger immobilisiert wurde, zu ermöglichen.

Alternativ werden eine Probe und ein Anti-IL-6R-Antikörper, der an einen Marker gebunden ist, gemischt, so dass sIL-6R, wenn vorhanden, in der Probe immunologisch mit dem Anti-IL-6R-Antikörper (zweiten Antikörper) bindet, um einen Immunkomplex zu erzeugen, und dann wird das Gemisch mit dem Anti-IL-6R-Antikörper (ersten Antikörper), der zuvor im festen Träger immobilisiert wurde, in Kontakt gebracht, so dass das sIL-6R im Immunkomplex an den Anti-IL-6R-Antikörper, der auf dem festen Träger immobilisiert ist, bindet. Auf diese Weise wird der Marker in einer Menge immobilisiert, die die Menge an sIL- 6R in der Probe widerspiegelt. Der Anti-IL-6R-Antikörper als erster Antikörper und der Anti- IL-6R-Antikörper als zweiter Antikörper sollten an verschiedene Epitope auf dem sIL-6R- Molekül binden. Sowohl der erste als auch der zweite Antikörper sind polyclonale Antikörper oder monoclonale Antikörper. Alternativ ist der erste Antikörper ein monocionaler Antikörper und der zweite Antikörper ein polyclonaler Antikörper; oder der erste Antikörper ist ein polyclonaler Antikörper und der zweite Antikörper ist ein monocionaler Antikörper.

Im Kompetitivtest wird ein Anti-IL-6R-Antikörper als erster Antikörper auf der Oberfläche eines festen Trägers immobilisiert, wie für den Sandwich-Test beschrieben. Der feste Träger für den Kompetitivtest kann derselbe wie jene für den Sandwich-Test sein. Als Nächstes wird eine Probe und sIL-6R, das an einen Marker gebunden ist, vermischt, und das Gemisch wird mit dem festen Träger, der mit dem Anti-IL-6R-Antikörper beschichtet ist, in Kontakt gebracht, um die Kompetition zwischen sIL-6R in der Probe, wenn vorhanden, und dem sIL-6R, der an den Marker gebunden ist, um den Anti-IL-6R-Antikörper, der auf dem festen Träger immobilisiert ist, zu gewähren. Auf diesem Weg wird der Marker in einer Menge auf der Oberfläche des festen Trägers immobilisiert, die die Menge des sIL-6R in der Probe invers widerspiegelt.

Zusätzlich zu dem vorstehend erwähnten Sandwich-Test und Kompetitivtest kann die Abschätzung der Dichteveränderung und die Diagnose von Osteoporose gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung einer physikalischen Eigenschaft von IL-6R durchgeführt werden. Abgesehen von den Anti-sIL-6R-Antikörpern bindet nämlich das IL-6R spezifisch an IL-6, und ein Komplex von IL-6R und BL-6 bindet spezifisch an das gp130- Protein. Deshalb kann zum Beispiel im vorstehend erwähnten Sandwich-Test und im Kompetitivtest der Anti-sIL-6R-Antikörper durch IL-6 ersetzt werden. Genauer gesagt kann im Sandwich-Test einer der ersten und zweiten Antikörper durch IL-6 ersetzt werden. Auf der anderen Seite kann im Kompetitivtest der Anti-sIL-6-Antikörper, der auf dem festen Träger immobilisiert werden soll, durch IL-6 ersetzt werden.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist, obwohl jedes der vorstehend erwähnten Verfahren für den sIL-6R-Test verwendet werden kann, der Sandwich-Test auf Grund der leichten Herstellung der Testreagenzien wie der Anti-sIL-6R-Antikörper und auf Grund der hohen Empfindlichkeit am stärksten zu bevorzugen.

Der sIL-6R, der in den vorliegenden Verfahren verwendet wird, kann zum Beispiel gemäß dem im USP Nr. 5.171.840 beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Zusätzlich kann der so hergestellte sIL-6R als Antigen zur Herstellung von Anti-sIL-6R-Antikörpern verwendet werden, zum Beispiel wie in der Japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 4-99800 beschrieben.

Der m den vorliegenden Verfahren verwendete Marker kann jeder herkömmliche Marker sein, der in Immuntests verwendet wird und ist zum Beispiel ein fluoreszierender Stoff, Radioisotop, lichtabsorbierender Stoff oder Enzym. Darunter sind Enzyme am stärksten bevorzugt, da sie ohne spezielle Geräte leicht zu handhaben sind sowie auf Grund der hohen Empfindlichkeit. Das typische Enzym ist alkalische Phosphatase. Die Menge an alkalischer Phosphatase, die auf dem festen Träger abhängig von der Menge an sIL-6R in der Probe immobilisiert wird, wird durch ein chromogenes Substrat für das Enzym wie p- Nitrophenylphosphat gemessen, und die Menge an freigesetztem p-Nitrophenol wird spektrophotometrisch gemessen, zum Beispiel durch ein im Handel erhältliches Plattenlesegerät.

Wie in den Beispielen detailliert gezeigt wird, korreliert eine Veränderung (Zunahme) der Konzentration an sIL-6R in einer Blutprobe mit einer Veränderung (Abnahme) der Knochen-Mineraldichte. Deshalb können gemäß der vorliegenden Erfindung Veränderungen der Knochen-Mineraldichte dadurch abgeschätzt werden, dass Veränderungen der SIL-6R- Konzentration beobachtet werden. Insbesondere können Veränderungen der Knochen- Mineraldichte eines bestimmten Patienten durch periodisches Messen von sIL-6R in Proben, die von demselben Patienten gewonnen werden, überwacht werden. Zusätzlich kann, wenn eine sIL-6R-Konzentration in einer Blutprobe eines Patienten einen vorher bestimmten Wert überschreitet, der Patient als an Osteoporose erkrankt diagnostiziert werden.

Als Nächstes wird die vorliegende Erfindung durch Beispiele genauer erklärt, obwohl der Umfang der Erfindung nicht darauf beschränkt ist.

Beispiel 1 Einrichtung eines Testverfahrens für sIL-6R

Ein Anti-IL-6R monoclonal er Antikörper PM1 (vgl. Japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (Kokai Nr. 3-139293), der fähig ist, an sIL-6R zu binden, wurde in 0,1 M Carbonatpuffer (pH 9,6) auf eine Endkonzentration von 5 ug/ml gelöst, und 100 ul/Vertiefung der Lösung wurde jeder Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen (fester Träger) zugesetzt, und das Ganze wurde bei 4ºC über Nacht inkubiert, damit der Antikörper auf den Vertiefungen der Platte immobilisieren konnte. Die Platte wurde mit PB S (phosphatgepufferte Salzlösung), die 0,02% Tween 20 enthielt, gewaschen. 150 ul/Vertiefung PBS, welches 0,5% BSA enthielt, wurden den Vertiefungen zugesetzt, und die Platte wurde über Nacht bei 4ºC für die Blockierung stehen gelassen.

Anti-IL-6R monodonaler Antikörper, der mit alkalischer Phosphatase (ALP) markiert war, wurde wie folgt hergestellt: 2 mg Anti-IL-6R monodonaler Antikörper MT18 (vgl. Japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 2-288898) und 2 mg einer im Handel erhältlichen alkalischen Phosphatase aus Kälberdünndarm wurden durch S-S-Brücken miteinander verbunden, und das Produkt wurde dadurch gereingt, dass das Reaktionsgemisch einer Gelfiltration unterzogen wurde (Säule: G3000S W, Tosoh; Elutionspuffer: 50 mM Phosphatpuffer (pH 7), welcher 150 mM NaCl enthielt) (vgl. Koso Meneki Sokutei Ho., dritte Ausgabe, herausgegeben durch Eiji Ishikawa et al., Igaku Shoin, Seite 117).

Um Standard-IL-6R-Lösungen herzustellen, wurde IL-6R, hergestellt durch ein Verfahren von Yasukawa K. et al., J. Biochem. Bd. 108, S. 673-676, 1990, mit einer lösenden Lösung (0,1 M Tns-HCl (pH 8,0), ImM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2; 1% BSA) gelöst, um die Endkonzentration des IL-6R auf 25, 12,5, 6,25, 3,13, 1,56, 0,78 und 0,36 mg/ml festzusetzen.

Die Platte wurde mit PBS, welches 0,02% Tween 20 enthielt, gewaschen, und jeder Vertiefung wurden 50 ul der Standardlösung sowie 50 ul einer Lösung, die 1 mA des ALPmarkierten Antikörpers (1 mA ist eine Konzentration des ALP-markierten Antikörpers, die eine Absorption von 0,001 bei 280 nm liefert), zugesetzt, und man ließ die Platte bei Raumtemperatur 2 Stunden lang stehen, so dass der Standard-sIL-6R und der ALP-markierte Antikörper aneinander binden. Nach Waschen der Platte wurden 100 ul einer Lösung von 1 mg/ml p-Nitrophosphat in 0,05 M Carbonatpuffer (pH 9,8) jeder Vertiefung zugesetzt, um die Reaktion des ALP-markierten Antikörpers, der auf dem festen Träger immobilisiert war, mit p-Nitrophenylphosphat ablaufen zu lassen, und die Menge des entstandenen p-Nitrophenol wurde unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Plattenlesegeräts (MPR-A4, Tosoh) bei einer Wellenlänge von 405 nm mit einer Referenz-Wellenlänge von 492 nm photospektrometrisch gemessen.

Das Ergebnis ist in Fig. 1 gezeigt. Wie in Fig. 1 zu sehen ist, kann IL-6R im Bereich von 0,39 bis 25 ng/ml gemessen werden.

Beispiel 2 Messung von sIL-6R in Serumprobe bei Frauen

Serumproben wurden von gesunden weiblichen ambulanten Patienten, die zwischen 44 und 65 Jahren alt waren und die ein gynäkologisches Krankenhaus besuchten, gewonnen. Die Proben umfassen 65 Proben von Frauen vor der Menopause, 35 Proben von Frauen während der Menopause und 51 Proben von Frauen nach der Menopause.

Die gewonnenen Serumproben wurden bis zur Messung bei -80ºC gelagert. Für den Test auf sIL-6R wurden die Serumproben 60-fach mit der in Beispiel 1 beschriebenen Verdünnungslösung verdünnt, und der Test wurde gemäß demselben Verfahren, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Es ist zu bemerken, dass zum Vergleich die Konzentration von IL-6 in denselben Proben durch den Sandwich-Test unter Verwendung eines Anti-IL-6-Antikörpers, der auf einem festen Träger immobilisiert war, und eines Anti- IL-6R-Antikörpers, der mit ALP markiert war, gemessen wurde.

Fig. 2 stellt eine Graphik dar, die die Konzentrationen von IL-6 und sIL-6R zeigt, welche in Seren von Frauen vor, während und nach der Menopause gemessen wurden.

Die Konzentrationen (Mittelwert ± Standardfehler) von sIL-6R in Serumproben betrugen 125,95 ± 4,29 ng/ml, 122,81 ± 7,40 ng/ml beziehungsweise 180,26 ± 15,18 ng/ml, was zeigt, dass die Konzentration von sIL-6R in Serumproben von Frauen nach der Menopause signifikant höher ist als die der anderen beiden Gruppen. Im Gegensatz dazu gibt es keinen signifikanten Unterschied zwischen den IL-6-Konzentrationen in Serumproben, die von Frauen vor, während und nach der Menopause gewonnen wurden. Es ist zu bemerken, dass die statistische Signifikanz gemäß dem Mann-Whitney-Test (U-Test) bestimmt wurde.

Beispiel 3 Korrelation zwischen gemessenem Wert an sIL-6R und DXA

Es wurde berichtet, dass die Knochen-Mineraldichte bei Frauen nach der Menopause abnimmt, und die Abnahme der Knochen-Mineraldichte verursacht die Osteoporose. In diesem Beispiel wurde die Knochen-Mineraldichte des Lumbalknochens der 151 Patienten, auf die in Beispiel 2 Bezug genommen wurde, durch ein Lunar DPX-L (Lunar Inc.) gemessen, und die Korrelation zwischen der durch das vorliegende Verfahren gemessenen Menge an sIL-6R und der DXA-Wert wurde untersucht. Das Ergebnis ist in Fig. 3 gezeigt. Wie in Fig. 3 zu sehen ist, war die Menge an SIL-6R höher, wenn die Knochen-Mineraldichte niedriger war, und der Korrelationskoeffizient betrug 0,4.

Beispiel 4 Beziehung zwischen der gemessenen Menge an sIL-6R und Serum- Osteocaicin oder der Urin-Desoxvpvridinolin-Menge

Bei den 151 Patienten, auf die in Beispiel 2 Bezug genommen wurde, wurden die Menge an Serum-Osteocalcin (intakte Osteocakin-Konz. - N-terminale Osteocalcin-Konz.) sowie die Menge an Urin-Desoxypyridinolin (korrigiert unter Verwendung der Kreatinin- Konzentration), welche als Indikatoren des Knochen-Stoffwechsels bekannt sind, gemessen und mit der sEL-oR-Menge, die durch das vorliegende Verfahren gemessen wurde, verglichen.

Tabelle 1 zeigt den Korrelationskoeffizienten zwischen Knochen-Mineraldichte und sIL-6R, der Serum-Osteocalcin-Menge beziehungsweise dem Urin-Desoxypyridinolin (Kreatinin-korrigiert). Tabelle 1 zeigt, dass sIL-6R von den üblichen biochemischen Bestandteilen des Knochen-Stoffwechsels die stärkste Beziehung zur Knochen-Mineraldichte aufweist. Es ist zu bemerken, dass es auch eine Korrelation zwischen Serum-sIL-6R und der Serum-Osteocalcin-Menge beziehungsweise der Kreatinin-korrigierten Urin- Desoxypyridinolin-Menge gibt und dass eine Zunahme der sIL-6R-Menge den Knochen- Stoffwechsel widerspiegelt.

Tabelle 1

Gemäß der vorliegenden Erfindung sind die Abschätzung der Veränderungen der Knochen-Mineraldichte und die Diagnose von Osteoporose unter Verwendung einer Blutprobe wie einer Serumprobe die relativ leicht zu nehmen ist, möglich. Die vorliegenden Verfahren können gemäß den herkömmlichen Immuntests routinemäßig durchgeführt werden, ohne spezielle Geräte zu verwenden. Darüber hinaus ist gemäß den vorliegenden Verfahren die Anwendung von Strahlung auf den menschlichen Körper nicht notwendig, und deshalb ist das vorliegende Verfahren sicher.

Wie aus der vorstehenden Erklärung hervorgeht, nimmt die Knochen-Mineraldichte bei zunehmender sIL-oR-Konzentration in einer Blutprobe ab. Entsprechend kann die Veränderung der Knochen-Mineraldichte durch Beobachten der Konzentrationsänderung von sIL-6R durch die vorliegende Erfindung überwacht werden und zusätzlich kann die Osteoporose diagnostiziert werden, wenn eine sIL-6R-Konzentration in einer Blutprobe über einem zuvor bestimmten Wert liegt.


Anspruch[de]

1. Verfahren zur Abschätzung der Veränderung von Knochen-Mineraldichte, umfassend den Schritt der Messung der Konzentrationsänderung des löslichen Interleukin-6-Rezeptors (sIL-6R) in einer Blutprobe.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Blutprobe eine Serumprobe ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 unter Verwendung eines Anti-sIL-6R- Antikörpers, der auf einem festen Träger immobilisiert ist, und eines Anti-sIL- 6R-Antikörpers, der an einen nachweisbaren Marker gebunden ist oder fähig ist, an einen nachweisbaren Marker zu binden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Blutprobe von einem Menschen ist, und der sIL-6R ein menschlicher sIL-6R ist.

5. Verfahren zur Diagnose von Osteoporose, umfassend den Schritt der Messung einer sIL-6R Konzentration in einer Blutprobe.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Blutprobe eine Serumprobe ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6 unter Verwendung eines Anti-sIL-6R- Antikörpers, der auf einem festen Träger immobilisiert ist, und eines Anti-sIL- 6R Antikörpers, der an einen nachweisbaren Marker gebunden ist oder fähig ist, an einen nachweisbaren Marker zu binden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die Blutprobe von einem Menschen ist, und der sIL-6R ein menschlicher sIL-6R ist.







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